विरोधी ट्यूमर गुण के साथ अलगाव और न्यूट्रोफिल की विशेषता

1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center
Published 6/19/2015
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Immunology and Infection

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Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., et al. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

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Abstract

न्यूट्रोफिल, मानव संचलन में सभी सफेद रक्त कोशिकाओं की सबसे प्रचुर मात्रा में, हमलावर सूक्ष्मजीवों के खिलाफ मेजबान रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, न्यूट्रोफिल ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिरक्षा निगरानी में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। वे या तो हाइड्रोजन पेरोक्साइड या एंटीबॉडी निर्भर सेल की मध्यस्थता cytotoxicity (ADCC) के माध्यम से जुड़े एक सेल संपर्क निर्भर तंत्र के माध्यम से ट्यूमर कोशिका मृत्यु ट्यूमर कोशिकाओं को समझते हैं और प्रेरित करने की क्षमता है। विरोधी ट्यूमर गतिविधि के साथ न्यूट्रोफिल कैंसर के रोगियों के लिए और ट्यूमर असर चूहों के परिधीय रक्त से अलग किया जा सकता है। ये न्यूट्रोफिल कोई महत्वपूर्ण ट्यूमर साइटोटोक्सिक गतिविधि बताते हैं कि स्वस्थ विषयों या भोले चूहों के न्यूट्रोफिल से अलग करने के ट्यूमर entrained न्यूट्रोफिल (दस) कहा जाता है। अन्य श्वेत रक्त कोशिकाओं के साथ तुलना में, न्यूट्रोफिल एक घनत्व ढाल के अधीन जब यह संभव एक> 98% शुद्ध न्यूट्रोफिल आबादी प्राप्त करने के लिए कर रही विभिन्न उछाल दिखा। हालांकि, इसके अलावा मेंसामान्य उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल आबादी (HDN) के लिए, कैंसर रोगियों में, ट्यूमर असर चूहों में है, साथ ही जीर्ण सूजन की शर्तों के तहत, विशिष्ट कम घनत्व न्यूट्रोफिल आबादी (LDN) संचलन में दिखाई देते हैं। LDN मोनोन्यूक्लियर अंश के साथ सह-शुद्ध और सकारात्मक या नकारात्मक चयन रणनीतियों का उपयोग कर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है। पृथक न्यूट्रोफिल की शुद्धता प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया जाता है एक बार, वे इन विट्रो के लिए और इन विवो कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया जा सकता है। हम neutrophils के विरोधी ट्यूमर गतिविधि की निगरानी के लिए उनकी क्षमता विस्थापित करने के लिए और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के लिए, साथ ही उनके phagocytic क्षमता पूर्व vivo निगरानी तकनीक का वर्णन है। हम आगे vivo में ट्रैकिंग के लिए न्यूट्रोफिल लेबल करने के लिए तकनीक का वर्णन है, और इन विवो में उनके विरोधी मेटास्टैटिक क्षमता का निर्धारण करने के लिए। इन सभी तकनीकों को प्राप्त करने और विरोधी ट्यूमर के साथ न्यूट्रोफिल चिह्नित करने के लिए कैसे को समझने के लिए आवश्यक हैंसमारोह।

Introduction

न्यूट्रोफिल शुरू में हमलावर सूक्ष्मजीवों के खिलाफ पहली पंक्ति बचाव के रूप में सेवा करते हैं, जो सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में विशेषता थे। आज यह न्यूट्रोफिल अधिक कार्य दूरगामी है कि जाना जाता है, विदेशी एंटीजन 1,2 के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ते hematopoiesis 3, एंजियोजिनेसिस 4 को विनियमित करने और 5 घाव भरने में शामिल किया जा रहा है। इसके अलावा, न्यूट्रोफिल उनके समर्थक और विरोधी ट्यूमर गतिविधियों 6,7 के आधार पर ट्यूमर के विकास और मेटास्टेटिक प्रगति को प्रभावित कर सकता है। न्यूट्रोफिल एक बहुरूपी खंडों नाभिक की विशेषता है (इसलिए polymorphonuclear (PMN) ल्यूकोसाइट्स कहा जाता है) और कम से कम तीन कणिकाओं के विशिष्ट उपवर्ग के साथ-साथ स्रावी पुटिकाओं 8 (चित्रा 1 ए-सी) के होते हैं।

न्यूट्रोफिल उच्च phagocytic क्षमता और माइक्रोबियल उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण उच्च एनएडीपीएच ओक्सीडेस गतिविधि के अधिकारी है, और कम से लिए महत्वपूर्ण chemokines की एक विस्तृत श्रृंखला का स्रावअतिरिक्त न्यूट्रोफिल और सूजन 8,9 की साइट के लिए अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कर्षण। न्यूट्रोफिल टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs) सहित सतह रिसेप्टर्स की एक बड़ी राशि की अभिव्यक्ति की विशेषता है, सी टाइप Lectin रिसेप्टर्स (CLRS), रिसेप्टर 3 (CD11b / CD18) और अन्य आसंजन अणु (जैसे, एल selectin के पूरक LFA-1, VLA-4 और एंटीजन-सेल से संबंधित आसंजन अणु 3 (CEACAM3 / CD66b)), केमोकाइन रिसेप्टर्स (जैसे, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), chemoattractant रिसेप्टर्स (जैसे, PAFR, LTB 4 आर और C5aR) , साइटोकाइन रिसेप्टर्स (उदाहरण के लिए, जी CSFR, आईएल 1R, आईएल 4R, आईएल 12R, आईएल 18R, TNFR), रिसेप्टर्स (जैसे, FPR1-3) पेप्टाइड formyl, और एफसी रिसेप्टर्स (जैसे, CD16 (FcγRIII मानव न्यूट्रोफिल CD11b, CD15, CD16 और CD66b ल्युकोसैट मार्कर का उपयोग पहचान कर रहे हैं, जबकि), CD32 (FcγRII), और CD64 (FcγRI) 10। चूहों में, न्यूट्रोफिल आमतौर पर, CD11b + Ly6G + के रूप में पहचाने जाते हैं। यह भी आम तौर पर ऊतकों में न्यूट्रोफिल का पता लगाने के लिए दाना प्रोटीन myeloperoxidase (MPO) और न्युट्रोफिल इलास्टेज (पूर्वोत्तर) के लिए दाग स्वीकार कर लिया है।

यह neutrophils के विविध कार्यों को एक ही सेल द्वारा या अलग सेल उप आबादी से मध्यस्थता कर रहे हैं कि क्या अभी भी स्पष्ट नहीं है। जमते डेटा समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं और माइक्रोएन्वायरमेंट 11,12 से प्रभावित नमनीयता के एक उच्च डिग्री दर्शाती है कि एक heterogenic न्यूट्रोफिल आबादी की उपस्थिति के लिए सुझाव देते हैं। Fridlender एट अल। 13 निहायत समर्थक ट्यूमर गुणों के साथ विरोधी ट्यूमर गुण और एन 2 के साथ एन 1 करार दिया दो प्रमुख उप आबादी में कैंसर में न्यूट्रोफिल बांट दिया है। कैंसर में है, साथ ही जीर्ण सूजन में, टी सेल प्रतिक्रिया 14 को दबाने कि granulocytic माइलॉयड व्युत्पन्न का शमन कोशिकाओं (जी MDSCs) से बना एक अतिरिक्त उप जनसंख्या है। जी MDSCs एक CD11b + Ly6C द्वारा विशेषता अपरिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं माना जाता हैचूहों 15 में कम Ly6G हाय फेनोटाइप, मानव 16 में एक CD15 / + CD16 कम फेनोटाइप करते हुए। जी MDSCs, सामान्य परिसंचारी न्यूट्रोफिल की तुलना में साइटोकिन्स और chemokines की, जबकि निचले स्तर arginase और myeloperoxidase के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। वे कम phagocytic और प्रवासी हैं, लेकिन आरओएस 15,17,18 के उच्च स्तर का उत्पादन। वर्तमान पत्र में हम विरोधी ट्यूमर गुणों के साथ neutrophils के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए कुछ बुनियादी तरीके का वर्णन करेंगे।

