隔离和中性粒细胞的表征与抗肿瘤性质

1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center
Immunology and Infection

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Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., et al. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

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Abstract

嗜中性粒细胞,最丰富的全白血细胞在人体循环的,起到对入侵微生物的宿主防御中起重要作用。此外,嗜中性粒细胞在肿瘤细胞的免疫监视中心作用​​。他们必须认识到肿瘤细胞,并诱导肿瘤细胞死亡或者通过涉及过氧化氢,或通过抗体依赖性细胞介导的​​细胞毒性(ADCC)的细胞接触依赖性机制的​​能力。嗜中性粒细胞具有抗肿瘤活性可以从癌症患者和荷瘤小鼠的外周血中分离出来。这些嗜中性粒细胞被称为肿瘤夹带的嗜中性粒细胞(TEN)从健康受试者或天真的小鼠表明,没有显著的肿瘤细胞毒活性的嗜中性粒细胞区分开来。与其他的白血细胞相比,嗜中性粒细胞显示出不同的浮力使得当经受密度梯度它可行,得到> 98%纯的嗜中性白细胞群体。然而,除了到正常的高密度嗜中性白细胞群体脱氮(HDN),在癌症患者中,在肿瘤的小鼠,以及下慢性炎性病症,不同的低密度中性粒细胞种群(LDN)出现在循环中。 LDN共纯化的单核组分,并且可以从使用​​正或负选择策略的单核细胞中分离出来。一旦分离嗜中性粒细胞的纯度通过流式细胞术确定的,它们可以被用于在体外体内功能性测定法。我们描述的技术用于监测中性粒细胞的抗肿瘤活性,它们的迁移,并产生活性氧,以及监测其吞噬能力的离体的能力。我们进一步描述的技术来标记的嗜中性粒细胞在体内跟踪,并确定其在体内的抗转移能力。所有这些技术是必不可少的理解如何获得和具有抗肿瘤表征嗜中性粒细胞功能。

Introduction

嗜中性粒细胞被初步定性为它作为对抗入侵微生物的第一道防线的先天免疫细胞。目前已知有中性粒细胞更为深远的功能,被卷入安装适应性免疫反应对抗外来抗原1,2,调节造血3,4血管新生和伤口愈合5。此外,嗜中性粒细胞可影响肿瘤的生长和转移进程凭借自己亲和抗肿瘤活性6,7。嗜中性粒细胞的特征是多态分段核(因此称为多形核(PMN)白细胞)和含有颗粒的至少三个不同的亚类,以及分泌囊泡8( 图1A-C)。

嗜中性粒细胞具有较高的吞噬能力和高NADPH氧化酶的活性微生物消灭批判,并分泌一系列趋化因子在重要的牵引的附加 ​​中性粒细胞和其它免疫细胞到炎症8,9的部位。嗜中性粒细胞的特征是大量的表面受体,包括Toll样受体(TLR)的表达,C型凝集素受体 ​​(的CLR),补体受体3(细胞CD11b / CD18)和其它粘附分子( 例如,L-选择LFA-1,VLA-4和癌胚抗原相关细胞粘附分子3(CEACAM3 / CD66b)),趋化因子受体( 例如,CXCR1,CXCR2,CCR1,CCR2),趋化因子受体( 例如,PAFR,LTB 4 R和C5aR的) ,细胞因子受体( 例如,G-CSFR,IL-1R,IL-4R,IL-12R,IL-18R,TNFR),甲酰基肽受体( 例如,FPR1-3),和Fc受体( 例如,CD16(FcγRIII ),CD32(FcγRII),CD64和(FcγRI)10。在小鼠中,中性粒细胞通常被认定为细胞CD11b + Ly6G +,而人类嗜中性粒细胞使用的CD11b,CD15,CD16和CD66b白细胞识别标志。它也被普遍接受染色的颗粒蛋白髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)检测组织中嗜中性粒细胞。

目前还不清楚是否嗜中性粒细胞的不同功能由同一小区或由不同的细胞亚群介导的。累积的数据表明了异种嗜中性白细胞群体表现出可塑性受促炎性刺激物和微环境11,12的高度的存在。 Fridlender 等人 13已经严重分割在癌症中的嗜中性粒细胞分成两个主要的亚群称为N1具有抗肿瘤性质和N2与亲肿瘤性质。在癌症中,以及在慢性炎症中,有一个附加的子种群粒髓源抑制细胞(G-肌源性干细胞),该抑制T细胞反应14组成。 G-肌源性干细胞被认为是其特征在于由一个细胞CD11b +的Ly6C未成熟骨髓细胞 Ly6G 表型的小鼠15,而具有CD15 + / CD16 人体16的表型。 G-肌源性干细胞表达更高水平的精氨酸酶和髓过氧化物酶,细胞因子和趋化因子比正常循环中性粒细胞,而较低的水平。他们不太吞噬和游走性,但产生较高水平的ROS 15,17,18的。在本文中,我们将介绍一些基本的方法进行隔离中性粒细胞具有抗肿瘤特性和表征。

而中性粒细胞构成的所有白血细胞在人体循环的人口最多(45 - 70%; 1800 - 6000 /微升),在小鼠体内,正常情况下,他们是相当稀疏(10 - 15%; 300 - 500 /微升)。嗜中性粒细胞计数增加时炎症稳步偶尔在癌症,它代表的慢性炎症7的状态。嗜中性粒细胞多能,从普通的骨髓前体(CMP)CE开发LLS在骨髓,通过分化过程通过原粒细胞的阶段(MB),早幼粒细胞(PM),髓细胞(MC),晚幼(MM)和带细胞(BC)8。成熟,有丝分裂后的中性粒细胞可以保持骨髓4内- 7日他们被释放到循环8之前。嗜中性粒细胞周转在血液通常是迅速,平均半衰期为6 - 12小时,这可能是炎症条件下延长。未刺激的嗜中性粒细胞已通过暴露于佛波醇酯佛波12不限抗肿瘤发生活性,可以通过使幼稚中性粒细胞的趋化因子IL-8(CXCL2),CCL2,CCL5和CXCL5 6,19或人工地获取的特征, -myristate 13-乙酸酯(PMA)6。

