Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center
Immunology and Infection

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Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., et al. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

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Abstract

Neutrophile, die häufigste aller weißen Blutzellen im menschlichen Kreislauf, spielen eine wichtige Rolle bei der Verteidigung des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen. Außerdem spielen die Neutrophilen eine zentrale Rolle bei der Immunüberwachung von Tumorzellen. Sie haben die Fähigkeit, Tumorzellen entweder durch eine Zelle kontaktabhängige Mechanismus mit Wasserstoffperoxid oder durch antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zu erkennen und zu induzieren Tumorzelltod. Neutrophilen mit Antitumor-Aktivität können aus dem peripheren Blut von Krebspatienten und von Tumor-tragenden Mäusen isoliert werden. Diese Neutrophilen werden als tumor mitgerissen Neutrophilen (TEN), um sie von Neutrophilen von gesunden Probanden oder naiven Mäusen, die keine signifikante Tumor zytotoxische Aktivität zeigen, zu unterscheiden. Verglichen mit anderen weißen Blutzellen, Neutrophilen zeigen unterschiedliche Auftriebs macht es möglich, eine> 98% rein neutrophilen Population, wenn sie einer Dichtegradientenzentrifugation unterworfen erhalten. Jedoch zusätzlichzum normalen hoher Dichte neutrophilen Population (HDN), bei Krebspatienten, in Tumor-tragenden Mäusen, wie auch unter chronischen Entzündungsbedingungen, deutlich niedriger Dichte neutrophile Populationen (LDN) sind in den Kreislauf. LDN Co-Reinigung mit der einkernigen Fraktion und von mononukleären Zellen mit entweder positiven oder negativen Selektionsstrategien getrennt werden. Sobald die Reinheit der isolierten Neutrophile durch Durchflusszytometrie bestimmt sind, können sie für die in vitro und in vivo funktionelle Assays verwendet werden. Wir beschreiben Methoden zur Überwachung der anti-Tumor-Aktivität von Neutrophilen, ihre Fähigkeit zu wandern und reaktive Sauerstoffspezies zu erzeugen, sowie die Überwachung ihrer phagozytischen Kapazität ex vivo. Wir beschreiben weitere Techniken, um die Neutrophile in vivo-Tracking zu kennzeichnen und ihre anti-metastatischen Kapazität in vivo zu bestimmen. Alle diese Techniken sind für das Verständnis, wie man zu erhalten und zu charakterisieren Neutrophilen mit Anti-Tumor-Funktion.

Introduction

Neutrophile wurden zunächst als die angeborene Immunzellen, die als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen dienen gekennzeichnet. Heute ist bekannt, dass Neutrophile haben weiterreichende Funktionen, die in Montage adaptive Immunantwort gegen fremde Antigene 1,2, Regulierung der Hämatopoese 3, 4 Angiogenese und Wundheilung 5 beteiligt. Zusätzlich kann Neutrophilen Tumorwachstum und Metastasen Progression beeinflussen aufgrund ihres pro- und anti-Tumor-Aktivitäten 6,7. Neutrophile werden durch einen polymorphen segmentierten Kern gekennzeichnet (daher bezeichnet polymorphkernigen (PMN) Leukozyten) und enthalten mindestens drei verschiedene Unterklassen von Granulat sowie Sekretvesikel 8 (1A-C).

Neutrophile besitzen eine hohe phagozytische Kapazität und NADPH-Oxidase-Aktivität kritisch für Mikrobenentfernung und sezernieren eine Vielzahl von Chemokinen wichtig für zuminTraktions zusätzlicher Neutrophilen und anderen Immunzellen an den Ort der Entzündung 8,9. Neutrophile werden durch die Expression einer großen Menge von Oberflächenrezeptoren einschließlich Toll-like Rezeptoren (TLR), dadurch gekennzeichnet, C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLRs), Komplement-Rezeptor 3 (CD11b / CD18) und anderen Adhäsionsmolekülen (zB L-Selectin, LFA-1, VLA-4 und carcinoembryonales Antigen bezogenen Zelladhäsionsmolekül 3 (CEACAM3 / CD66b)), Chemokinrezeptoren (beispielsweise CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2) Chemoattraktans-Rezeptoren (zB PAFR LTB 4 R und C5aR) Zytokin-Rezeptoren (zB G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), Formyl-Peptid-Rezeptoren (zB FPR1-3) und Fc-Rezeptoren (zB CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) und CD64 (FcyRI) 10. Bei Mäusen sind Neutrophile in der Regel als CD11b + Ly6G + identifiziert, wohingegen menschlichen Neutrophilen werden mit den CD11b, CD15, CD16 und CD66b Leukozyten-Marker identifiziert. Es ist auch allgemein akzeptiert, um die Granulat Proteine ​​Myeloperoxidase (MPO) und Neutrophilen-Elastase (NE) zum Nachweis von Neutrophilen im Gewebe zu färben.

Es ist noch unklar, ob die verschiedenen Funktionen der Neutrophilen von der gleichen Zelle oder mit verschiedenen Zellunterpopulationen vermittelt. Akkumulieren Daten deuten auf die Anwesenheit eines heterogenen Neutrophilen-Population, die ein hohes Maß an Plastizität durch proinflammatorische Stimuli und der Mikroumgebung 11,12 betroffen aufweist. Fridlender et al. 13 haben grob unterteilt die Neutrophilen in Krebs in zwei große Teilpopulationen genannt N1 mit Anti-Tumor-Eigenschaften und N2 mit pro-Tumor-Eigenschaften. Bei Krebs, wie auch bei chronischen Entzündungen, gibt es einen zusätzlichen Subpopulation granulocytic myeloische-Suppressorzellen (G-MDSC), die T-Zellreaktionen zu unterdrücken 14 zusammengesetzt ist. G-MDSCs gelten als unreifen myeloischen Zellen, gekennzeichnet durch eine CD11b + Ly6C seinNieder Ly6G hallo Phänotyp bei Mäusen 15, während mit einem CD15 + / CD16 niedrig Phänotyp in humanen 16. G-MDSCs auszudrücken höhere Arginase und Myeloperoxidase, während niedrigere Zytokine und Chemokine als normal zirkulierenden Neutrophilen. Sie sind weniger phagozytischen und Zugvögel, aber produzieren höheren ROS 15,17,18. In der vorliegenden Arbeit werden wir einige grundlegende Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften zu beschreiben.

Während Neutrophile bilden die größte Bevölkerung aller weißen Blutkörperchen im menschlichen Kreislauf (45 - 70%; 1800 - 6000 / ul), bei Mäusen, unter normalen Bedingungen, sie sind eher spärlich (10-15%; 300-500 / ul ). Die Erhöhungen Neutrophilenzahl fest auf Entzündung und gelegentlich bei Krebs, die eine chronische Entzündung 7 stellt. Neutrophile entwickeln sich aus multipotenten myeloischen Vorläufer gemeinsamen (CMP) cells im Knochenmark, durch einen Differenzierungsprozess vorbei an den Stufen der Myeloblasten (MB), Promyelozyten (PM), Myelozyten (MC), Metamyelozyten (MM) und Bandzellen (BC) 8. Die reifen, post-mitotischen Neutrophile innerhalb des Knochenmarks für 4 bleiben - 7 Tage, bevor sie in den Kreislauf 8 freigegeben. Neutrophilen-Umsatz im Blut ist in der Regel eine schnelle mit einer mittleren Halbwertszeit von 6 bis 12 Stunden, die unter entzündlichen Bedingungen verlängert werden kann. Nicht-stimulierten Neutrophilen haben anti-tumorigene Aktivität, eine Funktion, die durch Aussetzen der naiven Neutrophilen an der Chemokine IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 und CXCL5 6,19 oder künstlich erworben werden können, indem sie an den Phorbolester Phorbol 12 begrenzt -myristat-13-acetat (PMA) 6.