न्यूट्रोफिल मानव संचलन में सभी सफेद रक्त कोशिकाओं की सबसे बड़ी आबादी का गठन करते हुए (45 - 70%, 1,800 - 6,000 / μl) -, 300 - 500 / μl 15%, चूहों में, सामान्य परिस्थितियों में, वे 10 (बल्कि विरल हैं )। सूजन पर और कभी-कभी जीर्ण सूजन 7 के एक राज्य का प्रतिनिधित्व करता है जो कैंसर, में तेजी से न्यूट्रोफिल गिनती बढ़ जाती है। न्यूट्रोफिल multipotent आम माइलॉयड अग्रदूत (सीएमपी) सीई से विकसितmyeloblasts के चरणों (एमबी), promyelocytes (प्रधानमंत्री), myelocytes (एमसी), metamyelocytes (मिमी) और बैंड कोशिकाओं (ईसा पूर्व) गुजर रहा एक भेदभाव प्रक्रिया के माध्यम से अस्थि मज्जा में LLS, 8। वे परिसंचरण 8 के लिए जारी किया जाता है जो पहले के 7 दिनों - परिपक्व, बाद mitotic न्यूट्रोफिल 4 के लिए अस्थि मज्जा के भीतर रह सकती है। भड़काऊ शर्तों के तहत लंबे समय तक किया जा सकता है, जो 12 बजे, - रक्त में न्युट्रोफिल कारोबार 6 की एक औसत आधा जीवन के साथ आम तौर पर तेजी है। Unstimulated न्यूट्रोफिल phorbol एस्टर phorbol 12 करने के लिए उन्हें उजागर करके विरोधी tumorigenic गतिविधि, chemokines आईएल 8 (CXCL2), CCL2, CCL5 और CXCL5 6,19 या कृत्रिम रूप से करने के लिए भोले न्यूट्रोफिल उजागर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है कि एक सुविधा है, सीमित है -myristate 13-एसीटेट (पीएमए) 6।

न्यूट्रोफिल की कम संख्या के साथ मिलकर रक्त न्यूट्रोफिल से कम आधा जीवन (~ 3 - 5 10 5 एक्स) एक भोले 6 के 1 मिलीलीटर रक्त से प्राप्त किया - 8 सप्ताह पुरानी माउस, इसे बनाया हैमुश्किल में इन विट्रो में माउस न्यूट्रोफिल परिसंचारी के समारोह में पता लगाने के लिए। इस कठिनाई को दूर करने के लिए, अन्य स्रोतों इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, न्यूट्रोफिल की बड़ी संख्या (thioglycollate शोरबा या Zymosan ए की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद, उदाहरण के लिए) अस्थि मज्जा 20 या बाँझ सूजन की प्रेरण निम्नलिखित पेरिटोनियम से प्राप्त किया जा सकता है। यह पेरिटोनियल गुहा से प्राप्त न्यूट्रोफिल किसी भी विरोधी tumorigenic गतिविधि (अप्रकाशित अवलोकन) लागू नहीं है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

। 40 लाख रक्त न्यूट्रोफिल आसानी से 1 मिलीलीटर रक्त से अलग किया जा सकता है - Granot एट अल 6 BALB / ग चूहों 20 कि इस तरह के ट्यूमर प्रगति 6 (2A चित्रा) के साथ aggravates जो neutrophilia, विकसित माउस 4T1 स्तन कार्सिनोमा सेल लाइन के साथ orthotopically टीका कि मनाया 3 - 4 हफ्तों के बाद ट्यूमर टीका। ये न्यूट्रोफिल विरोधी ट्यूमर गतिविधियों का अधिग्रहण किया है, और तदनुसार COI किया गया हैआदेश में नेड ट्यूमर entrained न्यूट्रोफिल (दस), भोले न्यूट्रोफिल 6 (चित्रा 2 बी) से अलग करने के लिए। उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल (HDN, चित्रा 1 ए) अत्यधिक विरोधी tumorigenic हैं, कैंसर के संदर्भ में उत्पन्न कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN, चित्रा 1 बी) 21 नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, ट्यूमर असर चूहों की अस्थि मज्जा और तिल्ली से उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल विरोधी ट्यूमर गतिविधि (अप्रकाशित डेटा) है। यह न्यूट्रोफिल की बढ़ती मात्रा के साथ, ट्यूमर प्रगति के साथ तिल्ली धीरे-धीरे बढ़े (तिल्ली का बढ़ना) हो जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

यह दस भी सहज (MMTV-PyMT और MMTV-Wnt1 स्तन ट्यूमर और कश्मीर रास संचालित फेफड़ों के ट्यूमर) सहित दोनों कैंसर के अन्य मॉडलों में उत्पन्न और एटी-3 (MMTV-PyMT) और E0771 स्तन कार्सिनोमा (इंजेक्ट कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए कोशिकाओं, एलएलसी लुईस फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं और B16-F10 मेलेनोमा कोशिकाओं)। इन Tum में न्यूट्रोफिल लामबंदी की हालांकि, इस हद तक3 सप्ताह के बाद 1 मिलीलीटर रक्त में 10 एक्स 10 6 न्यूट्रोफिल - या मॉडल 5 तक पहुंच गया, 4T1-टीका चूहों की तुलना में कहीं कम है।

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Protocol

पशु: 5-7 सप्ताह पुरानी BALB / ग चूहों हरलन (इजराइल) से खरीदे जाते हैं। जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों हिब्रू विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया। मानव नमूनों: कैंसर रोगियों और स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त का संग्रह Hadassah मेडिकल सेंटर संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

एक स्तन कैंसर के माउस मॉडल का उपयोग vivo में एंटी-ट्यूमर गुण के साथ न्यूट्रोफिल 1. प्रेरण।

नोट: सभी चरणों का एक लामिना airflow के (एलएएफ) के जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. 10 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम मिलीलीटर (DMEM) 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक 4.5 ग्राम / एल डी ग्लूकोज युक्त, 2 मिमी डी में 100 मिमी टिशू कल्चर प्लेट में बीज 5 एक्स 10 5 4T1 कोशिकाओं glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन जी और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट। वें सेते3 से 4 दिनों के लिए 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ई कोशिकाओं। प्रयोग के दिन पर 100% मिला हुआ - कोशिकाओं को 50 कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  2. टिशू कल्चर प्लेट से ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए, 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने, संस्कृति के माध्यम महाप्राण पीबीएस महाप्राण और 2.5 ग्राम / एल trypsin समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर trypsin के साथ 3 मिनट - कोशिकाओं 2 सेते हैं।
  3. कोशिकाओं के सभी अलग कर दिया गया है जब तक ऊपर और नीचे trypsin और पिपेट बेअसर करने के लिए 10 मिलीलीटर सीरम युक्त मध्यम जोड़ें। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं निलंबन स्थानांतरण।
  4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सेल गोली से ऊपर 200 μl मध्यम छोड़ने मध्यम aspirate। अवशिष्ट मात्रा में कोशिकाओं Resuspend और पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें। एक सजातीय सेल निलंबन पाने के लिए और एक hemocytometer में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए 10 μl बाहर लेने के लिए 3 बार - ट्यूब 2 उलटें। रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए trypan नीले रंग का प्रयोग करें। आरटी पर 200 XG पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। पीबीएस Aspirate और 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में पीबीएस में कोशिकाओं resuspend। एकल कक्ष निलंबन कोई clumping है कि सुनिश्चित करें।
  5. इंजेक्षन 1 एक्स 10 6 4T1 कोशिकाओं या luciferase व्यक्त orthotopically एक 30G एक्स 8mm सुई के साथ एक 0.3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर महिला BALB / ग चूहों के बाईं वंक्षण स्तन वसा पैड में 50 μl पीबीएस में 4T1 कोशिकाओं।
    1. 100% ऑक्सीजन में - (5%) 3 इंजेक्शन से पहले, isoflurane की एक धीमी गति से प्रवाह की दर को प्राप्त करने के एक प्रेरण कक्ष में चूहों anesthetize।
    2. एक बाँझ शल्य पैड पर माउस निर्धारित करना और सिर ठीक से isoflurane के नाक शंकु के अंदर रखा जाता है सुनिश्चित करें। पंजा बन्द रखो द्वारा उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें। इंजेक्शन स्थल के आसपास बाल दाढ़ी और 70% EtOH के साथ कीटाणुरहित।
    3. एक छोटे से क्षैतिज चीरा बनाने के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों का एक बाँझ सेट का प्रयोग करें (5 मिमी) लगभगवंक्षण और पेट निपल्स के बीच imately आधे रास्ते, वसा पैड बेनकाब और 50 μl में 1 एक्स 10 6 4T1 कोशिकाओं इंजेक्षन। एक सप्ताह बाद हटा दिया जाना चाहिए कि 9 मिमी क्लिप के साथ चीरों बंद करें। Luciferase व्यक्त कोशिकाओं के इंजेक्शन bioluminescence इमेजिंग द्वारा ट्यूमर का आकार और मेटास्टेसिस की निगरानी की अनुमति देता है।
      नोट: यह न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया किसी भी शल्य चिकित्सा के बाद उपचार की आवश्यकता नहीं है और इंजेक्शन चूहों 2 के भीतर ठीक - 3 मिनट।
    4. वे होश में आने तक चूहों की निगरानी करें, और वे अन्य चूहों की कंपनी में शामिल होने से पहले पूर्ण चेतना हासिल सुनिश्चित करें।
  6. 3 के बाद - 4 सप्ताह, प्राथमिक ट्यूमर 2 3 सेमी की एक मात्रा तक पहुँच गया है, जब एक धीमी गति से सीओ 2 धारा से चूहों बलिदान, और तुरंत आखिरी सांस के बाद, एक 25G एक्स 5/8 'सुई का उपयोग हृदय पंचर द्वारा रक्त प्राप्त हेपरिन के साथ pretreated 1 मिलीलीटर टुबरकुलीन सिरिंज से जुड़ा हुआ है। सम्मिलित करते समय ऊपर की ओर सुई के मुंह रखेंअतिरिक्त दबाव (चित्रा 3) से परहेज खून आकर्षित और धीरे धीरे धीरे दिल की ओर डायाफ्राम के माध्यम से एक क्षैतिज स्थिति में सिरिंज, और।