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数(约3 - 5×10 5)取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标,使人们艰难的探索循环中性粒细胞小鼠体外的功能。为了克服这个困难,其他来源的已被使用。例如,大量的中性粒细胞可以从骨髓20或以下无菌炎症的诱导腹膜得到的( 例如 ,腹膜内注射硫乙醇酸盐肉汤或酵母聚糖A的之后)。应当指出的是,从腹腔得到嗜中性粒细胞不施加任何抗肿瘤发生活性(未发表的观察)。

。Granot酒店 6观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌细胞系开发嗜中性这恶化了与肿瘤进展6( 图2A),以使得20 - 40万血嗜中性粒细胞可以容易地从1毫升血液中分离3 - 第4周后,肿瘤接种。这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性,并因此被瑰奈德肿瘤夹带中性粒细胞(TEN),以便从幼稚中性粒细胞6( 图2B)相区别。而高密度的中性粒细胞(HDN, 图1A)是高度抗肿瘤发生,在癌症的情况下产生的低密度中性粒细胞(LDN, 图1B)不是21。另外,来自肿瘤携带小鼠的骨髓及脾脏高密度的中性粒细胞具有抗肿瘤活性(未发表数据)。应当指出的是,与肿瘤进展脾脏逐渐放大(脾肿大),以增加嗜中性粒细胞的数量。

应当指出的是,也被在癌症包括自发(MMTV-PyMT和MMTV-WNT1乳腺肿瘤和K-ras基因驱动的肺肿瘤)其他模型生成并注射(AT-3(MMTV-PyMT)和E0771乳腺癌TEN细胞,LLC Lewis肺癌细胞和B16-F10黑素瘤细胞)。然而,在这些TUM中性粒细胞动员的程度或模型远比4T1-接种小鼠的少,达到5 - 10×10 6中性粒细胞在1ml血后3周。

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Protocol

动物:5-7周龄的BALB / c小鼠自Harlan(以色​​列)购得。所有涉及的动物实验均批准了希伯来大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)。人类样本:采集血液癌症患者和健康志愿者被批准哈达萨医疗中心机构审查委员会(IRB)。

1.诱导中性粒细胞在体内抗肿瘤特性使用乳腺癌小鼠模型。

注:应使用无菌溶液在层流(LAF)生物安全柜中进行的所有步骤。

  1. 种子5×10 5个4T1细胞在100mm组织培养板在10ml Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中含有4.5g / L的D-葡萄糖补充有10%热灭活的小牛血清(FBS),2mM的D-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,100U / ml青霉素G和100微克/ ml硫酸链霉素。第孵育在含5%CO 2的3至4天的潮湿培养箱E细胞在37℃。确保细胞是50 - 在实验当天100%汇合。
  2. 分离从组织培养板中的肿瘤细胞,吸出培养基,用5ml PBS洗涤细胞,吸出PBS,并添加2.5克/升胰蛋白酶溶液3毫升孵育细胞2 - 3分钟,用胰蛋白酶在37ºC。
  3. 加10ml含有血清的培养基中,以中和胰蛋白酶和吸管上下,直到所有的细胞已被分离。转移的细胞悬浮到15ml锥形离心管中。
  4. 离心细胞,在200×g离心5分钟,在室温。吸留200上面的细胞沉淀微升培养基中的介质。悬浮细胞中的残留量和加入10毫升的PBS。倒置管2 - 3次,以获得均匀的细胞悬浮液,并取出10微升到计数细胞在血细胞计数器。使用台盼蓝活的和死的细胞之间进行区分。 离心细胞悬浮液5分钟,在200×g离心在RT。吸出PBS中并悬浮细胞于PBS中的2×10 6个细胞/ ml的终浓度。确保单细胞悬浮液没有结块。
  5. 注入1×10 6个4T1细胞或荧光素酶表达4T1细胞在50μlPBS中原位成使用0.3毫升注射器用30G x8毫米针雌性BALB / c小鼠的左腹股沟乳腺脂肪垫。
    1. 注射前,麻醉小鼠在感应腔室接收异氟烷缓慢的流速(3 - 5%)在100%的氧。
    2. 莱鼠标在无菌手术垫,并确保头妥善安置异氟醚鼻锥内。按捏爪子确认正确的麻醉。使用对眼睛的兽医药膏,以防止干燥,而在麻醉下。剃注射部位周围的头发和消毒用70%乙醇。
    3. 使用无菌一套手术工具,使一个小切口的水平(5毫米)的约腹股沟和腹部乳头之间imately一半的方式,暴露脂肪垫并注入1×10 6个4T1细胞在50μl。关闭与应一周后取出9毫米剪辑的切口。注射萤光素酶表达细胞的允许监测肿瘤的大小和转移由生物发光成像。
      注意:此微创过程不需要任何手术后的治疗,并将注入的小鼠在2回收 - 3分钟。
    4. 监测小鼠,直到他们恢复意识,并确保他们重新获得加盟其他老鼠的公司前全意识。
  6. 3后- 4周,当原发肿瘤已经达到2 cm 3的体积,牺牲小鼠慢 CO 2流,并最后一口气后,立即用一25G x 5/8“针头获得血液通过心脏穿刺连接到1毫升结核菌素注射器预处理肝素。保持在针的口朝上插入时的通过朝向心脏隔膜注射器在水平位置,并缓慢和逐渐绘制血液避免过高的压力( 图3)。

