Isolering och karakterisering av neutrofiler med Anti-tumöregenskaper

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., Fridlender, Z. G., Granot, Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofiler, den vanligast förekommande av samtliga vita blodkroppar i den humana cirkulationen, spelar en viktig roll i värdförsvar mot invaderande mikroorganismer. Dessutom neutrofiler spelar en central roll i immunövervakning av tumörceller. De har förmågan att känna igen tumörceller och inducera tumörcelldöd antingen genom en cellkontaktberoende mekanism som innefattar väteperoxid eller genom antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet (ADCC). Neutrofiler med antitumöraktivitet kan isoleras från perifert blod av cancerpatienter och hos tumörbärande möss. Dessa neutrofiler kallas tumörburna neutrofiler (TEN) för att skilja dem från neutrofiler av friska försökspersoner eller naiva möss som inte visar någon signifikant tumörcytotoxisk aktivitet. Jämfört med andra vita blodkroppar, neutrofiler visar olika flytkraft som gör det möjligt att erhålla en> 98% ren neutrofila populationen när det utsätts för en densitetsgradient. Men förutomden normala hög densitet neutrofila populationen (HDN), i cancerpatienter, i tumörbärande möss, samt under kroniska inflammatoriska tillstånd, olika låg densitet neutrofila populationer (LDN) återfinns i cirkulationen. LDN samrenas med den mononukleära fraktionen och kan separeras från mononukleära celler genom att använda antingen positiva eller negativa strategier för urvalet. När renheten hos de isolerade neutrofiler bestäms genom flödescytometri, kan de användas för in vitro-och in vivo-funktionella analyser. Vi beskriver metoder för övervakning av antitumöraktivitet av neutrofiler, deras förmåga att migrera och att producera reaktiva syreradikaler, samt att övervaka deras fagocytisk kapacitet ex vivo. Vi beskriver ytterligare metoder för att märka neutrofiler för in vivo-spårning, och för att bestämma deras anti-metastatiska kapacitet in vivo. Alla dessa tekniker är nödvändiga för att förstå hur du skaffar och karakterisera neutrofiler med antitumörfunktion.

Introduction

Neutrofiler ursprungligen karakteriserades som det medfödda immunceller, vilka fungerar som första linjens försvar mot invaderande mikroorganismer. Idag är det känt att neutrofiler har mer långtgående funktioner, vara delaktiga i montering adaptiva immunsvar mot främmande antigener 1,2, som reglerar blodbildningen 3, angiogenes 4 och sårläknings 5. Dessutom kan neutrofiler påverka tumörtillväxt och metastasutvecklingen i kraft av deras pro- och anti-tumöraktiviteter 6,7. Neutrofiler kännetecknas av en polymorf segmenterad kärna (därav kallas polymorfonukleära (PMN) leukocyter) och innehåller åtminstone tre distinkta underklasser av granulat samt sekretoriska vesiklar 8 (Figur 1A-C).

Neutrofiler har hög fagocytisk kapacitet och hög NADPH-oxidasaktivitet kritisk för mikrobiell eliminering, och utsöndrar ett brett spektrum av kemokiner som är viktiga för pådragning av ytterligare neutrofiler och andra immunceller till platsen för inflammation 8,9. Neutrofiler kännetecknas av uttrycket av en stor mängd av ytreceptorer inklusive Toll-liknande receptorer (TLRs), C-typ Lectin Receptorer (CLR), komplementreceptor 3 (CD11b / CD18) och andra adhesionsmolekyler (t.ex., L-selektin, LFA-1, VLA-4 och karcinoembryoantigen relaterade celladhesionsmolekyl 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokinreceptorer (t.ex. CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemoattraherande receptorer (t.ex. PAFR, LTB4 R och C5AR) , cytokinreceptorer (t.ex. G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptidreceptorer (t.ex. FPR1-3) och Fc-receptorer (t ex CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) och CD64 (FcyRI) 10. Hos möss är neutrofiler vanligen identifieras som CD11b + Ly6G +, medan humana neutrofiler identifieras med hjälp av CD11b, CD15, CD16 och CD66b leukocyter markörer. Det är också allmänt accepterat att färga för granulproteiner myeloperoxidas (MPO) och neutrofilelastas (NE) för detektering av neutrofiler i vävnader.

Det är fortfarande oklart om de olika funktionerna hos neutrofiler förmedlas av samma cell eller olika cellunderpopulationer. Ackumulerande data tyder på närvaron av en heterogen neutrofil population som uppvisar en hög grad av plasticitet som påverkas av pro-inflammatoriska stimuli och mikromiljön 11,12. Fridlender et al. 13 har grovt delas neutrofilerna i cancer i två stora delpopulationer kallas N1 med anti-tumöregenskaper och N2 med pro-tumöregenskaper. I cancer, såväl som vid kronisk inflammation, finns det ytterligare en subpopulation sammansatt av granulocytiska myeloida härledda suppressorceller (G-MDSCs) som undertrycker T-cellsvar 14. G-MDSCs anses vara omogna myeloidceller som kännetecknas av en CD11b + Ly6Clåg Ly6G hej fenotyp i möss 15, samtidigt som en CD15 + / CD16 låg fenotyp i mänsklig 16. G-MDSCs uttrycka högre nivåer av arginas och myeloperoxidas, medan lägre nivåer av cytokiner och kemokiner än normalt cirkulerande neutrofiler. De är mindre fagocytiska och flyttande, men ger högre nivåer av ROS 15,17,18. I föreliggande dokument kommer vi att beskriva några grundläggande metoder för isolering och karakterisering av neutrofiler med antitumöregenskaper.

Medan neutrofiler utgör den största befolkningen av alla vita blodkroppar i den mänskliga cirkulationen (45 - 70%, 1800 - 6000 / l), hos möss, under normala förhållanden, de är ganska glesa (10 - 15%, från 300 till 500 / il ). Neutrofilantalet ökar stadigt vid inflammation och ibland i cancer, som representerar ett tillstånd av kronisk inflammation 7. Neutrofiler utvecklas från multi gemensam myeloid föregångare (CMP) cells i benmärgen, genom en differentieringsprocess som passerar de olika stadierna i myeloblaster (MB), promyelocyter (PM), myelocyter (MC), metamyelocyter (MM) och bandceller (BC) 8. De mogna, efter mitotiska neutrofiler kan förbli i benmärgen 4 - 7 dagar innan de släpps till cirkulationen 8. Neutrofil omsättning i blodet är vanligtvis snabb med en genomsnittlig halveringstid på 6 - 12 timmar, som kan förlängas i enlighet med inflammatoriska tillstånd. Ostimulerade neutrofiler har begränsad anti-tumörframkallande aktivitet, en funktion som kan förvärvas genom att exponera de naiva neutrofiler till kemokinerna IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 och CXCL5 6,19 eller artificiellt, genom att utsätta dem för forbolestem forbol 12 -myristate 13-acetat (PMA) 6.