2. न्यूट्रोफिल अलगाव

  1. ट्यूमर असर चूहों के रक्त से साइटोटोक्सिक neutrophils के अलगाव।
    1. एक ट्यूमर असर माउस से तैयार की 1 मिलीलीटर रक्त पतला पीबीएस 6 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) (w / v) 0.5% से युक्त में (प्रोटोकॉल 1.11 देखें)।
    2. एक नया तैयार असंतत sucrose के ढाल पर पतला खून की Fractionation:
      1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए बाँझ फ़िल्टर सूक्रोज 1.119 ग्राम / मिलीलीटर की 3 मिलीलीटर जोड़ें।
      2. धीरे धीरे और सावधानी से, 1.119 ग्राम / मिलीलीटर परत के शीर्ष पर बाँझ फ़िल्टर सूक्रोज 1.077 ग्राम / मिलीलीटर की परत 3 मिलीलीटर। इसके बाद, 1.077 ग्राम / मिलीलीटर परत (चित्रा -4 ए) के शीर्ष पर धीरे धीरे और सावधानी से पतला रक्त (प्रोटोकॉल 2.1.1) के 6 मिलीलीटर जोड़ने। यह झुका ट्यूब आयोजित करने की सिफारिश की है और एकट्यूब के निचले दीवार की ओर पिपेट के मुंह में रखते हुए, एक धीमी, लेकिन सतत प्रवाह द्वारा विभिन्न घटकों dding, कोई अशांति का गठन किया गया है कि इस तरह के।
    3. ब्रेक के बिना आरटी पर 30 मिनट के लिए 700 XG पर sucrose के ढाल पर पतला रक्त युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    4. ध्यान से किसी भी अशांति के कारण के बिना सेंट्रीफ्यूज से ट्यूब को हटा दें। एरिथ्रोसाइट्स के अधिकांश ट्यूब के नीचे हो जाएगा। कम घनत्व ल्यूकोसाइट्स में पाए जाते हैं, जबकि उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल (HDN), 1.119 ग्राम / मिलीलीटर और (3 एमएल निशान के आसपास) 1.077 ग्राम / मिलीलीटर परतों के बीच इंटरफेस में एक सफेद करने वाली लाल अंगूठी के रूप में पाए जाते हैं 1.077g / एमएल परत और बीएसए युक्त पीबीएस के बीच इंटरफेस में एक सफेद अंगूठी (6 मिलीग्राम के निशान के आसपास, 4B चित्रा देखें)।
    5. कम घनत्व सेल परत के ऊपर 5 मिमी तक पहुँचने तक पीबीएस + 0.5% बीएसए aspirate। धीरे-धीरे कोशिकाओं के चारों ओर घूमता के माध्यम से 1 मिलीलीटर टिप में धीमी गति से चूषण से कम घनत्व कोशिकाओं बाहर पिपेट।0.5% BSA के साथ पीबीएस के 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं स्थानांतरण।
    6. उच्च घनत्व सेल बैंड से ऊपर 5 मिमी तक पहुँचने तक एक ही ढाल ट्यूब में ऊपरी परत aspirate। अधिकतर उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल हैं जो उच्च घनत्व कोशिकाओं, बाहर पिपेट, और 0.5% BSA युक्त पीबीएस के 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं को हस्तांतरण।
    7. आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    8. 30 सेकंड के लिए 36 मिलीलीटर बाँझ एचपीएलसी ग्रेड पानी में कोशिकाओं resuspending से सतह पर तैरनेवाला और lyse एरिथ्रोसाइट्स aspirate। Isotonicity एक 5x के 9 मिलीलीटर जोड़कर बहाल किया जाना चाहिए पीबीएस 2.5% (डब्ल्यू / वी) बीएसए के साथ पूरक ध्यान केंद्रित किया।
    9. आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    10. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और पीबीएस BSA में कोशिकाओं resuspend। एक hemocytometer में न्यूट्रोफिल की संख्या की गणना और रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए trypan नीले रंग का उपयोग करें।
    11. आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और अंतिम सेल घनत्व के लिए वांछित ऊष्मायन माध्यम में न्यूट्रोफिल resuspend। उपयोगतुरंत न्यूट्रोफिल।
    12. फिर, एक और centrifugation के बाद, अंतिम सेल घनत्व के लिए ऊष्मायन माध्यम में न्यूट्रोफिल resuspend। तुरंत न्यूट्रोफिल का प्रयोग करें।
  2. कैंसर रोगियों से न्यूट्रोफिल परिसंचारी के अलगाव।
    1. खारा में 3% dextran T500 के एक बराबर मात्रा के साथ heparinized (20 यू / एमएल) के मानव रक्त के 10 मिलीलीटर मिक्स और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। इस ऊष्मायन के दौरान एरिथ्रोसाइट्स तलछट जाएगा।
    2. 10 मिलीलीटर सूक्रोज 1.077 ग्राम / मिलीलीटर के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene ट्यूब को तैयार है और धीरे-धीरे 1.077 ग्राम / मिलीलीटर सूक्रोज परत (चित्रा 4C) के शीर्ष पर ल्युकोसैट युक्त सतह पर तैरनेवाला परत।
    3. ब्रेक के बिना आरटी पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल (HDN) गोली में दिखाई देगा। कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN) 1.077 ग्राम / मिलीलीटर सूक्रोज परत और प्लाज्मा (चित्रा 4D) के बीच इंटरफेस में monocytes और लिम्फोसाइटों के साथ सह-शुद्ध।
    4. 10 मिलीलीटर 0 में न्यूट्रोफिल Resuspend।30 सेकंड के लिए 2% NaCl contaminating एरिथ्रोसाइट्स lyse, और 1.6% NaCl के 10 मिलीलीटर जोड़कर isotonicity बहाल करने और एक बार पलटना।
    5. अपकेंद्रित्र 5 आरटी पर 160 XG पर मिनट, और 20 मिलीलीटर हैंक्स 'संतुलित नमक के घोल में तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के बाद अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
    6. न्यूट्रोफिल गणना और मिलीलीटर या वांछित के रूप में 2 एक्स 10 6 न्यूट्रोफिल / पर 2% FBS के साथ पूरक RPMI-1640 में कोशिकाओं resuspend।

