Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center
Immunology and Infection

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Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., et al. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

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Abstract

Los neutrófilos, la más abundante de todas las células blancas de la sangre en la circulación humana, juegan un papel importante en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores. Además, los neutrófilos desempeñan un papel central en la vigilancia inmune de las células tumorales. Tienen la capacidad de reconocer las células tumorales e inducir la muerte de células tumorales, ya sea a través de un mecanismo dependiente del contacto celular que implica peróxido de hidrógeno o a través de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los neutrófilos con actividad anti-tumor se pueden aislar a partir de sangre periférica de pacientes con cáncer y de ratones portadores de tumores. Estos neutrófilos se denominan neutrófilos tumorales arrastradas (diez) para distinguirlos de los neutrófilos de sujetos sanos o ratones naïve que no muestran actividad citotóxica significativa tumor. En comparación con otras células blancas de la sangre, los neutrófilos muestran diferente flotabilidad por lo que es factible obtener a> 98% de la población de neutrófilos puro cuando se somete a un gradiente de densidad. Sin embargo, ademása la población de neutrófilos de alta densidad normal (HDN), en pacientes con cáncer, en ratones portadores de tumores, así como en condiciones inflamatorias crónicas, las poblaciones de neutrófilos de baja densidad distintas (LDN) aparecen en la circulación. LDN co-purifica con la fracción mononuclear y se puede separar a partir de células mononucleares utilizando cualquiera de las estrategias de selección positivos o negativos. Una vez que la pureza de los neutrófilos aislados se determina por citometría de flujo, pueden ser utilizados para in vitro y en ensayos funcionales in vivo. Se describen técnicas para el seguimiento de la actividad anti-tumor de los neutrófilos, su capacidad para migrar y para producir especies reactivas del oxígeno, así como la supervisión de su capacidad fagocítica ex vivo. Describimos más técnicas para etiquetar los neutrófilos para el seguimiento in vivo, y para determinar su capacidad anti-metastásico in vivo. Todas estas técnicas son esenciales para la comprensión de cómo obtener y caracterizar los neutrófilos con anti-tumorfunción.

Introduction

Los neutrófilos se caracterizaron inicialmente como las células inmunes innatas que sirven como primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Hoy en día se sabe que los neutrófilos han más funciones de gran alcance, estar involucrado en el montaje de la respuesta inmune adaptativa contra antígenos extraños 1,2, regulación de la hematopoyesis 3, 4 angiogénesis y cicatrización de heridas 5. Además, los neutrófilos pueden afectar el crecimiento del tumor y la progresión metastásica en virtud de sus actividades pro- y anti-tumorales 6,7. Los neutrófilos se caracterizan por un núcleo segmentado polimórfica (por lo tanto denominado polimorfonucleares (PMN) leucocitos) y contienen al menos tres subclases distintas de gránulos, así como vesículas secretoras 8 (Figura 1A-C).

Los neutrófilos poseen alta capacidad fagocítica y de alta actividad de la oxidasa NADPH crítico para la eliminación microbiana, y secretan una amplia gama de quimioquinas importantes por lotracción de los neutrófilos adicionales y otras células inmunes en el sitio de la inflamación 8,9. Los neutrófilos se caracterizan por la expresión de una gran cantidad de receptores de la superficie, incluyendo los receptores de tipo Toll (TLRs), lectina tipo C receptores (CLR), receptor del complemento 3 (CD11b / CD18) y otras moléculas de adhesión (por ejemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 y carcinoembrionario relacionados antígeno-molécula de adhesión celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimiocinas (por ejemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), los receptores quimioatrayentes (por ejemplo, PAFR, LTB 4 y R C5aR) , receptores de citoquinas (por ejemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-receptores de péptidos (por ejemplo, FPR1-3), y los receptores de Fc (por ejemplo, CD16 (Fc? RIII ), CD32 (RII) y CD64 (Fc? RI) 10. En los ratones, los neutrófilos suelen identificarse como CD11b + Ly6G +, mientras que los neutrófilos humanos se identifican utilizando los marcadores de leucocitos CD11b, CD15, CD16 y CD66b. También es generalmente aceptado para teñir para la mieloperoxidasa proteínas granulares (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NE) para la detección de los neutrófilos en los tejidos.

Aún no está claro si las diversas funciones de los neutrófilos están mediados por la misma célula o por sub-poblaciones de células distintas. La acumulación de datos sugieren la presencia de una población heterogénea de neutrófilos que exhibe un alto grado de plasticidad afectados por estímulos proinflamatorios y el microambiente 11,12. Fridlender et al. 13 groseramente han dividido a los neutrófilos en el cáncer en dos grandes grupos de población denominado N1 con propiedades antitumorales y N2 con propiedades pro-tumorales. En el cáncer, así como en la inflamación crónica, existe una sub-población adicional compuesta de células granulocíticas mieloides derivadas de supresores (G-MDSCs) que suprimen las respuestas de células T 14. G-MDSCs se considera que son las células mieloides inmaduras se caracterizan por un CD11b + Ly6Cbajo hi fenotipo Ly6G en ratones 15, mientras que con un CD15 + / CD16 baja fenotipo en humanos 16. G-MDSCs expresan niveles más altos de arginasa y la mieloperoxidasa, mientras que los niveles más bajos de citocinas y quimiocinas que los neutrófilos circulantes normales. Son menos de fagocitosis y migratoria, pero producen mayores niveles de ROS 15,17,18. En el presente artículo vamos a describir algunas metodologías básicas para el aislamiento y la caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales.

Mientras que los neutrófilos constituyen la población más grande de todas las células blancas de la sangre en la circulación humana (45 - 70%; 1800 - 6000 / l), en ratones, en condiciones normales, son más bien escasa (10 - 15%; 300-500 / l ). El recuento de neutrófilos aumenta de manera constante sobre la inflamación y en ocasiones en el cáncer, lo que representa un estado de inflamación crónica 7. Los neutrófilos se desarrollan a partir multipotentes precursor mieloide común (CMP) cells en la médula ósea, a través de un proceso de diferenciación que pasan las etapas de mieloblastos (MB), promielocitos (PM), mielocitos (MC), metamielocitos (MM) y células de la banda (BC) 8. Los neutrófilos, post-mitóticas maduras pueden permanecer dentro de la médula ósea de 4-7 días antes de que se liberan a la circulación 8. Facturación de neutrófilos en la sangre suele ser rápida con una vida media promedio de 6 - 12 horas, que puede ser prolongado en condiciones inflamatorias. Neutrófilos no estimulados han limitado la actividad anti-tumorigénicos, una característica que puede ser adquirida mediante la exposición de los neutrófilos ingenuos a las quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 y CXCL5 6,19 o artificialmente, al exponerlos a la forbol éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) 6.