2.中性粒细胞分离

  1. 隔离从血液肿瘤的小鼠的细胞毒性的中性粒细胞。
    1. 稀释1毫升血液从荷瘤小鼠进行拉伸(见协议1.11)在PBS中含有0.5%(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA),以6 ml的终体积。
    2. 分级对新鲜烹制的连续蔗糖梯度稀释血液:
      1. 加入3毫升无菌过滤的蔗糖1.119克/毫升到15毫升锥形聚丙烯离心管的底部。
      2. 慢慢地,小心地,3层毫升无菌过滤的蔗糖1.077克/毫升的1.119克/毫升层的顶部。此后,在1.077克/ ml的层( 图4A)的顶部缓慢且小心地添加6毫升稀释血液(协议2.1.1)。建议保持倾斜管和一个dding不同的组件通过缓慢,但连续流动,保持吸管的嘴朝向管的下壁,使得没有湍流形成。
    3. 离心含有对蔗糖梯度稀释血液于700×g离心30分钟,在RT下无制动管。
    4. 小心取出离心管,而不会导致任何动荡。大部分的红细胞将在管的底部。高密度的中性粒细胞(HDN)被发现,其为白色到红色环在1.119克/毫升和1.077克/ ml的层(约3 ml刻度)之间的界面,而低密度白细胞被发现在一个白色的环在1.077克/ ml的层和含BSA的PBS之间的界面(约6 ml刻度,参见图4B)。
    5. 吸出PBS + 0.5%BSA中,直至达到5mm处低密度细胞层的上方。吸取出来的低密度细胞通过缓慢吸入1毫升尖通过围绕细胞慢慢漩涡状。转移细胞为30个毫升的PBS与0.5%BSA的。
    6. 吸在相同的梯度管的上层,直至到达上方5mm高密度细胞带。吸取出来的高密度细胞,这是主要的高密度的中性粒细胞,并将细胞转移到30毫升PBS中含有0.5%BSA。
    7. 离心细胞,在400×g离心在室温10分钟。
    8. 重新悬浮细胞36毫升无菌HPLC级水30秒吸出上清液并裂解红细胞。等渗应通过加入9毫升5倍的还原浓缩的PBS补充有2.5%(重量/体积)BSA中。
    9. 离心细胞,在400×g离心在室温10分钟。
    10. 吸出上清液,并将细胞重新悬浮在PBS-BSA中。计数嗜中性粒细胞的数量在血细胞计数器,并使用台盼蓝活的和死的细胞之间进行区分。
    11. 离心细胞,在400×g离心在室温10分钟,并重新悬浮于期望的温育培养基中的嗜中性粒细胞,以最终细胞密度。使用立即中性粒细胞。
    12. 然后,再次离心分离后,悬浮在培养介质中的嗜中性粒细胞,以最终细胞密度。立即使用中性粒细胞。
  2. 从分离肿瘤患者循环中性粒细胞。
    1. 混合10毫升肝素(20U / ml)的人血液与3%葡聚糖T500在盐水等体积并孵育在室温30分钟。在此孵化的红细胞沉降会。
    2. 准备一个50ml锥形聚丙烯管,用10ml蔗糖1.077克/ ml和慢慢层的富白细胞的上清液上1.077克/ ml的蔗糖层( 图4C)的顶部。
    3. 离心在400×g离心30分钟,在RT下无制动。高密度的中性粒细胞(HDN)将出现在颗粒。低密度中性粒细胞(LDN)与单核细胞和淋巴细胞共纯化的1.077克/ ml的蔗糖层和血浆( 图4D)之间的接口。
    4. 悬浮的嗜中性粒细胞在10毫升0。2%的NaCl持续30秒以溶解所述污染的红细胞,并通过加入10ml 1.6%NaCl中的恢复等渗性和反转一次。
    5. 离心5分钟,在160×g离心在RT,并在20ml的Hanks'平衡盐溶液洗涤三次。每次洗涤后离心机吸出上清液。
    6. 算的中性粒细胞和悬浮细胞在RPMI-1640补充有2%FBS的2×10 6中性粒细胞/ ml或根据需要。