चुंबकीय मोती का उपयोग रक्त न्यूट्रोफिल 3. संवर्धन

  1. सकारात्मक चयन
    1. एक heparinized सिरिंज के साथ, प्रोटोकॉल 1.8 में वर्णित के रूप में एक माउस से रक्त के 1 मिलीलीटर ले लो।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रक्त अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate या आगे के अध्ययन के लिए रक्त प्लाज्मा रहते हैं।
    4. Lyse 8 मिलीलीटर एचपीएलसी ग्रेड पानी में कोशिकाओं resuspending द्वारा एरिथ्रोसाइट्स। 30 सेकंड के बाद 5x conce के 2 मिलीलीटर जोड़कर isotonicity बहालntrated पीबीएस 2.5% BSA युक्त। कोशिकाओं की गणना।
    5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    6. 0.5% BSA और 10 8 कोशिकाओं के अनुसार 2 मिमी EDTA युक्त 200 μl पीबीएस में सेल गोली Resuspend।
    7. Biotinylated विरोधी Ly6G एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और नहीं है (बर्फ पर) फ्रिज में 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. ठंड पीबीएस 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA युक्त 150 μl जोड़ें।
    9. भंवर विरोधी बायोटिन लेपित चुंबकीय microbead शेयर समाधान। सेल निलंबन के लिए 100 μl स्थानांतरण। अच्छी तरह मिक्स और नहीं है (बर्फ पर) फ्रिज में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    10. 10 मिलीलीटर पीबीएस आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA, और अपकेंद्रित्र युक्त जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
    11. 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA युक्त 500 μl ठंड पीबीएस में महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला, और resuspend।
    12. एक चुंबकीय स्टैंड से जुड़ा हुआ है कि एक चुंबक धारक में एक चुंबकीय जुदाई स्तंभ डालें, और 500 μl ठंड पीबीएस 0 को रोकने के साथ यह कुल्ला।5% BSA और 2 मिमी EDTA।
    13. स्तंभ पर सेल निलंबन लागू करें। प्रवाह के माध्यम से unlabeled LyG6 नकारात्मक सेल शामिल हैं।
    14. 500 μl पीबीएस 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA को रोकने के साथ स्तंभ धो लें। अतिरिक्त unlabeled कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाह में होगा।
    15. एक और 500 μl पीबीएस 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA को रोकने के साथ कपड़े धोने चरण को दोहराएँ।
    16. चुंबक से स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब पर जगह है। पीबीएस 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA युक्त के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और मजबूती स्तंभ में सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल की कोशिकाओं को बाहर निकलवाने। प्रवाह के माध्यम से Ly6G + न्यूट्रोफिल गये हैं।
  2. नकारात्मक चयन
    1. चरणों 3.1.5 के लिए 3.1.1 के अनुसार रक्त ल्यूकोसाइट्स तैयार करें।
    2. Resuspend एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब में 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA युक्त 1 मिलीलीटर पीबीएस में 1 एक्स 10 8 कोशिकाओं।
    3. 50 μl सामान्य चूहे सीरम जोड़ें।
    4. न्यूट्रोफिल संवर्धन सी के 50 μl जोड़ेंocktail (गैर न्यूट्रोफिल सफेद रक्त कोशिकाओं के लिए विशिष्ट biotinylated एंटीबॉडी युक्त), मिश्रण अच्छी तरह से और फ्रिज में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. 4 जोड़ने मिलीलीटर पीबीएस 10 मिनट के लिए 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA, और सेंट्रीफ्यूज 400 XG युक्त द्वारा कोशिकाओं को धो लें।
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीलीटर पीबीएस 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA युक्त कोशिकाओं resuspend।
    7. बायोटिन और dextran के खिलाफ निर्देशित tetrameric एंटीबॉडी परिसरों के 50 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और फ्रिज में 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. सेल निलंबन के लिए 150 μl जोड़ने से पहले dextran लेपित चुंबकीय मोती युक्त भंवर अच्छी तरह से ट्यूब। अच्छी तरह मिक्स और फ्रिज में 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    9. पीबीएस 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA युक्त जोड़कर 2.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए सेल निलंबन लाओ। एक समरूप सेल निलंबन पाने के लिए धीरे मिलाएं।
    10. चुंबक में (कैप) के बिना ट्यूब डालें, और 3 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
    11. निरंतर एक में ट्यूब के साथ चुंबक उलटेंगति तरल पदार्थ में अपार कोशिकाओं को एक नया ट्यूब को हस्तांतरित किया जाएगा कि इस तरह के। 2 के लिए उल्टे चुंबक और ट्यूब छोड़ दो - 3 सेकंड, तो ईमानदार स्थिति में लौटने। अनबाउंड न्यूट्रोफिल हस्तांतरित तरल पदार्थ में होगा, जबकि चुंबकीय लेबल अवांछित कोशिकाओं, मूल ट्यूब की दीवार के लिए बाध्य रहेगा।

न्यूट्रोफिल 4. कोशिकाविज्ञान धुंधला

  1. 50 μl पीबीएस में 1x10 5 न्यूट्रोफिल Resuspend और इस तरह एक Cytospin के रूप में एक पतली परत सेल तैयार एडाप्टर के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 150 XG पर अनुकूलक अपकेंद्रित्र। एडाप्टर से पूर्व लेबल गिलास स्लाइड अलग करें।
  2. 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में कांच स्लाइड सूई से कोशिकाओं को ठीक करें। अनुकूलक (कदम 4.1 देखें) से तैयारियाँ धुंधला से पहले आरटी पर सूखे की अनुमति दें। आसुत जल में 6 बार - स्लाइड 5 डुबकी।
  3. मेयर का Hematoxylin समाधान में 2 मिनट - 1 दाग। नल के पानी में 1 मिनट कुल्ला। Eosin वाई समाधान में 10 सेकंड के दाग । नल के पानी में धो लें। इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने में स्लाइड (70%, 96% और 100%) rinsing द्वारा निर्जलीकरण। शीघ्र ही गिलास स्लाइड हवा शुष्क करते हैं और एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे स्लाइड का निरीक्षण किया।
    नोट: eosin गुलाबी है और nonspecifically प्रोटीन दाग जबकि Hematoxylin, एक गहरे नीले-बैंगनी रंग और धब्बे न्यूक्लिक एसिड होता है। न्यूट्रोफिल के cytoplasmic कणिकाओं 'तटस्थ होने के लिए प्यार' नाम के लिए मूल है, जो अम्लीय या बुनियादी रंजक, द्वारा बेदाग रहते हैं। Hematoxylin और eosin और eosinophilc साथ basophilic granulocytes दाग ​​गहरे नीले रंग लाल उज्ज्वल granulocytes जबकि, न्यूट्रोफिल तटस्थ गुलाबी (चित्रा 1 ए देखें) दिखाई देते हैं। 5 पालियों 'खंडों न्यूट्रोफिल' (चित्रा 1 ए और 1 सी) - परिपक्व न्यूट्रोफिल 2 के साथ बड़ी सामान्य रूप में है, जो एक polymorphonuclear नाभिक, की विशेषता है। अपरिपक्व न्यूट्रोफिल एक-lobed घुमावदार या अंगूठी के आकार का नाभिक (चित्रा 1 बी) की विशेषता है।
ve_title "> 5। फ्लो द्वारा न्यूट्रोफिल की पवित्रता का निर्धारण।

  1. FACS बफर के 100 μl (पीबीएस 0.5% बीएसए, 2 मिमी EDTA और 0.02% नेन 3 युक्त) में 1x10 6 कोशिकाओं Resuspend। धुंधला (3.1.5 के लिए 3.1.1 कदम) से पहले पूरे रक्त के नमूने लिए, रक्तापघटन आवश्यक है। 5 मिनट के लिए FCR अवरुद्ध अभिकर्मक के 10 μl जोड़ें।
  2. , मानव न्यूट्रोफिल के लिए माउस न्यूट्रोफिल के लिए या CD11b और CD66b को Ly-6G को एक विशिष्टता के साथ फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के 0.5 माइक्रोग्राम जोड़ें मिश्रण अच्छी तरह से और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पीबीएस 0.5% BSA और 2 मिमी EDTA को रोकने के साथ 500 μl के लिए मात्रा समायोजित करें और फ्लो द्वारा धुंधला विश्लेषण करते हैं।

Vivo में 6. पालन न्यूट्रोफिल गेट

  1. Neutrophils के विवो BrdU लेबलिंग में
    1. ट्यूमर असर चूहों को intraperitoneally बाँझ पीबीएस में एक 10 मिलीग्राम / एमएल bromodeoxyuridine (BrdU) समाधान के 100 μl इंजेक्षन।
    2. रक्त न्यूट्रोफिल 48 बजे के बाद इंजेक्शन एक पृथकप्रोटोकॉल 2.1 ccording। दाग एक BrdU के प्रवाह किट का उपयोग कर न्यूट्रोफिल BrdU के लेबल।
  2. Neutrophils के CFSE लेबलिंग
    1. पूर्व गर्म पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 10 7 न्यूट्रोफिल Resuspend।
    2. 10 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए निलंबित कर दिया न्यूट्रोफिल करने के लिए एक 5 मिमी CFSE शेयर समाधान के 2 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 1 मिलीलीटर DMSO में 5 मिमी CFSE 2.8 CFSE की मिलीग्राम (Carboxyfluorescein Diacetate, succinimidyl एस्टर - -) 5 (और 6) भंग करके तैयार किया जाता है। -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में बाँझ 200 μl ट्यूब और दुकान में 10 μl aliquots में विभाजित करते हैं।
    3. 10% FBS युक्त RPMI-1640 के एक बराबर मात्रा जोड़कर अतिरिक्त CFSE बेअसर। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर न्यूट्रोफिल अपकेंद्रित्र। 10% FBS युक्त RPMI-1640 के 10 एमएल में दो बार न्यूट्रोफिल धो लें।
    4. पीबीएस के एक उचित मात्रा में 10 मिनट और resuspend के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। न्यूट्रोफिल (उदाहरण के लिए, 1 10 x 7

7 में इन विट्रो luciferase परख पृथक न्यूट्रोफिल की विरोधी ट्यूमर गतिविधि पर नजर रखने के लिए।

  1. प्रोटोकॉल 1.1-1.5 में 4T1 कोशिकाओं के लिए के रूप में वर्णित luciferase लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को खेती के लिए, लेकिन 2% FBS के साथ पूरक अनुकूलित कम सीरम माध्यम में ट्रिप्सिन-अलग कोशिकाओं resuspend। मिलीलीटर प्रति 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं को सेल घनत्व को समायोजित करें।
  2. 100 μl में बीज 5,000 luciferase लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को एक सफेद 96 फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति में अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 0.5% FBS युक्त कम सीरम मध्यम अनुकूलित।
  3. 4 बजे ट्यूमर कोशिकाओं को बोने के बाद, 0.5% FBS युक्त कम सीरम मध्यम अनुकूलित 50 μl में 1 एक्स 10 5 न्यूट्रोफिल जोड़ने के लिए, और / एन ओ सेते हैं। 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व के साथ एक न्युट्रोफिल सेल निलंबन तैयार करें। नियंत्रण कुओं न्यूट्रोफिल बिना 50 μl मध्यम मिलना चाहिए। करप्रत्येक प्रयोगात्मक सेटिंग के कई दोहराता है।
  4. निम्नलिखित सुबह, धीरे सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और 200 μl पीबीएस के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धोने। पीबीएस Aspirate और निष्क्रिय lysis बफर के 50 μl जोड़ें। (जैसे एटी-3 कोशिकाओं के रूप में) आसानी से detaching कोशिकाओं के लिए, पीबीएस में धो नहीं है और मध्यम विकास aspirating के तुरंत बाद सेल संस्कृति lysis बफर जोड़ें।
  5. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट कवर और आरटी पर 20 मिनट के लिए 150 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर यह सेते हैं।
  6. एक luminescence प्लेट रीडर में प्लेट रखें। अच्छी तरह से वार 50 μl luciferase परख समाधान इंजेक्षन, और अच्छी तरह से प्रति 10 सेकंड के लिए chemiluminescence पढ़ें।
  7. निम्नलिखित सूत्र द्वारा% ट्यूमर सेल की गणना:% ट्यूमर सेल = (1- [न्यूट्रोफिल साथ नमूनों की luminescence] / [मध्यम में नमूनों की luminescence]) 100% एक्स।