Die kurze Halbwertszeit von Blut Neutrophilen zusammen mit der geringen Zahl der neutrophilen Granulozyten (~ 3-5 x 10 5) von 1 ml Blut eines naiven 6 erreicht - 8 Wochen alten Maus, haben es geschafftschwierig, die Funktion der zirkulierenden Neutrophilen Maus in vitro zu erforschen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, sind andere Quellen verwendet. Zum Beispiel kann eine große Anzahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark 20 oder das Peritoneum nach der Induktion der Entzündung steril erhalten werden (beispielsweise nach intraperitonealer Injektion von Thioglykolat-Bouillon oder Zymosan A). Es sei darauf hingewiesen, daß Neutrophile von der Peritonealhöhle erhalten keine anti-tumorigene Aktivität (unveröffentlichte Beobachtung) auszuüben.

. Granot et al 6 beobachtet, dass BALB / c Mäusen orthotop mit der Maus 4T1-Brustkarzinom-Zelllinie beimpft entwickeln Neutrophilie der mit Tumorprogression 6 (2A) verschärft, so dass 20-40000000 Blutneutrophilen leicht von 1 ml Blut isoliert werden 3-4 Wochen nach der Tumor-Inokulation. Diese Neutrophilen haben Anti-Tumor-Aktivitäten erworben und wurden entsprechend coi gewesenNed tumor mitgerissen Neutrophilen (TEN), um sie einem naiven Neutrophilen 6 (2B) unterscheiden. Während hoher Dichte Neutrophilen (HDN, 1A) sind hoch anti-tumorigenen niedriger Dichte Neutrophilen (LDN, 1B) im Rahmen von Krebs erzeugt nicht 21. Auch hoher Dichte Neutrophile aus dem Knochenmark und der Milz von Tumor-tragenden Mäusen anti-Tumor-Aktivität (unveröffentlichte Daten). Es sollte beachtet werden, dass bei der Tumorprogression die Milz allmählich vergrößert (Splenomegalie) mit steigenden Mengen an Neutrophilen.

Es sollte beachtet werden, dass TEN werden auch in anderen Modellen von Krebs, einschließlich sowohl spontane (MMTV-PyMT und MMTV-Wnt1 Brusttumoren und K-ras angetrieben Lungentumoren) erzeugt und injiziert (AT-3 (MMTV-PyMT) und E0771 Mammakarzinom werden Zellen, LLC Lewis-Lungenkarzinom-Zellen und B16-F10-Melanomzellen). Allerdings ist der Umfang der Neutrophilen-Mobilisierung in diese tumoder Modelle ist weit weniger als der 4T1-inokulierten Mäusen erreichte 5-10 x 10 6 Neutrophile in 1 ml Blut nach 3 Wochen.

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Protocol

Tiere: 5-7 Wochen alte BALB / c-Mäuse werden von Harlan (Israel) bezogen. Alle Experimente mit Tieren wurden von der Hebräischen Universität Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. Humanproben: Sammlung von Blut von Krebspatienten und gesunden Probanden wurde von Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB) genehmigt.

1. Induktion von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften in vivo Verwendung eines Brustkrebs-Mausmodell.

HINWEIS: Alle Schritte sollten mit sterilen Lösungen in einem laminaren Luftstroms (LAF) Bio-Sicherheitsschrank durchgeführt werden.

  1. Samen 5 x 10 5 4T1-Zellen in 100 mm Gewebekulturplatte in 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 4,5 g / L D-Glucose mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 2 mM D- Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycinsulfat. Inkubieren thE-Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 3 bis 4 Tage. Sicherzustellen, daß die Zellen 50 bis 100% konfluent auf dem Tag des Experiments.
  2. Um die Tumorzellen aus der Gewebekulturplatte lösen, saugen Sie den Kulturmedium, waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS, saugen Sie den PBS und 3 ml einer 2,5 g / L Trypsinlösung. Inkubieren Sie die Zellen 2 - 3 min mit Trypsin bei 37 ºC.
  3. 10 ml serumhaltigem Medium, das Trypsin und Pipette auf und ab zu neutralisieren, bis alle der Zellen gelöst sind. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen.
  4. Zentrifugieren der Zellen bei 200 g für 5 min bei RT. Saugen Sie das Medium so dass 200 ul Medium über dem Zellpellet. Die Zellen in dem Restvolumen und 10 ml PBS. Das Röhrchen 2 - 3-mal, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten und nehmen Sie 10 ul der Zellen in einem Hämocytometer zählen. Verwenden Trypanblau zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 200 × g bei RT. Absaugen PBS und Resuspendieren der Zellen in PBS bei einer Endkonzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml. Stellen Sie sicher, dass die Einzelzellsuspension keine Klumpenbildung.
  5. Injizieren 1 x 10 6 4T1-Zellen oder Luciferase-exprimierende 4T1-Zellen in 50 ul PBS orthotopisch in die linke Leistenbrustfettpolster weiblicher Balb / c-Mäusen unter Verwendung einer 0,3 ml-Spritze mit einer 30G x 8mm Nadel.
    1. Vor der Injektion anästhesiert den Mäusen in einer Induktionskammer Empfangen einer langsamen Fließgeschwindigkeit von Isofluran (3-5%) in 100% Sauerstoff.
    2. Legen Sie die Maus auf einem sterilen OP-Polster, und stellen Sie sicher, dass der Kopf richtig in der Isofluran Nasenkegel platziert. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Kneifen der Pfote. Verwenden vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Rasieren Sie die Haare an der Injektionsstelle und desinfizieren mit 70% EtOH.
    3. Verwenden Sie eine sterile Reihe von chirurgischen Werkzeugen, um einen kleinen horizontalen Einschnitt (5 mm) ca.imately halbem Weg zwischen der Leisten- und Bauch Brustwarzen, setzen die Fettpolster und spritzen 1 x 10 6 4T1-Zellen in 50 ul. Schließen Sie die Schnitte mit 9 mm Clips, die eine Woche später entfernt werden sollte. Injektion von Luciferase-exprimierenden Zellen ermöglicht die Überwachung der Größe des Tumors und Metastasen durch Biolumineszenz-Bildgebung.
      HINWEIS: Diese minimal-invasive Verfahren keine post-operative Behandlung erfordern und die injizierten Mäuse erholen sich innerhalb von 2 - 3 min.
    4. Überwachen Sie den Mäusen, bis sie das Bewusstsein wieder zu erlangen, und sicherzustellen, dass sie vollen Bewußtsein, bevor er die Gesellschaft von anderen Mäusen wieder zu erlangen.
  6. Nach 3-4 Wochen, als der Primärtumor ein Volumen von 2 cm 3 erreicht hat, zu opfern die Mäuse durch einen langsamen CO 2 -Strom, und unmittelbar nach dem letzten Atemzug zu erhalten Blut durch Herzpunktion unter Verwendung einer 25G x 5/8 "Nadel zu einer 1 ml Tuberkulin-Spritze mit Heparin vorbehandelte verbunden. Halten Sie den Mund der Nadel nach oben beim Einlegen derSpritze in einer horizontalen Position durch die Membran in Richtung des Herzens, und langsam und allmählich ziehen das Blut Vermeidung von Überdruck (Abbildung 3).

2. Neutrophilen-Isolation

  1. Isolation von zytotoxischen Neutrophile aus dem Blut von tumortragenden Mäusen.
    1. Gebrauchslösung: 1 ml Blut aus einer Tumor-tragenden Maus gezogen (siehe Protokoll 1.11) in PBS, das 0,5% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) zu einem endgültigen Volumen von 6 ml.
    2. Fraktionierung von verdünntem Blut an einer frisch hergestellten diskontinuierlichen Saccharosegradienten:
      1. 3 ml der sterilfiltrierten Saccharose 1,119 g / ml auf den Boden eines 15 ml fassenden konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
      2. Langsam und vorsichtig Schicht 3 ml sterilfiltrierter Saccharose 1,077 g / ml oben auf dem 1,119 g / ml-Schicht. Danach fügen Sie langsam und vorsichtig die 6 ml verdünntes Blut (Protocol 2.1.1) auf dem 1,077 g / ml Schicht (4A). Es wird empfohlen, um das Rohr zu halten und eine gekipptdding die verschiedenen Komponenten durch einen langsamen, jedoch kontinuierlichen Strom, wobei die Mündung der Pipette in Richtung der unteren Wand der Röhre, so dass keine Turbulenzen gebildet.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit dem verdünnten Blut auf dem Saccharosegradienten bei 700 × g für 30 min bei RT ohne Bremse.
    4. Das Röhrchen aus der Zentrifuge vorsichtig entfernen, ohne dass eine Turbulenz. Die meisten der Erythrozyten am Boden des Rohrs ist. High-Density-Neutrophilen (HDN) als einen weißen-to-roten Ring an der Schnittstelle zwischen dem 1,119 g / ml und 1,077 g / ml Schichten (rund um die 3-ml-Markierung) festgestellt, während die Low-Density-Leukozyten werden in gefunden ein weißer Ring an der Schnittstelle zwischen dem 1,077 g / ml Schicht und der BSA-enthaltenden PBS (um die 6-ml-Markierung, siehe 4B).
    5. Absaugen PBS + 0,5% BSA bis zum Erreichen von 5 mm über dem Low-Density-Zellschicht. Pipettieren Sie die Low-Density-Zellen durch langsame Ansaugen in eine 1 ml Spitze durch langsam wirbelnden um die Zellen.Übertragen der Zellen in 30 ml PBS mit 0,5% BSA.
    6. Saugen Sie die obere Schicht in der gleichen Steigung Rohr bis zur 5 mm über die hochdichte Zell Band. Pipettieren sich die hochdichten Zellen, die meist mit hoher Dichte Neutrophile und übertragen die Zellen in 30 ml PBS, enthaltend 0,5% BSA.
    7. Zentrifugieren der Zellen bei 400 g für 10 min bei RT.
    8. Den Überstand aspirieren und Lyse Erythrozyten durch Resuspendieren der Zellen in 36 ml sterile HPLC-Wasser für 30 Sekunden. Isotonie sollte durch Zugabe von 9 ml einer 5-fach konzentriert, wieder hergestellt werden PBS, ergänzt mit 2,5% (w / v) BSA.
    9. Zentrifugieren der Zellen bei 400 g für 10 min bei RT.
    10. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in PBS-BSA. Zählen Sie die Anzahl von Neutrophilen in einem Hämozytometer und benutzen Trypanblau zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden.
    11. Zentrifugieren der Zellen bei 400 g für 10 min bei RT und Resuspendieren der Neutrophilen im gewünschten Inkubationsmedium Endzelldichte. Verwendendie Neutrophilen sofort.
    12. Dann, nach einer weiteren Zentrifugation Resuspendieren der Neutrophilen in Inkubationsmedium zu Endzelldichte. Verwenden Sie die Neutrophilen sofort.
  2. Isolierung von zirkulierenden Neutrophilen von Krebspatienten.
    1. Mischungs 10 ml heparinisiertes (20 U / ml) menschliches Blut mit einem gleichen Volumen an 3% Dextran T500 in Kochsalzlösung und Inkubation für 30 min bei RT. Während dieser Inkubation werden die Erythrozyten sedimentieren.
    2. Vorbereitung einer 50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen mit 10 ml Saccharose 1,077 g / ml und langsam Schicht die Leukozyten-reiche Überstand auf der Oberseite der 1,077 g / ml Saccharose Schicht (4C).
    3. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei RT ohne Bremse. Hochdichte Neutrophilen (HDN) wird in dem Pellet angezeigt. Low-Density-Neutrophilen (LDN) Co-Reinigung mit Monozyten und Lymphozyten an der Grenzfläche zwischen 1,077 g / ml Saccharose-Schicht und Plasma (4D).
    4. Resuspendieren der Neutrophilen in 10 ml 0.2% NaCl für 30 Sekunden, um die kontaminierenden Erythrozyten zu lysieren, und Wiederherstellen der Isotonie durch Zugabe von 10 ml 1,6% NaCl und schwenken sofort.
    5. Zentrifuge 5 min bei 160 · g bei RT und dreimal in 20 ml Hanks 'ausgeglichene Salzlösung. Zentrifuge nach jedem Waschen und saugen Sie den Überstand.
    6. Zählen der Neutrophilen und Resuspendieren der Zellen in RPMI-1640 mit 2% FBS bei 2 × 10 6 Neutrophile / ml oder wie gewünscht.

3. Anreicherung von Neutrophilen Mit Magnetic Beads

  1. Positive Auswahl
    1. Nimm 1 ml Blut aus einer Maus, wie in Protokoll 1.8 beschrieben mit einer heparinisierten Spritze.
    2. Zentrifugieren Sie das Blut in einem 15 ml konischen Röhrchen bei 400 xg für 5 Minuten bei RT.
    3. Den Überstand aspirieren oder behalten Sie den Blutplasma für weitere Studien.
    4. Lyse der Erythrozyten durch Resuspendieren der Zellen in 8 ml HPLC-Wasser. Nach 30 sec wiederherzustellen Isotonie durch Zugabe von 2 ml 5x concentrated PBS, enthaltend 2,5% BSA. Zählen Sie die Zellen.
    5. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT.
    6. Zellpellet in 200 ul PBS, das 0,5% BSA und 2 mM EDTA pro 10 8 Zellen.
    7. In 50 ul biotinylierten anti-Ly6G Antikörper. Gut mischen und inkubieren für 10 Minuten in den Kühlschrank (nicht auf Eis).
    8. Zugabe von 150 & mgr; l kaltem PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA.
    9. Vortex die Anti-Biotin-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen-Stammlösung. Dann 100 ul der Zellsuspension. Gut mischen und inkubieren für 15 Minuten in den Kühlschrank (nicht auf Eis).
    10. Wash-Zellen durch Zugabe von 10 ml PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA und Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei RT.
    11. Überstand wird abgesaugt vollständig und Resuspension in 500 & mgr; l kaltem PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA.
    12. Legen Sie eine magnetische Trennsäule in einen Magnethalter, die auf eine magnetische Halterung befestigt ist, und spülen Sie ihn mit 500 ul kaltem PBS, 0.5% BSA und 2 mM EDTA.
    13. Übernehmen Sie die Zellsuspension auf die Säule. Der Durchlauf enthält unmarkierten LyG6-negativen Zellen.
    14. Mit 500 ul PBS, das 0,5% BSA und 2 mM EDTA Die Säule. Zusätzliche unmarkierten Zellen in der Strömung durch sein.
    15. Wiederholung des Waschschrittes mit einem weiteren 500 ul PBS, das 0,5% BSA und 2 mM EDTA.
    16. Entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und legen Sie sie auf einem 15 ml-Collection-Tube. 1 ml PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA und spülen die magnetisch markierten Zellen durch kräftiges Schieben des Kolbens in die Kolonne. Die Strömung enthält durch Ly6G + Neutrophilen.
  2. Negative Auswahl
    1. Bereiten Blutleukozyten gemäß den Schritten 3.1.1 bis 3.1.5.
    2. Resuspendieren 1 x 10 8 Zellen in 1 ml PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA in einem 5 ml-Polystyrol-Rundrohr.
    3. In 50 ul normales Rattenserum.
    4. In 50 ul der neutrophilen Bereicherung cocktail (mit biotinyliertem Antikörper, die für nicht-neutrophilen weißen Blutkörperchen), gut mischen und inkubieren für 15 Minuten in den Kühlschrank stellen.
    5. Die Zellen werden durch Zugabe von 4 ml PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA und Zentrifuge 400 × g für 10 min.
    6. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 1 ml PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA.
    7. In 50 ul tetrameren Antikörperkomplexen gegen Biotin und Dextran gerichtet. Gut mischen und inkubieren für 10 Minuten in den Kühlschrank stellen.
    8. Wirbelschacht das Röhrchen mit Dextran-beschichteten magnetischen Kügelchen vor Zugabe von 150 & mgr; l der Zellsuspension. Gut mischen und inkubieren Sie 10 Minuten in den Kühlschrank stellen.
    9. Bringen der Zellsuspension bis zu einem Gesamtvolumen von 2,5 ml durch Zugabe von PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA. Vorsichtig mischen, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.
    10. Stecken Sie den Schlauch (ohne Cap) in den Magneten, und lassen Sie stehen für 3 min.
    11. Kehren Sie die Magneten mit dem Rohr in einem kontinuierlichenBewegung, so daß die ungebundenen Zellen in der Flüssigkeit wird in ein neues Röhrchen übertragen. Lassen Sie den Magnet und Rohr für 2 invertiert - 3 sec, dann in die aufrechte Position zurück. Die magnetisch markierten unerwünschte Zellen gebunden an die Wand des ursprünglichen Rohres bleiben, während die ungebundenen Neutrophilen wird in der übertragenen Flüssigkeit ist.

4. Die zytologische Färbung der Neutrophilen

  1. Resuspendieren 1x10 5 Neutrophilen in 50 ul PBS und übertragen die Zellsuspension auf eine Dünnschichtzelle Herstellung Adapter wie einem Cytospin. Zentrifugieren Sie den Adapter bei 150 xg für 5 min. Trennen Sie die pre-markierten Objektträger aus dem Adapter.
  2. Fixieren Zellen durch Eintauchen der Objektträger aus Glas in 70% Ethanol für 2 min. Lassen Sie die Präparate aus dem Adapter (siehe Schritt 4.1) bei RT vor der Färbung zu trocknen. Tauchen Sie die Objektträger 5-6 mal in destilliertem Wasser.
  3. Färben 1-2 min in Mayers Hämatoxylin-Lösung. Spülen 1 min in Leitungswasser. Fleck 10 sec in Eosin Y-Lösung . In Leitungswasser zu waschen. Dehydratisieren durch Spülen der Objektträger in zunehmenden Ethanolkonzentrationen (70%, 96% und 100%). Lassen Sie den Glasobjektträger an der Luft trocknen kurz und überprüfen Sie die Objektträger unter einem Lichtmikroskop.
    HINWEIS: Hematoxylin hat eine tief blau-violette Farbe und Flecken Nukleinsäuren, während Eosin ist rosa und färbt Proteine ​​unspezifisch. Die zytoplasmatischen Granula von Neutrophilen bleiben sauren oder basischen Farbstoffe, die der Ursprung für den Namen "lieb neutral" ist ungefärbt. In der Erwägung, basophilen Granulozyten Flecken dunkelblau mit Hämatoxylin und Eosin und eosinophilc Granulozyten leuchtend rot, rosa erscheinen Neutrophilen neutral (siehe 1A). 5 Lappen "segmentierte Neutrophile '(1A und 1C) - reife Neutrophile werden durch eine polymorphkernige Zellkern, die im allgemeinen groß mit 2 gekennzeichnet. Unreifen Neutrophilen werden durch eine ein-lappigen gekrümmten oder ringförmigen Kern (1B) gekennzeichnet.
ve_title "> 5. Bestimmung der Reinheit von Neutrophilen durch Durchflusszytometrie.

  1. Resuspendieren 1x10 6 Zellen in 100 & mgr; l FACS-Puffer (PBS enthaltend 0,5% BSA, 2 mM EDTA und 0,02% NaN 3). Für Vollblutproben wird Hämolyse erforderlich vor der Färbung (Schritte 3.1.1 bis 3.1.5). In 10 ul FcR Blocking Reagenz für 5 min.
  2. Mit 0,5 ug des fluoreszenzmarkierten Antikörpers mit einer Spezifität für Ly-6G für Maus Neutrophilen oder CD11b und CD66b für humane Neutrophile, gut mischen und Inkubation für 15 min bei RT.
  3. Einstellen der Lautstärke auf 500 ul mit PBS, enthaltend 0,5% BSA und 2 mM EDTA und Färbung analysiert mittels Durchflusszytometrie.

6. Folge Neutrophil Tor in vivo

  1. In-vivo-BrdU-Markierung von Neutrophilen
    1. Injizieren 100 ul einer 10 mg / ml Bromdesoxyuridin (BrdU) Lösung in sterilem PBS intraperitoneal an Tumor-tragenden Mäusen.
    2. Isolieren Blut Neutrophilen zu 48 Stunden nach der Injektion einL aut Protocol 2.1. Stain BrdU-markierten Neutrophilen unter Verwendung eines BrdU Flow Kit.
  2. CFSE Kennzeichnung von Neutrophilen
    1. Resuspendieren 10 7 Neutrophilen in 1 ml vorgewärmtes PBS.
    2. Add 2 ul einer 5 mM CFSE Stammlösung zu den suspendierten Neutrophilen zu einer Endkonzentration von 10 uM. Gut mischen und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. In 1 ml DMSO 5 mM CFSE wird durch Auflösen von 2,8 mg von CFSE (- -), Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester 5- (und 6) hergestellt. Teilen Sie sich in 10 ul Aliquots in sterile 200 ul Röhrchen und lagern im Dunkeln bei -20 ° C.
    3. Neutralisieren überschüssigen CFSE durch Zugabe eines gleichen Volumen RPMI-1640 mit 10% FBS. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. Zentrifugieren Neutrophilen bei 400 xg für 10 min bei RT. Zweimal in 10 ml RPMI-1640, das 10% FBS waschen die Neutrophilen.
    4. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min und resuspendieren in einem geeigneten Volumen an PBS. Die Neutrophilen (beispielsweise 1 × 10 7

7. In-vitro-Luciferase Assay, um die Anti-Tumor-Aktivität von isolierten Neutrophile überwachen.

  1. Kulti Luciferase-markierte Tumorzellen als für 4T1-Zellen in Protocol 1.1-1.5 beschrieben, aber resuspendieren Trypsin-dissoziierten Zellen in einer optimierten reduzierten Serum-Medium mit 2% FBS. Einstellen der Zelldichte auf 5 x 10 4 Zellen pro ml.
  2. Seed 5000 Luciferase-markierten Tumorzellen in 100 & mgr; optimierte reduzierte Serum-Medium, das 0,5% FBS in jede Vertiefung einer weißen 96-Flachboden-Gewebekultur Well-Platte.
  3. 4 Stunden nach der Aussaat der Tumorzellen, fügen Sie 1 x 10 5 Neutrophilen in 50 ul optimierte reduzierte Serum-Medium, das 0,5% FBS, und Inkubation O / N. Vorbereitung einer Neutrophilen-Zellsuspension mit einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml. Kontrollvertiefungen sollte 50 ul Medium ohne Neutrophilen zu bekommen. Machenmehrere Wiederholungen von jeder experimentellen Einstellung.
  4. Am folgenden Morgen, sanft den Überstand aspirieren und waschen Sie jedes Well mit 200 ul PBS. Saugen Sie das PBS und fügen Sie 50 ul der passiven Lyse-Puffer. Für leicht Abnehmen Zellen (wie AT-3-Zellen), nicht in PBS waschen und fügen Sie die Zellkultur Lysepuffer unmittelbar nach dem Absaugen des Wachstumsmediums.
  5. Die Platte mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie auf einem Rundschüttler bei 150 Upm für 20 min bei RT.
  6. Die Platte wird in einem Lumineszenz-Plattenlesegerät. Spritzen Sie auch weise 50 ul Luciferase-Assay-Lösung, und lesen Sie die Chemilumineszenz für 10 Sekunden pro Vertiefung.
  7. Berechnung der% Tumor-Lyse durch die folgende Formel berechnet:% Lyse = Tumor (1- [Lumineszenz von Proben mit Neutrophilen] / [Lumineszenz von Proben in Medium]) x 100%.

WICHTIG: Um den Beitrag von Neutrophilen an metastasierendem Aussaat beurteilen kann Neutrophilen wie in Protokoll 8.1 erschöpft. Für eine effektive deplEtion verwalten Neutrophilen-abbauenden Antikörper, beginnend am Tag 7 nach der Tumor-Transplantation.

8. Anti-metastasiertem Aktivität von Neutrophilen in einer Brustkrebs-Mausmodell.

  1. In-vivo-Abreicherung von Neutrophilen.
    1. Frisch herzustellen 12,5 ug Ratte-anti-Ly6G Antikörper (neutrophile abbau Antikörper) oder von Ratten-Isotyp-Kontrollantikörper (IgG 2a, Κ) in Kochsalzlösung in einem Endvolumen von 100 ul pro Maus.
    2. Beginnend am Tag 3 nach der Tumor engraftment injizieren täglich eine intraperitoneale Dosis von 12,5 ug Ratte anti-Ly6G Antikörper (100 ul). Injizieren Kontrollmäusen mit oder 12,5 ug (100 ul) Ratten-Isotyp-Kontrollantikörper (IgG 2a, Κ).
    3. Beginnend am Tag 14, verwalten die Antikörper zweimal täglich, wie der Neutrophilen Produktionsrate erhöht drastisch, wenn die 4T1 Tumor wächst.
    4. Jeden zweiten Tag, erhalten eine Blutprobe (2-3 Tropfen) durch Nicking die laterale Schwanzvene. Das Blut in eine anti-coagulant haltige Rohr (Heparin, Citrat oder EDTA).
    5. Stellen Sie sicher, Neutrophilen-Depletion mittels Durchflusszytometrie in Protokoll 5 beschrieben.
  2. Tumor Neutralisationstest (Modified Winn Assay)
    1. Isolierung von Neutrophilen Tumor-tragenden Mäusen. Mix 1 × 10 6 Tumorzellen und 3 x 10 6 Neutrophile in 50 ul Kochsalzlösung (pro Maus).
    2. Injizieren der Zellen subkutan in die Flanke 6-8 Wochen alt naiven BALB / c-Mäusen. Rasur die Flanke vor der Tumor Verpflanzung, genaue Messungen der Tumorgröße zu ermöglichen. Messen der Größe des Tumors täglich, beginnend am Tag 5 nach der Transplantation.
  3. Neutrophilen adoptiven Transfer
    1. Injizieren 2 x 10 4 Luciferase-exprimierenden Tumorzellen in 200 ul PBS in die Schwanzvene.
    2. Neutrophilen-Transfer durchgeführt werden sollte 4 Stunden nach der Tumorzellinjektion. So starten Sie die Reinigung der HDN von tumortragenden Mäusen (Protokoll 2.1) ca. 2 Stunden vor ihrer geplantenvivo-Transfer. Resuspendieren Neutrophilen in PBS auf eine Endkonzentration von 2,5 x 10 7 Zellen / ml.
    3. 4 Stunden nach der Einführung der Tumorzellen zu platzieren die Mäuse unter einer Wärmelampe für 5 min. Platzieren Sie die Mäuse in einem Verzögerer und injizieren 5 x 10 6 HDN (200 ul) über die Schwanzvene. Kontrollmäuse werden mit Vehikel (PBS) injiziert.
    4. Überwachung der Bildung von Lungenmetastasen zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung eines Biolumineszenz in vivo-Bildgebungssystem oder durch Immunhistochemie.
  4. Lunge Metastasen Aussaat Assay
    1. Injizieren 0,5-1 x 10 6 Eltern 4T1 Zellen orthotop in die linke Leistenbrustfettpolster wie in Protokoll 1 beschrieben.
    2. Am Tag 10 resuspendieren GFP exprimierende 4T1-Zellen, die in PBS bei einer Endkonzentration von 5 x 10 5 Zellen / ml. Zeigen die Mäuse unter einer Wärmelampe für 5 min.
    3. Platzieren Sie die Mäuse in einem Verzögerer und injizieren 1x10 5 GFP exprimierende 4T1-Zellen (200 ul) intravenös 4T1. Tumor-tragenden Mäusen oder naiven Mäusen.
    4. Am folgenden Tag, euthanize die Mäuse und versorgen die Lungen mit 20 ml PBS, um die verbleibenden roten Blutkörperchen zu entfernen.
    5. Auszuschneiden die Lunge für die Analyse von GFP-positiven Zellen immunhistochemisch.
      WICHTIG: Um den Beitrag von Neutrophilen an metastasierendem Aussaat beurteilen kann Neutrophilen wie in Protokoll 8.1 erschöpft. Für eine effektive Verarmungs verwalten Neutrophilen-abbauenden Antikörper, beginnend am Tag 7 nach der Tumor-Transplantation.

9. Suppression der T-Zellproliferation durch Neutrophile von Tumor-tragenden Mäusen.

  1. Entfernen Sie die Milz aus einer eingeschläfert naiven BALB / c-Maus und in 10 ml PBS.
  2. Legen Sie die Milz auf eine 40 um Zellsieb, die passen auf eine Petrischale mit RPMI-1640 gefüllt ist. Verwenden Sie den Kolben Ende der Spritze, zerdrücken die Milz durch die Zellen in der Petrischale Sieb. Spülen Sie die Zelle Sieb mit 5 ml RPMI. Entsorgen Sie das Sieb.
  3. Übertragen die resuspendierten Zellen in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr und 400 g für 10 min.
  4. Überstand verwerfen und Lyse der Erythrozyten durch Suspendieren der Zellen in 36 ml reinem Wasser für 20 Sekunden, und passen Sie auf Isotonizität durch Zugabe von 4 ml PBS konzentriert x 10. Alternativ zu lysieren die Erythrozyten durch Suspendieren der Zellen in 5 ml Erythrozyten- Lysepuffer (ACK), und inkubieren 5 min bei RT. Neutralisieren die ACK durch Zugabe von 10 ml RPMI-1640-Medium. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei RT. Die Zellen in 5 ml PBS und zählen Sie die Zellen.
  5. Resuspendieren der Splenozyten in PBS bis zu einer endgültigen Dichte von 4 × 10 7 Zellen / 2 ml in 15-ml-Röhrchen. 2 ml einer 2,5 & mgr; M CFSE-Lösung in PBS. Invertieren schnell den Schlauch und Inkubation für 10 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Mischen (alle 2 min), vor Licht geschützt.
  6. Stillen Sie überschüssige CFSE durch Zugabe von 4 ml vorgewärmtes FBS (100%) und Inkubation für 1 min bei RT. 3 ml PBS und Zentrifugation bei 400 × g für 10Minute
  7. Die Zellen werden mit 30 ml PBS und Zentrifugation bei 400 g für 10 min.
  8. Filtern Sie die Zellen durch ein 40 & mgr; m Zellsieb und nachwaschen mit PBS.
  9. Resuspendieren der Zellen in RPMI-1640-Medium mit 10% FBS auf eine Enddichte von 2 x 10 7 Zellen / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / Vertiefung (200 ul) in einer 24-Well-Gewebekulturplatte.
  11. Stimulierung der Zellen durch die Zugabe von 1 & mgr; g gereinigtem armenischen Hamster-anti-Maus-CD3 & egr; Antikörper in 500 ul RPMI-1640 mit 10% FBS.
  12. Add 2 x 10 6 oder HDN LDN in 300 ul RPMI-1640 mit 10% FBS zu den CFSE-markierten Splenozyten und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C. Wells ohne Neutrophilen sollte 300 ul Medium zu erhalten. Gesamtvolumen in jeder Vertiefung sollte 1 ml sein.
  13. Sammeln Sie die Zellen und bereiten sie für die Durchflusszytometrie. Die Zellen in 100 ul FACS Puffer (Protokoll 5), und fügen Sie 10 ul FcR Blocking Reagenz. Inkubation für 5 min bei RT.
  14. 1 &# 956; l APC-konjugiertem anti-CD8a-Antikörper und Inkubation für 15 min bei RT.
  15. Bestimmen die CFSE Fluoreszenzintensität auf CD8 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 5). Die CFSE Intensität wird bei jeder Zellteilung halbiert. Somit kann die Anzahl der Zellteilungen durch die Intensität des CFSE-Färbung bestimmt werden.

10. Neutrophilen-Migration Assay

  1. Samen 5x10 5 4T1 Zellen in 7 ml optimiert den Serum Medium mit 0,5% FBS ergänzt in einem 25 cm 2 Gewebekulturflasche und Inkubation 24 Stunden bei 37 ° C.
  2. Übertragen 800 ul des Überstands in die untere Kammer eines Migrationsplatte mit einer Porengröße von 5 um.
  3. Resuspendieren 2 × 10 5 Neutrophilen in 400 ul optimierten reduzierten Serum-Medium mit 0,5% FBS ergänzt. Übernehmen Sie die Zellsuspension in die obere Kammer und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C.
  4. Am Ende der Inkubation, entfernen Sie die obere Kammer undzählen die Anzahl von Neutrophilen, die in die untere Kammer gewandert sind.

11. Überwachung Neutrophilen-Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).

  1. Vorbereitung 1,1 x 10 6 Neutrophile / ml in Hanks balancierter Salzlösung ohne Phenolrot. Platte 180 & mgr; l, das 2 x 10 5 Neutrophilen in jede Vertiefung einer weißen 96-Flachboden-Well-Platte.
  2. Die Platte wird in einem Lumineszenz-Plattenlesegerät. Mit 20 ul einer 500 uM Luminol-Lösung in PBS zu jeder Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von 50 uM erhalten. Lesen Sie den basalen Chemilumineszenz für 1 s in einer Zeit von 5 min mit 10 Sekunden-Intervallen.
  3. Hinzufügen eines Stimulans (zB PMA bei einer Konzentration von 10 nM oder 100 nM fMLP oder in einer Konzentration von 10 uM). Bereiten Sie eine 10-fach konzentrierte Lösung von jedem Mittel in ausgewogener Hank-Salzlösung ohne Phenolrot und fügen Sie 22 ul in die entsprechenden Wells. Um zu steuern, Brunnen fügen 22 ul Fahrzeug.
  4. Measure der Chemilumineszenz in der Plattenlesegerät. Haben sowohl einen kurzen (alle 10 Sek für 5 Minuten) und lange (jede Minute für 1 Stunde) Zeitverlauf.

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Representative Results

In einer neueren Studie identifizierten wir eine antimetastatische Funktion für Neutrophile 6. Neutrophile von tumortragenden Mäusen erwerben einen zytotoxischen Phänotyp und haben die Fähigkeit, Tumorzellen 6 töten. Dies steht im Gegensatz zu Neutrophilen von naiven Mäusen, die keinen signifikanten Antitumoreffekt 6 haben. Einige der in dem Protokoll Abschnitt beschriebenen Techniken zur Untersuchung Antitumor Neutrophilenfunktion in vitro und in vivo-6 verwendet.

Tumorzytotoxischer Neutrophile aus Tumor-tragenden Mäusen 6 erhalten werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden die Mäuse orthotopisch mit 4T1-Zellen in der linken Leistenbrustfettpolster (Protokoll 1) injiziert. Am Tag 21 nach der Tumorimpfung, der primäre Tumor erreicht eine Größe von 1 bis 2 cm 3 (Figur 3 - der Tumor im linken unteren Abdomen ersichtlich). Zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse getötet und 1 ml Blut wurde gezogen (pro Maus)durch Herzpunktion (Abbildung 3). Parallel dazu wurde Blut von einem naiven, nicht-tumortragenden Maus gezeichnet. HDN wurden dann auf einem Dichtegradienten gereinigt (Protocol 2,1 und 4), um ein hochreines (> 98%) Population von Neutrophilen ergeben. Neutrophil Lebensfähigkeit wurde durch Trypan-Blau-Färbung (Protokoll 2.1) bestimmt. Die Neutrophilen wurden anschließend in einer optimierten reduzierten Serum-Medium, das 0,5% FBS auf 2 × 10 6 Neutrophile / ml resuspendiert.

Um das Ausmaß der neutrophilen Zytotoxizitätstest, haben wir 10 5 Neutrophilen (50 ul einer 2 x 10 6 Neutrophile / ml Stammlösung), um Luciferase 4T1 Zielzellen (5.000 Zellen / Vertiefung in 100 ul) in einer Flachboden-weiß 96 -Nun Platte (Protocol 7). Nach einer O / N der Inkubation wurden die Zellen in PBS gewaschen und in passiven Lyse-Puffer lysiert und die Luciferase-Aktivität in jeder Probe wurde getestet, um das Ausmaß der neutrophilen Zytotoxizität (evaluieren (2B getötet präsentiert tumorfrei), von tumortragenden Mäusen gereinigt Neutrophilen zeigen eine signifikante Zytotoxizität (2B, Tumor-Lager).

Um die immunsuppressiven Eigenschaften in LDN und HDN prüfen verwendeten wir die T-Zellproliferationsassay (Protokoll 9). Wir untersuchten dieAnzahl der CD8 + Zellen in unbehandelten Milzzellen und Splenozyten mit einer & agr; CD3-Antikörper behandelt, die alleine kultiviert wurden, und die Zellen, die in Gegenwart von LDN oder in Gegenwart von HDN (5A-D) kultiviert wurden. Notieren Sie sich den dramatischen Anstieg der CD8 + CFSE + Zellen nach anti-CD3-Stimulation (vergleiche obere rechte Platte in A und B) die dramatische Hemmwirkung der unterdrück LDN (vergleiche obere rechte Platte in B und C) und das Fehlen von hemmenden Effekt von HDN (Panel D). Wir untersuchten auch das Ausmaß der CFSE Retention, als eine Anzeige für die Proliferation. In 5E stellt die orange Kurve unbehandeltem CD8 + -Zellen, die blaue Kurve CD8 + Zellen mit & agr; CD3-Antikörpern behandelt werden, die rote Kurve CD8 + Zellen, die mit & agr; CD3 stimuliert in Anwesenheit LDN und die grüne Kurve stellt CD8 + Zellen, die mit α stimuliert; CD3 in Gegenwart von HDN. Beachten Sie die Linksverschiebung in den & agr; CD3 behandelten Zellen (blaue Kurve) und die & agr; CD3 behandelten Zellen mit HDN (grüne Kurve) kultiviert, die CD8 + Zellproliferation zeigen.

Abbildung 1
Abbildung lichtmikroskopische Aufnahme mit hoher Dichte (A) und Low-Density-Neutrophilen (B) mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt folgenden Dünnschichtzelle Vorbereitung 1. Neutrophilen-Morphologie.. (C) Eine Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bild eines hochdichten Neutrophilen. Die Bar steht für 1.000 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Blut neutrophilen Granulozyten zu erhöhen mit Tumor progression und Neutrophilen erwerben einen zytotoxischen Phänotyp. (A) Die die Neutrophilen-Anzahl pro 1 ml wurde durch FACS an verschiedenen Tagen nach der Inokulation der Tumorzellen in BALB / c-Mäuse gezählt. Die Anzahl der Zirkulieren CD11b + Ly6G + Neutrophiler 4T1 Tumorprogression kontinuierlich zunimmt. (B) 4T1-Brustkarzinomzellen wurden co-kultiviert mit hoher Dichte Neutrophilen entweder aus naiven Mäusen (Tumor frei) oder 4T1-Tumor-tragenden Mäusen (Tumor Lager) Mäuse oder inkubiert in Medium in Abwesenheit von Neutrophilen (Forts.) bei 37 ° C für 20 Std. Neutrophile für tumortragenden Mäusen, aber nicht von tumorfrei Mäusen zeigen signifikante Zytotoxizität gegenüber 4T1 Tumorzellen. Fehlerbalken stellen ± SEM ** p <0.01 mit ein Student t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

"3" Abbildung 3. Sammlung von murinen Blut über Herzpunktion. Die Maus wurde in einem Induktionskammer unter langsamen CO 2 -Strom euthanasiert. Unmittelbar nachdem die Maus hat seinen Anschluß Atemzug genommen wird, wird sie auf den Rücken gelegt und eine 1 ml heparinisierten Spritze wird an der Basis des Brustbeins bis zur Herz eingeführt. Ziehen Sie langsam auf den Kolben, um das Blut zu saugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Neutrophilen-Reinigung aus Vollblut. (A) mit 3 ml von 1,077 g / ml Saccharose wird vorsichtig oben auf 3 ml 1,119 g / ml Sucrose, um einen diskontinuierlichen Gradienten bilden. Gesamte murine Blut, in PBS-BSA (0,5%) bis zu einem Endvolumen von 6 ml verdünnt, dann auf der Oberseite des geschichteten 1,077 g / ml Sucrose (B) Nach einer 30 Minuten bei 700 xg Spin ohne Pause, 3 verschiedene Fraktionen beobachtet werden kann.; R - rote Blutkörperchen in dem Pellet, G - die granulozytische enthaltenden Fraktion hoher Dichte Neutrophilen, M -. Mononukleären enthaltende Fraktion mononukleärer Zellen und niedriger Dichte Neutrophilen (C) Frisch entnommenes menschliches Blut wird mit einem gleichen Volumen Dextran 500 (gemischt 3%) und bei RT für 30 min inkubiert. . Die Kopffraktion, die die weißen Blutkörperchen (Buffy Coat) wird dann auf der Oberseite der 10 ml 1,077 g / ml Sucrose (D) Nach einem 30 min bei 400 xg Spin ohne Pause, können 2 verschiedene Fraktionen beobachtet werden überlagert; R + G - Pellet, das rote Blutkörperchen und High-Density-Neutrophilen, M -. Mononukleäre Fraktion, die mononuklearen Zellen und Low-Density-Neutrophilen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur 5
Abbildung 5 Suppression der T-Zellproliferation. Durchflusszytometrie analysiert, welche die Anzahl von CFSE-markierten CD8 + in Abwesenheit des Stimulus (A) kultivierten Zellen nach Stimulation mit & agr; CD3-Antikörper in Abwesenheit (B) oder in Gegenwart von LDN (C) oder HDN (D) (E) Histogramm-Darstellung der CFSE Intensität in CD8 + -Zellen von Platten A -.. D Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Neutrophile sind die häufigsten aller weißen Blutzellen und die Ersthelfer bei Infektionen und Entzündungen. Als solche sind sie sehr empfindlich für externe Signale sind und leicht aktiviert. Darüber hinaus haben Neutrophilen eine sehr kurze Halbwertszeit und einen schnellen Umsatz. Zusammen bilden diese Merkmale heben einige Schwierigkeiten in der Arbeit mit Neutrophilen, so dass einzigartige experimentelle Strategien erforderlich sind. Beispielsweise gibt es mehrere Neutrophilen Reinigungsstrategien, die jeweils mit einem eigenen Vor- und Nachteile.

Ein entscheidender Schritt in der Arbeit mit Neutrophilen ist ihre Reinigung aus Vollblut. Neutrophile effizient entweder Dichtegradienten oder Antikörper-basierte Strategien (positive oder negative Auswahl) gereinigt werden. Unser Verfahren der Wahl ist die Verwendung eines Dichtegradienten da es ergibt eine hohe Zahl von hoch gereinigten Neutrophilen bei minimaler nicht-spezifischer Aktivierung. Doch wie wir in einer aktuellen Studie 21, Witzh Tumorprogression Neutrophilen akkumulieren in großer Zahl in der einkernigen Low-Density-Fraktion. Unter diesen Bedingungen ist der Einsatz einer Dichtegradientenzentrifugation liefert ein hochreines Hochdichte Neutrophilenfraktion, bedeutet, dass nicht unbedingt die gesamte zirkulierende Neutrophilen Repertoire und eine niedrige Dichte neutrophilen Fraktion, die stark mit anderen mononuklearen Zellen (Lymphozyten und Monozyten) verunreinigt ist. Unter diesen Umständen ist das Verfahren der Wahl ein Antikörper ist Kläranlagen, vorzugsweise negative Selektion. Die Verwendung von Antikörpern an Neutrophile reinigen ergibt hochreines Neutrophilen und besser repräsentiert die gesamte zirkulierende Neutrophilen Repertoires. Allerdings haben wir festgestellt, daß je länger die Neutrophile werden mit den Antikörpern, die Aussichten für nicht-spezifische Aktivierung Erhöhung inkubiert. Wir schlagen daher vor, dass für die besten Ergebnisse, Antikörper-basierte Neutrophilen Reinigung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Antikörper-basierte Neutrophilen Reinigung ist auch die Methode der Wahl, wenn purifying Neutrophilen aus Geweben oder Tumoren.

Unabhängig von der gewählten Reinigungsverfahren, die Reinheit, die Lebensfähigkeit und funktionelle Integrität rigoros ausgewertet werden. Die Reinheit von Neutrophilen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Antikörpern, die mit Neutrophilen Oberflächenmarker reagiert bestimmt werden. In der Maus ist Ly-6G, spezifisch für Neutrophile, die von einem CD11b + Ly-6C niedrigen Ly-6G + F4 / 80 gekennzeichnet sind - Phänotyp. Human-Neutrophile nicht eine Markierung analog Ly-6G exprimieren und werden häufig durch die Expression von CD11b, CD15, CD16 und CD66b wird. Da Neutrophile haben Fc-Rezeptoren, müssen diese vor der Immunfärbung blockiert werden. Neutrophile können auch von anderen weißen Blutzellen durch die eine höhere SSC unterscheiden. Lebensfähigkeit sollte am Ende des Reinigungsprozesses (Trypanblau Protokoll 2.1) ermittelt werden und sollte gehend größer 98% sein. Funktionserhalt sollte von Puri bestimmt werdenfizierung von Neutrophilen aus naiven Mäusen. Diese Neutrophile nicht aktiviert werden und nicht-zytotoxischen Steuerung für tumor mitgerissen Neutrophilen in einer Co-Kultur-Einstellung mit Tumorzellen (Protokoll 7).

