Zebrafish भ्रूण में Microbead आरोपण

Developmental Biology
 

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Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).

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Abstract

zebrafish विकास जीव विज्ञान और रोग के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान आनुवंशिक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। Zebrafish मानव सहित अन्य रीढ़ के साथ, सेलुलर आणविक, और शारीरिक प्रक्रियाओं में एक उच्च जीनोमिक संरक्षण की डिग्री है, साथ ही समानता का हिस्सा है। जल्दी व्यक्तिवृत्त के दौरान, zebrafish भ्रूण शोधकर्ताओं ने एक साधारण stereomicroscope का उपयोग जीवोत्पत्ति की गतिशीलता कल्पना करने के लिए अनुमति देता है, ऑप्टिकली पारदर्शी होते हैं। Microbead आरोपण स्थानीय वातावरण में कारकों में परिवर्तन के माध्यम से ऊतक हेरफेर सक्षम बनाता है एक विधि है। यह शोधकर्ताओं जैसे विकासशील भ्रूण के भीतर विशिष्ट स्थानिक और लौकिक बिंदुओं पर स्रावित पेप्टाइड्स, के रूप में ब्याज की संकेतन अणुओं के किसी भी संख्या के प्रभाव को परख करने के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम विस्तार से जल्दी zebrafish विकास के दौरान हेरफेर और प्रत्यारोपण मोतियों के लिए कैसे के लिए एक प्रोटोकॉल।

Introduction

विकासात्मक जीव विज्ञान शोधकर्ताओं ने एक जीव का गठन कैसे किया जाता है कि नियंत्रण तंत्र को उजागर करने के लिए, सेलुलर आणविक, और आनुवंशिक तरीकों की एक विशाल सरणी का उपयोग। इन तरीकों के अलावा, ऊतक हेरफेर सेल भाग्य, सेलुलर आंदोलन, और ऊतकों के संगठन के बारे में जटिल सवालों का गूढ़ रहस्य में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। स्थानीय ऊतक वातावरण को बदलने के लिए एक तरह से प्रोटीन या अन्य संकेतन अणुओं 1 का केन्द्र स्रोत वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि microbeads की शल्य आवेदन के माध्यम से है। प्रयोगात्मक हेरफेर के इस प्रकार के व्यापक रूप से इस तरह के मेंढक और लड़की के रूप में 2 शास्त्रीय कशेरुकी भ्रूण विज्ञान मॉडल, में लागू किया गया है।

zebrafish जीवोत्पत्ति के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण कशेरुकी मॉडल जीव बन गए हैं और वे मनुष्यों 6 के साथ उच्च आनुवंशिक संरक्षण साझा के रूप में भी रोग मॉडलिंग 3-5 के लिए कई अद्वितीय लाभ प्रदान किया है। विशेष रूप से, ऑप्टिकल पारदर्शिता और पूर्व मेंzebrafish भ्रूण की तेहरा विकास ऊतक व्यक्तिवृत्त 3-5 के अवलोकन के लिए एक बेजोड़ दृष्टिकोण प्रदान करता है। बड़े पैमाने पर आगे आनुवंशिक स्क्रीन के कार्यान्वयन के आगे के अध्ययन के 7,8, और कुशलता से एकल प्रयोगशालाओं 9,10 में कम पैमाने पर आयोजित किया जा सकता है कि वैकल्पिक स्क्रीनिंग तकनीक की पहचान के लिए zebrafish उत्परिवर्ती उपभेदों के एक शक्तिशाली रिपोजिटरी उत्पन्न किया है। इसके अलावा zebrafish साथ प्रयोगात्मक कार्य ट्रांसजेनिक के तरीके में प्रगति के माध्यम से मदद की और आनुवंशिक दृष्टिकोण 11,12, साथ ही रासायनिक आनुवंशिकी 13-15 रिवर्स कर दिया गया है।