नोट: प्रोटोकॉल 8.1 में वर्णित के रूप में मेटास्टैटिक बोने के लिए neutrophils के योगदान का आकलन करने के लिए, न्यूट्रोफिल समाप्त हो सकता है। प्रभावी depl के लिएetion 7 दिन के बाद ट्यूमर engraftment पर शुरू न्यूट्रोफिल घट एंटीबॉडी प्रशासन।

एक स्तन कैंसर के माउस मॉडल में न्यूट्रोफिल 8. विरोधी मेटास्टैटिक गतिविधि।

  1. Neutrophils के विवो रिक्तीकरण में।
    1. हौसले माउस प्रति 100 μl के अंतिम मात्रा में खारा में चूहे विरोधी Ly6G एंटीबॉडी की 12.5 माइक्रोग्राम (न्यूट्रोफिल घट एंटीबॉडी) या चूहा निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी की (आईजीजी 2A, Κ) तैयार करते हैं।
    2. 3 दिन के बाद ट्यूमर engraftment पर शुरू दैनिक 12.5 माइक्रोग्राम चूहा विरोधी Ly6G एंटीबॉडी (100 μl) की intraperitoneal खुराक इंजेक्षन। नियंत्रण के साथ चूहों या 12.5 माइक्रोग्राम (100 μl) चूहा निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी (आईजीजी 2A, Κ) इंजेक्षन।
    3. 4T1 ट्यूमर बढ़ता है जब न्यूट्रोफिल उत्पादन दर में नाटकीय रूप से बढ़ जाती है के रूप में दिन में 14 पर शुरू, दो बार, दैनिक एंटीबॉडी प्रशासन।
    4. पार्श्व पूंछ-नस nicking द्वारा - (3 बूँदें 2) हर दूसरे दिन, एक खून का नमूना प्राप्त करते हैं। एक विरोधी में रक्त एकत्र-coagulant युक्त ट्यूब (हेपरिन, साइट्रेट या EDTA)।
    5. प्रोटोकॉल 5 में वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry का उपयोग न्यूट्रोफिल कमी की जाँच करें।
  2. ट्यूमर निराकरण टेस्ट (Winn परख संशोधित)
    1. ट्यूमर असर चूहों से न्यूट्रोफिल पृथक। 1 एक्स 10 6 ट्यूमर कोशिकाओं और 3 एक्स 10 6 न्यूट्रोफिल (माउस के अनुसार) 50 μl खारा में मिलाएं।
    2. 8 सप्ताह पुराने भोले BALB / ग चूहों - subcutaneously 6 की ओर करने के लिए कोशिकाओं इंजेक्षन। ट्यूमर के आकार की सही माप की अनुमति देने के ट्यूमर engraftment करने के लिए पूर्व दिशा दाढ़ी। 5 दिन के बाद engraftment पर ट्यूमर का आकार दैनिक प्रारंभिक उपाय।
  3. न्यूट्रोफिल दत्तक हस्तांतरण
    1. पूंछ नस के लिए 200 μl पीबीएस में 2 एक्स 10 4 luciferase व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन।
    2. न्यूट्रोफिल स्थानांतरण ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद 4 बजे किया जाना चाहिए। इसलिए, लगभग 2 बजे की योजना बनाई में उनके पहले ट्यूमर असर चूहों (प्रोटोकॉल 2.1) से HDN की शुद्धि शुरूविवो हस्तांतरण। 2.5 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में पीबीएस में न्यूट्रोफिल Resuspend।
    3. ट्यूमर कोशिकाओं को शुरू करने के बाद 4 बजे 5 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे चूहों जगह है। एक restrainer में चूहों प्लेस और पूंछ नस के माध्यम से 5 एक्स 10 6 HDN (200 μl) इंजेक्षन। नियंत्रण चूहों वाहन (पीबीएस) के साथ इंजेक्ट कर रहे हैं।
    4. Vivo इमेजिंग प्रणाली में या immunohistochemistry द्वारा एक bioluminescence का उपयोग करके विभिन्न समय बिंदुओं पर फेफड़ों मेटास्टेसिस के गठन की निगरानी करें।
  4. फेफड़े मेटास्टैटिक बोने परख
    1. 1 प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में orthotopically बाईं वंक्षण स्तन वसा पैड में 1 एक्स 10 6 पैतृक 4T1 कोशिकाओं - 0.5 इंजेक्षन।
    2. 10 दिन पर, 5 एक्स 10 5 सेल / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में पीबीएस में GFP व्यक्त 4T1 कोशिकाओं resuspend। 5 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे चूहों रखें।
    3. एक restrainer में चूहों प्लेस और 4T को नसों के 1x10 5 GFP- व्यक्त 4T1 कोशिकाओं (200 μl) इंजेक्षन1 ट्यूमर असर चूहों या भोले चूहों।
    4. अगले दिन, चूहों euthanize और शेष लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए 20 मिलीलीटर पीबीएस के साथ फेफड़ों छिड़कना।
    5. Immunohistochemistry द्वारा GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए फेफड़ों आबकारी।
      नोट: प्रोटोकॉल 8.1 में वर्णित के रूप में मेटास्टैटिक बोने के लिए neutrophils के योगदान का आकलन करने के लिए, न्यूट्रोफिल समाप्त हो सकता है। प्रभावी कमी के लिए 7 दिन के बाद ट्यूमर engraftment पर शुरू न्यूट्रोफिल घट एंटीबॉडी प्रशासन।

ट्यूमर असर चूहों से न्यूट्रोफिल द्वारा टी सेल प्रसार 9. दमन।

  1. 10 मिलीलीटर पीबीएस में एक euthanized भोले BALB / ग माउस और जगह से तिल्ली निकालें।
  2. RPMI-1640 के साथ भरा एक पेट्री डिश पर फिट है कि एक 40 माइक्रोन सेल झरनी पर तिल्ली रखें। कोशिकाओं पेट्री डिश में झरनी के माध्यम से सिरिंज के सवार अंत का उपयोग करना, तिल्ली सानी। 5 मिलीलीटर RPMI के साथ सेल झरनी कुल्ला। झरनी त्यागें।
  3. 10 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र 400 XG में resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 20 सेकंड के लिए शुद्ध पानी की 36 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित द्वारा एरिथ्रोसाइट्स lyse, और जोड़कर isotonicity को समायोजित 4 पीबीएस के मिलीलीटर एक्स 10 वैकल्पिक रूप से, एरिथ्रोसाइट के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं निलंबित द्वारा एरिथ्रोसाइट्स lyse केंद्रित बफर (एसीके) lysing, और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। RPMI-1640 के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर एसीके बेअसर। आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। 5 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend और कोशिकाओं की गिनती।
  5. 15 मिलीलीटर ट्यूब में 4 × 10 7 कोशिकाओं / 2 मिलीलीटर की एक अंतिम घनत्व पीबीएस में splenocytes Resuspend। पीबीएस में 2.5 माइक्रोन CFSE समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें। जल्दी ट्यूब पलटना और प्रकाश से सुरक्षित सामयिक मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस (हर 2 मिनट) पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. पूर्व गर्म एफ बी एस (100%) के 4 मिलीलीटर जोड़कर अतिरिक्त CFSE बुझा लेते हैं और आरटी पर 1 मिनट के लिए सेते हैं। 10 के लिए 400 XG पर पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के 3 मिलीलीटर जोड़ेंमि।
  7. 10 मिनट के लिए 400 XG पर 30 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं, और अपकेंद्रित्र धो लें।
  8. एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर और पीबीएस के साथ फिर से धो लें।
  9. 2 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम घनत्व 10% FBS के साथ पूरक RPMI-1640 मध्यम में कोशिकाओं Resuspend।
  10. बीज 2 एक्स 10 6 / अच्छी तरह से (200 μl) 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में।
  11. 10% FBS के साथ 500 μl RPMI-1640 में शुद्ध अर्मेनियाई हैम्स्टर विरोधी माउस CD3ε एंटीबॉडी के 1 माइक्रोग्राम जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित।
  12. CFSE लेबल splenocytes करने के लिए 10% FBS के साथ 300 μl RPMI-1640 में 2 एक्स 10 6 HDN या LDN जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए सेते हैं। न्यूट्रोफिल बिना वेल्स 300 μl मध्यम मिलना चाहिए। प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा 1 मिलीग्राम होना चाहिए।
  13. कोशिकाओं को ले लीजिए और फ्लो के लिए उन्हें तैयार करते हैं। 100 μl FACS बफर (प्रोटोकॉल) 5 में कोशिकाओं Resuspend, और FCR अवरुद्ध अभिकर्मक के 10 μl जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  14. जोड़ें 1 &# 956; एपीसी संयुग्मित विरोधी CD8α एंटीबॉडी के एल और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  15. फ्लो (चित्रा 5) द्वारा CD8 + टी कोशिकाओं पर CFSE प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण। CFSE तीव्रता प्रत्येक कोशिका विभाजन पर आधी है। इस प्रकार, सेल डिवीजनों की संख्या CFSE धुंधला की तीव्रता के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