3.富集血中性粒细胞使用磁珠

  1. 正选择
    1. 取从小鼠1ml血液中协议1.8所述,用肝素化的注射器中。
    2. 离心血液在15ml锥形管中,在400×g离心5分钟,在RT。
    3. 吸出上清液或维持血浆进行进一步的研究。
    4. 裂解的红细胞通过在8ml HPLC级水重悬细胞。 30秒后,通过加入2ml 5×conce的恢复等渗含ntrated PBS 2.5%BSA。计数细胞。
    5. 离心在400×g离心5分钟,在RT。
    6. 重悬含有0.5%BSA和每10 8个细胞2mM EDTA的细胞沉淀在200微升PBS中。
    7. 加入50微升生物素标记的抗Ly6G抗体。拌匀在冰箱(未在冰上)孵育10分钟。
    8. 添加150微升含0.5%BSA和2mM EDTA的冷PBS。
    9. 涡流的抗生物素涂覆的磁性微珠原液。转移100μl到细胞悬浮液。拌匀在冰箱(未在冰上)孵育15分钟。
    10. 通过加入含有PBS中0.5%BSA和2mM EDTA和离心机在400×g离心在室温10分钟10毫升洗涤细胞。
    11. 吸去上清液完全,并且重悬在500微升冷PBS含有0.5%BSA和2mM EDTA中。
    12. 插入一个磁性分离柱成附连到磁性底座的磁体保持器,并用500μL冷PBS含0冲洗。5%BSA和2mM EDTA中。
    13. 应用该细胞悬浮液上柱。流过的包含未标记LyG6阴性细胞。
    14. 用含有0.5%BSA和2mM EDTA的500μl的PBS洗涤该柱。额外未标记细胞将在通过的流动。
    15. 重复洗涤步骤用含有0.5%BSA和2mM EDTA的另外500微升的PBS。
    16. 从磁体取出柱,并将其放置在一个15毫升的收集管。加含有0.5%BSA和2mM EDTA的PBS中1毫升,并冲洗出磁性标记的细胞牢固地推动活塞到列。流通过包含Ly6G +中性粒细胞。
  2. 阴性选择
    1. 按照步骤3.1.1到3.1.5备血白细胞。
    2. 重悬1×10 8个细胞的1ml PBS中含有5ml的聚苯乙烯圆底管0.5%BSA和2mM EDTA中。
    3. 加入50微升正常大鼠血清。
    4. 加入50微升中性粒细胞富集Çocktail(包含特定非中性粒细胞白血细胞生物素化抗体),拌匀孵育在冰箱15分钟。
    5. 加入4毫升含有的PBS 0.5%BSA和2mM EDTA和离心机400×g离心10分钟清洗菌体。
    6. 弃去上清液并将细胞重新悬浮于1ml含有0.5%BSA和2mM EDTA的PBS中。
    7. 加入50微升的针对生物素和葡聚糖四聚抗体复合物。拌匀,孵育在冰箱10分钟。
    8. 涡流孔含有葡聚糖 - 包被的磁珠加入150微升细胞悬浮液中之前的管。拌匀,孵育10分钟,在冰箱中。
    9. 通过加入含有0.5%BSA和2mM EDTA的PBS使细胞悬浮液以2.5毫升的总体积。轻轻混匀,以获得均匀的细胞悬浮液。
    10. 插入管(无盖)到磁体,静置3分钟。
    11. 倒置磁铁与管子在一个连续运动,使得未结合的细胞中的流体将被转移到新的管中。离开磁铁和管倒2 - 3秒,然后回到直立位置。磁性标记不想要的细胞将仍然结合到原管的壁上,而该未结合的中性粒细胞会在传送流体。

中性粒细胞的细胞学4.染色

  1. 重悬1×10 5嗜中性粒细胞在50μlPBS中,将细胞悬液转移到薄层细胞制备适配器诸如细胞离心涂片。离心在150×g离心适配器5分钟。分离从适配器预标记的载玻片上。
  2. 通过浸渍玻片在70%乙醇2分钟,固定细胞。允许从适配器(见步骤4.1)的准备工作,以在室温染色前晾干。浸载玻片5 - 6次蒸馏水。
  3. 染色1 - 梅耶的苏木素液2分钟。冲洗自来水中1分钟。染色10秒,曙红Y解 。在自来水冲洗。通过漂洗中增加的乙醇浓度的幻灯片(70%,96%和100%)脱水。让载玻片风干不久并检查在光学显微镜下的幻灯片。
    注:苏木有一个深蓝色,紫色和污渍核酸,而伊红是粉红色的污渍和非特异性的蛋白质。嗜中性粒细胞的胞质颗粒仍然由酸性或碱性染料,它是原点为名称“爱是中性的”不染色。而嗜碱性粒细胞染色深蓝色HE染色和eosinophilc粒细胞鲜红色,中性粒细胞出现中性粉色( 见图1a)。成熟嗜中性粒细胞的特征是多形核,这是在一般大2 - 5裂片'分段中性粒细胞'( 图1A1C)。未成熟粒细胞的特征在于通过一叶形弯曲的或环状的核( 图1B)。
ve_title“> 5。中性粒细胞的流式细胞仪检测纯度的测定。

  1. 重悬在100μlFACS缓冲液(含有0.5%BSA,2毫摩尔EDTA和0.02%NaN 3的PBS)中1×10 6个细胞。对于全血样本,溶血之前需要染色(步骤3.1.1至3.1.5)。加10微升FcR阻断剂的5分钟。
  2. 0.5添加荧光标记的抗体微克用特异性阮文黎-6G鼠标中性粒细胞或CD11b和CD66b的人中性粒细胞,拌匀孵育15分钟在室温。
  3. 调整体积至500微升用含0.5%BSA和2mM EDTA的PBS中并通过流式细胞术分析染色。

6.按照中性粒细胞门体内

  1. 嗜中性粒细胞的体内 BrdU标记
    1. 注入100微升10毫克/毫升的溴脱氧尿苷(BrdU)标记在无菌PBS溶液腹膜内给荷瘤小鼠。
    2. 隔离血嗜中性粒细胞48小时后喷射一ccording议定书2.1。染色的BrdU标记使用的BrdU流动试剂盒中性粒细胞。
  2. 嗜中性粒细胞的CFSE标记
    1. 悬浮10 7嗜中性粒细胞在1ml预热的PBS。
    2. 加入2微升的5mM CFSE原液悬浮嗜中性粒细胞,以10μM的终浓度。拌匀,孵育15分钟,在37℃。在1毫升DMSO中的5mM CFSE通过溶解2.8毫克的CFSE的(羧基二乙酸酯,琥珀酰亚胺基酯 - - )5-(和6)制备。在-20℃下分成在无菌200μl的管和储存10微升等分试样在黑暗中。
    3. 通过加入含有10%FBS的RPMI-1640等体积的中和过量的CFSE。孵育10分钟,在37℃。离心嗜中性粒细胞在400×g离心在室温10分钟。在含有10%FBS10毫升的RPMI-1640洗两次的中性粒细胞。
    4. 在PBS中的适当体积离心,在400×g离心10分钟,重悬。嗜中性粒细胞( 例如,1×10 7