Die kurze Halbwertszeit von Blut Neutrophilen zusammen mit der geringen Zahl der neutrophilen Granulozyten (~ 3-5 x 10 5) von 1 ml Blut eines naiven 6 erreicht - 8 Wochen alten Maus, haben es schwer, Mäuseblut Neutrophilenfunktion in erforschen gemacht vitro. Neutrophil Nummern erhöhen stetig in Zustände von Entzündung und gelegentlich bei Krebs, die eine chronische Entzündung 7 darstellt. Einige Forscher haben versucht, alternative Quellen für Neutrophile, wie beispielsweise Knochenmark 20 zu finden. 24 h nach einer intraperitonealen Injektion von 1 ml einer 3% Thioglykolat-Bouillon Lösung oder 1 ml einer 1 mg / ml Zymosan A-Lösung in Kochsalzlösung - Eine hohe Anzahl von Maus-Neutrophilen kann in 4 erhalten werden. Aber diese ausgelöst Neutrophilen nicht ausüben einny anti-tumorigene Aktivität (unveröffentlichte Beobachtung).

. Granot et al 6 beobachtet, dass BALB / c Mäusen orthotop mit der Maus 4T1 Mammakarzinom geimpft entwickeln Neutrophilie, die auf Zeit (2A) verschärft, so dass 20 - 4 Wochen - 40 Millionen Blutneutrophilen leicht von 1 ml Blut 3 isoliert werden post-Tumor-Inokulation. Diese Neutrophilen wurden Antitumoraktivitäten erfasst und sind entsprechend bezeichnet worden tumor mitgerissen Neutrophilen (TEN), um sie einem naiven Neutrophilen (2B) unterscheiden. Während hoher Dichte Neutrophilen (HDN) sind hoch anti-tumor niedriger Dichte Neutrophilen (LDN) im Rahmen von Krebs erzeugt nicht 21. Hoher Dichte Neutrophile aus dem Knochenmark und der Milz von Tumor-tragenden Mäusen haben auch Antitumor-Aktivität (unveröffentlichte Daten). Es sollte beachtet werden, dass bei der Tumorprogression die Milz allmählich vergrößert (Splenomegalie), wobei inFalten Mengen von Neutrophilen.

Um das Schicksal der Neutrophilen zu verfolgen nach ihrer Adoptivübertragung, müssen diese markiert sein. Neutrophilen kann in vivo durch Injektion von Bromdesoxyuridin (BrdU) in tumortragenden oder naive Mäuse 2 Tage vor Isolation zu kennzeichnen. BrdU ist ein Analog der DNA-Vorläufer-Thymidin, die in proliferierenden Zellen in neu synthetisierte DNA eingebaut wird. Im Fall von Neutrophilen wird BrdU in proliferierenden Vorläuferzellen, die BrdU-Färbung bei Differenzierung in reife postmitotische Neutrophilen behalten eingearbeitet werden. Die eingebaute BrdU kann mit spezifischen Anti-BrdU-Fluoreszenz-Antikörpern gefärbt werden. Die BrdU + Zellen können dann mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Ein anderer Ansatz ist, die isolierten Neutrophilen mit einer Zelle Tracker-Farbstoff, wie 5-Carboxyfluorescein-N-Succinimidylester (CFSE) kennzeichnen. CFSE eine Esterverbindung, die durch lebensfähige Zellmembranen passieren können. Es hat eine aminoreaktive Succinimidyl-Gruppe, die die kovalente Bindung von Fluorescein an Proteine ​​und andere Aminogruppen in der Zelle und der Zelloberfläche führt. Die CFSE-markierten Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der 488 nm-Argonlaser analysiert werden. Die beiden Markierungstechniken unterscheiden sich in der Tatsache, dass BrdU hängt proliferierenden Vorläuferzellen, und nicht alle zirkulierenden Neutrophilen wird markiert werden, während alle CFSE Neutrophilen färben. Nachweis von CFSE ist einfacher als BrdU-Färbung jedoch BrdU-Markierung ist ein gutes Mittel, um die unreifen zu reifen Neutrophilen Umwandlung folgen.

Wir haben auch verschiedene Methoden beschrieben, um die anti-Tumor- und anti-metastatische Funktion von Neutrophilen zu bestimmen. Dazu gehören Neutrophilen Erschöpfung, Neutrophilen adoptiven Transfer, Tumorneutralisationstest und Lungenmetastasen Aussaat Assay. Jeder dieser Assays erreicht einen spezifischen Aspekt des Anti-Tumor-Neutrophilen-Funktionen. Zum Beispiel Granot et al. 6 beobachtet, die nach depletion von Neutrophilen wird die Anzahl der Lungenmetastasen in 4T1-Tumor-tragenden Mäusen erhöht, was nahe legt eine antimetastatische Rolle der Neutrophilen. Auf Neutrophilen adoptiven Transfer werden die Tumorzellen intravenös 4 Stunden vor der Injektion von gereinigtem HDN injiziert. Die Fähigkeit der Tumorzellen Lungen- und Lebermetastasen, werden in einem Zeitverlaufsstudie unter Verwendung eines optischen Abbildungssystems in vivo verfolgt. Mäuse, die HDN zeigten weniger metastatischen Foci als taten Kontrollmäusen 6. Im Tumor Neutralisationstest, werden die Tumorzellen subkutan mit oder ohne HDN injiziert, die Anwesenheit von HDN reduziert das Tumorwachstum 21. Im metastatischen seeding Assay werden GFP-markierten Tumorzellen intravenös in Steuer- oder Neutrophilen abgereicherte vorge metastatischen Tumor-tragende Mäuse injiziert, und die Fähigkeit der GFP-markierten Zellen in der Lunge Samen bestimmt. Die Lungen von vorge metastatischen Tumor-tragenden Mäusen sind durch hohe Neutrophilinfiltration das Tumor verhindert gekennzeichnetZellaussaat in dem spezifischen Organ 6. Dies führt zu mehr metastatischen Foci in Neutrophilen verarmte Mäuse verglichen mit Kontroll Tumor-tragenden Mäusen.

Die Protokolle über das Studium Neutrophilenfunktion im Kontext von Krebs und bieten Strategien zur krebsbedingten neutrophilen Eigenschaften in vitro und in vivo zu bewerten beschriebenen Fokus. Allerdings sind die Neutrophilen-Reinigungsstrategien sowie einige der beschriebenen experimentellen Verfahren kann für das Studium Neutrophilenfunktion in einer Vielzahl von experimentellen Situationen, in denen neutrophile spielen eine entscheidende Rolle (dh Entzündung und Infektion) verwendet werden.

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Acknowledgements

ZG wird durch Zuschüsse aus dem I-CORE-Programm der Israel Science Foundation (Grant No 41/11) unterstützt, die Abisch-Frenkel-Stiftung, die Rosetrees Trust, die Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forschung Career Development Award) und die CONCERN Fundament. ZGF wird durch Zuschüsse aus dem Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forschung Career Development Award) unterstützt, Chief Scientist des israelischen Gesundheitsministerium und dem Israel Lung Association.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

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References

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