La corta vida media de los neutrófilos en la sangre junto con el bajo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 5) alcanzado entre el 1 ml de sangre de un inocente 6-8 semanas de edad ratón, han hechodifícil de explorar la función de los neutrófilos circulantes ratón in vitro. Para superar esta dificultad, se han utilizado otras fuentes. Por ejemplo, un gran número de neutrófilos pueden ser obtenidas de la médula ósea 20 o el peritoneo tras la inducción de la inflamación estéril (por ejemplo, después de la inyección intraperitoneal de caldo de tioglicolato o Zymosan A). Cabe señalar que los neutrófilos obtenidos a partir de la cavidad peritoneal no ejercen ninguna actividad anti-tumorigénico (observación no publicada).

. Granot et al 6 observó que los ratones BALB / c inoculados ortotópicamente con el ratón 4T1 línea celular de carcinoma de mama desarrollar neutrofilia que agrava con la progresión tumoral 6 (Figura 2A), de tal manera que 20 a 40000000 neutrófilos de la sangre pueden ser fácilmente aislados de 1 ml de sangre 3 - 4 weeks post-inoculación del tumor. Estos neutrófilos han adquirido las actividades antitumorales, y en consecuencia han sido coineutrófilos nidos tumorales arrastradas (RTE), a fin de distinguirlos de los neutrófilos ingenuos 6 (Figura 2B). Mientras que los neutrófilos de alta densidad (HDN, la Figura 1A) son altamente anti-tumorigénicos, los neutrófilos de baja densidad (LDN, Figura 1B) generados en el contexto de cáncer no son 21. Además, los neutrófilos de alta densidad de la médula ósea y el bazo de ratones portadores de tumores tienen actividad anti-tumor (datos no publicados). Cabe señalar que con la progresión del tumor del bazo se vuelve gradualmente agrandada (esplenomegalia), con cantidades crecientes de neutrófilos.

Cabe señalar que la RTE se generan también en otros modelos de cáncer incluyendo tanto espontáneas (MMTV-PYMT y MMTV-Wnt1 tumores mamarios y tumores de pulmón impulsados ​​k-Ras) y se inyectaron (AT-3 (MMTV-PYMT) y carcinoma de mama E0771 células, células de carcinoma de pulmón de Lewis LLC y células de melanoma B16-F10). Sin embargo, la medida de la movilización de neutrófilos en estos tumo modelos es mucho menor que los ratones inoculados-4T1, alcanzando 5-10 x 10 6 neutrófilos en 1 ml de sangre después de 3 semanas.

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Protocol

Animales: 5-7 semanas de edad BALB / c ratones se adquirieron de Harlan (Israel). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por Cuidado y Uso Institucional Comité de Animales de la Universidad Hebrea (IACUC). Muestras de humanos: Colección de sangre de pacientes con cáncer y voluntarios sanos fue aprobado por Hadassah Center Institucional Junta de Revisión Médica (IRB).

1. Inducción de neutrófilos con propiedades anti-tumorales in vivo utilizando un modelo de ratón del cáncer de pecho.

NOTA: Todos los pasos deben realizarse utilizando soluciones estériles en un flujo de aire laminar armario (LAF) Bio-Seguridad.

  1. Seed 5 x 10 5 células 4T1 en 100 mm placa de cultivo de tejido en 10 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 4,5 g / L de D-glucosa suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 2 mM D- glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina. Incubar ªcélulas correos a 37 ° C en un incubador humidificado contiene 5% de CO 2 durante 3 a 4 días. Asegúrese de que las células son 50 - 100% de confluencia en el día del experimento.
  2. Para separar las células tumorales de la placa de cultivo de tejidos, aspirar el medio de cultivo, lavar las células con 5 ml de PBS, aspirar el PBS y añadir 3 ml de una solución de tripsina 2,5 g / L. Se incuban las células por 2 - 3 min con tripsina a 37 ºC.
  3. Añadir 10 ml de medio que contiene suero para neutralizar la tripsina y la pipeta arriba y abajo hasta que todas las células se han separado. Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
  4. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min a TA. Aspirar el medio dejando 200 l de medio por encima del sedimento celular. Resuspender las células en el volumen residual y añadir 10 ml de PBS. Invierta el tubo 2-3 veces para obtener una suspensión celular homogénea y sacar 10 l para contar las células en un hemocitómetro. Utilice azul tripán para distinguir entre células vivas y muertas. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 xg a TA. Aspirar el PBS y resuspender las células en PBS a una concentración final de 2 x 10 6 células / ml. Asegúrese de que la suspensión de células individuales no tiene la formación de grumos.
  5. Inyectar 1 x 10 6 células 4T1 o luciferasa que expresan células 4T1 en 50 l de PBS ortotópicamente en la almohadilla mamaria inguinal izquierda de grasa de ratones BALB / c hembras utilizando una jeringa de 0,3 ml con una aguja 30G x 8 mm.
    1. Antes de la inyección, anestesiar los ratones en una cámara de inducción que reciben un caudal lento de isoflurano (3 - 5% de) en 100% de oxígeno.
    2. Coloque el ratón sobre una almohadilla quirúrgica estéril y asegúrese de que la cabeza está correctamente colocado en el interior del cono de la nariz isoflurano. Confirme la anestesia adecuada pellizcando la pata. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Afeitarse el pelo alrededor de la zona de inyección y desinfecte con EtOH al 70%.
    3. Utilice un conjunto estéril de instrumentos quirúrgicos para hacer una pequeña incisión horizontal (5 mm) aproxa mitad de camino entre el madamente inguinal y los pezones abdominales, exponer la almohadilla de grasa e inyectar 1 x 10 6 células 4T1 en 50 l. Cerrar las incisiones con clips de 9 mm que deben ser eliminados una semana después. La inyección de células que expresan luciferasa permite la monitorización del tamaño del tumor y la metástasis por imágenes de bioluminiscencia.
      NOTA: Este procedimiento mínimamente invasivo no requiere ningún tratamiento post-quirúrgico y los ratones inyectados recuperar dentro de 2 - 3 min.
    4. Monitorear los ratones hasta que recuperen la conciencia, y asegurarse de que recuperar la plena conciencia antes de unirse a la compañía de los otros ratones.
  6. Después de 3 - 4 semanas cuando el tumor primario ha alcanzado un volumen de 2 cm 3, sacrificar los ratones por una corriente lenta CO 2, e inmediatamente después de la última respiración, obtener sangre por punción cardiaca usando un 25G x 5/8 'aguja conectado a una jeringa de tuberculina de 1 ml pretratados con heparina. Mantener la boca de la aguja hacia arriba al insertar eljeringa en posición horizontal a través del diafragma hacia el corazón, y poco a poco y gradualmente extraerá sangre evitando el exceso de presión (Figura 3).