7. 在体外萤光素酶测定来监测隔离中性粒细胞的抗肿瘤活性。

  1. 培育荧光素酶标记的肿瘤细胞作为在协议1.1-1.5描述为4T1细胞,但悬浮胰蛋白酶解离细胞在最优化缩小血清培养基补充有2%FBS中。调整细胞密度为每毫升5×10 4个细胞。
  2. 种子5000荧光素酶标记的肿瘤细胞在100μl优化缩小含有0.5%FBS的白色96-平底组织培养孔板的每个孔中的血清培养基。
  3. 4小时接种肿瘤细胞后,在含有0.5%FBS的50μl的最优化缩小血清培养基添加1×10 5嗜中性粒细胞,并孵育O / N。准备一个中性粒细胞悬浮液以2×10 6细胞/ ml的密度。对照孔应该得到50微升介质中无嗜中性粒细胞。办多次重复每个实验的设置。
  4. 在第二天早上,轻轻吸出上清液,用200微升PBS洗好每个。吸出PBS,加入50微升被动裂解液。对于易分离的细胞(如AT-3细胞),不要在PBS洗,并立即吸出生长培养基后添加细胞培养裂解液。
  5. 覆盖板用铝箔和孵育它在轨道摇床上以150rpm进行20分钟,在RT。
  6. 将板在发光板读数器。注入以及明智的50微升荧光素酶检测解决方案,并宣读了化学发光每孔10秒。
  7. 由下式计算%的肿瘤裂解:%肿瘤裂解=(1- [与嗜中性粒细胞的样品的发光] / [在介质样品的发光])×100%。

注:为了评估中性粒细胞转移播种的贡献,中性粒细胞可在协议8.1所述被耗尽。为了有效DEPL奥迅管理中性粒细胞消耗抗体在开始后第7天的肿瘤细胞植入。

中性粒细胞在乳腺癌小鼠模型8.抗转移活性。

  1. 中性粒细胞体内枯竭。
    1. 新鲜制备12.5微克大鼠抗Ly6G抗体(嗜中性粒细胞消耗性抗体)或大鼠同种型对照抗体(IgG抗体2a中 ,Κ)在盐水中以每只小鼠100微升的最终体积。
    2. 开始后第3天肿瘤植入每日注入12.5微克大鼠抗Ly6G抗体(100微升)腹膜内剂量。注射对照组小鼠或12.5微克(100微升)大鼠同种型对照抗体(IgG 2A,Κ)。
    3. 开始第14天,每天两次施用的抗体,作为嗜中性粒细胞的生产速率时,4T1肿瘤生长显着地增加。
    4. 隔日,取得血液样本(2 - 3滴)由切口侧尾静脉。采集血液进入反含有管-coagulant(肝素,柠檬酸盐或EDTA)。
    5. 使用流式细胞仪的协议中说明5中性粒细胞验证枯竭。
  2. 肿瘤中和试验(改良温测定)
    1. 隔离荷瘤小鼠嗜中性粒细胞。拌1×10 6个肿瘤细胞和3×10 6中性粒细胞在50μl盐水(每只小鼠)。
    2. 注入细胞皮下注射到6侧翼 - 8周龄幼稚BALB / c小鼠。剃须前侧翼肿瘤植入,使肿瘤大小的精确测量。测量肿瘤大小每天在出发后第5天移植。
  3. 嗜中性粒细胞过继转移
    1. 注入2×10 4荧光素酶表达的肿瘤细胞在200μlPBS中至尾静脉。
    2. 嗜中性粒细胞转移应执行4小时以下肿瘤细胞注射。因此,约2小时,他们计划开始前HDN从荷瘤小鼠(2.1协议)的净化体内转移。重悬在PBS中的中性粒细胞以2.5×10 7个细胞/ ml的终浓度。
    3. 引进肿瘤细胞后4小时将小鼠在5分钟加热灯。将小鼠在阻挡器,并通过尾静脉注射5×10 6 HDN(200微升)。对照小鼠注射载体(PBS)。
    4. 通过体内成像系统或通过免疫组织化学使用生物发光监视肺转移在不同时间点的形成。
  4. 肺转移播种法
    1. 注入0.5 - 1×10 6个亲本4T1细胞原位进入左腹股沟乳腺脂肪垫如方案1所述。
    2. 在第10天,重悬表达GFP的4T1细胞在PBS中的5×10 5细胞/ ml的终浓度。将小鼠在5分钟加热灯。
    3. 将小鼠在阻挡器和注入1×10 5表达GFP的4T1细胞(200微升)静脉内给4T1荷瘤小鼠或幼稚小​​鼠。
    4. 在接下来的一天,安乐死的小鼠和灌注用20ml的PBS肺以除去剩余的红细胞。
    5. 切除肺部GFP阳性细胞通过免疫组织化学分析。
      注:为了评估中性粒细胞转移播种的贡献,中性粒细胞可在协议8.1所述被耗尽。为有效耗尽施用嗜中性粒细胞消耗抗体开始后第7天肿瘤植入。