Den korta halveringstiden för blodneutrofiler tillsammans med det låga antalet neutrofiler (~ 3-5 x 10 5) uppnås från en ml blod från en naiv 6-8 veckor gammal mus, har gjort detsvårt att utforska funktionen av cirkulerande mus neutrofiler in vitro. För att övervinna denna svårighet har andra källor använts. Exempelvis kan ett stort antal neutrofiler erhållas från benmärg 20 eller bukhinnan efter induktionen av steril inflammation (t.ex., efter intraperitoneal injektion av tioglykolat buljong eller Zymosan A). Det bör noteras att neutrofiler erhållna från peritonealhålan inte utövar något antitumörframkallande aktivitet (opublicerad observation).

Et al. Granot 6 observerat att BALB / c-möss ympades ortotopiskt med musen 4T1 bröstkarcinom cellinjen utveckla neutrofili vilket förvärrar med tumörprogression 6 (figur 2A), så att 20 till 40.000.000 blodneutrofiler kan lätt isoleras från en ml blod 3-4 veckor efter tumörinokulering. Dessa neutrofiler har förvärvat anti-tumöraktiviteter, och har därför varit coibestämda tumörburna neutrofiler (TEN), i syfte att skilja dem från naiva neutrofiler 6 (Figur 2B). Medan hög densitet neutrofiler (HDN, Figur 1A) är starkt antitumörframkallande, låg densitet neutrofiler (LDN, Figur 1B) som genereras i samband med cancer är inte 21. Även hög densitet neutrofiler från benmärgen och mjälten hos tumörbärande möss har anti-tumöraktivitet (opublicerade data). Det bör noteras att med tumörprogression mjälten blir gradvis förstorad (splenomegali), med ökande mängder neutrofiler.

Det bör noteras att TEN genereras också i andra modeller av cancer inklusive både spontana (MMTV-pymt och MMTV-Wnt1 brösttumörer och K-Ras-drivna lungtumörer) och injicerades (AT-3 (MMTV-pymt) och E0771 bröstkarcinom celler, LLC Lewis lungkarcinomceller och B16-F10-melanomceller). Men omfattningen av neutrofila mobilisering i dessa tumeller modeller är betydligt mindre än i 4T1-ympade möss, når 5 - 10 x 10 6 neutrofiler i 1 ml blod efter 3 veckor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djur: 5-7 veckor gamla BALB / c-möss köptes från Harlan (Israel). Alla experiment på djur har godkänts av Hebrew University institutionella Djurvård och användning kommittén (IACUC). Mänskliga prov: Insamling av blod från cancerpatienter och friska försökspersoner godkändes av Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Induktion av neutrofiler med Anti-tumöregenskaper in vivo hjälp av en bröstcancer musmodell.

OBS: Alla steg ska utföras med hjälp av sterila lösningar i ett laminärt luftflöde (LAF) biosäkerhet skåp.

  1. Seed 5 x 10 5 4T1-celler i 100 mm vävnadsodlingsplatta i 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) innehållande 4,5 g / L D-glukos som kompletterats med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2 mM D- glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml penicillin G och 100 | ig / ml streptomycinsulfat. Inkubera the celler vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2 under 3 till 4 dagar. Säkerställa att cellerna är 50-100% sammanflytande på dagen för experimentet.
  2. Att lösgöra tumörcellerna från vävnadsodlingsplattan, aspirera odlingsmedium, tvätta cellerna med 5 ml PBS, aspirera PBS och tillsätt 3 ml av en 2,5 g / I trypsinlösning. Inkubera cellerna med 2 - 3 minuter med trypsin vid 37 ° C.
  3. Tillsätt 10 ml seruminnehållande medium för att neutralisera trypsin och pipettera upp och ner tills alla cellerna har lösgjorts. Överför celler suspensionen till en 15 ml koniskt centrifugrör.
  4. Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 min vid RT. Sug mediet lämnar 200 l mediet ovanför cellpelleten. Resuspendera cellerna i residualvolymen och tillsätt 10 ml PBS. Vänd röret 2-3 gånger för att få en homogen cellsuspension och ta ut 10 | il för att räkna cellerna i en hemocytometer. Använd trypanblått att skilja mellan levande och döda celler. Centrifugera cellsuspensionen under 5 min vid 200 xg vid rumstemperatur. Aspirera PBS och återsuspendera cellerna i PBS vid en slutlig koncentration av 2 x 10 6 celler / ml. Se till att encellssuspension har ingen klumpar.
  5. Injicera 1 x 10 6 4T1-celler eller luciferas-uttryckande 4T1-celler i 50 pl PBS ortotopiskt in i den vänstra inguinala bröstfettkudden av BALB / c-möss med användning av en 0,3 ml spruta med en 30G x 8 mm nål.
    1. Före injektion söva mössen i en induktionskammare som mottar en långsam flödeshastighet av isofluran (3-5%) i 100% syre.
    2. Lägg muspekaren över en steril kirurgisk pad och se till att huvudet är korrekt placerad inuti isofluran noskonen. Bekräfta korrekt anestesi genom att nypa tassen. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Raka håret runt injektionsstället och desinficera med 70% EtOH.
    3. Använd en steril uppsättning kirurgiska verktyg för att göra ett litet horisontellt snitt (5 mm) ca.imately halvvägs mellan inguinal och buken bröstvårtor, utsätta fettkudden och injicera 1 x 10 6 4T1 celler i 50 pl. Stäng snitt med 9 mm klipp som ska tas bort en vecka senare. Injektion av luciferas-uttryckande celler tillåter övervakning av tumörstorlek och metastasering av mareld avbildning.
      OBS: Denna minimalt invasivt förfarande kräver ingen efter-kirurgisk behandling och de injicerade mössen tillfrisknar inom 2-3 min.
    4. Övervaka möss tills de återfår medvetandet, och se till att de återfår fullt medvetande innan han började på företaget av andra möss.
  6. Efter 3 - 4 veckor, när den primära tumören har nått en volym på 2 cm 3, offra mössen genom en långsam CO2 ström, och omedelbart efter den sista andetag, få blod genom hjärtpunktion med användning av en 25G x 5/8 "nål förbunden med en tuberkulinspruta 1 ml förbehandlade med heparin. Håll mynningen av nålen uppåt när insättning avsprutan i horisontellt läge genom membranet mot hjärtat, och långsamt och gradvis dra blod undvika övertryck (Figur 3).