2. Aislamiento de neutrófilos

  1. Aislamiento de neutrófilos citotóxicos de la sangre de los ratones portadores de tumores.
    1. Diluir 1 ml de sangre extraída de un ratón portador de un tumor (véase el Protocolo 1,11) en PBS que contenía 0,5% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) a un volumen final de 6 ml.
    2. El fraccionamiento de sangre diluida en un gradiente discontinuo de sacarosa recién preparado:
      1. Añadir 3 ml de sacarosa esterilizada por filtración 1,119 g / ml a la parte inferior de un tubo de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml.
      2. Poco a poco y con cuidado, de capa 3 ml de sacarosa esterilizada por filtración 1,077 g / ml en la parte superior de la g / ml capa de 1.119. A partir de entonces, añadir lentamente y con cuidado los 6 ml de sangre diluida (Protocolo 2.1.1) en la parte superior de la 1,077 g / ml capa (Figura 4A). Se recomienda mantener el tubo inclinado y unadding los diferentes componentes por un flujo lento, pero continuo, manteniendo la boca de la pipeta hacia la pared inferior del tubo, de tal manera que no se forma ninguna turbulencia.
    3. Centrifugar el tubo que contiene la sangre diluida en el gradiente de sacarosa a 700 xg durante 30 min a TA sin freno.
    4. Retirar con cuidado el tubo de la centrífuga sin causar ninguna turbulencia. La mayoría de los eritrocitos habrá en la parte inferior del tubo. Neutrófilos de alta densidad (HDN) se encuentran como un anillo de blanco a rojo en la interfaz entre el 1,119 g / ml y las capas de 1,077 g / ml (alrededor de la marca de 3 ml), mientras que los leucocitos de baja densidad se encuentran en un anillo blanco en la interfaz entre la capa / ml 1,077 g y la PBS que contiene BSA-(alrededor de la marca de 6 ml, véase la Figura 4B).
    5. Aspirar el PBS + BSA 0,5% hasta llegar a 5 mm por encima de la capa de células de baja densidad. Pipetear las células de baja densidad por aspiración lenta en una punta de 1 ml a través arremolinándose lentamente alrededor de las células.Transferencia de las células en 30 ml de PBS con 0,5% de BSA.
    6. Aspirar la capa superior en el mismo tubo de gradiente hasta llegar a 5 mm por encima de la banda celular de alta densidad. Pipetear a cabo las células de alta densidad, que son principalmente los neutrófilos de alta densidad, y transferir las células en 30 ml de PBS que contenía 0,5% de BSA.
    7. Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a TA.
    8. Aspirar los eritrocitos sobrenadante y lisan por resuspender las células en 36 ml de agua estéril de grado HPLC para 30 seg. Isotonicidad debe ser restaurada mediante la adición de 9 ml de un concentrado 5X PBS suplementado con 2,5% (w / v) BSA.
    9. Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a TA.
    10. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en PBS-BSA. Cuente el número de neutrófilos en un hemocitómetro y utilizar azul tripán para distinguir entre células vivas y muertas.
    11. Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a TA y resuspender los neutrófilos en medio de incubación deseada a la densidad celular final. Usarlos neutrófilos inmediatamente.
    12. Entonces, después de otra centrifugación, resuspender las neutrófilos en medio de incubación a la densidad celular final. Utilice los neutrófilos inmediatamente.
  2. Aislamiento de los neutrófilos circulantes de pacientes con cáncer.
    1. Mezclar 10 ml de heparinizada (20 U / ml) de sangre humana con un volumen igual de 3% de dextrano T500 en solución salina y se incuba durante 30 min a TA. Durante esta incubación, los eritrocitos serán sedimento.
    2. Preparar un tubo de polipropileno cónico de 50 ml con 10 ml de sacarosa 1,077 g / ml y la capa lentamente el sobrenadante rico en leucocitos en la parte superior de la g / ml capa de sacarosa 1,077 (Figura 4C).
    3. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA sin freno. Los neutrófilos de alta densidad (HDN) aparecerán en el sedimento. Neutrófilos de baja densidad (LDN) co-purifican con monocitos y linfocitos en la interfaz entre el / capa de 1,077 g ml de sacarosa y plasma (Figura 4D).
    4. Resuspender los neutrófilos en 10 ml 0.2% de NaCl durante 30 segundos para lisar los eritrocitos contaminantes, y restaurar la isotonicidad mediante la adición de 10 ml de 1,6% de NaCl y invertir una vez.
    5. Centrifugar 5 min a 160 xg a TA, y se lava tres veces en solución salina equilibrada de Hanks 20 ml. Centrifugar después de cada lavado y aspirar el sobrenadante.
    6. Contar los neutrófilos y resuspender las células en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 2% en 2 x 10 6 neutrófilos / ml o como se desee.

3. El enriquecimiento de la sangre neutrófilos usando perlas magnéticas

  1. La selección positiva
    1. Tomar 1 ml de sangre de un ratón como se describe en el Protocolo de 1,8, con una jeringa heparinizada.
    2. Centrifugar la sangre en un tubo cónico de 15 ml a 400 xg durante 5 min a TA.
    3. Aspirar el sobrenadante o mantener el plasma de la sangre para estudios adicionales.
    4. Lyse los eritrocitos por resuspensión de las células en agua grado HPLC 8 ml. Después de 30 seg restaurar la isotonicidad mediante la adición de 2 ml de 5x concentrated PBS que contenía 2,5% de BSA. Contar las células.
    5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
    6. Resuspender el sedimento celular en 200 l de PBS que contiene 0,5% de BSA y EDTA 2 mM por 10 8 células.
    7. Añadir 50 l de anticuerpo anti-Ly6G biotinilado. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en el refrigerador (no en el hielo).
    8. Añadir 150 l de PBS frío que contienen 0,5% de BSA y EDTA 2 mM.
    9. Vortex la solución de recubrimiento anti-biotina social microperla magnético. Transferir 100 l de la suspensión celular. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en el refrigerador (no en el hielo).
    10. Lavar las células mediante la adición de 10 ml de PBS que contienen 0,5% de BSA y EDTA 2 mM, y se centrifuga a 400 xg durante 10 min a TA.
    11. Aspirar el sobrenadante por completo, y resuspender en 500 l de PBS frío que contienen 0,5% de BSA y EDTA 2 mM.
    12. Inserte una columna de separación magnética en un soporte de imán que está unido a un soporte magnético, y enjuagarlo con 500 l de PBS frío que contenía 0.5% de BSA y EDTA 2 mM.
    13. Aplicar la suspensión celular en la columna. El flujo a través contiene células-LyG6 negativo no marcados.
    14. Lavar la columna con 500 l de PBS que contiene 0,5% de BSA y EDTA 2 mM. Células no marcadas, además, estarán en el flujo a través.
    15. Repetir la etapa de lavado con otros 500 l de PBS que contiene 0,5% de BSA y EDTA 2 mM.
    16. Retire la columna del imán y colocarlo en un tubo de recogida de 15 ml. Añadir 1 ml de PBS que contenía 0,5% de BSA y EDTA 2 mM, y eliminar las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna. El flujo a través de los neutrófilos contiene Ly6G +.
  2. La selección negativa
    1. Preparar leucocitos de sangre de acuerdo a los pasos 3.1.1 al 3.1.5.
    2. Resuspender 1 x 10 8 células en 1 ml de PBS que contienen 0,5% de BSA y EDTA 2 mM en un tubo de fondo redondo de 5 ml de poliestireno.
    3. Añadir 50 l de suero de rata normal.
    4. Añadir 50 l de enriquecimiento de neutrófilos cocktail (que contiene anticuerpos con biotina específica para las células blancas de la sangre no neutrófilos), mezclar bien e incubar durante 15 minutos en el refrigerador.
    5. Lavar las células mediante la adición de 4 ml de PBS que contenía 0,5% de BSA y EDTA 2 mM, y se centrifuga 400 xg durante 10 min.
    6. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de PBS que contienen 0,5% de BSA y EDTA 2 mM.
    7. Añadir 50 l de complejos de anticuerpos tetraméricos dirigidos contra biotina y dextrano. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en el refrigerador.
    8. Vortex bien el tubo que contiene perlas magnéticas recubiertas de dextrano antes de añadir 150 l de la suspensión celular. Mezclar bien e incubar 10 min en el refrigerador.
    9. Llevar la suspensión celular a un volumen total de 2,5 ml mediante la adición de PBS que contenía 0,5% de BSA y EDTA 2 mM. Mezclar suavemente para obtener una suspensión celular homogénea.
    10. Inserte el tubo (sin la tapa) en el imán, y dejar reposar durante 3 min.
    11. Invierta el imán con el tubo en una continuamovimiento de tal manera que las células no unidas en el fluido serán transferidos a un nuevo tubo. Deja el imán y tubo invertido por 2 - 3 segundos, y luego volver a la posición vertical. Las células no deseadas marcadas magnéticamente seguirán vinculados a la pared del tubo original, mientras que los neutrófilos no consolidados serán en el líquido transferido.