9.抑制T细胞增殖的中性粒细胞从荷瘤小鼠。

  1. 取下一个安乐死的天真BALB / c小鼠和地点脾脏在10毫升PBS。
  2. 将脾到40微米的细胞滤网即配合在培养皿填充用RPMI-1640。使用注射器的柱塞端,捣碎脾通过细胞过滤器进入培养皿。冲洗细胞过滤用5ml RPMI中。丢弃的过滤器。
  3. 转移的悬浮细胞到50ml锥形管中,并离心400×g离心10分钟。
  4. 弃去上清液,并且通过将细胞悬浮成36种毫升纯水进行20秒溶解红细胞,并通过添加调整到等渗4毫升PBS中浓缩x 10.替代地,通过将​​细胞悬浮溶解红细胞到5ml红细胞裂解缓冲液(ACK),并孵育5分钟,在室温。通过加入10ml的RPMI-1640培养基中和所述ACK。离心在400×g离心在室温10分钟。悬浮细胞在5ml PBS中并计数细胞。
  5. 重悬在PBS中的脾细胞以4×10 7个细胞/ 2毫升在15毫升管的最终密度。加入2毫升在PBS中的2.5微米的CFSE溶液。快速翻转试管孵育10分钟,在37℃偶尔混合(每2分钟),避光。
  6. 猝灭过量的CFSE通过加入4毫升预温热的FBS(100%)的孵育在室温下1分钟。添加3mL的PBS和离心机在400×g离心10分钟。
  7. 在400×g离心洗细胞用30ml PBS中,离心10分钟。
  8. 通过40微米的细胞滤网过滤细胞,用PBS再次洗涤。
  9. 将细胞重悬于RPMI-1640培养基补充有10%FBS的为2×10 7个细胞/ ml的终密度。
  10. 种子2×10 6 /孔(200微升)在24孔组织培养板。
  11. 通过加入1微克纯化的亚美尼亚仓鼠抗小鼠CD3ε抗体在500μlRPMI-1640含10%FBS刺​​激的细胞。
  12. 有10%FBS添加2×10 6 HDN或LDN在300微升的RPMI-1640的CFSE标记的脾细胞,并孵育3天,在37℃。掘井无嗜中性粒细胞应该得到300微升介质。在每孔总体积应为1毫升
  13. 收集细胞,并将它们准备流式细胞仪。将细胞重悬于100μl的FACS缓冲液(协议5),并添加10微升FcR阻断剂的。孵育5分钟,在RT。
  14. 加1μ升APC标记的抗CD8α抗体孵育15分钟,在RT。
  15. 确定CD8 + T细胞通过流式细胞术( 图5)的CFSE荧光强度。在每次细胞分裂的CFSE强度减半。因此,细胞分裂的数量可以通过CFSE染色的强度确定。

10.中性粒细胞迁移实验

  1. 种子5×10 5 4T1细胞在7ml优化缩小血清培养基补充有0.5%FBS中的25cm 2组织培养烧瓶中,并培养24小时,在37℃下。
  2. 转移800微升上清液到迁移板的底腔具有5微米的孔尺寸。
  3. 重悬2×10 5嗜中性粒细胞在400μl的最优化缩小血清培养基补充有0.5%FBS中。应用该细胞悬液,以顶室孵育2小时,在37℃。
  4. 在温育结束时,除去顶部室和算已迁移至底室嗜中性粒细胞的数量。

11.监测中性粒细胞生产活性氧(ROS)。

  1. 制备1.1×10 6中性粒细胞/中Hank氏平衡盐溶液无酚红。板180微升含有在一个白色96-平底孔平板的每个孔2×10 5嗜中性粒细胞。
  2. 将板在发光板读数器。在PBS中加入20微升的500μM的鲁米诺溶液,以每孔以获得50微米的最终浓度。阅读基础化学发光1秒在5分钟的时间过程,用10秒的间隔。
  3. 添加一种兴奋剂( 例如,PMA以10nM或100nM或fMLP的浓度为10μM的浓度)。制备的Hank氏平衡盐溶液每剂的10倍浓溶液不含酚红并添加22微升到各孔中。为了控制井添加22微升的车辆。
  4. Measu再在板读数器的发光。两者都做一​​个短的(每10秒,5分钟)和长(每分钟1小时)的时间过程。

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Representative Results

在最近的研究中,我们确定了一个抗转移功能,中性粒细胞6。从荷瘤小鼠嗜中性粒细胞获得细胞毒性表型并具有杀灭肿瘤细胞6的能力。这是相对于那些没有显著抗肿瘤作用6从天真的小鼠嗜中性粒细胞。几个在协议部分中描述的技术已被用于在体外体内 6研究抗肿瘤嗜中性粒细胞的功能。

肿瘤细胞毒性的中性粒细胞可以从肿瘤携带小鼠6来获得。要达到这个目的,将小鼠原位注射4T1细胞进入左腹股沟乳腺脂肪垫(方案1)。通过后第21天肿瘤接种,原发肿瘤达到1的尺寸- 2 cm 3的( 图3 -肿瘤是显而易见的,在左下腹部)。此时,对小鼠进行安乐死和1ml抽血(每只小鼠)通过心脏穿刺( 图3)。与此同时,血液从一个天真的,非荷瘤小鼠被吸引。 HDN然后在密度梯度纯化(协议2.1和图4),得到的中性粒细胞的高纯度(> 98%)的人口。嗜中性粒细胞存活率,台盼蓝染色(协议2.1)确定。的嗜中性粒细胞,然后再悬浮于含有0.5%FBS的2×10 6中性粒细胞/ ml的最优化缩小血清培养基。

为了测试中性粒细胞的细胞毒性的程度,我们加入10 5嗜中性粒细胞(50微升从2×10 6中性粒细胞/ ml储备溶液),以荧光素酶在一个平底白色96表达4T1靶细胞(5000个细胞/孔在100μl) - 嗯板(协议7)。以下的O / N培养,将细胞在PBS中洗涤,并溶解在被动细胞裂解缓冲液和每个样本中的荧光素酶活性进行测试,以便评估中性粒细胞的细胞毒性的程度( 图2B实验程序下杀死的,无肿瘤),嗜中性粒细胞从肿瘤携带小鼠纯化显示显著的细胞毒性( 图2B,肿瘤轴承)。