2. Neutrofil Isolering

  1. Isolering av cytotoxiska neutrofiler från blodet hos tumörbärande möss.
    1. Späd 1 ml blod tas från en tumörbärande mus (se protokoll 1,11) i PBS innehållande 0,5% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) till en slutlig volym av 6 ml.
    2. Fraktionering av utspätt blod på en nygjord diskontinuerligt sukrosgradient:
      1. Lägg 3 ml sterilfiltrerad sackaros 1,119 g / ml till botten av en 15 ml koniskt polypropen centrifugrör.
      2. Sakta och försiktigt, skikt 3 ml sterilfiltrerad sackaros 1,077 g / ml ovanpå 1.119 g / ml lager. Därefter, tillsätt långsamt och försiktigt de 6 ml utspätt blod (Protokoll 2.1.1) på toppen av 1,077 g / ml skikt (Figur 4A). Det rekommenderas att hålla röret lutas och endding de olika komponenterna av en långsam, men kontinuerligt flöde, hålla mynningen av pipetten mot den nedre väggen av röret, så att ingen turbulens bildas.
    3. Centrifugera röret innehållande den utspädda blod på sackarosgradient vid 700 xg under 30 min vid RT utan broms.
    4. Försiktigt bort röret från centrifugen utan att orsaka någon turbulens. De flesta av de erytrocyter kommer att vara på botten av röret. Hög densitet neutrofiler (HDN) finns som ett vitt till röd ring vid gränsytan mellan 1.119 g / ml och 1.077 g / ml skikt (runt 3 ml-märket), medan de låg densitet leukocyter återfinns i en vit ring vid gränsytan mellan den 1.077g / ml skiktet och det BSA-innehållande PBS (runt 6 ml-märket, se figur 4B).
    5. Aspirera PBS + 0,5% BSA tills den når 5 mm ovanför låg densitet cellskikt. Pipettera ut med låg densitet celler genom långsam sugning in i en 1 ml spets genom långsamt virvlande runt cellerna.Överföra celler i 30 ml PBS med 0,5% BSA.
    6. Aspirera det övre skiktet i samma lutning röret tills den når 5 mm över den med hög densitet cellband. Pipettera de hög densitet celler, som är mestadels hög densitet neutrofiler, och överföra cellerna till 30 ml PBS innehållande 0,5% BSA.
    7. Centrifugera cellerna vid 400 xg under 10 min vid RT.
    8. Aspirera supernatanten och lyserar erytrocyter genom återsuspendering av cellerna i 36 ml sterilt HPLC-kvalitet vatten under 30 sekunder. Isotonicitet bör återställas genom tillsats av 9 ml av en 5 x koncentrerad PBS kompletterad med 2,5% (vikt / volym) BSA.
    9. Centrifugera cellerna vid 400 xg under 10 min vid RT.
    10. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i PBS-BSA. Räkna antalet neutrofiler i en hemocytometer och använda trypanblått för att skilja mellan levande och döda celler.
    11. Centrifugera cellerna vid 400 xg under 10 min vid RT och resuspendera neutrofiler i önskad inkubationsmedium till slutlig celltäthet. Användningneutrofilerna omedelbart.
    12. Sedan, efter en centrifugering, resuspendera neutrofiler i inkubationsmedium till slutlig celltäthet. Använd neutrofiler omedelbart.
  2. Isolering av cirkulerande neutrofiler från cancerpatienter.
    1. Blanda 10 ml av hepariniserat (20 U / ml) humant blod med en lika stor volym av 3% Dextran T500 i saltlösning och inkubera under 30 min vid RT. Under denna inkubation erytrocyterna sedimenterar.
    2. Bered en 50 ml koniskt polypropenrör med 10 ml sackaros 1,077 g / ml och långsamt skiktet leukocyt-rika supematanten ovanpå 1,077 g / ml sackaros skikt (Figur 4C).
    3. Centrifugera vid 400 xg under 30 min vid RT utan broms. De med hög densitet neutrofiler (HDN) kommer att visas i pelleten. Låg densitet neutrofiler (LDN) samrenas med monocyter och lymfocyter vid gränsytan mellan den 1,077 g / ml sackaros skikt och plasma (Figur 4D).
    4. Resuspendera neutrofiler i 10 ml 0.2% NaCl under 30 sek för att lysera kontaminerande erytrocyter, och återställa isotonicitet genom tillsats 10 ml av 1,6% NaCl och invertera en gång.
    5. Centrifugera 5 min vid 160 xg vid rumstemperatur, och tvätta tre gånger i 20 ml Hanks balanserade saltlösning. Centrifugera efter varje tvätt och aspirera supernatanten.
    6. Räkna neutrofiler och återsuspendera cellerna i RPMI-1640 kompletterat med 2% FBS vid 2 x 10 6 neutrofiler / ml eller som önskas.