4. La tinción citológica de neutrófilos

  1. Resuspender 1x10 5 neutrófilos en 50 l de PBS y transferir la suspensión celular a un adaptador de preparación de células de capa fina, tal como un Cytospin. Centrifugar el adaptador a 150 xg durante 5 min. Separar el portaobjetos de vidrio pre-marcado del adaptador.
  2. Fijar las células por inmersión de los portaobjetos de vidrio en etanol al 70% durante 2 min. Permitir a los preparativos del adaptador (consulte el paso 4.1) para secar a temperatura ambiente antes de la tinción. Sumergir las preparaciones 5-6 veces en agua destilada.
  3. Teñir 1-2 minutos en una solución de hematoxilina de Mayer. Enjuague 1 min en el agua del grifo. Teñir 10 segundos en una solución de eosina Y . Lavar con agua del grifo. Deshidratar enjuagando las diapositivas en concentraciones crecientes de etanol (70%, 96% y 100%). Deje que el portaobjetos de vidrio con aire seco en breve e inspeccionar las diapositivas bajo un microscopio óptico.
    NOTA: Hematoxilina tiene un color azul-púrpura profunda y manchas ácidos nucleicos, mientras que es de color rosa y eosina tiñe las proteínas no específicamente. Los gránulos citoplásmicos de los neutrófilos permanecen sin teñir por colorantes ácidos o básicos, que es el origen del nombre de "amar al ser neutral '. Mientras que los granulocitos basófilos mancha azul oscuro con hematoxilina y eosina y Eosinophilc granulocitos rojo brillante, neutrófilos aparecen rosa neutro (Ver Figura 1). Los neutrófilos maduros se caracterizan por un núcleo polimorfonucleares, que es en general grande con 2 - 5 lóbulos 'neutrófilos segmentados' (Figura 1A y 1C). Los neutrófilos inmaduros se caracterizan por un núcleo curvada o en forma de anillo uno lóbulos (Figura 1B).
ve_title "> 5. Determinación de la pureza de los neutrófilos mediante citometría de flujo.

  1. Resuspender 1x10 6 células en 100 l de tampón FACS (PBS que contiene 0,5% de BSA, EDTA 2 mM y 0,02% NaN 3). Para muestras de sangre entera, se requiere hemólisis antes de la tinción (pasos 3.1.1 a 3.1.5). Añadir 10 l de reactivo de bloqueo para FcR 5 min.
  2. Añadir 0,5 g de anticuerpo marcado fluorescente con una especificidad para Ly-6G para los neutrófilos de ratón o para CD11b y CD66b para los neutrófilos humanos, mezclar bien e incubar durante 15 min a TA.
  3. Ajustar el volumen a 500 l con PBS que contenía 0,5% de BSA y EDTA 2 mM y analizar tinción por citometría de flujo.

6. Siga Puerta de neutrófilos in vivo

  1. En el etiquetado BrdU vivo de neutrófilos
    1. Inyectar 100 l de una solución 10 mg / ml de bromodesoxiuridina (BrdU) en PBS estéril por vía intraperitoneal a ratones portadores de tumores.
    2. Aislar los neutrófilos de sangre 48 horas después de la inyección de unegún Protocolo 2.1. Neutrófilos utilizando un kit de flujo BrdU a las manchas BrdU etiquetado.
  2. CFSE etiquetado de neutrófilos
    1. Resuspender 10 7 neutrófilos en 1 ml de PBS precalentado.
    2. Añadir 2 l de una solución mM CFSE 5 stock a los neutrófilos en suspensión a una concentración final de 10 mM. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 37 ° C. 5 mM CFSE se prepara disolviendo 2,8 mg de CFSE (5- (y 6 -) - carboxifluoresceína diacetato, succinimidil éster) en 1 ml de DMSO. Divida en 10 alícuotas en tubos estériles 200 ly tienda en la oscuridad a -20 ° C.
    3. Neutralizar el exceso de CFSE mediante la adición de un volumen igual de medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C. Centrifugar los neutrófilos a 400 xg durante 10 min a TA. Lavar los neutrófilos dos veces en 10 ml de RPMI-1640 que contienen 10% de FBS.
    4. Centrifugar a 400 xg durante 10 min y se resuspende en un volumen apropiado de PBS. Los neutrófilos (por ejemplo, 1 x 10 7