10 न्यूट्रोफिल प्रवासन परख

  1. कम सीरम मध्यम एक 25 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में 0.5% FBS के साथ पूरक और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 बजे सेते अनुकूलित 7 मिलीलीटर में बीज 5x10 5 4T1 कोशिकाओं।
  2. 5 माइक्रोन का एक छेद के आकार के साथ एक प्रवास प्लेट के नीचे चैम्बर के लिए सतह पर तैरनेवाला के 800 μl स्थानांतरण।
  3. Resuspend 0.5% FBS के साथ पूरक अनुकूलित कम सीरम माध्यम के 400 μl में 2 एक्स 10 5 न्यूट्रोफिल। शीर्ष चैम्बर के लिए सेल निलंबन लागू करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  4. ऊष्मायन के अंत में, शीर्ष चैम्बर को हटाने औरनीचे चैम्बर के लिए स्थानांतरित किया है कि न्यूट्रोफिल की संख्या गिनती।

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की 11. निगरानी न्यूट्रोफिल उत्पादन (आरओएस)।

  1. फिनोल लाल के बिना हांक संतुलित नमक के घोल में 1.1 एक्स 10 6 न्यूट्रोफिल / एमएल तैयार करें। प्लेट एक सफेद 96 फ्लैट नीचे अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 2 एक्स 10 5 न्यूट्रोफिल युक्त 180 μl।
  2. एक luminescence प्लेट रीडर में प्लेट रखें। 50 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पीबीएस में एक 500 माइक्रोन Luminol समाधान के 20 μl जोड़ें। 10 सेकंड के अंतराल के साथ 5 मिनट के समय के पाठ्यक्रम में 1sec के लिए बेसल chemiluminescence पढ़ें।
  3. (10 माइक्रोन की एकाग्रता में 10 एनएम या 100 एनएम या fMLP की एकाग्रता में जैसे, पीएमए) एक उत्तेजक जोड़ें। लाल फिनोल के बिना हांक संतुलित नमक के घोल में एक एजेंट के एक 10x केंद्रित समाधान तैयार है और संबंधित कुओं 22 μl जोड़ें। नियंत्रित करने के लिए कुओं 22 μl वाहन जोड़ें।
  4. Measuप्लेट रीडर में chemiluminescence रहे हैं। एक छोटी (5 मिनट के लिए हर 10 सेकंड) और एक लंबे समय के पाठ्यक्रम (1 घंटे के लिए हर मिनट) दोनों करते हैं।

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Representative Results

हाल ही में एक अध्ययन में हम न्यूट्रोफिल 6 के लिए एक विरोधी मेटास्टैटिक समारोह की पहचान की। ट्यूमर असर चूहों से न्यूट्रोफिल एक साइटोटोक्सिक phenotype के अधिग्रहण और ट्यूमर कोशिकाओं 6 मारने की क्षमता है। यह कोई महत्वपूर्ण विरोधी ट्यूमर प्रभाव 6 है कि भोले चूहों से न्यूट्रोफिल के विपरीत है। नयाचार अनुभाग में वर्णित तकनीकों के कई इन विट्रो में और vivo 6 में विरोधी ट्यूमर न्यूट्रोफिल समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

ट्यूमर साइटोटोक्सिक न्यूट्रोफिल ट्यूमर असर चूहों 6 से प्राप्त किया जा सकता है। इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, चूहों orthotopically बाईं वंक्षण स्तन वसा पैड में 4T1 कोशिकाओं (1 प्रोटोकॉल) के साथ इंजेक्शन थे। 2 सेमी 3 (चित्रा 3 - - ट्यूमर निचले बाएँ पेट में स्पष्ट है) 21 दिन के बाद ट्यूमर टीका करके, प्राथमिक ट्यूमर 1 के आकार पर पहुंच गया। इस समय, चूहों euthanized थे और 1 मिलीलीटर रक्त (माउस के अनुसार) तैयार की गई थीहृदय पंचर (चित्रा 3) से। समानांतर में, एक भोले, गैर ट्यूमर असर माउस से रक्त तैयार की गई थी। HDN तो न्यूट्रोफिल की एक अत्यधिक शुद्ध (> 98%) जनसंख्या उपज के लिए एक घनत्व ढाल पर (प्रोटोकॉल 2.1 और चित्रा 4) के शुद्ध थे। न्यूट्रोफिल व्यवहार्यता Trypan ब्लू धुंधला (प्रोटोकॉल 2.1) द्वारा निर्धारित किया गया था। न्यूट्रोफिल तो 2 एक्स 10 6 न्यूट्रोफिल / एमएल में 0.5% FBS युक्त अनुकूलित कम सीरम माध्यम में resuspended थे।

न्यूट्रोफिल cytotoxicity की हद तक परीक्षण करने के लिए, हम 96 में एक फ्लैट नीचे सफेद में 4T1 लक्ष्य कोशिकाओं (5,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 100 μl में) व्यक्त luciferase करने के लिए (एक 2 x 10 6 न्यूट्रोफिल / एमएल शेयर समाधान से 50 μl) 10 5 न्यूट्रोफिल जोड़ा -well प्लेट (प्रोटोकॉल 7)। एक हे / एन ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं पीबीएस में धोया गया और निष्क्रिय सेल बफर में lysed और प्रत्येक नमूने में luciferase गतिविधि न्यूट्रोफिल cytotoxicity की हद (मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किया गया था (चित्रा 2B ट्यूमर कोशिकाओं की दिशा में कोई cytotoxicity दिखा पाया कि इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का उपयोग एक की हत्या% = 0 है, जहां अलग अलग परिस्थितियों में मारे गए कोशिकाओं के% के रूप में प्रस्तुत किया जाता है ट्यूमर मुक्त), न्यूट्रोफिल ट्यूमर असर चूहों से शुद्ध महत्वपूर्ण cytotoxicity (चित्रा 2B, ट्यूमर असर) दिखा।

LDN और HDN में प्रतिरक्षा दमनकारी गुणों का परीक्षण करने के लिए हम (प्रोटोकॉल 9) टी-सेल प्रसार परख का इस्तेमाल किया। हम का मूल्यांकनLDN की उपस्थिति में या HDN की उपस्थिति (चित्रा 5 ए-डी) में सुसंस्कृत थे कि सीडी 8 + सुसंस्कृत अकेले थे जो अनुपचारित splenocytes में और एक αCD3 एंटीबॉडी के साथ इलाज किया splenocytes में कोशिकाओं, और कोशिकाओं की संख्या। विरोधी CD3 उत्तेजना निम्नलिखित सीडी 8 + CFSE + कोशिकाओं में नाटकीय वृद्धि नोट दमनकारी की नाटकीय निरोधात्मक प्रभाव (ऊपरी सही में पैनल और बी तुलना) LDN (बी और सी में ऊपरी सही पैनल तुलना) और HDN की निरोधात्मक प्रभाव की कमी (पैनल डी)। हम यह भी प्रसार के लिए एक संकेत के रूप में, CFSE प्रतिधारण की हद तक मूल्यांकन किया है। चित्रा 5E में, नारंगी वक्र α के साथ प्रेरित अनुपचारित सीडी 8 + कोशिकाओं, αCD3 एंटीबॉडी के साथ इलाज नीले रंग की अवस्था सीडी 8 + कोशिकाओं, सीडी 8 + कोशिकाओं LDN और हरे रंग की वक्र की उपस्थिति में αCD3 के साथ प्रेरित लाल वक्र का प्रतिनिधित्व करता है सीडी 8 + कोशिकाओं को प्रस्तुत करता है; HDN की उपस्थिति में CD3। ΑCD3 इलाज कोशिकाओं में बाई ओर शिफ्ट (नीला वक्र) और αCD3 सीडी 8 + सेल प्रसार से संकेत मिलता है जो HDN (हरी वक्र) के साथ संवर्धित कोशिकाओं का इलाज ध्यान दें।