3. Anrikning av blodneutrofiler med användning av magnetiska pärlor

  1. Positiv selektering
    1. Ta 1 ml blod från en mus som beskrivs i protokoll 1.8, med en hepariniserad spruta.
    2. Centrifugera blodet i en 15 ml koniskt rör vid 400 xg under 5 min vid RT.
    3. Aspirera supernatanten eller hålla blodplasma för vidare studier.
    4. Lyse erytrocyterna genom att återsuspendera celler i 8 ml av HPLC-kvalitet vatten. Efter 30 sekunder åter isotonicitet genom att tillsätta 2 ml 5x concentrated PBS innehållande 2,5% BSA. Räkna cellerna.
    5. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT.
    6. Resuspendera cellpelleten i 200 | il PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA per 10 8 celler.
    7. Lägg 50 | il biotinylerad anti-Ly6G antikropp. Blanda väl och inkubera under 10 minuter i kylskåp (inte på is).
    8. Lägg 150 | il kall PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA.
    9. Vortex anti-biotin belagda magnetiska mikrokornet stamlösning. Överför 100 | j, l till cellsuspensionen. Blanda väl och inkubera under 15 minuter i kylskåp (inte på is).
    10. Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA och centrifugera vid 400 xg under 10 min vid RT.
    11. Aspirera supernatanten fullständigt, och återsuspendera i 500 pl kall PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA.
    12. Sätt en magnetisk separationskolonn i en magnethållare som är ansluten till en magnetisk monter, och skölj den med 500 pl kall PBS innehållande 0.5% BSA och 2 mM EDTA.
    13. Applicera cellsuspension på kolonnen. Genomflödet innehåller omärkta LyG6-negativa celler.
    14. Tvätta kolonnen med 500 | il PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA. Ytterligare omärkta celler kommer att vara i flödet genom.
    15. Upprepa tvättsteg med en annan 500 pl PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA.
    16. Ta bort kolumnen från magneten och placera den på en 15 ml provrör. Tillsätt 1 ml av PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA och spola ut de magnetiskt märkta cellerna genom att bestämt trycka in kolven i kolonnen. Flödet innehåller genom Ly6G + neutrofiler.
  2. Negativ selektion
    1. Förbered blodleukocyter enligt steg 3.1.1 till 3.1.5.
    2. Resuspendera 1 x 10 8 celler i 1 ml PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA i en 5 ml polystyren rundbottnad röret.
    3. Lägg 50 | il normalt råttserum.
    4. Tillsätt 50 pl neutrofila anrikning cocktail (innehållande biotinylerade antikroppar som är specifika för icke-neutrofila vita blodkroppar), blanda väl och inkubera under 15 minuter i kylskåp.
    5. Tvätta cellerna genom att tillsätta 4 ml PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA och centrifugera 400 xg under 10 minuter.
    6. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA.
    7. Lägg 50 pl av tetramera antikroppskomplex mot biotin och dextran. Blanda väl och inkubera under 10 minuter i kylskåp.
    8. Vortexa väl röret innehållande dextran-belagda magnetiska pärlor före tillsats 150 pl till cellsuspensionen. Blanda väl och inkubera 10 minuter i kylskåp.
    9. Bringa cellsuspensionen till en total volym av 2,5 ml genom tillsättning av PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA. Blanda försiktigt för att få en homogen cellsuspension.
    10. För in röret (utan locket) in i magneten och låt stå i 3 minuter.
    11. Vänd magneten med röret i en kontinuerligrörelse, så att de obundna cellerna i vätskan kommer att överföras till ett nytt rör. Lämna magneten och rör inverterad 2 - 3 sek, sedan tillbaka till upprätt läge. De magnetiskt märkta oönskade celler kommer att förbli bunden till väggen av den ursprungliga röret, medan de obundna neutrofiler kommer att vara i den överförda fluiden.

4. Cytologisk Färgning av neutrofiler

  1. Resuspendera 1x10 5 neutrofiler i 50 pl PBS och överför cellsuspensionen till en tunnskiktscellberedningen adapter såsom en Cytospin. Centrifugera adaptern vid 150 xg under 5 minuter. Separera den pre-märkta glasskiva från adaptern.
  2. Fix celler genom doppning av objektglas i 70% etanol under 2 minuter. Låt förberedelserna från adaptern (se steg 4.1) att torka vid rumstemperatur före färgning. Doppa dem 5-6 gånger i destillerat vatten.
  3. Stain 1 - 2 min i Mayers hematoxylin-lösning. Skölj en min i kranvatten. Färga 10 sek i Eosin Y-lösning . Tvätta i kranvatten. Torka genom att skölja bilderna i ökande etanolkoncentrationer (70%, 96% och 100%). Låt objektglas lufttorka kort och inspektera bilderna under ett ljusmikroskop.
    OBS: Hematoxylin har en djup blålila färg och fläckar nukleinsyror, medan eosin är rosa och färgar proteiner ospecifikt. De cytoplasmiska korn av neutrofiler förblir ofärgade av sura eller basiska färgämnen, som är ursprunget till namnet "älska att vara neutral". Av följande skäl basofila granulocyter fläcken mörkblå med hematoxylin och eosin och eosinophilc granulocyter klarröd, neutrofiler verkar neutral rosa (se figur 1A). Mogna neutrofiler kännetecknas av en polymorfonukleära kärna, som är i allmänhet stort med 2-5 lober "segmenterade neutrofiler" (Figur 1A och 1C). Omogna neutrofiler kännetecknas av en en-flikig krökta eller ringformiga kärnan (Figur 1B).
ve_title "> 5. Fastställande av renhet av neutrofiler genom flödescytometri.

  1. Resuspendera 1x10 6 celler i 100 | il FACS-buffert (PBS innehållande 0,5% BSA, 2 mM EDTA och 0,02% NaN3). För hela blodprov, är hemolys krävs innan färgning (steg 3.1.1 till 3.1.5). Lägg 10 pl av FcR Blocking Reagent under 5 min.
  2. Lägg 0,5 pg av fluorescensmärkt antikropp med en specificitet för Ly-6G för mus neutrofiler eller CD11b och CD66b för humana neutrofiler, blanda väl och inkubera under 15 min vid RT.
  3. Justera volymen till 500 pl med PBS innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA och analysera färgning genom flödescytometri.

6. Följ Neutrofil Gate in vivo

  1. In vivo-BrdU-märkning av neutrofiler
    1. Injicera 100 | il av en 10 mg / ml bromodeoxyuridin (BrdU) lösning i steril PBS intraperitonealt till tumörbärande möss.
    2. Isolera blodneutrofiler 48 timmar efter injektion anligt protokoll 2.1. Stain BrdU-märkta neutrofiler med en BrdU flödessats.
  2. CFSE märkning av neutrofiler
    1. Resuspendera 10 7 neutrofiler i 1 ml förvärmda PBS.
    2. Lägg 2 pl av en 5 mM CFSE stamlösning till de suspenderade neutrofiler till en slutlig koncentration av 10 | iM. Blanda väl och inkubera under 15 minuter vid 37 ° C. 5 mM CFSE framställes genom upplösning av 2,8 mg CFSE (5- (och 6 -) - karboxifluorescein-diacetat, succinimidylester) i 1 ml DMSO. Dela i 10 l alikvoter i sterila 200 il rör och förvara i mörker vid -20 ° C.
    3. Neutralisera överskott CFSE genom tillsats av en lika stor volym av RPMI-1640 innehållande 10% FBS. Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C. Centrifugera neutrofilerna vid 400 xg under 10 min vid RT. Tvätta neutrofiler två gånger i 10 ml RPMI-1640 innehållande 10% FBS.
    4. Centrifugera vid 400 xg under 10 min och återsuspendera i en lämplig volym PBS. De neutrofiler (t.ex. 1 x 10 7