为了测试在LDN和加氢脱氮的免疫抑制特性,我们使用了T细胞增殖测定(协议9)。我们评估了CD8 +细胞在未处理的脾细胞,并与一个αCD3抗体处理的脾细胞,这是单独培养,细胞培养在LDN的存在下或在HDN的存在( 图5A-D)的数量。请注意以下的抗CD3刺激的急剧增加CD8 + CFSE +细胞(比较和右上面板A,B)抑制戏剧性的抑制作用LDN(比较右上面板BC)以及缺乏HDN的抑制作用(图D)。我们也评估CFSE保留的程度,作为指示对于增殖。在图5E中 ,将橙色曲线呈现未处理CD8 +细胞中,蓝色曲线CD8 +细胞,与αCD3抗体处理,红色曲线CD8 +细胞在LDN和绿色曲线的存在下刺激αCD3代表CD8 +细胞与α刺激; CD3在新生儿溶血病的存在。注意在αCD3处理的细胞中向左移动(蓝色曲线)和αCD3处理的细胞与HDN(绿色曲线)中培养,这表明CD8 +细胞的增殖。

图1
图1.中性粒细胞的形态。高密度(A)和低密度中性粒细胞(B)用苏木和曙红(H&E)以下的薄层细胞制备的光学显微镜图像。(C)透射电子显微镜(TEM)图像的高密度的中性粒细胞。酒吧代表1000纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.血中性粒细胞计数与肿瘤p增加rogression和中性粒细胞获得细胞毒性表型。 (A)中每毫升的循环嗜中性粒细胞数,通过FACS在以下肿瘤细胞接种在BALB / c小鼠不同天数进行计数。的数量 循环的CD11b + Ly6G +中性粒细胞不断用4T1肿瘤进展而增加。(B)的 4T1乳腺癌细胞共培养以从任天真的小鼠高密度的中性粒细胞(肿瘤免费)或4T1肿瘤的小鼠(肿瘤轴承)小鼠,或培养在介质中不存在嗜中性粒细胞(续)在37℃下20小时。嗜中性粒细胞对肿瘤的小鼠,但不能从肿瘤免费小鼠,表现出对4T1肿瘤细胞显著细胞毒性。误差棒代表±SEM ** P <0.01使用学生t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

“图3”SRC 图3.收集的鼠血液通过心脏穿刺 。将小鼠安乐死在感应腔在缓慢的CO 2流。后立即鼠标已采取其末端呼气,它被放置在它的后面和1毫升肝素化注射器插入在胸骨的基部直到到达心脏。柱塞慢慢拉吸出血液。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图从全血中性粒细胞4.净化。 (A)3毫升1.077克/ ml的蔗糖小心地层叠在3毫升1.119克/ ml的蔗糖顶部上以形成一个不连续梯度。全鼠血,稀释在PBS-BSA(0.5%),以6 ml的终体积,然后分层对1.07的顶为7g / ml的蔗糖(B)经过30分钟旋转700 XG,没有突破,3个不同的部分,可以观察到。的R -红细胞沉淀中,G -含有高密度的中性粒细胞,M中的粒级分-单核组分含有单核细胞和低密度中性粒细胞(C)的新鲜抽取的人血液与葡聚糖500(等体积混合3%)和在室温下孵育30分钟。含有白血细胞(血沉棕黄层)的顶部馏分,然后层叠在以10ml1.077克/ ml的蔗糖(D)按照30分钟旋在400×g离心,并且没有断点,2个不同的级分,可以观察到顶部。 R + G -含有红细胞和高密度的中性粒细胞,男沉淀-含有单核细胞和低密度单核嗜中性粒细胞比例请点击此处查看该图的放大版本。 图5
图5.抑制的T细胞增殖。流式细胞仪分析表示CFSE标记CD8 +细胞在没有刺激(A)的培养的数量,刺激后αCD3抗体在不存在(B)或LDN的存在(C)的HDN(D)CFSE强度CD8 +细胞板A的(E)直方图呈现- 。ð 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

嗜中性粒细胞是最丰富的全白血细胞,并且是在感染和炎症的情况下,第一反应者。因此,它们是外部线索高度敏感,并且容易激活。此外,嗜中性粒细胞具有非常短的半衰期和快速周转。总之,这些特点提高一些困难与中性粒细胞,这种独特的实验策略是必需的工作。例如,有几个中性粒细胞纯化策略,每一个都有自己的优点和缺点。

在中性粒细胞工作的一个关键步骤是从全血中的净化。嗜中性粒细胞可使用任一密度梯度或基于抗体的策略(阳性或阴性选择)被有效纯化。我们选择的方法是使用密度梯度的,因为它会产生高数量的高度纯化的嗜中性粒细胞具有最小的非特异性活化。然而,正如我们展示在最 ​​近的研究中21,机智^ h肿瘤进展中性粒细胞聚集在高数量的单核低密度部分。在这些条件下使用密​​度梯度提供了一种高纯度的高密度中性白细胞部分,这并不表示整个循环嗜中性粒细胞的曲目,而且是严重污染的其他单核细胞(淋巴细胞和单核细胞)低密度中性白细胞部分。在这些情况下选择的方法是一种基于抗体的纯化,优选负选择。使用抗体的纯化的中性粒细胞产生高纯度的中性粒细胞和更好地代表了整个循环嗜中性粒细胞的剧目。然而,我们注意到,在较长的中性粒细胞一起孵育的抗体,非特异性激活的机会增加。因此,我们建议,对于最佳结果,基于抗体的嗜中性粒细胞的纯化应尽可能快地进行。基于抗体的嗜中性粒细胞的纯化也是当选择浦的方法rifying从组织或肿瘤中性粒细胞。