7. In vitro de ensayo de luciferasa para controlar la actividad antitumoral de los neutrófilos aislados.

  1. Cultivar las células tumorales de luciferasa marcado como se describe para las células 4T1 en Protocolo de 1.1 a 1.5, pero resuspender las células con tripsina disociado en un medio de suero reducido optimizado suplementado con 2% de FBS. Ajuste la densidad celular a 5 x 10 4 células por ml.
  2. Semilla 5000 células tumorales luciferasa marcado en 100 l optimizados medio de suero reducido que contiene 0,5% de SFB en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de fondo 96 plana blanco.
  3. 4 horas después de la siembra de las células tumorales, añadir 1 x 10 5 neutrófilos en 50 l optimizados medio de suero reducido que contienen 0,5% de FBS, y se incuba O / N. Preparar una suspensión celular de neutrófilos con una densidad de 2 x 10 6 células / ml. Los pocillos de control deben recibir 50 l medio sin neutrófilos. Hacermúltiples repeticiones de cada configuración experimental.
  4. A la mañana siguiente, aspirar con cuidado el sobrenadante y lavar cada pocillo con 200 l de PBS. Aspirar el PBS y añadir 50 l de tampón de lisis pasiva. Para las células fácilmente desprendimiento (como AT-3 células), no lavar en PBS y añadir el tampón de lisis de cultivo celular inmediatamente después de aspirar el medio de crecimiento.
  5. Cubrir la placa con papel de aluminio y se incuba en un agitador orbital a 150 rpm durante 20 min a TA.
  6. Colocar la placa en un lector de placas de luminiscencia. Inyectar bien sabia 50 solución de ensayo de luciferasa l, y leer la quimioluminiscencia durante 10 segundos por pocillo.
  7. Calcular el% de lisis tumoral mediante la siguiente fórmula:% de lisis tumoral = (1- [luminiscencia de las muestras con neutrófilos] / [luminiscencia de muestras en medio]) x 100%.

NOTA: Para evaluar la contribución de los neutrófilos a la siembra metastásica, los neutrófilos pueden agotarse según se describe en el protocolo 8.1. Para depl efectivaetion administrar anticuerpos de neutrófilos de ozono a partir del día 7 de injerto post-tumor.

Actividad 8. Anti-metastásica de neutrófilos en un modelo de ratón del cáncer de pecho.

  1. En vivo el agotamiento de los neutrófilos.
    1. Recién preparar 12,5 g de rata anticuerpo anti-Ly6G (neutrófilos anticuerpo ozono) o de anticuerpo control de isotipo de rata (IgG 2a, Κ) en solución salina en un volumen final de 100 l por ratón.
    2. A partir del día 3 injerto post-tumor inyectar una dosis diaria intraperitoneal de 12,5 g de rata anticuerpo anti-Ly6G (100 l). Inyectar ratones de control con o 12,5 g (100 l) de anticuerpo de control de isotipo de rata (IgG 2a, Κ).
    3. A partir del día 14, la administración de los anticuerpos dos veces al día, como la tasa de producción de neutrófilos aumenta dramáticamente cuando el tumor crece 4T1.
    4. Cada dos días, obtener una muestra de sangre (2 - 3 gotas) por mellar la cola-vena lateral. Recoger la sangre en un anti-coagulant tubo que contiene (heparina, citrato o EDTA).
    5. Verifique el agotamiento de los neutrófilos mediante citometría de flujo como se describe en el Protocolo 5.
  2. Tumor Neutralización Test (Modificado Winn Assay)
    1. Aislar los neutrófilos de ratones portadores de tumores. Mezclar 1 x 10 6 células tumorales y 3 x 10 6 neutrófilos en 50 l de solución salina (por ratón).
    2. Inyectar las células por vía subcutánea en el flanco de 6-8 semanas de edad ingenuos ratones BALB / c. Afeitarse el flanco antes del injerto tumoral para permitir mediciones precisas de tamaño del tumor. Medir el tamaño del tumor de partida diaria en el día 5 post-injerto.
  3. Neutrófilos transferencia adoptiva
    1. Inyectar 2 x 10 4 células tumorales que expresan luciferasa en 200 l de PBS a la vena de la cola.
    2. Transferencia de neutrófilos debe realizarse 4 horas después de la inyección de células tumorales. Por lo tanto, comenzar la purificación de HDN de los ratones portadores de tumor (protocolo 2.1) aproximadamente 2 horas antes de su prevista entransferencia vivo. Resuspender neutrófilos en PBS a una concentración final de 2,5 x 10 7 células / ml.
    3. 4 horas después de la introducción de las células tumorales colocan los ratones bajo una lámpara de calor durante 5 min. Coloca los ratones en una inmovilización e inyectar 5 x 10 6 HDN (200 l) a través de la vena de la cola. Los ratones de control se inyectaron con vehículo (PBS).
    4. Monitorear la formación de metástasis pulmonares en varios puntos de tiempo mediante el uso de un sistema de imágenes de bioluminiscencia en vivo o por inmunohistoquímica.
  4. Ensayo de siembra metastásica de pulmón
    1. Inyectar 0,5 a 1 x 10 6 células 4T1 parentales ortotópicamente en la almohadilla de grasa mamaria inguinal izquierda como se describe en el Protocolo 1.
    2. En el día 10, resuspender las células 4T1 que expresan GFP en PBS a una concentración final de 5 x 10 5 células / ml. Coloca los ratones bajo una lámpara de calor durante 5 minutos.
    3. Coloca los ratones en una inmovilización e inyectar 1x10 5 células 4T1 que expresan GFP (200 l) por vía intravenosa para 4T1 ratones portadores de tumores o ratones no tratados previamente.
    4. Al día siguiente, la eutanasia a los ratones y perfundir los pulmones con 20 ml de PBS para eliminar el resto de los glóbulos rojos.
    5. Extirpar los pulmones para el análisis de las células GFP-positivas mediante técnicas de inmunohistoquímica.
      NOTA: Para evaluar la contribución de los neutrófilos a la siembra metastásica, los neutrófilos pueden agotarse según se describe en el protocolo 8.1. Por agotamiento eficaz administrar anticuerpos de neutrófilos de ozono a partir del día 7 de injerto post-tumor.

9. Supresión de la proliferación de células T por los neutrófilos de ratones portadores de tumores.

  1. Retirar el bazo de un ingenuo BALB / c ratón y lugar sacrificados en 10 ml de PBS.
  2. Coloque el bazo en un filtro de células de 40 micras que es apto en una placa de Petri llena de medio RPMI-1640. Usando el extremo del émbolo de la jeringa, triturar el bazo a través de las células colador en la placa de Petri. Enjuague el filtro de células con 5 ml de RPMI. Deseche el filtro.
  3. Transferencia de las células resuspendidas en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar 400 xg durante 10 min.
  4. Descartar el sobrenadante, y lisar los eritrocitos mediante la suspensión de las células en 36 ml de agua pura durante 20 s, y ajustar a la isotonicidad mediante la adición de 4 ml de PBS concentra x 10. Alternativamente, lisar los eritrocitos mediante la suspensión de las células en 5 ml de eritrocitos tampón de lisis (ACK), e incubar 5 min a TA. Neutralizar el ACK mediante la adición de 10 ml de medio RPMI-1640. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a TA. Resuspender las células en 5 ml de PBS y contar las células.
  5. Resuspender los esplenocitos en PBS a una densidad final de 4 × 10 7 células / 2 ml en tubo de 15 ml. Añadir 2 ml de una solución de CFSE 2,5 M en PBS. Invertir rápidamente el tubo y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C con mezcla ocasional (cada 2 minutos), protegido de la luz.
  6. Inactivar el exceso de CFSE mediante la adición de 4 ml de FBS pre-calentado (100%) y se incuba durante 1 min a TA. Añadir 3 ml de PBS y centrifugar a 400 xg durante 10min.
  7. Lavar las células con 30 ml de PBS, y centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  8. Filtrar las células a través de un filtro de células de 40 micras y lavar de nuevo con PBS.
  9. Resuspender las células en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS a una densidad final de 2 x 10 7 células / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / pocillo (200 l) en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos.
  11. Estimular las células mediante la adición de 1 g de hámster armenio anticuerpo anti-ratón CD3ε purificada en 500 l RPMI-1640 con FBS al 10%.
  12. Añadir 2 x 10 6 HDN o LDN en 300 l RPMI-1640 con FBS al 10% a los esplenocitos marcadas con CFSE, y se incuba durante 3 días a 37 ° C. Wells sin neutrófilos deben recibir 300 l medio. Volumen total en cada pocillo debe ser 1 ml.
  13. Recoger las células y prepararlos para citometría de flujo. Resuspender las células en 100 l de tampón FACS (Protocolo 5), y añadir 10 l de FcR Reactivo de bloqueo. Incubar durante 5 min a TA.
  14. Añadir 1 &# 956; l de anticuerpo anti-CD8a APC-conjugado y se incuba durante 15 min a TA.
  15. Determinar la intensidad de fluorescencia CFSE en las células T CD8 + por citometría de flujo (Figura 5). La intensidad CFSE se redujo a la mitad en cada división celular. Así, el número de divisiones celulares se puede determinar mediante la intensidad de la tinción CFSE.

10. Ensayo de neutrófilos Migración

  1. Seed 5x10 5 células 4T1 en 7 ml optimizados suero reducido suplementado con 0,5% de FBS en un matraz de cultivo de 25 cm 2 de tejido e incubar 24 horas a 37 ° C.
  2. Transferir 800 l del sobrenadante a la cámara inferior de una placa de migración con un tamaño de poro de 5 micras.
  3. Resuspender 2 x 10 5 neutrófilos en 400 l de medio de suero reducido optimizado suplementado con 0,5% de FBS. Aplicar la suspensión de células a la cámara superior y se incuba durante 2 horas a 37 ° C.
  4. Al final de la incubación, retirar la cámara superior ycontar el número de neutrófilos que han migrado a la cámara inferior.

11. Monitoreo de neutrófilos Producción de especies reactivas del oxígeno (ROS).

  1. Preparar 1,1 x 10 6 neutrófilos / ml en solución salina equilibrada de Hank sin rojo de fenol. Placa de 180 l que contienen 2 x 10 5 neutrófilos en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano blanco.
  2. Colocar la placa en un lector de placas de luminiscencia. Añadir 20 l de una solución de Luminol 500 mM en PBS a cada pocillo para obtener una concentración final de 50 mM. Lea la quimioluminiscencia basal de 1 seg en un transcurso de tiempo de 5 minutos con intervalos de 10 seg.
  3. Añadir un estimulante (por ejemplo, PMA a una concentración de 10 nM o 100 nM o fMLP a una concentración de 10 mM). Preparar una solución concentrada 10x de cada agente en solución salina equilibrada de Hank sin rojo de fenol y añadir 22 l a los pocillos respectivos. Para controlar los pozos añaden 22 l vehículo.
  4. Measure la quimioluminiscencia en el lector de placas. No tanto un corto (cada 10 s durante 5 min) y una larga (cada minuto durante 1 hr) curso de tiempo.

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Representative Results

En un estudio reciente se identificó una función anti-metastásica de neutrófilos 6. Los neutrófilos de ratones portadores de tumores adquirir un fenotipo citotóxico y tienen la capacidad para matar las células tumorales 6. Esto está en contraste con los neutrófilos de ratones naïve que no tienen efecto anti-tumoral significativa 6. Varias de las técnicas descritas en la Sección de Protocolo se han utilizado para el estudio de la función de neutrófilos anti-tumor in vitro e in vivo 6.

Neutrófilos citotóxicos tumorales pueden ser obtenidos a partir de ratones portadores de tumores 6. Para lograr este objetivo, los ratones fueron inyectados con ortotópicamente 4T1 células en la almohadilla de grasa mamaria inguinal izquierda (Protocolo 1). Durante el día 21 posterior a la inoculación del tumor, el tumor primario alcanzó un tamaño de 1-2 cm 3 (Figura 3 - el tumor es evidente en el abdomen inferior izquierda). En este momento, los ratones fueron sacrificados y la sangre 1 ml se elaboró ​​(por ratón)por punción cardiaca (Figura 3). En paralelo, se ha elaborado la sangre de un ratón no tumoral devengo de ingenuo,. HDN se purificaron en un gradiente de densidad (Protocolo de 2.1 y la Figura 4) para producir un (> 98%) de la población de alta pureza de los neutrófilos. Viabilidad de neutrófilos se determinó por tinción con azul de tripano (Protocolo 2.1). Los neutrófilos se resuspendieron en medio de suero reducido optimizado que contiene 0,5% de FBS a 2 x 10 6 neutrófilos / ml.

Para probar la medida de la citotoxicidad de neutrófilos, hemos añadido 10 5 neutrófilos (50 l de un x 10 6 neutrófilos solución madre 2 / ml) para expresar luciferasa 4T1 células diana (5.000 células / pocillo en 100 l) en un fondo plano blanco 96 placa -bien (Protocolo 7). Después de una incubación O / N, las células se lavaron en PBS y se lisaron en tampón de lisis celular pasiva y la actividad de luciferasa en cada muestra se ensayó para evaluar el grado de citotoxicidad de neutrófilos ( (Figura 2B, libres de tumor), los neutrófilos purificó a partir de ratones portadores de tumores muestran una citotoxicidad significativa (Figura 2B, portador de un tumor).

Para probar las propiedades supresoras inmunitarias en LDN y HDN se utilizó el ensayo de proliferación de células T (Protocolo 9). Se evaluó lanúmero de células CD8 + en los esplenocitos no tratados y en los esplenocitos tratados con un anticuerpo αCD3, que se cultivaron solas y las células que se cultivaron en presencia de LDN o en presencia de HDN (Figura 5A-D). Tenga en cuenta el dramático aumento de las células CD8 + CFSE + tras la estimulación anti-CD3 (compare panel superior derecho en A y B) el efecto inhibitorio dramática de supresor LDN (compare panel superior derecho en B y C) y la falta de efecto inhibidor de HDN (panel D). También se evaluó el grado de retención de CFSE, como una indicación para la proliferación. En la Figura 5E, la curva de naranja presenta células no tratadas CD8 +, la curva azul CD8 + células, se trataron con anticuerpos αCD3, la curva roja CD8 + células estimuladas con αCD3 en presencia de LDN y la curva verde representa las células CD8 + estimuladas con α; CD3 en presencia de HDN. Tenga en cuenta el desplazamiento hacia la izquierda en las células tratadas αCD3 (curva azul) y el αCD3 trataron células cultivadas con HDN (curva verde), que indican la proliferación de células CD8 +.

Figura 1
Figura imagen de microscopía de luz de alta densidad (A) y los neutrófilos de baja densidad (B) se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E) después de la preparación de células de capa fina 1. Neutrófilos morfología.. Una microscopía electrónica de imagen (C) de transmisión (TEM) de un neutrófilo de alta densidad. La barra representa 1.000 nm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. recuento de neutrófilos de sangre aumentan con tumor progression y neutrófilos adquieren un fenotipo citotóxico. (A) El número de neutrófilos circulantes por 1 ml fue contado por FACS en varios días después de la inoculación de células tumorales en ratones BALB / c. El número de circulante CD11b + Ly6G + neutrófilos aumenta continuamente con la progresión de tumor 4T1. (B) células 4T1 de carcinoma de mama fueron co-cultivadas con neutrófilos de alta densidad de cualquiera de ratones naïve (libre de tumor) o 4T1 ratones portadores de tumor (portador de un tumor) ratones, o incubadas en un medio en ausencia de neutrófilos (Cont.) a 37 ° C durante 20 hrs. Los neutrófilos de ratones con tumores que lleva, pero no de los ratones libres de tumor, muestran citotoxicidad significativa hacia 4T1 células tumorales. Las barras de error representan ± SEM ** p <0,01 mediante la prueba t de un estudiante. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

"Figura Figura 3. Recolección de sangre murina mediante punción cardíaca. El ratón fue sacrificado en una cámara de inducción bajo lento flujo de CO 2. Inmediatamente después de que el ratón ha tomado su aliento terminal, que se coloca sobre su espalda y un 1 ml jeringa heparinizada se inserta en la base del esternón hasta llegar al corazón. Tire lentamente el émbolo para aspirar la sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. neutrófilos purificación de la sangre entera. (A) 3 ml de 1,077 g / ml de sacarosa es en capas cuidadosamente en la parte superior de 3 ml 1,119 g / ml de sacarosa para formar un gradiente discontinuo. Sangre murino entero, diluido en PBS-BSA (0,5%) a un volumen final de 6 ml, es entonces en capas en la parte superior de la 1,077 g / ml de sacarosa (B) Después de dar una vuelta de 30 minutos a 700 xg sin descanso, 3 fracciones distintas se pueden observar.; R - glóbulos rojos en el sedimento, G - la fracción granulocítica que contiene neutrófilos de alta densidad, M -. Fracción mononuclear que contiene células mononucleares y neutrófilos de baja densidad (C) recién obtenidas de sangre humana se mezcla con un volumen igual de Dextrano 500 ( 3%) y se incubaron a TA durante 30 min. La fracción superior que contiene las células blancas de la sangre (capa leucocitaria) se acoda a continuación, en la parte superior de 10 ml 1,077 g / ml de sacarosa (D) Después de dar una vuelta de 30 minutos a 400 xg sin descanso, se puede observar 2 fracciones distintas.; R + G - pastilla que contiene glóbulos rojos y neutrófilos de alta densidad, M -. Mononucleares fracción que contiene células mononucleares y neutrófilos baja densidad Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5
Figura 5. Supresión de la proliferación de células T. La citometría de flujo análisis que muestra el número de células marcadas con CFSE CD8 + cultivadas en ausencia de estímulo (A), después de la estimulación con el anticuerpo αCD3 en ausencia (B) o presencia de LDN (C) o HDN (D) (E) Presentación de histograma de la intensidad de CFSE en las células CD8 + a partir de paneles A -.. D Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los neutrófilos son las más abundantes de todas las células blancas de la sangre y son los primeros en responder en casos de infección y la inflamación. Como tales, son muy sensibles a las señales externas y se activan fácilmente. Además, los neutrófilos tienen una vida media muy corta y una rápida rotación. En conjunto, estas características plantean varias dificultades en el trabajo con los neutrófilos, de tal manera que se requieren estrategias experimentales únicas. Por ejemplo, hay varias estrategias de purificación de neutrófilos, cada uno con sus pros y sus contras.

Un paso crítico en el trabajo con los neutrófilos es su purificación a partir de sangre entera. Los neutrófilos pueden purificarse de manera eficiente ya sea utilizando gradientes de densidad o estrategias basadas en anticuerpos (positivos o negativos) de selección. Nuestro método de elección es el uso de gradientes de densidad, ya que produce un alto número de neutrófilos altamente purificadas con un mínimo de activación no específica. Sin embargo, como se muestra en un estudio reciente 21, ingenioneutrófilos progresión h tumorales acumulan en grandes cantidades en la fracción mononuclear de baja densidad. Bajo estas condiciones el uso de un gradiente de densidad proporciona una fracción de neutrófilos de alta densidad altamente puro, que no representa todo el repertorio de neutrófilos circulantes, y una fracción de neutrófilos de baja densidad que está fuertemente contaminado con otras células mononucleares (linfocitos y monocitos). Bajo estas circunstancias, el método de elección es una purificación basada en anticuerpos, preferiblemente de selección negativa. El uso de anticuerpos para purificar los neutrófilos produce neutrófilos altamente puros y mejor representa todo el repertorio de neutrófilos circulantes. Sin embargo, nos dimos cuenta de que cuanto más tiempo los neutrófilos se incubaron con los anticuerpos, las posibilidades de aumento de la activación no específica. Por lo tanto, sugerimos que para obtener mejores resultados, la purificación de los neutrófilos a base de anticuerpos debe realizarse lo más rápidamente posible. Purificación de neutrófilos a base de anticuerpos es también el método de elección cuando la PUrifying de neutrófilos a partir de tejidos o tumores.

Independientemente del procedimiento de purificación elegido, la pureza, la viabilidad y la integridad funcional deben ser rigurosamente evaluados. La pureza de los neutrófilos puede ser determinada por citometría de flujo utilizando anticuerpos que reaccionan con marcadores de superficie de los neutrófilos. En el ratón, Ly-6G es específico para los neutrófilos, que se caracterizan por un CD11b + Ly-6C bajo Ly-6G + F4 / 80 - fenotipo. Los neutrófilos humanos no expresan un marcador análoga a Ly-6G y, a menudo se caracterizan por la expresión de CD11b, CD15, CD16, CD66b y. Desde neutrófilos tienen receptores Fc, éstos deben ser bloqueados antes de inmunotinción. Los neutrófilos también se pueden distinguir de las otras células blancas de la sangre por tener un SSC superior. Viabilidad debe determinarse al final del proceso de purificación (azul tripán, protocolo 2.1) y debe ser siempre mayor que 98%. Integridad funcional debe ser determinado por purificación de los neutrófilos de los ratones no tratados previamente. Estos neutrófilos no se activan y proporcionan un control no citotóxico para los neutrófilos tumorales arrastradas en un entorno de co-cultivo con células tumorales (protocolo 7).