7. In vitro Luciferase analys för att övervaka den antitumöraktivitet av isolerade neutrofiler.

  1. Odla luciferas-märkta tumörceller såsom beskrivits för 4T1-celler i protokoll 1,1-1,5, men resuspendera trypsinliknande dissocierade celler i optimerad reducerat serummedium kompletterat med 2% FBS. Justera celldensiteten till 5 x 10 4 celler per ml.
  2. Seed 5000 luciferas-märkta tumörceller i 100 | il optimerade reducerat serummedium innehållande 0,5% FBS i varje brunn av en vit 96-flatbottnad vävnadsodlings brunnar.
  3. 4 timmar efter ympning av tumörcellerna, tillsätt 1 x 10 5 neutrofiler i 50 pl optimerade reducerat serummedium innehållande 0,5% FBS och inkubera O / N. Förbered en neutrofila cellsuspensionen med en densitet av 2 x 10 6 celler / ml. Kontrollbrunnar bör få 50 il medium utan neutrofiler. Göramultipla upprepningar av varje experimentell inställning.
  4. På följande morgon, försiktigt aspirera supernatanten och tvätta varje brunn med 200 pl PBS. Aspirera PBS och tillsätt 50 pl passiv lysbuffert. För lätt lossnar celler (såsom AT-3-celler), inte tvätta i PBS och tillcellodlings lysbuffert omedelbart efter aspiretillväxtmediet.
  5. Täck plattan med aluminiumfolie och inkubera den på en orbital skakanordning vid 150 rpm under 20 min vid RT.
  6. Placera plattan i en luminiscens plattläsare. Injicera väl klokt 50 il luciferas analyslösningen och läs kemiluminiscensen för 10 sek per brunn.
  7. Beräkna% tumörlys med följande formel:% tumörlys = (1- [luminiscens av prover med neutrofiler] / [luminiscens av prover i medium]) x 100%.

OBS: För att bedöma bidrag neutrofiler till metastaserande sådd kan neutrofiler vara uttömda som beskrivs i protokoll 8.1. För effektiv depletion administrera neutrofila nedbrytande antikroppar som börjar på dag 7 efter tumör engraftment.

8. Anti-metastaserad aktivitet av neutrofiler i en bröstcancer musmodell.

  1. In vivo-utarmning av neutrofiler.
    1. Färskt förbereda 12,5 pg av rått-anti-Ly6G antikropp (neutrofil utarmande antikropp) eller rått-isotyp kontrollantikropp (IgG 2a, Κ) i saltlösning vid en slutlig volym av 100 | il per mus.
    2. Med start på dag 3 efter tumör inympning injicera dagligen en intraperitoneal dos av 12,5 | ag rått-anti-Ly6G antikropp (100 | il). Spruta kontrollmöss med eller 12,5 mikrogram (100 pl) råtta isotypkontrollantikropp (IgG 2a, Κ).
    3. Med början dag 14, administrera antikropparna två gånger dagligen, såsom den neutrofila produktionshastigheten ökar dramatiskt när 4T1 tumören växer.
    4. Varannan dag, erhålla ett blodprov (2-3 droppar) genom hack den laterala svans ven. Samla upp blod i en anti-coagulant innehållande rör (Heparin, citrat eller EDTA).
    5. Kontrollera neutrofila utarmning med användning av flödescytometri som beskrivs i protokoll 5.
  2. Tumör neutralisering Test (Ändrad Winn-analys)
    1. Isolera neutrofiler från tumörbärande möss. Blanda 1 x 10 6 tumörceller och 3 x 10 6 neutrofiler i 50 pl saltlösning (per mus).
    2. Injicera cellerna subkutant till flanken av 6 - 8 veckor gamla naiva Balb / c möss. Raka flanken före tumör inympning att möjliggöra noggranna mätningar av tumörstorlek. Mät tumörstorlek dagliga start på dag 5 efter inympning.
  3. Neutrofil adoptiv överföring
    1. Injicera 2 x 10 4 luciferas-uttryckande tumörceller i 200 pl PBS i svansvenen.
    2. Neutrofil överföring bör utföras 4 timmar efter tumörcellinjektion. Därför startar rening av HDN från tumörbärande möss (protokoll 2,1) ca 2 timmar innan de planerade ivivo överföring. Resuspendera neutrofiler i PBS vid en slutlig koncentration av 2,5 x 10 7 celler / ml.
    3. 4 timmar efter att införa tumörcellerna placera mössen under en värmelampa under 5 min. Placera mössen i en restrainer och injicera 5 x 10 6 HDN (200 | il) via svansvenen. Kontrollmöss injicerades med vehikel (PBS).
    4. Övervaka bildandet av lungmetastaser vid olika tidpunkter genom att använda en bioluminiscens in vivo-avbildningssystemet eller genom immunhistokemi.
  4. Lung metastatisk ympning analys
    1. Spruta 0,5-1 x 10 6 föräldra 4T1 celler ortotopiskt i den vänstra inguinala bröstfettkudden som beskrivs i protokoll 1.
    2. På dag 10, återsuspendera GFP-uttryckande 4T1-celler i PBS vid en slutlig koncentration av 5 x 10 5 celler / ml. Placera möss under en värmelampa under 5 min.
    3. Placera möss i fixerings och injicera 1x10 5 GFP-uttryckande 4T1-celler (200 pl) intravenöst till 4TEn tumörbärande möss eller naiva möss.
    4. Dagen därpå, euthanize möss och BEGJUTA lungorna med 20 ml PBS för att avlägsna återstående RBC.
    5. Punktskatter lungorna för analys av GFP-positiva celler genom immunohistokemi.
      OBS: För att bedöma bidrag neutrofiler till metastaserande sådd kan neutrofiler vara uttömda som beskrivs i protokoll 8.1. För effektiv utarmning administrera neutrofila nedbrytande antikroppar som börjar på dag 7 efter tumör engraftment.