无论选择哪种纯化过程,纯度,活力和功能的完整性,必须严格评估。嗜中性粒细胞的纯度通过流式细胞术使用以嗜中性粒细胞表面标记物反应的抗体来确定。在小鼠,LY-6G是特异于嗜中性粒细胞,其特征在于细胞CD11b +莱曼6C 莱曼6G + F4 / 80 -表型。人中性粒细胞不表达的标记类似于到Lym-6G,并且通常特征在于的CD11b,CD15,CD16,和CD66b的表达。由于嗜中性粒细胞具有Fc受体,这些需要免疫染色前被阻塞。嗜中性粒细胞,也可以从其他的白血细胞由具有更高的SSC区分。生存力应在纯化过程的结束来确定(台盼蓝,协议2.1),并应大于98%一致更大。功能完整应得到普里确定fication从天真的小鼠中性粒细胞。这些嗜中性粒细胞没有被激活,并提供无细胞毒性的控制用于在共培养的设置与肿瘤细胞(协议7)肿瘤携带的中性粒细胞。

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数(约3 - 5×10 5)取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标,使人们难以探索小鼠血中性粒细胞功能体外 。中性粒细胞数量稳步在炎症状态和偶尔增加癌症,它代表的慢性炎症7的状态。一些研究人员试图寻找对嗜中性粒细胞的替代来源,如骨髓20。 24小时腹膜内注射1ml的1mg / ml的酵母聚糖A有盐溶液的3%的硫乙醇酸盐肉汤溶液或1毫升后 - 可在4可以得到的大量的小鼠嗜中性粒细胞。但是,这些中性粒细胞引起不发挥ny的抗肿瘤发生活性(未发表的观察)。

。Granot酒店 6观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌发展嗜中性这恶化时的时间( 图2A),以使得20 - 4周- 40万血嗜中性粒细胞可从取血1ml 3很容易地分离后肿瘤接种。这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性,并因此被称为肿瘤夹带中性粒细胞(TEN),以便从幼稚中性粒细胞( 图2B)相区别。而高密度的中性粒细胞(HDN)是高度抗肿瘤发生,在癌症的情况下产生的低密度中性粒细胞(LDN)不是21。从骨髓和荷瘤小鼠的脾高密度的中性粒细胞也具有抗肿瘤活性(未发表数据)。应当指出的是,与肿瘤进展脾脏逐渐放大(脾肿大),以在嗜中性粒细胞压痕量。

为了跟随他们的过继转移追踪中性粒细胞的命运,这些都需要进行标识。嗜中性粒细胞可以通过分离前2天注射溴脱氧尿苷(尿嘧啶)到荷瘤或天真的小鼠被标记在体内 。 BrdU的是该DNA的前体胸苷被掺入新合成的DNA中的增殖细胞的类似物。在嗜中性粒细胞的情况下,BrdU的将并入增殖前体细胞分化为成熟的有丝分裂后的中性粒细胞时保留的BrdU染色。掺入的BrdU可以使用特定的抗BrdU荧光抗体染色。通过流式细胞术对的BrdU +细胞然后可以分析。另一种方法是用细胞追踪染料如5-羧基N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记分离的嗜中性粒细胞。 CFSE是能够通过活细胞膜的酯化合物。它有一个氨基反应性succinimid这导致共价荧光素结合到在细胞与细胞表面蛋白质和其他氨基基团。的CFSE标记的细胞可以通过流式细胞术使用的488nm氩激光进行分析。两种标记技术的区别在于,BrdU标记依赖于增殖前体细胞,并且不是所有的循环嗜中性粒细胞将被标记,而CFSE会沾污所有嗜中性粒细胞的事实。检测CFSE是不是染色的BrdU更直截了当,但是BrdU标记是跟随不成熟到成熟的中性粒细胞转化的良好手段。

我们还描述了几种方法,以确定嗜中性粒细胞的抗肿瘤和抗转移作用。这些措施包括中性粒细胞耗竭,中性粒细胞过继转移,肿瘤中和试验和肺转移播种法。每个这些测定的完成的抗肿瘤嗜中性粒细胞的功能的特定方面。例如,Granot酒店 6观察到,当出发嗜中性粒细胞的letion,在4T1肿瘤的小鼠肺转移的数目增加,这表明对于嗜中性粒细胞的抗转移作用。在中性粒细胞过继转移,肿瘤细胞注射纯化HDN前静脉注射4小时。肿瘤细胞形成肺和肝脏转移的能力都遵循一个时间过程研究使用光学体内成像系统。接收HDN小鼠表现出更少的转移灶比没有对照组6。在肿瘤中和试验中,肿瘤细胞被皮下注射或不HDN,HDN的存在降低肿瘤生长21。在转移性播种测定中,GFP标记的肿瘤细胞静脉注射到控制或嗜中性粒细胞的贫预转移性肿瘤的小鼠,并且GFP标记的细胞在肺中的种子的能力是确定的。预转移性肿瘤的小鼠的肺中的特征在于高的中性粒细胞浸润,防止肿瘤细胞接种在特定器官6。这转化为更多转移灶与对照荷瘤小鼠相比嗜中性粒细胞耗尽的小鼠。

该协议描述于研究中性粒细胞功能中的癌症的上下文和提供策略,以评估在体外体内癌症相关的嗜中性粒细胞特性的焦点。然而,在嗜中性粒细胞纯化策略以及一些所述的实验程序可用于在大范围的实验设置,其中的中性粒细胞发挥 ​​至关重要的作用( 即,炎症和感染)研究嗜中性粒细胞的功能。

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Acknowledgements

ZG支持从以色列科学基金会(批准号:41/11)的I-CORE项目赠款,在Abisch-福仁基金会,Rosetrees信托,以色列癌症研究基金会(ICRF - 研究职业发展奖)和令人关注的基础。 ZGF支持从以色列癌症研究基金会(ICRF - 研究职业发展奖)赠款,以色列卫生部和以色列肺脏协会的首席科学家。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

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References

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