La corta vida media de los neutrófilos en la sangre junto con el bajo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 5) alcanzado entre el 1 ml de sangre de un inocente 6-8 semanas de edad ratón, han hecho difícil para explorar la función de neutrófilos en la sangre del ratón en vitro. Número de neutrófilos aumentan de manera constante en estados de inflamación y de vez en cuando en el cáncer, lo que representa un estado de inflamación crónica 7. Algunos investigadores han tratado de encontrar fuentes alternativas para los neutrófilos, como la médula ósea 20. Un alto número de neutrófilos de ratón puede ser obtenido dentro de 4-24 horas después de una inyección intraperitoneal de 1 ml de una solución de caldo de tioglicolato 3% o 1 ml de un 1 mg / ml Zymosan Una solución en solución salina. Pero estos neutrófilos provocados no ejercen unany actividad anti-tumorigénicos (observación no publicada).

. Granot et al 6 observó que los ratones BALB / c inoculados ortotópicamente con el carcinoma de mama de ratón 4T1 desarrollar neutrofilia que agrava al tiempo (Figura 2A), de tal manera que 20-40.000.000 neutrófilos de la sangre pueden ser fácilmente aislados de 1 ml 3 de la sangre - 4 semanas inoculación posterior al tumor. Estos neutrófilos han adquirido actividades anti-tumorales, y en consecuencia se han denominado neutrófilos tumorales-arrastrado (TEN), con el fin de distinguirlos de los neutrófilos tratados previamente (Figura 2B). Mientras que los neutrófilos de alta densidad (HDN) son altamente anti-tumorigénicos, los neutrófilos de baja densidad (LDN) generados en el contexto de cáncer no son 21. Neutrófilos de alta densidad de la médula ósea y el bazo de ratones portadores de tumores también tienen actividad anti-tumor (datos no publicados). Cabe señalar que con la progresión del tumor del bazo se vuelve gradualmente ampliada (esplenomegalia), con enarrugar cantidades de neutrófilos.

Con el fin de realizar el seguimiento del destino de los neutrófilos después de su transferencia adoptiva, estos deben ser etiquetados. Los neutrófilos pueden ser etiquetados in vivo mediante la inyección de bromodesoxiuridina (BrdU) en portadores de tumores o ratones naïve 2 días antes del aislamiento. BrdU es un análogo de la timidina precursor de ADN que se incorpora en el ADN recién sintetizado en células proliferantes. En el caso de los neutrófilos, BrdU se incorporará a la proliferación de células precursoras que conservan la tinción de BrdU cuando diferenciarse en neutrófilos post-mitóticas maduros. La BrdU incorporado se puede teñir usando anticuerpos fluorescentes anti-BrdU específicos. Las células BrdU + pueden ser analizados por citometría de flujo. Otro enfoque es etiquetar los neutrófilos aislados con un tinte rastreador celular tal como 5-carboxifluoresceína éster de N-succinimidilo (CFSE). CFSE es un compuesto éster que puede pasar a través de las membranas de células viables. Tiene una succinimida-amino reactivagrupo ilo que lleva a la unión de fluoresceína a las proteínas y otros grupos amino en la célula y la superficie de la célula covalente. Las células CFSE marcado pueden ser analizadas por citometría de flujo usando el láser de argón de 488 nm. Las dos técnicas de etiquetado difieren en el hecho de que el etiquetado BrdU depende de la proliferación de células precursoras, y no todos los neutrófilos circulantes será marcado, mientras que CFSE teñirá todas las neutrófilos. La detección de la CFSE es más sencilla que la tinción de BrdU, sin embargo etiquetado BrdU es un buen medio para seguir los inmaduros para madurar la conversión de los neutrófilos.

También hemos descrito varios métodos para determinar la función de anti-tumor y anti-metastática de los neutrófilos. Estos incluyen el agotamiento de los neutrófilos, la transferencia adoptiva de neutrófilos, prueba de neutralización del tumor y la metástasis de pulmón siembra ensayo. Cada uno de estos ensayos logra un aspecto específico de funciones de los neutrófilos anti-tumorales. Por ejemplo, Granot et al. 6 observó que al depletion de neutrófilos, se incrementa el número de metástasis pulmonares en 4T1 ratones portadores de tumores, lo que sugiere un papel para anti-metastática de los neutrófilos. Tras la transferencia adoptiva de neutrófilos, las células tumorales se inyectan por vía intravenosa 4 horas antes de la inyección de HDN purificada. La capacidad de las células tumorales para formar metástasis de pulmón e hígado son seguidos en un estudio del curso del tiempo utilizando un sistema de imagen óptica vivo en. Los ratones que recibieron HDN mostraron menos focos metastásicos que los ratones de control 6. En la prueba de neutralización del tumor, las células tumorales se inyectan por vía subcutánea con o sin HDN, la presencia de HDN reduce el crecimiento del tumor 21. En el ensayo de siembra metastásico, las células tumorales marcadas con GFP se inyectan por vía intravenosa en el control o pre-metastásicas ratones portadores de tumores de neutrófilos-agotado, y la capacidad de las células GFP-etiquetados para sembrar en el pulmón se determina. Los pulmones de los ratones portadores de tumores pre-metastásicas se caracterizan por una alta infiltración de neutrófilos que impide tumorla siembra de células en el órgano específico 6. Esto se traduce en más focos metastásicos en ratones con depleción de neutrófilos en comparación con los ratones portadores de tumores control.

Los protocolos descritos se centran en el estudio de la función de neutrófilos en el contexto del cáncer y proporcionar estrategias para evaluar las propiedades de neutrófilos relacionados con el cáncer, tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, las estrategias de purificación de neutrófilos, así como algunos de los procedimientos experimentales descritos pueden ser utilizados para estudiar la función de los neutrófilos en una amplia gama de ajustes experimentales donde los neutrófilos juegan un papel crítico (es decir, la inflamación y la infección).

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Acknowledgements

ZG es apoyada por las subvenciones del Programa de I-CORE de la Fundación de Ciencias de Israel (Grant No. 41/11), la Fundación Abisch-Frenkel, la rosales Trust, la Fundación de Investigación de Cáncer de Israel (ICRF - Premio al Desarrollo de Carreras de Investigación) y la fundación PREOCUPACIÓN. ZGF es apoyado por becas de la Fundación de Investigación del Cáncer de Israel (ICRF - Premio al Desarrollo de Carreras de Investigación), Jefe Científico del Ministerio de Salud de Israel y la Asociación del Pulmón Israel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

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References

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