9. Undertryckande av T-cellsproliferation genom Neutrofiler från tumörbärande möss.

  1. Ta bort mjälten från en avlivas naiv BALB / c-mus och placera i 10 ml PBS.
  2. Placera mjälten på ett 40 | im cellfilter som är lämplig på en petriskål fylld med RPMI-1640. Med användning av kolvänden hos sprutan, mosa mjälten genom cellerna sil i petriskålen. Skölj cellen silen med 5 ml RPMI. Kasta silen.
  3. Överför de resuspenderade cellerna till ett 50 ml koniskt rör och centrifugera 400 xg under 10 minuter.
  4. Kasta bort supernatanten och lysera erytrocyterna genom att suspendera celler i 36 ml rent vatten under 20 s, och justera till isotonicitet genom tillsats 4 ml PBS koncentrerad x 10. Alternativt lysera erytrocyter genom att suspendera cellerna i 5 ml erytrocyt lyseringsbuffert (ACK), och inkubera 5 min vid rumstemperatur. Neutralisera ACK genom tillsats 10 ml RPMI-1640-medium. Centrifugera vid 400 xg under 10 min vid RT. Resuspendera cellerna i 5 ml PBS och räkna cellerna.
  5. Resuspendera splenocyterna i PBS till en slutlig densitet av 4 x 10 7 celler / 2 ml i 15 ml rör. Lägg 2 ml av en 2,5 uM CFSE lösning i PBS. Snabbt vända röret och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C med tillfällig blandning (varje 2 min), skyddad mot ljus.
  6. Släck överskott CFSE genom tillsats 4 ml förvärmd FBS (100%) och inkubera under 1 min vid rumstemperatur. Lägg 3 ml PBS och centrifugera vid 400 xg under 10min.
  7. Tvätta cellerna med 30 ml PBS och centrifugera vid 400 xg under 10 minuter.
  8. Filtrera cellerna genom en 40 ìm cell sil och tvätta igen med PBS.
  9. Resuspendera cellerna i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% FBS till en slutlig densitet av 2 x 10 7 celler / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / brunn (200 | il) i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta.
  11. Stimulera cellerna genom att tillsätta 1 | ig av renad Armenian hamster-anti-mus-CD3s antikropp i 500 ^ il RPMI-1640 med 10% FBS.
  12. Lägg 2 x 10 6 HDN eller LDN i 300 | il RPMI-1640 med 10% FBS till CFSE-märkta splenocyter, och inkubera under 3 dagar vid 37 ° C. Wells utan neutrofiler bör få 300 ul medium. Total volym i varje brunn bör vara 1 ml.
  13. Samla cellerna och förbereda dem för flödescytometri. Resuspendera cellerna i 100 pl FACS buffert (protokoll 5), och tillsätt 10 pl FcR Blocking Reagent. Inkubera under 5 min vid RT.
  14. Tillsätt 1 &# 956; il av APC-konjugerad anti-CD8a-antikropp och inkubera under 15 min vid RT.
  15. Bestäm CFSE fluorescensintensiteten på CD8 + T-celler från flödescytometri (figur 5). Den CFSE intensitet halveras vid varje celldelning. Sålunda kan det antal celldelningar bestämmas genom intensiteten av CFSE färgning.

10. neutrofilmigrationen analys

  1. Seed 5x10 5 4T1-celler i 7 ml optimerade reducerat serummedium kompletterat med 0,5% FBS i en 25 cm 2 vävnadsodlingskolv och inkubera 24 timmar vid 37 ° C.
  2. Överför 800 | il av supernatanten till den nedre kammaren av en övergångsplatta med en porstorlek av 5 | am.
  3. Resuspendera 2 x 10 5 neutrofiler i 400 pl optimerad reducerat serummedium kompletterat med 0,5% FBS. Applicera cellsuspension till den övre kammaren och inkubera i 2 h vid 37 ° C.
  4. Vid slutet av inkubationen, ta bort den övre kammaren ochräkna antalet neutrofiler som har migrerat till den nedre kammaren.

11. Övervakning Neutrofil produktionen av reaktiva syreradikaler (ROS).

  1. Bered 1,1 x 10 6 neutrofiler / ml i Hanks balanserade saltlösning utan fenolrött. Plattan 180 | il innehållande 2 x 10 5 neutrofiler i varje brunn i en vit 96-flatbottnad brunnar.
  2. Placera plattan i en luminiscens plattläsare. Lägg 20 | il av en 500 pM Luminol lösning i PBS till varje brunn för att få en slutlig koncentration av 50 ^ M. Läs den basala kemiluminescensen för 1 sekund under en tidsperiod av 5 min med 10 sek intervall.
  3. Lägg ett stimulerande (t.ex. PMA vid en koncentration av 10 nM eller 100 nM eller fMLP vid en koncentration av 10 | iM). Bered en 10x koncentrerad lösning av varje medel i Hanks balanserade saltlösning utan fenolrött och tillsätt 22 | il till respektive brunnar. Till kontrollbrunnar lägga 22 ul fordon.
  4. Measure kemiluminiscensen i plattläsare. Gör både en kort (var 10 sekund under 5 min) och en lång (varje minut under 1 timme) tidsförloppet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en nyligen genomförd studie identifierade vi en anti-metastaserande funktion för neutrofiler 6. Neutrofiler från tumörbärande möss förvärva en cytotoxiska fenotyp och har förmåga att döda tumörceller 6. Detta är i motsats till neutrofiler från naiva möss som inte har någon signifikant antitumöreffekt 6. Flera av de tekniker som beskrivits i protokollenheten har använts för att studera antitumör neutrofil funktion in vitro och in vivo-6.

Tumörcytotoxisk neutrofiler kan erhållas från tumörbärande möss 6. För att uppnå detta mål, möss ortotopiskt injicerades med 4T1 celler i den vänstra ljumsken bröstfettkudden (protokoll 1). Vid dag 21 efter tumörinokulering, den primära tumören nådde en storlek av 1 - 2 cm 3 (Figur 3 - tumören är uppenbart i den nedre vänstra delen av buken). Vid denna tidpunkt, mössen avlivades och 1 ml blod drogs (per mus)genom hjärtpunktion (fig 3). Parallellt togs blod från en naiv, icke-tumörbärande mus dras. HDN renades sedan på en densitetsgradient (protokoll 2,1 och figur 4) för att ge en mycket ren (> 98%) population av neutrofiler. Neutrofil livskraft bestämdes genom Trypan-blåfärgning (protokoll 2,1). Neutrofilerna återsuspenderades sedan i optimerad minskat serummedium innehållande 0,5% FBS vid 2 x 10 6 neutrofiler / ml.

För att testa omfattningen av neutrofila cytotoxicitet, har vi lagt 10 5 neutrofiler (50 ^ från en 2 x 10 6 neutrofiler / ml stamlösning) för att luciferas uttrycka 4T1 målceller (5000 celler / brunn i 100 ^) i en flatbottnad vit 96 -Ja platta (protokoll 7). Efter en O / N-inkubering, tvättades cellerna i PBS och lyserades i passiv cellysbuffert och luciferasaktiviteten i varje prov testades för att utvärdera omfattningen av neutrofil cytotoxicitet ( (Figur 2B, tumörfria), renade neutrofiler från tumörbärande möss visar signifikant cytotoxicitet (figur 2B, tumörbärande).