चित्र 1
चित्रा 1. न्यूट्रोफिल आकृति विज्ञान। पतली परत सेल तैयारी निम्नलिखित hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग उच्च घनत्व (ए) और कम घनत्व न्यूट्रोफिल (बी) की लाइट माइक्रोस्कोपी छवि। (सी) एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) छवि एक उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल की। बार 1,000 एनएम का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. रक्त न्युट्रोफिल मायने रखता ट्यूमर पी के साथ वृद्धिrogression और न्यूट्रोफिल एक साइटोटोक्सिक phenotype के अधिग्रहण। (ए) 1 मिलीलीटर प्रति परिसंचारी न्यूट्रोफिल संख्या BALB / ग चूहों में ट्यूमर सेल टीका निम्नलिखित विभिन्न दिनों में FACS द्वारा गिना गया। की संख्या परिसंचारी CD11b + Ly6G + न्यूट्रोफिल लगातार 4T1 ट्यूमर प्रगति के साथ बढ़ जाती है। (बी) 4T1 स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं या तो भोले चूहों से उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल (ट्यूमर) मुक्त या 4T1 ट्यूमर असर चूहों (ट्यूमर असर) चूहों, या incubated के साथ सह-सुसंस्कृत थे न्यूट्रोफिल की अनुपस्थिति (जारी।) 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए मध्यम में। ट्यूमर असर चूहों के लिए न्यूट्रोफिल, लेकिन नहीं ट्यूमर मुक्त चूहों से, 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं की दिशा में महत्वपूर्ण cytotoxicity दिखा। त्रुटि सलाखों के एक छात्र की टी परीक्षण का उपयोग ± SEM के ** पी <0.01 प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हृदय पंचर के माध्यम से murine रक्त का संग्रह 3. चित्रा। माउस धीमी गति से सीओ 2 के प्रवाह के तहत एक प्रेरण कक्ष में euthanized किया गया था। माउस अपने टर्मिनल सांस ले लिया है के तुरंत बाद, यह अपनी पीठ पर रखी है और 1 मिलीलीटर heparinized सिरिंज दिल तक पहुँचने तक उरोस्थि के आधार पर डाला जाता है। धीरे धीरे खून महाप्राण करने के लिए सवार पर खींच। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
पूरे रक्त से 4. न्यूट्रोफिल शुद्धि चित्रा। (ए) 1.077 के 3 मिलीग्राम / छ मिलीलीटर सूक्रोज ध्यान से एक असंतत ढाल के लिए फार्म 3 मिलीग्राम 1.119 ग्राम / मिलीलीटर सुक्रोज के शीर्ष पर स्तरित है। 6 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए पीबीएस बीएसए (0.5%) में पतला पूरे murine रक्त, 1.07 की चोटी पर फिर स्तरों पर होती है7 ग्राम / मिलीलीटर सुक्रोज (ख) नहीं तोड़ने के साथ 700 XG पर एक 30 मिनट स्पिन के बाद, 3 अलग भिन्नों मनाया जा सकता है। आर - गोली, जी में लाल रक्त कोशिकाओं - उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल, एम युक्त granulocytic अंश -। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं और कम घनत्व न्यूट्रोफिल युक्त मोनोन्यूक्लियर अंश (सी) हौसले से तैयार की गई मानव रक्त Dextran 500 (के एक बराबर मात्रा के साथ मिलाया जाता है 3%) और 30 मिनट के लिए आरटी पर incubated। । सफेद रक्त कोशिकाओं (Buffy कोट) युक्त शीर्ष अंश तो / एमएल सूक्रोज कोई तोड़ने के साथ 400 XG पर एक 30 मिनट स्पिन के बाद (डी), 2 अलग भिन्नों देखा जा सकता है जी 10 मिलीलीटर 1.077 के शीर्ष पर स्तरित है; आर + जी - लाल रक्त कोशिकाओं और उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल, एम युक्त गोली -। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं और कम घनत्व न्यूट्रोफिल युक्त मोनोन्यूक्लियर अंश इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5
टी सेल प्रसार की चित्रा 5. दमन। प्रवाह cytometry अनुपस्थिति (बी) या LDN की उपस्थिति में αCD3 एंटीबॉडी के साथ उत्तेजना के बाद, उत्तेजना (ए) के अभाव में सुसंस्कृत CFSE लेबल सीडी 8 + कोशिकाओं की संख्या दिखा विश्लेषण करती है (सी) या HDN (डी) पैनलों एक से सीडी 8 + कोशिकाओं में CFSE तीव्रता (ई) हिस्टोग्राम प्रस्तुति -। डी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

न्यूट्रोफिल सभी सफेद रक्त कोशिकाओं के सबसे प्रचुर मात्रा में हैं और संक्रमण और सूजन के मामलों में पहले responders हैं। जैसे, वे बाहरी संकेतों को अत्यधिक संवेदनशील होते हैं और आसानी से सक्रिय कर रहे हैं। इसके अलावा, न्यूट्रोफिल एक बहुत ही कम आधा जीवन और एक तेजी से कारोबार है। साथ में, इन विशेषताओं अद्वितीय प्रयोगात्मक रणनीतियों के लिए आवश्यक हैं कि इस तरह के न्यूट्रोफिल, साथ काम करने में कई कठिनाइयों का बढ़ा। उदाहरण के लिए, कई न्यूट्रोफिल शुद्धि रणनीतियों अपने स्वयं के पेशेवरों और विपक्ष के साथ प्रत्येक रहे हैं।

न्यूट्रोफिल के साथ काम करने में एक महत्वपूर्ण कदम पूरे रक्त से उनकी शुद्धि है। न्यूट्रोफिल कुशलता घनत्व ढ़ाल या प्रतिरक्षी आधारित रणनीतियों (सकारात्मक या नकारात्मक चयन) का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है। यह कम से कम गैर विशिष्ट सक्रियण के साथ उच्च शुद्ध न्यूट्रोफिल की उच्च संख्या पैदावार के बाद से पसंद की हमारी विधि घनत्व ढ़ाल का इस्तेमाल होता है। हालांकि, हम हाल ही में एक अध्ययन में 21 में दिखाने के लिए, बुद्धिएच ट्यूमर प्रगति न्यूट्रोफिल मोनोन्यूक्लियर कम घनत्व अंश में उच्च संख्या में जमा हो। एक घनत्व ढाल के उपयोग के एक अत्यधिक शुद्ध उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल अंश प्रदान करता है इन शर्तों के तहत, कि पूरे परिसंचारी न्यूट्रोफिल प्रदर्शनों की सूची, और भारी अन्य मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (लिम्फोसाइटों और monocytes) के साथ दूषित है कि एक कम घनत्व न्यूट्रोफिल अंश का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। इन परिस्थितियों में पसंद की विधि एक एंटीबॉडी आधारित शुद्धि, अधिमानतः नकारात्मक चयन है। न्यूट्रोफिल शुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग अत्यधिक शुद्ध न्यूट्रोफिल पैदावार और बेहतर पूरे परिसंचारी न्यूट्रोफिल प्रदर्शनों की सूची का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, हम न्यूट्रोफिल एंटीबॉडी, गैर विशिष्ट सक्रियण वृद्धि के लिए संभावना के साथ incubated रहे हैं कि अब देखा। इसलिए हम सबसे अच्छा परिणाम के लिए, एंटीबॉडी आधारित न्यूट्रोफिल शुद्धि संभव के रूप में जल्दी के रूप में किया जाना चाहिए कि सुझाव देते हैं। एंटीबॉडी आधारित न्यूट्रोफिल शुद्धि भी पु जब पसंद की विधि हैऊतकों या ट्यूमर से न्यूट्रोफिल rifying।

भले ही चुना शोधन प्रक्रिया, पवित्रता, व्यवहार्यता और कार्यात्मक अखंडता का कड़ाई से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। न्यूट्रोफिल की पवित्रता न्यूट्रोफिल सतह मार्कर के साथ प्रतिक्रिया करता है कि एंटीबॉडी का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। फेनोटाइप - माउस में, Ly-6G एक CD11b + Ly-6C कम Ly-6G + F4 / 80 की विशेषता है जो न्यूट्रोफिल, के लिए विशिष्ट है। मानव न्यूट्रोफिल Ly-6G के अनुरूप एक मार्कर व्यक्त नहीं करते हैं और अक्सर CD11b, CD15, CD16, और CD66b की अभिव्यक्ति की विशेषता है। न्यूट्रोफिल एफसी रिसेप्टर्स है, इन immunostaining से पहले अवरुद्ध होने की जरूरत है। न्यूट्रोफिल भी एक उच्च एसएससी होने से अन्य श्वेत रक्त कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। व्यवहार्यता शुद्धिकरण की प्रक्रिया के अंत में निर्धारित किया जाना चाहिए, (नीले प्रोटोकॉल 2.1 trypan) और 98% की तुलना में लगातार अधिक से अधिक होना चाहिए। कार्यात्मक अखंडता पुरी द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिएभोले चूहों से neutrophils के fication। ये न्यूट्रोफिल सक्रिय और ट्यूमर कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 7) के साथ एक सह संस्कृति की स्थापना में ट्यूमर entrained न्यूट्रोफिल के लिए गैर-साइटोटोक्सिक नियंत्रण प्रदान नहीं कर रहे हैं।

न्यूट्रोफिल की कम संख्या के साथ मिलकर रक्त न्यूट्रोफिल से कम आधा जीवन (~ 3 - 5 10 5 एक्स) एक भोले 6 के 1 मिलीलीटर रक्त से प्राप्त किया - 8 सप्ताह पुरानी माउस, माउस रक्त न्यूट्रोफिल समारोह का पता लगाने के लिए यह कठिन बना दिया है इन विट्रो। न्यूट्रोफिल संख्या जीर्ण सूजन 7 के एक राज्य का प्रतिनिधित्व करता है जो कैंसर, में तेजी से सूजन के राज्यों में और कभी कभी वृद्धि हुई है। कुछ शोधकर्ताओं ने ऐसे अस्थि मज्जा के रूप में 20 न्यूट्रोफिल के लिए वैकल्पिक स्रोतों को खोजने के लिए कोशिश की है। खारा में एक 1 मिलीग्राम / एमएल Zymosan एक समाधान के 1 एक 3% thioglycollate शोरबा समाधान के मिलीलीटर या 1 मिलीलीटर की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद 24 घंटा - माउस न्यूट्रोफिल के एक उच्च संख्या 4 के भीतर प्राप्त किया जा सकता है। लेकिन इन हासिल न्यूट्रोफिल एक लागू नहीं हैहिन्दी अनुवाद विरोधी tumorigenic गतिविधि (अप्रकाशित अवलोकन)।

। 4 सप्ताह - 40 लाख रक्त न्यूट्रोफिल आसानी से 1 मिलीलीटर रक्त 3 से अलग किया जा सकता है - Granot एट अल 6 BALB / ग चूहों कि इस तरह के 20 समय (2A चित्रा) पर aggravates जो neutrophilia, विकसित माउस 4T1 स्तन कार्सिनोमा के साथ orthotopically टीका कि मनाया बाद के ट्यूमर टीका। ये न्यूट्रोफिल विरोधी ट्यूमर गतिविधियों का अधिग्रहण किया है, और तदनुसार भोले न्यूट्रोफिल (चित्रा 2 बी) से अलग करने के क्रम में, ट्यूमर entrained न्यूट्रोफिल (दस) कहा गया है। उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल (HDN) अत्यधिक विरोधी tumorigenic हैं, कैंसर के संदर्भ में उत्पन्न कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN) 21 नहीं कर रहे हैं। अस्थि मज्जा और ट्यूमर असर चूहों की तिल्ली से उच्च घनत्व न्यूट्रोफिल भी विरोधी ट्यूमर गतिविधि (अप्रकाशित डेटा) है। यह साथ में, ट्यूमर प्रगति के साथ तिल्ली धीरे-धीरे बढ़े (तिल्ली का बढ़ना) हो जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिएन्यूट्रोफिल की मात्रा बढ़ती है।

उनके दत्तक स्थानांतरण निम्नलिखित न्यूट्रोफिल के भाग्य को ट्रैक करने के क्रम में, इन लेबल किया जाना चाहिए। न्यूट्रोफिल 2 दिनों के अलगाव से पहले ट्यूमर असर या भोले चूहों में bromodeoxyuridine (BrdU) इंजेक्शन लगाने के द्वारा vivo में लेबल किया जा सकता है। BrdU कोशिकाओं proliferating में नए संश्लेषित डीएनए में शामिल किया है जो डीएनए अग्रदूत thymidine के अनुरूप है। न्यूट्रोफिल के मामले में, BrdU के परिपक्व बाद mitotic न्यूट्रोफिल में फर्क जब BrdU धुंधला बनाए रखने कि अग्रदूत साबित कोशिकाओं proliferating में शामिल किया जाएगा। निगमित BrdU के विशिष्ट विरोधी BrdU फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग दाग जा सकता है। BrdU + कोशिकाओं तो प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। एक और दृष्टिकोण को ऐसे 5-Carboxyfluorescein एन succinimidyl एस्टर (CFSE) के रूप में एक सेल पर नजर रखने वाली डाई के साथ पृथक न्यूट्रोफिल लेबल करने के लिए है। CFSE व्यवहार्य कोशिका झिल्ली के माध्यम से पारित कर सकते हैं कि एक एस्टर यौगिक है। यह एक एमिनो प्रतिक्रियाशील succinimid हैसेल और कोशिका की सतह में प्रोटीन और अन्य अमीनो समूहों को fluorescein के बंधन सहसंयोजक की ओर जाता है जो YL समूह। CFSE लेबल की कोशिकाओं 488 एनएम आर्गन लेजर का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। दो लेबलिंग तकनीक BrdU लेबलिंग CFSE सभी न्यूट्रोफिल दाग होगा, जबकि लेबल किया जाएगा सब परिसंचारी न्यूट्रोफिल अग्रदूत कोशिकाओं proliferating, और नहीं पर निर्भर करता है कि वास्तव में भिन्न होते हैं। CFSE की जांच हालांकि BrdU लेबलिंग न्यूट्रोफिल रूपांतरण परिपक्व करने के लिए अपरिपक्व पालन करने के लिए एक अच्छा साधन है, BrdU धुंधला की तुलना में अधिक स्पष्ट है।

हम यह भी neutrophils के विरोधी ट्यूमर और विरोधी मेटास्टैटिक समारोह का निर्धारण करने के लिए कई तरीकों का वर्णन किया है। ये न्यूट्रोफिल कमी, न्यूट्रोफिल दत्तक स्थानांतरण, ट्यूमर निराकरण परीक्षण और परख बोने फेफड़ों मेटास्टेसिस शामिल हैं। इन assays के प्रत्येक विरोधी ट्यूमर न्यूट्रोफिल कार्यों का एक विशिष्ट पहलू accomplishes। उदाहरण के लिए, Granot एट अल। 6 रवानगी पर मनायाneutrophils के letion, 4T1 ट्यूमर असर चूहों में फेफड़ों मेटास्टेसिस की संख्या neutrophils के एक विरोधी मेटास्टैटिक भूमिका के लिए सुझाव दे, बढ़ जाती है। न्यूट्रोफिल दत्तक हस्तांतरण पर, ट्यूमर कोशिकाओं को शुद्ध HDN के इंजेक्शन से पहले नसों 4 घंटा इंजेक्ट कर रहे हैं। फेफड़े और यकृत मेटास्टेसिस के लिए फार्म का ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता एक ऑप्टिकल vivo इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए एक समय पाठ्यक्रम अध्ययन में पीछा कर रहे हैं। HDN प्राप्त चूहों पर नियंत्रण चूहों 6 किया था की तुलना में कम मेटास्टैटिक foci दिखाया। ट्यूमर के निराकरण परीक्षण में, ट्यूमर कोशिकाओं HDN की उपस्थिति ट्यूमर के विकास को 21 कम कर देता है, के साथ या बिना HDN subcutaneously इंजेक्ट कर रहे हैं। मेटास्टैटिक बोने परख में, GFP लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को नसों के नियंत्रण या न्यूट्रोफिल समाप्त पूर्व मेटास्टैटिक ट्यूमर असर चूहों में इंजेक्ट कर रहे हैं, और फेफड़ों में बीज के लिए GFP लेबल कोशिकाओं की क्षमता निर्धारित किया जाता है। पूर्व मेटास्टैटिक ट्यूमर असर चूहों के फेफड़ों के ट्यूमर से बचाता है कि उच्च न्युट्रोफिल घुसपैठ की विशेषता हैविशिष्ट अंग 6 में सेल बोने। यह नियंत्रण ट्यूमर असर चूहों के साथ तुलना में न्यूट्रोफिल समाप्त चूहों में अधिक मेटास्टैटिक foci के लिए अनुवाद।

प्रोटोकॉल के कैंसर के संदर्भ में न्यूट्रोफिल समारोह का अध्ययन और इन विट्रो में और vivo में दोनों कैंसर से संबंधित न्यूट्रोफिल गुणों का मूल्यांकन करने के लिए रणनीति प्रदान पर ध्यान केंद्रित करने का वर्णन किया। हालांकि, न्यूट्रोफिल शुद्धि रणनीति के रूप में अच्छी तरह से वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में से कुछ न्यूट्रोफिल एक महत्वपूर्ण भूमिका (यानी, सूजन और संक्रमण) खेलने जहां प्रयोगात्मक सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में न्यूट्रोफिल समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgements

ZG इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 41/11) की मैं-मुख्य कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित है, Abisch-Frenkel फाउंडेशन, Rosetrees ट्रस्ट, इसराइल कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (ICRF - अनुसंधान कैरियर विकास पुरस्कार) और चिंता फाउंडेशन। ZGF इसराइल कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (ICRF - अनुसंधान कैरियर विकास पुरस्कार) से अनुदान द्वारा समर्थित है, स्वास्थ्य के इसराइल मंत्रालय और इसराइल फेफड़े एसोसिएशन के मुख्य वैज्ञानिक।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

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References

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