ऐसे microbeads के कार्यान्वयन के रूप में ऊतक हेरफेर तकनीक, व्यापक रूप से zebrafish में कार्यरत रूप में किया गया है, लेकिन फिर भी आगे के विकास के दौरान कोशिका संकेतन को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान नहीं की है। Microbead आरोपण zebrafish रेटिना में अंग गठन की प्रक्रिया से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया है16,17, दिल 18, मस्तिष्क 19-22, तंत्रिका शिखा 23, और 24,25 फिन। इन और अन्य अध्ययनों में, मोती ढ़ाल सेल प्रवास 27 और अक्षीय patterning के 28 कैसे प्रभावित संकेतन अणुओं 26 के प्रसार को समझने के लिए विकास के दौरान लागू किया गया है। हाल ही में, microbeads के लिए zebrafish वयस्कों के 29 में उत्थान तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया है। विकास अध्ययन में, उदाहरण के लिए, zebrafish microbead काम छाती पर का कवच पंख 25 के अध्ययन के माध्यम से अंग गठन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। zebrafish छाती पर का कवच पंख कली माउस 30 और लड़की 31 में forelimb कली को मुताबिक़ है। कशेरुकी अंग कली दो आवश्यक संकेतन नोड्स है: ध्रुवीकरण गतिविधि ध्वनि हाथी की अभिव्यक्ति के माध्यम से पूर्वकाल-टू-पीछे अक्ष स्थापित करता है कि (ZPA) (श) और नीचे की ओर Hox जीन लक्ष्य का क्षेत्र,और fibroblast वृद्धि कारकों की अभिव्यक्ति (Fgfs) के माध्यम से अंग के बाहर का पहचान करने के लिए समीपस्थ स्थापित करने के लिए कार्य करता है जो अंग कली, की नोक पर मौजूद शिखर बहिर्जनस्तरीय रिज (AER)। zebrafish श्श्श आनुवंशिक म्यूटेंट, जांचकर्ताओं में FGF लथपथ microbeads दाखिल कशेरुकी अंग 25 की कोशिका चक्र और विकास की प्रगति के लिए आवश्यक के रूप में FGF की पहचान की। इसके अलावा स्थितीय पहचान स्थापित कि FGF और श्श्श संकेत Cascades, पहचान 32 पीछे पूर्वकाल स्थापित करने के ध्रुवीकरण क्षेत्र की कार्रवाई की नकल कर सकता है कि एक अणु के रूप में retinoic एसिड (आरए) की पहचान की लड़की के अंग कली का उपयोग करते हुए अग्रणी अध्ययन। लड़की अंग में आरए से लथपथ वाटमान कागज के छोटे स्ट्रिप्स रखकर शामिल इन प्रयोगों अंकों patterning के 32 मूल्यांकन करने के लिए। इसके अलावा, शोधकर्ताओं microbeads के उपयोग को रोजगार अन्य सुरुचिपूर्ण पढ़ाई प्रदर्शन किया है, कोशिका प्रत्यारोपण, और exogenousZebrafish में आरए उपचार आरए zebrafish पश्चमस्तिष्क और mesoderm 28 के भीतर लंबी दूरी स्थितीय संकेतों प्रदान करने के लिए कार्य करता है कि निर्धारित करने के लिए। हालांकि, वर्तमान में कई सवाल कशेरुकी विकास के कई पहलुओं के दौरान FGF और रा जैसे कारकों संकेत की भूमिका के बारे में रहते हैं। आरए के संकेत प्रभाव, एक morphogen के रूप में अभिनय, इस तरह के आरए समीपस्थ गुर्दे की कोशिकाओं भाग्य 35-39 प्रकार निर्दिष्ट जहां विकासशील दिल 34 और गुर्दे पूर्वज के रूप में कई अंगों 33, प्रभाव। इस तरह के विषयों के आगे समझने ऊतक हेरफेर और microbead आरोपण तकनीक का उपयोग कर प्रयोगात्मक अध्ययन से काफी फायदा हो सकता है।

लड़की की तरह मॉडल की तुलना में जब कम पढ़ाई के लिए zebrafish में microbead आरोपण के साथ प्रदर्शन किया गया है, वहीं बाहर किया गया है कि उन बेहद जानकारीपूर्ण किया गया है। Zebrafish भ्रूण में microbead आरोपण आधारित अनुसंधान की कमी का एक कारण likel हैY एक बाधा सफलतापूर्वक ऐसे जोड़तोड़ करने के लिए प्रदर्शन का गठन जो भ्रूण के आकार के आधार पर, कठिन तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं कि यह विचार। हालांकि, zebrafish भ्रूण में microbead आरोपण अभ्यास के साथ सीखा और तकनीक के दृश्य अवलोकन के माध्यम से सहायता प्रदान की, और इस तरह के विकास के तंत्र से पूछताछ करने के लिए एक साधन के रूप में चलाया जा सकता है किया जा सकता है। यहाँ, हम ऊतक गठन और सेलुलर morphogenesis पर assays के एक विस्तृत विविधता के संचालन के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो zebrafish भ्रूण में एक microbead की सटीक आवेदन प्रदर्शित करता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित zebrafish भ्रूण के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. घंटी समाधान तैयारी

  1. किसी भी नमक वर्षा से बचने के लिए निरंतर क्रियाशीलता के माध्यम से ultrapure एच 2 ओ के साथ 116 मिमी NaCl, 2.9 मिमी KCl, 3.6 मिमी 2 CaCl, और 5 मिमी Hepes का समाधान करें।
  2. लवण जोड़ने और समाधान अभी भी सरगर्मी है थोड़ी देर के बाद, 100 इकाइयों / एमएल प्रति पेनिसिलिन और मिलीग्राम प्रति 100 माइक्रोग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें।
  3. सभी एंटीबायोटिक दवाओं और नमक जोड़ने के बाद, बाँझ कंटेनर में समाधान और दुकान के फिल्टर नसबंदी प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: एन-Phenylthiourea (1-फिनायल-2-Thiourea) या पी टी यू भ्रूण स्वास्थ्य के लिए नकारात्मक परिणामों के बिना मनका प्रत्यारोपित भ्रूण में वर्णक के गठन ब्लॉक करने के लिए घंटी समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है। घंटी / रंजकता अवरुद्ध समाधान तैयार करने के लिए, एक ध्यान केंद्रित का उपयोग0.003% पी टी यू के tration। कारण पी टी यू की एकाग्रता कम करने के लिए इसे पी टी यू पाउडर की miniscule मात्रा में जोड़ने से बचने के लिए, घंटी समाधान की एक बड़ी मात्रा में कम से कम 1 एल, बनाया जा सलाह दी है कि जोड़ा जाएगा। समाधान सरगर्मी है, जबकि 1.2 चरण के दौरान पी टी यू जोड़ें।

2. Tricaine समाधान तैयारी

  1. 9.5 के पीएच को संतुलित एक 1 एम स्टॉक से, समाधान प्लस 0.1 एम Tris के एल प्रति इथाइल के 3-aminobenzoate methanesulfonate नमक (Tricaine) 2 जी जोड़ें और ultrapure एच 2 ओ के साथ बनाया
    नोट: Tricaine मनका आरोपण phenotypes के परख करने के लिए वांछित समय बिंदु पर zebrafish भ्रूण euthanize करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

3. E3 के समाधान तैयारी

  1. E3 के 1 एल बनाने के लिए 0.25 एम NaCl, 10 मिमी KCl, 12.5 मिमी 2 CaCl, और 16.6 मिमी MgSO 4 ultrapure पानी के एल 1 के समाधान करें।
  2. कवक विकास को बाधित करने के लिए E3 के समाधान के लिए methylene नीले रंग के 200 μl जोड़ें।

Microbead स्थानांतरण के लिए 4. पुलिंग सुई

  1. एक आयुध डिपो में फिलामेंट के साथ आग पॉलिश borosilicate ग्लास का उपयोग करें: 1.0 मिमी, आईडी: 0.5 मिमी, 10 सेमी की लंबाई पर।
  2. ठीक सुइयों तैयार करने के लिए एक micropipette खींचने में borosilicated गिलास रखें।
    नोट: = 245, वेग = 200, और समय = 125 खींचो, हीट = 540: निम्नलिखित चार आयामों सुई खींचने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. सुइयों के एक पर्याप्त संख्या खींच के बाद, कवर प्लास्टिक की दुकान में उपयोग करें जब तक, क्ले मॉडलिंग या सुई टिप तोड़ने को रोकने के लिए चिपकने वाला टेप के स्ट्रिप्स पर तैनात व्यंजन, पेट्री।
  4. वांछित बोर आकार करने के लिए सुई की नोक ट्रिम करने के लिए, सुई के अंत स्कोर करने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें।
    नोट: सुई बोर आकार microbead आकार का उपयोग किया है और साथ ही उपयोगकर्ता से निपटने वरीयताओं किया जा रहा है के आधार पर अलग अलग होंगे। 50-100 माइक्रोन से लेकर microbeads उपयोग किया जाएगा यदि एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु 100 और 200 माइक्रोन के बीच एक सीमा में शिल्प बोर आकार करने के लिए है।
  5. PRIOआर पूरा microbead स्थानांतरण साधन फैशन के लिए केशिका ट्यूब धारक में छंटनी की सुई डालने, उपयोग करने के लिए।

5. गलमुच्छा / चलाओ उपकरण तैयारी

  1. एक गलमुच्छा प्राप्त जोर से मारना, या प्राकृतिक या सिंथेटिक हेयर फिलामेंट के अन्य छोटे से अभी तक फर्म टुकड़ा। एक 45 डिग्री के कोण पर फिलामेंट के आधार के पास कट। स्थायी स्पष्ट चिपकने वाला गोंद का उपयोग कर एक पी-1000 micropipette टिप करने के लिए गलमुच्छा पालन करें।

6. Microbead आरोपण ट्रे तैयारी

  1. E3 के समाधान के 100 मिलीलीटर एक 2% E3 के agarose जेल बनाने के लिए साथ agarose के 2 जी मिलाएं।
  2. अधिक बुदबुदाती से जेल से बचने के लिए कुप्पी हर 30 सेकंड घूमता, एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में 1 मिनट और 30 सेकंड के लिए 2% agarose समाधान हीट।
  3. एक 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन लो और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ इंटीरियर के साथ एक बड़ा 150 मिमी x 15 मिमी पकवान में जगह है।
  4. नीचे लंगर के लिए सुनिश्चित कर रही है, 150 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में गर्म agarose जेल डालोतर्जनी के साथ छोटे डिश के ढक्कन।
    नोट: जेल डालने के लिये जब फार्म जाएगा कि संक्षेपण दूर करने के लिए छोटे डिश के ढक्कन के नीचे agarose की एक पतली परत की अनुमति दें; यह एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे देखने के लिए मोती आसान कर देगा।
  5. Agarose ठंडा यह solidifies से पहले, लेकिन, जेल पर एक अच्छी तरह से ढालना जगह है। इस भ्रूण की आसान प्लेसमेंट के लिए अनुमति देगा।
  6. नोट: यह जेल के शीर्ष पर चल रहा है जब तक कुओं में बुलबुले से बचने के क्रम में, एक कोण पर धीरे-धीरे ढालना जगह है।
  7. जेल जम गया है एक बार एक microspatula का प्रयोग, ध्यान अच्छी तरह से मोल्ड को हटा दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर E3 के समाधान और दुकान में जोड़े।

7. भ्रूण संग्रह

  1. प्रणाली पानी के साथ उन्हें भरने, और उसके बाद कक्षों हे / एन में वयस्क zebrafish पुरुष (एस) और महिला (ओं) को जोड़े रखने के द्वारा, डिवाइडर से अलग किए गए संभोग कक्षों, तैयार करें।
  2. ठीक एक तार की जाली झरनी का उपयोग कर निषेचित अंडे ले लीजिए (भ्रूण चरणों से थोड़ा भिन्न हो जाएगा)।
  3. वहाँ डिश में E3 के समाधान के लगभग 25 मिलीलीटर झरनी में छोड़ दिया अंडे नहीं कर रहे हैं जब तक उल्टा झरनी मोड़ और E3 के ठीक एक धारा के साथ यह rinsing द्वारा एक साफ, 10 सेमी व्यास पेट्री डिश में निषेचित अंडे जमा है, और।
  4. संग्रह के बाद, क्लच भीतर विकासात्मक asynchrony के लिए नेतृत्व और मुश्किल वांछित टाइम्स अंक एकत्रित कर सकता है जो भीड़भाड़ से बचने के लिए कई व्यंजन (डिश के अनुसार लगभग 50-60 अंडे) में अंडे विभाजित करते हैं।
  5. मानक zebrafish मचान सीरीज 40 के अनुसार विकास के मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर E3 के समाधान में भ्रूण सेते हैं।
    नोट: भ्रूण पुराने चरणों में जोड़तोड़ ऑप्टिकल स्पष्टता की जरूरत है अगर वर्णक विकास को रोकने के लिए 24 घंटे के बाद निषेचन (HPF) पर E3 के / पी टी यू करने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए।

8. मनका आरोपण

  1. वांछित परीक्षण अणु एकाग्रता में microbeads या इसी वाहन के सेतेएक उचित मात्रा में आवश्यक समय के लिए olution।
    नोट: शोधकर्ता बाँझ पेट्री 3-6 सेमी से व्यास में लेकर बर्तन, या समाधान के भीतर microbeads के दृश्य को सक्षम, जो दोनों के बहु अच्छी तरह प्लेटें, उपयोग कर सकते हैं। समय प्रकार और ब्याज की अणु की राशि के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, और शोधकर्ता इस तरह के प्रकाश और तापमान के प्रति संवेदनशीलता के रूप में ऊष्मायन और अन्य पहलुओं की अवधि के लिए निर्माता या प्रकाशित सिफारिशों का उल्लेख करना चाहिए।
  2. भ्रूण वांछित विकास समय बिंदु तक पहुँच चुके हैं एक बार, ठीक संदंश का उपयोग कर अपने chorions से भ्रूण को हटा दें।
  3. समाधान के लिए उन्हें acclimate करने के लिए 10 मिनट के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ फ़िल्टर्ड घंटी समाधान में भ्रूण सेते हैं।
  4. भ्रूण acclimating कर रहे हैं, आरोपण ट्रे के भीतर बसे microbead थाली में microbeads के हस्तांतरण और 10 मिनट के लिए घंटी समाधान में उन्हें कुल्ला।
    नोट: इस बिंदु तक पहुंचने के बाद 50 मिनट के भीतर मोती प्रत्यारोपण। इस wबीमार एक ब्याज की अणु के एक छोटे एकाग्रता के साथ एक मनका प्रत्यारोपण होगा कि संभावना कम।
  5. प्रत्यारोपित किया जाएगा microbead पहुँचा जा सकता है जहां इतनी रुचि के क्षेत्र में उन्हें ग्रहण करने के ख्याल रख रही microbead आरोपण ट्रे के कुओं में भ्रूण ऐरे।
  6. टंगस्टन सुई का उपयोग भ्रूण पर एक छोटा सा चीरा बनाओ।
  7. Microcapillary हस्तांतरण पिपेट का उपयोग भ्रूण पर एक microbead स्थानांतरण: पिपेट का बल्ब निराशाजनक, धीरे केशिका स्तंभ में microbead खींच, और फिर वांछित गंतव्य पर microbead स्थानांतरित करने के लिए दबाव जारी है।
  8. भ्रूण के अंदर microbead की स्थिति के लिए गलमुच्छा / चाबुक उपकरण का उपयोग करें। नोट: यह चंगा के रूप में microbead भ्रूण से निष्कासित नहीं किया जाएगा ताकि चीरा की साइट से दूर ऊतक में microbead की स्थिति के लिए सुनिश्चित करें।

Representative Results

हेरफेर उपकरण के कई प्रकार के अनुसंधान अनुप्रयोगों (चित्रा 1) के दौरान microbeads से निपटने के लिए उपयोगी होते हैं। इसके अलावा, छोटे कुओं के साथ एक सरल agarose ढालना एक समय पर और कुशल तरीके से (चित्रा 1) में इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है जो zebrafish भ्रूण, धारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। एक microbead का आरोपण शोधकर्ताओं हित के अणु के लिए कार्रवाई की एक विशिष्ट विंडो संकीर्ण करने के लिए अनुमति देता है जो भौगोलिक स्थिति और ब्याज के अस्थायी मंच है, में प्रदर्शन किया जा सकता है।

इधर, एकल microbeads पूंछ कली चरण में zebrafish भ्रूण में या somitogenesis चरणों (चित्रा 3) के दौरान बाद में समय बिंदुओं पर प्रत्यारोपित किया गया। अकेले घंटी समाधान के साथ rinsed दो अलग अलग आकार microbeads, इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन (चित्रा 3 ए, 3 बी और 3 सी) में इस्तेमाल किया गया। किसी भी संयुग्मित के अभाव में इस microbead आरोपणछोटे अणुओं मनका आरोपण zebrafish भ्रूण (चित्रा 4) के समुचित विकास के दौरान सकल रूपात्मक प्रभाव के बिना हासिल किया जा सकता है कि यह दर्शाता है।

experimentalist भ्रूण के ऊपर एक टंगस्टन सुई द्वारा किए गए पंचर छेद में microbead के युद्धाभ्यास के साथ कठिनाइयों का सामना कर सकते हैं। एक बार सूक्ष्म सुई द्वारा भ्रूण पर रखा microbead की बेहतर हैंडलिंग को प्राप्त करने के लिए, एक गलमुच्छा / चाबुक उपकरण का इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य प्राकृतिक या कृत्रिम चाबुक के filaments (चित्रा 1) का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि यह स्वाभाविक रूप से बिल्ली के समान या कुत्ते मूंछ शेड के साथ तैयार किया जा सकता है। टंगस्टन सुई या गलमुच्छा उपकरण के साथ या तो microbead के एक सज्जन धक्का microbead ढालना की घंटी समाधान में डूब देखना चाहिए। Microbead मोल्ड में डूब गया है एक बार जब यह आवश्यक हो तो टंगस्टन सुई का उपयोग बड़ी दूरी स्थानांतरित किया जाना चाहिए और एक बार भ्रूण के ऊपर सुई या गलमुच्छा उपकरण पदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैभ्रूण में microbead n। मनका स्थिरतापूर्वक ऊतक में तैनात रहेगी microbead आरोपण की सफलता के तुरंत, एक stereomicroscope पर दृश्य के माध्यम से लगाया जा सकता है। समय के साथ मनका स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए, प्रत्येक भ्रूण नमूना रहते समय पाठ्यक्रम फोटोग्राफी के माध्यम से imaged किया जा सकता है या (चित्रा 4 में दिखाया गया के रूप में) मनका स्थान होने के कारण अंतर्जात ऊतक करने के लिए प्रयोग की अवधि से अधिक स्थानांतरित नहीं किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित अंतराल पर जाँच morphogenesis। समय के साथ मनका की स्थिति को समझना इस तरह के एक लक्ष्य ऊतक या विकास की प्रक्रिया पर एक छोटा सा अणु के प्रभाव का मूल्यांकन के रूप में परिणाम है, की सबसे सूचित व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है।

इन ऊपर के चरणों का उपयोग एक वांछित समय और स्थान पर zebrafish भ्रूण में microbeads बैठाना, जिसमें एक आदर्श वातावरण प्रदान करेगा। हमारे अनुभव में, इस microbead आरोपण प्रोटोकॉल का नौसिखिया उपयोगकर्ताओं को आम तौर पर कौशल पूर्वोत्तर प्राप्त कीअभ्यास के लगभग एक सप्ताह के बाद zebrafish भ्रूण में microbeads की लगातार शल्य आरोपण प्रदर्शन करने के लिए cessary।

चित्र 1
चित्रा 1. उपकरण microbead आरोपण प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (ए) मनका आरोपण ट्रे (बाएं, 15 सेमी व्यास) भ्रूण molds के साथ (बाईं ओर) और एक microbead ऊष्मायन ट्रे (सही पर, 6 सेमी व्यास)। यह काम ट्रे शोधकर्ता microbead आरोपण के लिए वांछित अभिविन्यास में भ्रूण स्थान के लिए, और माइक्रोस्कोप स्टेशन पर करीब निकटता में आरोपण के लिए तैयार microbeads के पास करने के लिए सक्षम बनाता है। Microbeads छोटे अणु (एस) और / या वाहन में incubated और फिर माइक्रोस्कोप स्टेशन के तहत तैनात है कि मनका आरोपण ट्रे में उन्हें रखने से पहले एक अलग microbead प्लेट (दाएं) में rinsed होना चाहिए। (बी) के ठीक संदंश के दो जोड़े चोरी दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगाmicrocapillary सुई के अंत को तोड़ने के लिए भी प्रत्येक zebrafish भ्रूण के आसपास के और पर। (सी) एक टंगस्टन सुई microbead की स्थिति के लिए जो में zebrafish भ्रूण में एक बहुत ही सुन्दर पंचर बनाने के लिए नियोजित किया जाएगा। (डी) microcapillary हस्तांतरण पिपेट लेने और पंचर के स्थल के निकट zebrafish भ्रूण के शीर्ष पर एक microbead की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। (ई) में पहले टंगस्टन सुई द्वारा किया गया था कि भ्रूण के भीतर चीरा साइट में microbead की कोमल स्थिति की अनुमति देगा गलमुच्छा / चाबुक उपकरण। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Microbead आरोपण प्रक्रिया चित्रा 2. योजनाबद्ध। (ए) microbeads soaki के साथ एक microbead आरोपण ट्रेवांछित धोने समाधान में एनजी एक stereomicroscope स्टेशन के तहत स्थापित किया है, और भ्रूण ऊतक ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ तैनात है। एक टंगस्टन सुई का प्रयोग (बी), भ्रूण में एक छोटा सा चीरा एक मामूली अभी तक सशक्त आंदोलन के साथ बनाया जा सकता है। एक microcapillary हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग (सी), वांछित microbead सही पर स्थित ट्रे में microbead ऊष्मायन कक्ष से उठाया है, और भ्रूण कार्य क्षेत्र पर स्थित है, जहां बाईं डिब्बे में लाया जा सकता है। microbead चीरा के स्थल के निकट जमा किया जाना चाहिए, फिर धीरे गलमुच्छा / चाबुक उपकरण का उपयोग टंगस्टन सुई द्वारा किए गए चीरा साइट में तैनात हैं। एक microbead चीरा साइट में चतुराई हो जाने के बाद, यह स्थिरतापूर्वक microbead स्थिति और विकास जारी है के रूप में भ्रूण के बाहर बाद में आंदोलन को रोकने के लिए (दूर चीरा से) ऊतक में tucked किया जाना चाहिए। पीपट्टा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. microbeads विभिन्न विकासात्मक चरणों में भ्रूण में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। (ए) zebrafish भ्रूण पूंछ कली चरण में ट्रंक में एक microbead (लगभग 50 माइक्रोन का व्यास) के साथ प्रत्यारोपित किया गया। 24 घंटे बाद मनका प्रत्यारोपण (hpbi) में जांच की, भ्रूण सामान्य रूप से विकसित की थी और microbead विकासात्मक समय बीतने के दौरान कम से कम आंदोलन दिखाया। 3 विखंड चरण (एसएस) में जर्दी थैली में (लगभग 50 माइक्रोन की एक व्यास के साथ) microbeads के साथ प्रत्यारोपित (बी) zebrafish भ्रूण समय के साथ अपेक्षाकृत मामूली मनका आंदोलन के साथ सामान्य विकास का प्रदर्शन किया। (सी) बड़ा microbeads (लगभग 70 माइक्रोन का व्यास) इसी प्रकार सामान्य बाद के विकास, साथ ही मिनी दिखाया 7 एसएस भ्रूण में प्रत्यारोपित किया गयामल आरोपण की साइट से किसी भी आंदोलन। अगर इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Zebrafish भ्रूण की चित्रा 4. सकल विकास 72 hpbi के माध्यम से एक microbead की मौजूदगी से बेफिक्र है। Zebrafish भ्रूण 7 विखंड चरण (एसएस) में (लगभग 50 माइक्रोन की एक व्यास के साथ) घंटी समाधान में भिगो microbeads के साथ प्रत्यारोपित किया गया। प्रत्येक microbead शल्य चिकित्सा somites 3 ​​और 4 के बीच, ट्रंक में डाला गया था मनका की उपस्थिति 24 घंटे बाद मनका प्रत्यारोपण में प्रकट विकास संबंधी दोषों (hpbi), 48 hpbi, या 72 hpbi साथ जुड़ा नहीं था। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

Discussion

पिछली सदी में, शरीर योजना patterning और जीवोत्पत्ति की समझ स्मारकीय अग्रिमों आया है। ऊतक हेरफेर तकनीक इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी को उजागर करने में महत्वपूर्ण थे। आनुवंशिक संशोधन जीन समारोह सुनिश्चित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है, और इस तरह के सेल प्रत्यारोपण के रूप में मोज़ेक विश्लेषण के तरीकों, जीन समारोह की स्वायत्तता को समझने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। Microbead आरोपण इस विधि संकेतन अणुओं या अवरोधकों को शुरू करने से एक स्थानीय ऊतक वातावरण में परिवर्तन करने के शोधकर्ता सक्षम बनाता है, के रूप में विकास की गतिशीलता को बदल कैसे विशेष अणुओं से पूछताछ करने के लिए एक और स्थल प्रदान करता है। अलग microbeads की एक श्रृंखला की अलग आकार और अन्य भौतिक गुणों वे ब्याज की प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए नियोजित किया जा सकता है कि इस तरह के (जैसे, प्रभार) मौजूद है कि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस प्रकार, एक प्रोटीन या chemi में भिगो कर रहे हैं कि microbeads के द्वारा दाखिलएक जीव के भीतर ब्याज की कैलोरी, शोधकर्ताओं ने विकास के दौरान स्थानीय प्रभाव की जांच और जीन या ब्याज और विशेष रूप से जैविक फेनोटाइप (एस) के अणु के बीच संघों पा सकते हैं।

ऐसे zebrafish 23 में पूर्वकाल neurocranium (एएनसी) में कंकाल आकृति में वृद्धि हुई हाथी संकेतन के प्रभाव का आकलन करने के क्रम में microbead आरोपण इस्तेमाल किया वाडा द्वारा प्रदर्शन एक और सहयोगियों के रूप में अध्ययन। पिछले अध्ययनों श्श्श एएनसी गठन 14 के लिए आवश्यक है कि पता चला है। का प्रयोग श्श्श में लिपटे microbeads के शोधकर्ताओं ने यह संकेत एएनसी में उपास्थि गठन को बढ़ावा देता है कि पहचान की। microbead आरोपण प्रक्रिया एएनसी में हाथी संकेतन और उपास्थि के गठन के बीच एक स्पष्ट कड़ी प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। वैज्ञानिकों Erythroblastoma छब्बीस की ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण की जांच की जहां zebrafish में इस ऊतक हेरफेर तकनीक का एक अन्य प्रमुख उदाहरण के अध्ययन में मनाया जाता है (टिकट) डोमेन चअभिनेताओं के टिकट से संबंधित अणु (एर्म) और जल्दी zebrafish मस्तिष्क के विकास के दौरान 19 FGF संकेतन द्वारा Polyoma बढ़ाने उत्प्रेरक 3 (Pea3)। Microbead आरोपण प्रयोगों के माध्यम से, वे Fgf8 और Fgf3 ectopically एर्म और pea3 की अभिव्यक्ति को सक्रिय कर सकते हैं दिखाने के लिए सक्षम थे। ये उदाहरण जीन अभिव्यक्ति 41 का आकलन करने के तरीकों के उपयोग से अच्छी तरह से विशेषता जा सकता है जो ऊतक गठन के दौरान सहयोग कि विकास तंत्र, में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए microbeads की उपयोगिता को दर्शाते हैं। इस प्रकार, microbead प्रत्यारोपण जैसे गुर्दे को जन्म देता है जो मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) के रूप में अन्य ऊतकों, पता लगाने के लिए एक व्यावहारिक तरीका हो सकता है। विशेष रूप से, यह नेफ्रॉन 42 विभाजन और 43,44, केवल अल्पज्ञता वर्तमान में समझ रहे हैं कि प्रक्रियाओं tubulogenesis को प्रभावित कैसे अलग अणुओं की जांच करने के लिए, गुर्दे विकासात्मक अध्ययन में सहायता करेगा। इसके अलावा, microbead आरोपण संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए शुरू हो गया हैzebrafish 29] और y के उत्थान प्रक्रियाओं ऐसी इसी वयस्क संरचनाओं के साथ अनुसंधान प्रदर्शन करने के लिए तैयार किया गया है कि तरीकों के साथ नेफ्रॉन 45 या संयोजन के रूप में की तरह भ्रूण के ऊतकों के निम्नलिखित लेजर पृथक रूप में अंग उत्थान मॉडल, के किसी भी संख्या के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है 46-49। अंत में, microbead आरोपण इस तरह के कैंसर 50,51 या ऊतक अध: पतन 52,53 के रूप में मानव रोग के मॉडल में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम भी इसी तरह अन्य शोधकर्ताओं द्वारा वर्णित है, लेकिन वीडियो प्रोटोकॉल 1 के माध्यम से नहीं दिखाया गया है जो zebrafish भ्रूण में microbead आरोपण, की विधि प्रदर्शित करता है। कम से कम अभ्यास के साथ हम शोधकर्ता कुछ अनुभव है एक बार इस प्रक्रिया की व्यवहार्यता से संबंधित है जो 8-10 भ्रूण की एक अनुमानित दर / घंटा, पर microbeads के प्रत्यारोपण करने में सक्षम थे। इस के साथ साथ दिखाया गया है परिणामों विभिन्न डी का मोती है कि का प्रदर्शनimensions प्रारंभिक चरणों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, और देखभाल के साथ कि, इस ऊतक हेरफेर तकनीक भ्रूण के लिए कम से कम शारीरिक विघटन के साथ लागू किया जा सकता है। जोर दिया जाना चाहिए कि एक सुधार भ्रूण में microbead की स्थिति के लिए एक गलमुच्छा / चाबुक उपकरण का इस्तेमाल होता है। उपकरणों का यह अपेक्षाकृत सस्ती और आसान टुकड़ा microbead रूप में एक ही व्यास के बारे में प्राप्त करने के लिए आसान है और आरोपण की प्रक्रिया में तेजी लाने में मदद करता है। गलमुच्छा / चाबुक शोधकर्ता निपुणता और पसंद पर निर्भर करता है, अभी तक नाजुक मनका-संभाल उपकरण एक फर्म का निर्माण करने के लिए एक वांछित लंबाई में कटौती की जा सकती है। हम यहां शारीरिक रूप से आरोपण प्रदर्शन करने के लिए microbeads और zebrafish भ्रूण हेरफेर करने के लिए कैसे वर्णित अंत में, जबकि, इस प्रोटोकॉल के विभिन्न दवाओं या पेप्टाइड्स के लिए विशिष्ट हैंडलिंग प्रक्रियाओं की रूपरेखा तैयार नहीं है। सामान्य में, रासायनिक उपचार microbeads जीव के अन्य क्षेत्रों में अवांछित प्रभाव से बचने के लिए, अवसरवादिता के साथ पशु में प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए, और शोधकर्ताओं में अच्छी तरह से किया जाना चाहिएअपनी पढ़ाई शुरू करने से पहले किसी भी तरह के रसायनों के साथ जुड़े संभव सुरक्षा चिंताओं के बारे में गठन किया था।

संक्षेप में, हम प्रयोगशाला में आसानी से उपलब्ध हैं कि सामग्री का उपयोग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक अपेक्षाकृत सरल और कुशल microbead आरोपण विधि का प्रदर्शन किया है। अंत में, हम इस पुस्तिका zebrafish ऊतक में गड़बड़ी की नाजुक प्रकृति के साथ शोधकर्ताओं सहायता करेगा कि उम्मीद है।

Acknowledgements

यह काम एनआईएच अनुदान DP2OD008470 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250 ml Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674

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