För att testa immunhämmande egenskaper i LDN och HDN vi använde T-cellprolifereringsanalys (protokoll nr 9). Vi utvärderadeantalet CD8 + celler i obehandlade splenocyter och i splenocyter behandlade med en aCD3 antikropp, som var odlade ensam och celler som odlades i närvaro av LDN eller i närvaro av HDN (figur 5A-D). Observera den dramatiska ökningen av CD8 + CFSE + celler efter anti-CD3-stimulering (jämför övre högra panelen i A och B) den dramatiska hämmande effekten av suppressiv LDN (jämför övre högra panelen i B och C) och avsaknaden av inhiberande effekten av HDN (fält D). Vi utvärderade även omfattningen av CFSE retention, som en indikation för spridning. I fig 5E, presenterar den orange kurvan obehandlade CD8 + -celler, den blå kurvan CD8 * celler, behandlades med aCD3 antikroppar, den röda kurvan CD8 + celler stimulerade med aCD3 i närvaro av LDN och den gröna kurvan representerar CD8 + celler stimulerade med α; CD3 i närvaro av HDN. Notera den vänstra skift i aCD3 behandlade celler (blå kurva) och aCD3 behandlade celler odlade med HDN (grön kurva), som tyder på CD8 + celltillväxt.

Figur 1
(C) Ett transmissionselektronmikroskop (TEM) bild Figur 1. Neutrofil morfologi. Ljusmikroskopi bild av hög densitet (A) och låg densitet neutrofiler (B) färgades med hematoxylin och eosin (H & E) efter beredning tunnskiktscell. av en hög densitet neutrofila. Baren representerar 1.000 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Blod neutrofila granulocyter ökar med tumör progression och neutrofiler förvärva en cytotoxisk fenotyp. (A) Det cirkulerande neutrofila antal per 1 ml räknades med FACS vid olika dagar efter tumörcell inokulering i BALB / c-möss. Antalet cirkulerande CD11b + Ly6G + neutrofila ökar kontinuerligt med 4T1 tumörprogression. (B) 4T1 bröstkarcinomceller samodlades med hög densitet neutrofiler från antingen naiva möss (tumörfria) eller 4T1 tumörbärande möss (tumörbärande) möss eller ruvade i medium i frånvaro av neutrofiler (forts.) vid 37 ° C under 20 timmar. Neutrofiler för tumörbärande möss, men inte från tumörfria möss, visar signifikant cytotoxicitet mot 4T1 tumörceller. Felstaplar representerar ± SEM ** p <0,01 med hjälp av en t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Bild Figur 3. Insamling av murint blod via hjärtpunktion. Musen avlivades i en induktionskammare under långsam CO2 flöde. Omedelbart efter det att musen har tagit sin terminal andetag, är det läggas på rygg och en 1 ml hepariniserad spruta sätts in vid basen av bröstbenet tills den når hjärtat. Dra långsamt på kolven för att aspirera blod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Neutrofil rening från helblod. (A) 3 ml av 1,077 g / ml sackaros försiktigt skiktad ovanpå 3 ml 1,119 g / ml sukros för att bilda en diskontinuerlig gradient. Sammanlagt murint blod, späddes i PBS-BSA (0,5%) till en slutlig volym av 6 ml, är därefter skiktad ovanpå 1,077 g / ml sackaros (B) Efter en 30 minuters centrifugering vid 700 xg utan avbrott, 3 distinkta fraktioner kan observeras. R - röda blodkroppar i pelleten, G - den granulocytiska fraktionen innehållande hög densitet neutrofiler, M -. Mononukleära fraktionen innehållande mononukleära celler och låg densitet neutrofiler (C) Nytaget humant blod blandas med en lika stor volym Dextran 500 ( 3%) och inkuberades vid RT under 30 minuter. Toppfraktionen innehållande de vita blodkropparna (buffy coat) därefter skiktas på toppen av 10 ml 1,077 g / ml sackaros (D) Efter en 30 minuters centrifugering vid 400 x g utan avbrott, kan observeras två distinkta fraktioner.; R + G - pellet innehållande röda blodkroppar och hög densitet neutrofiler, M -. Mononukleära fraktionen som innehåller mononukleära celler och låg densitet neutrofiler Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5
Figur 5. Hämning av T-cellsproliferation. Flödescytometri analyser som visar antalet CFSE-märkta CD8 + -celler odlade i frånvaro av stimulus (A), efter stimulering med aCD3 antikropp i frånvaro (B) eller närvaro av LDN (C) eller HDN (D) (E) Histogram presentation av CFSE intensitet i CD8 + celler från panelerna A -.. D Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofiler är den vanligast förekommande av alla vita blodkroppar och är de första responders i fall av infektion och inflammation. Som sådana är de mycket känsliga för yttre signaler och är lätt aktiveras. Dessutom neutrofiler har en mycket kort halveringstid och en snabb omsättning. Tillsammans utgör dessa egenskaper upp flera svårigheter att arbeta med neutrofiler, så att unika experimentella strategier krävs. Till exempel finns det flera neutrofila strategier renings, alla med sina egna fördelar och nackdelar.

Ett kritiskt steg i arbetet med neutrofiler är deras rening från helblod. Neutrofiler kan effektivt renas med användning av antingen densitetsgradienter eller antikroppsbaserade strategier (positiva eller negativa urval). Vår metod för val är användningen av densitetsgradienter, eftersom den ger ett stort antal starkt renade neutrofiler med minimal icke-specifik aktivering. Men som vi visar i en ny studie 21, intelligensh tumörprogression neutrofiler ansamlas i stora mängder i den mononukleära låg densitet fraktionen. Under dessa betingelser användning av en densitetsgradient ger en högren hög densitet neutrofil fraktion, betyder det inte representerar hela cirkulerande neutrofila repertoar, och en låg-densitet neutrofil fraktion som är starkt förorenade med andra mononukleära celler (lymfocyter och monocyter). Under dessa omständigheter den metod man väljer är en antikropp-baserad rening, företrädesvis negativ selektering. Användningen av antikroppar för att rena neutrofiler ger högrena neutrofiler och bättre representerar hela cirkulerande neutrofila repertoar. Men vi märkte att ju längre neutrofilerna inkuberas med antikroppar, chanserna för icke-specifik ökning aktivering. Vi föreslår därför att för bästa resultat, bör antikroppsbaserad neutrofila rening utföras så snabbt som möjligt. Antikroppsbaserade neutrofila rening är också den metod som när purifying neutrofil från vävnader eller tumörer.

Oavsett reningsförfarande som valts, renhet, livskraft och funktionella integritet måste noggrant utvärderas. Renheten av neutrofiler kan bestämmas genom flödescytometri med användning av antikroppar som reagerar med neutrofil ytmarkörer. I mus, är Ly-6G specifik för neutrofiler, som kännetecknas av en CD11b + Ly-6C låg Ly-6G + F4 / 80 - fenotyp. Humana neutrofiler inte uttrycka en markör som är analogt med Ly-6G och ofta kännetecknas av uttrycket av CD11b, CD15, CD16 och CD66b. Eftersom neutrofiler har Fc-receptorer, dessa måste blockeras innan immunfärgning. Neutrofiler kan också särskiljas från de andra vita blodkroppar genom att ha en högre SSC. Viabilitet bör bestämmas vid slutet av reningsprocessen (trypanblått, protokoll 2.1) och bör vara konsekvent högre än 98%. Funktionell integritet bör bestämmas av purifiering av neutrofiler från naiva möss. Dessa neutrofiler aktiveras inte och tillhandahålla icke-cytotoxiska kontroll för tumörburna neutrofiler i en co-kultur miljö med tumörceller (protokoll 7).

Den korta halveringstiden för blodneutrofiler tillsammans med det låga antalet neutrofiler (~ 3-5 x 10 5) uppnås från en ml blod från en naiv 6-8 veckor gammal mus, har gjort det svårt att utforska musblod neutrofil funktion i vitro. Neutrofila siffror ökar stadigt i delstaterna inflammation och ibland i cancer, som representerar ett tillstånd av kronisk inflammation 7. Vissa forskare har försökt hitta alternativa källor för neutrofiler, såsom benmärgen 20. Ett högt antal mus neutrofiler kan erhållas inom 4-24 h efter en intraperitoneal injektion av 1 ml av en 3% tioglykollat ​​buljong lösning eller 1 ml av en 1 mg / ml Zymosan En lösning i saltlösning. Men dessa framkallade neutrofiler inte utövar enny anti-tumörframkallande aktivitet (opublicerad observation).

Et al. Granot 6 observerat att BALB / c-möss ympades ortotopiskt med musen 4T1 bröstkarcinom utveckla neutrofili vilket förvärrar vid tiden (figur 2A), så att 20 till 40.000.000 blodneutrofiler kan lätt isoleras från en ml blod 3-4 veckor efter tumörinokulering. Dessa neutrofiler har förvärvat antitumöraktiviteter, och har följaktligen benämnts tumörburna neutrofiler (TEN), för att skilja dem från naiva neutrofiler (Figur 2B). Medan hög densitet neutrofiler (HDN) är starkt antitumörframkallande, låg densitet neutrofiler (LDN) som genererats i samband med cancer är inte 21. Hög densitet neutrofiler från benmärg och mjälte hos tumörbärande möss har också antitumöraktivitet (opublicerade data). Det bör noteras att med tumörprogression mjälten blir gradvis förstorad (splenomegali), med iskrynklas mängder neutrofiler.

För att spåra ödet för neutrofiler efter deras adoptiv överföring, dessa måste märkas. Neutrofiler kan märkas in vivo genom att injicera bromdeoxiuridin (BrdU) i tumörbärande eller naiva möss 2 dagar innan isolering. BrdU är en analog av DNA-prekursor tymidin som inkorporeras in i nyligen syntetiserat DNA i prolifererande celler. I fallet med neutrofiler, kommer BrdU införlivas i prolifererande prekursorceller som bibehåller BrdU färgning när differentiera till mogna post mitotiska neutrofiler. Den införlivade BrdU kan färgas med specifika anti-BrdU fluorescerande antikroppar. BrdU + -celler kan sedan analyseras genom flödescytometri. Ett annat tillvägagångssätt är att märka de isolerade neutrofiler med en cell tracker färgämne såsom 5-karboxifluorescein-N-succinimidylester (CFSE). CFSE är en esterförening som kan passera genom viabla cellmembran. Den har en amino-reaktiv succinimidylgrupp, som leder till den kovalenta bindningen av fluorescein till proteiner och andra aminogrupper i cellen och cellytan. De CFSE-märkta celler kan analyseras genom flödescytometri med användning av 488 nm argonlaser. De två märkningstekniker skiljer sig i det faktum att BrdU-märkning är beroende av prolifererande prekursorceller, och inte alla cirkulerande neutrofiler skall märkas, medan CFSE färgar alla neutrofiler. Upptäckt av CFSE är enklare än BrdU färgning, men BrdU märkning är ett bra sätt att följa de omogna till mogna neutrofila konvertering.

Vi har också beskrivit flera förfaranden för att bestämma den antitumör och antimetastatisk funktion av neutrofiler. Dessa inkluderar neutrofil utarmning, neutrofila adoptiv överföring, tumör neutralisering test och lungmetastas sådd analys. Var och en av dessa analyser åstad en specifik aspekt av antitumör neutrofila funktioner. Till exempel, al. Granot et 6 observerat att vid DEPletion av neutrofiler, är antalet lungmetastaser i 4T1-tumörbärande möss ökade, vilket tyder på en anti-metastatisk roll neutrofiler. Vid neutrofil adoptiv överföring, är tumörcellerna injicerades intravenöst 4 h före injektion av renat HDN. Förmågan hos tumörceller att bilda lung- och levermetastaser följs på ett tidsförloppsstudie med användning av ett optiskt in vivo-avbildningssystem. Möss som erhöll HDN visade färre metastashärdar än gjorde kontrollmöss 6. I tumör neutraliseringstest, är tumörcellerna injicerades subkutant med eller utan HDN, närvaron av HDN reducerar tumörtillväxt 21. I den metastatiska sådd-analysen, är GFP-märkta tumörceller injicerades intravenöst i kontroll eller neutrofiler utarmade före metastatiska tumörbärande möss, och förmågan hos de GFP-märkta celler till utsäde i lungan bestäms. Lungorna av pre-metastatiska tumörbärande möss kännetecknas av hög neutrofil infiltration som förhindrar tumörcellsådd i specifika organ 6. Detta kan översättas till mer metastashärdar i neutrofila utarmade möss jämfört med kontrolltumörbärande möss.

De protokoll som beskrivs fokus på att studera neutrofil funktion i samband med cancer och att tillhandahålla strategier för att utvärdera cancerrelaterade neutrofila egenskaper både in vitro och in vivo. Men de neutrofila reningsstrategier samt några av de experimentella förfaranden som beskrivs kan användas för att studera neutrofila funktion i ett brett spektrum av experimentella miljöer där neutrofila spelar en avgörande roll (dvs, inflammation och infektion).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ZG stöds av bidrag från I-CORE-programmet i Israel Science Foundation (Grant nr 41/11), den Abisch-Frenkel Foundation, Rosetrees Trust, Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forskning Career Development Award) och ORO stiftelse. ZGF stöds av bidrag från Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forskning Career Development Award), chefsforskare i Israel hälsoministeriet och Israel Lung Association.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics