सरल और कम्प्यूटर की मदद से चूहे के लिए घ्राण परीक्षण

Behavior

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Brai, E., Alberi, L. Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice. J. Vis. Exp. (100), e52944, doi:10.3791/52944 (2015).

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Abstract

महक अत्यधिक प्रजातियों के बीच संरक्षित है और प्रजनन और अस्तित्व के लिए आवश्यक है।

इंसानों में, महक भी उम्र बढ़ने के साथ प्रभावित है कि इंद्रियों में से एक है और neurodegenerative रोगों की एक मजबूत कारक है। इस प्रकार, महक परीक्षण पर जल्दी न्यूरोलॉजिकल घाटा पता लगाने के लिए एक गैर इनवेसिव निदान पद्धति के रूप में प्रयोग किया जाता है। घ्राण नेटवर्क संवेदनशीलता अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, कृन्तकों में घ्राण अनुसंधान पिछले एक दशक में रफ्तार पकड़ ली है।

यहाँ, हम किसी भी पूर्व भोजन या पानी के प्रतिबंध की आवश्यकता के बिना चूहों में सहज गंध धारणा और संवेदनशीलता का एक बहुत ही सरल, समय कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घ्राण परीक्षण विधि प्रस्तुत करते हैं। परीक्षण चूहों के लिए एक परिचित माहौल में प्रदर्शन कर रहे हैं, scents और odorant जोखिम के एक 2 मिनट सत्र ही आवश्यकता होती है। विश्लेषण ImageJ पर कंप्यूटर की मदद से आदेशों का उपयोग, पोस्ट-हॉक किया जाता है और इसलिए, हो सकता है, एक शोधकर्ता द्वारा समाप्त करने के लिए शुरू से ही किया जाता है।

इस प्रोटोकॉल के किसी विशेष हार्डवेयर या सेटअप की आवश्यकता नहीं है और घ्राण धारणा और संवेदनशीलता परीक्षण में रुचि किसी भी प्रयोगशाला के लिए संकेत दिया है।

Introduction

महक स्तनधारियों में सबसे विकसित और महत्वपूर्ण संवेदी कार्यों में से एक है। घ्राण गतिविधि में कोई परेशानी होती है सबसे बुरी स्थिति में भोजन का सेवन, सामाजिक व्यवहार और, यहां तक ​​कि अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है। इंसानों में, घ्राण गिरावट 1 निर्भर उम्र है और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 2 के एक मजबूत कारक माना जाता है - 6। पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय द्वारा विकसित की घ्राण पहचान परीक्षण वर्तमान में जल्दी न्यूरोलॉजिकल घाटा 7 आकलन और उच्च संभावना के साथ मनोभ्रंश 8,9 की प्रगति की भविष्यवाणी कर सकते हैं, जो सबसे अधिक है, खेतों में गैर-आक्रामक और quantifiable, नैदानिक ​​परीक्षणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है।

घ्राण प्रणाली और कृन्तकों में महक की शोहरत की पहुंच, अंतर्निहित तंत्र घ्राण कार्यों 10 संबोधित कर अनुसंधान का एक तीव्र लाइन छिड़ गया है। हम पहले संकेतन recept के समारोह की हानि से पता चला हैया Notch1 घ्राण परिहार 11 प्रभावित करता है। इस प्रोटोकॉल में हम घ्राण प्रदर्शन का अध्ययन करने के न्यूरॉन्स या glia में संकेतन लिगेंड, Jagged1 कमी चूहों, का उपयोग करें।

जन्मजात महक धारणा के रूप में तीन मानकों, odors और घ्राण संवेदनशीलता 4 के बीच भेदभाव से परिभाषित किया गया है। कृन्तकों में घ्राण परीक्षण के तरीकों की एक किस्म में किया जा सकता है और कुछ व्यवहार के अध्ययन के लिए एक विशिष्ट वाष्प सांद्रता में और एक सटीक समय सीमा 12 में पशु करने के लिए गंध, जो उपलब्ध कराने olfactometers, का उपयोग करना - 14। फिर भी, इस इंस्ट्रूमेंटेशन महंगा है और केवल विशेष सुविधाओं में उपलब्ध हो सकता है। हमारे काम में, हम अस्थिर scents का उपयोग किया जाता है जो एक सरल, तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घ्राण परीक्षण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। परीक्षण एक attractant या एक से बचाने वाली क्रीम गंध करने के लिए उपाय धारणा करार दिया और खुशबू और पानी 11,15,16 के बीच भेदभाव का मूल्यांकन। डब्ल्यू, एक ही स्थापना का प्रयोगई भी अलग सांद्रता 16,17 पर एक गंध के प्रति संवेदनशीलता उपाय कर सकते हैं। पृष्ठ और उनके सहयोगियों ने 18 के काम से प्रेरित पद-हॉक कंप्यूटर की मदद से वीडियो प्रसंस्करण, प्रयोगात्मक चकाचौंध और पूरे प्रयोग के लिए बाहर ले जाने के लिए एक ही व्यक्ति के लिए अनुमति की आवश्यकता के बिना निष्पक्ष परिणाम प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल चूहों में घ्राण व्यवहार के अध्ययन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने का इरादा है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण पर यूरोपीय संघ के निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार कर रहे हैं और (फ़्राइबर्ग के कैंटन, स्विट्जरलैंड) स्थानीय पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।

1. पशु तैयारी

  1. प्रायोगिक पशुओं
    1. वयस्क पुरुष जंगली प्रकार और उम्र के 3-5 महीने की ट्रांसजेनिक चूहों (C57BL 6 / पृष्ठभूमि) पर प्रयोगों प्रदर्शन। चूहों के तीन समूहों जंगली प्रकार littermate नियंत्रण के अनुरूप (ग्रुप ए, Jagged1 flox / flox 19) और दो ​​सशर्त को माउस लाइनों (ग्रुप बी, Jagged1ncKO और सी, Jagged1gcKO)।
    2. एक 12 घंटा नियंत्रित अंधेरे / प्रकाश चक्र के साथ एक हवादार कमरे में मानक प्रयोगशाला परिस्थितियों में सदन चूहों, और भोजन और पानी यथेच्छ प्रदान करते हैं।

2. प्रायोगिक सेटअप

  1. प्रायोगिक अखाड़ा
    1. प्रयोगात्मक क्षेत्र के लिए, एक साफ निष्फल माउस पिंजरे का उपयोग (36 सेमी लंबाई एक्स 20.5 सेमी चौड़ाई x 13.5 सेमी ऊंचाई) (चित्रा 1 ए)।
    2. 3 सेमी उच्च ताजा बिस्तर, के साथ एक गिने पिंजरे में प्रत्येक माउस निरुपित। पिंजरों पुन: उपयोग कर रहे हैं, गंध संवेदनशीलता परीक्षण के रूप में, odors और चूहों के बीच पार संक्रमण से बचने के लिए निम्न उपाय करते हैं।
      1. पानी पक्ष में चिह्नित करें।
      2. 70% इथेनॉल, प्रत्येक पक्ष के लिए एक साथ छिड़काव दो ऊतक कागजात के साथ पिंजरों के संकरा दीवारों को साफ करें।
      3. चूहों के जीनोटाइप के अनुसार पिंजरों ढेर और एक लामिना हुड के नीचे अस्थायी रूप से दुकान।
  2. कैमरा
    1. पिंजरे (चित्रा 1 ए) के नीचे से 58 सेमी में उद्देश्य के साथ एक स्वनिर्धारित तिपाई पर एक कैमरा माउंट। तिपाई और पिंजरे की स्थिति ठीक है और कैमरे के पिंजरे के शीर्ष पर केन्द्रित करने के लिए अनुमति देने के लिए अंकों के साथ परिसीमित।
    2. X 240 पिक्सल, mov फ़ाइलें के रूप में प्रति सेकंड 15.08 फ्रेम 320 पिक्सल पर वीडियो रिकार्ड।
  3. Odors
    1. Scen Resuspendसंकेत दिया जब टीएस, विलायक में जिसमें वे घुलनशील हैं।
    2. वरीयता परीक्षण का उपयोग मूंगफली का मक्खन के लिए। मूंगफली तेल में मूंगफली का मक्खन (/ वी डब्ल्यू 10%) Resuspend।
    3. परिहार परीक्षण का उपयोग करें शुद्ध 2-Methylbutyric (2 एमबी) एसिड (98%) के लिए।
    4. संवेदनशीलता परीक्षण के लिए, एक ही माउस कॉलोनी और पृष्ठभूमि (C57BL / 6) से महिला मूत्र का उपयोग करें।
      1. सुविधा के लिए घ्राण परीक्षण करने के लिए 1-2 दिन पहले मूत्र इकट्ठा। नियंत्रित करना और पिंजरे ग्रिड ऊपर अपने पेट के साथ हुड के नीचे माउस पकड़। पिंजरे ग्रिड के तहत मूत्र की बूंदों को इकट्ठा करने के लिए एक प्लास्टिक पेट्री डिश रखें।
      2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक महिला से मूत्र लीजिए और पशुओं के बीच परिवर्तनशीलता के लिए सामान्य करने के लिए सभी मूत्र के नमूने मिश्रण। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      3. प्रयोग के दिन, मूत्र पिघलना और 10 की एक कमजोर पड़ने कारक पर दोहरा आसुत जल में 4 dilutions प्रदर्शन (1:10, 1: 100, 1: 1,000, 1: 10,000)।

3. घ्राण परीक्षण

नोट: मजबूत attractants (मूंगफली का मक्खन और महिला मूत्र) या मजबूत से बचाने वाली क्रीम (2 एमबी एसिड) 15 के रूप में माना जाता है जो जानबूझकर चुना गया है इस प्रोटोकॉल odors को में। यह घ्राण व्यवहार के साथ किसी भी हस्तक्षेप की संभावना को खत्म करने के लिए परिहार परीक्षण करने से पहले सुखद odors को वरीयता और संवेदनशीलता परीक्षण बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है। फिर भी, इस कागज, वरीयता और परिहार की परीक्षा में सादगी की खातिर, दोनों धारणा परीक्षण के तहत वर्णित किया जाएगा। प्रत्येक व्यवहार सत्र एक आदी होना चरण के साथ शुरू होता है।

  1. आदी होना चरण
    1. साफ सौंपा पिंजरे में पशु रखें और इसे 5 मिनट (चित्रा 1 बी) के लिए खोज करें। प्रयोगात्मक पिंजरे के वातावरण घर पिंजरे में परिचित है इसलिये कम समय के आदी होना के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त है।
    2. संवेदनशीलता परीक्षण एक दिन में पूरा हो गया है, तो आवेदन करने से पहले केवल एक बार आदी होना प्रदर्शनउच्चतम पतला गंध के एन। संवेदनशीलता परीक्षण अलग अलग दिनों पर किया जाता है, तो प्रत्येक दिन एक नया साफ पिंजरे पर एक आदी होना चरण की जरूरत है।
  2. धारणा परीक्षण
    1. आदी होना के बाद, कैमरे को सक्रिय करने और तुरंत नीचे (चित्रा 1C) से लगभग 10 सेमी में पिंजरे के विपरीत दीवारों पर सुखद खुशबू (मूंगफली का मक्खन) के 60 μl और तटस्थ खुशबू (नल का पानी) का 60 μl विंदुक।
    2. माउस 2 मिनट (चित्रा -1) के लिए odors को पता लगाएं। इसके बाद, कैमरा बंद।
    3. इस बिंदु पर, अगले माउस आदी होना चरण से शुरू करने के साथ आगे बढ़ें। बचाने वाली क्रीम गंध के 60 μl (2 एमबी एसिड) और पानी के 60 μl लागू करने के द्वारा एक ही रास्ते में बिल्कुल परिहार परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
  3. संवेदनशीलता परीक्षण
    1. 1: निम्न क्रम में महिला मूत्र की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए नर चूहों के आकर्षण दहलीज मूल्यांकन 10,000; 1: 1,000; 1: 100; 1:10 और शुद्ध मूत्र।
    2. आदी होना के बाद, पहले से 3.2.1 में वर्णित के रूप में प्रयोगकर्ता द्वारा pipetted उच्चतम कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक माउस बेनकाब।
    3. एक वीडियो कैमरा पर एक 2 मिनट समय सीमा के भीतर, पानी बनाम मूत्र की खोजपूर्ण व्यवहार रिकॉर्ड। सभी चूहों साथियों उच्चतम कमजोर पड़ने (1: 10,000) के लिए परीक्षण कर रहे हैं के बाद से ऊपर संकेत के रूप में, मूत्र के एक उच्च एकाग्रता के लिए बेनकाब।

4. पोस्ट-हॉक डेटा विश्लेषण

नोट: वर्णित सभी व्यवहार परीक्षण डेटा विश्लेषण निर्देशों का पालन पद हॉक कार्रवाई कर रहे हैं।

  1. विंडोज सिस्टम के लिए ImageJ में mov फ़ाइलें खोलें
    1. Http://www.apple.com/quicktime/download से अनुकूलित सेटिंग्स का उपयोग जावा के लिए जल्दी समय स्थापित करें।
    2. ImageJ वेबसाइट (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html) से जल्दी समय प्लगइन स्थापित करें।
    3. पुस्तकालय extens में: ( प्रोग्राम फ़ाइलें QuickTime के QTSystem सी) QTJava.zip आयात करेंImageJ के आयन (.ImageJ JRE उदारीकरण एक्सटेंशन)।
    4. Plugins फ़ोल्डर में भी कॉपी QTJava.zip और QTJava.jar के रूप में इसका नाम बदलें।
    5. मैक्रो फ़ोल्डर में संलग्न छह स्क्रिप्ट इंस्टॉल करें (ImageJ plugins के मैक्रो)।
    6. ओपन ImageJ उसके बाद करीब है, ImageJ का संकलन और त्वरित समय प्लगइन चलाने के लिए और।
    7. जल्दी समय का उपयोग कर> ImageJ फिर से खोलें और फ़ाइल> आयात का उपयोग MOV फ़ाइल को खोलने के।
  2. वीडियो समायोजन
    1. वीडियो फ़ाइल ImageJ में खोला है एक बार, प्रयोगकर्ता के पिंजरे (T0) में odorants pipetted गया है समय से लगातार 2 मिनट अन्वेषण प्राप्त करने के लिए वीडियो काटा। (ढेर ToolsSlice पदच्युत ImageJ छवि) 1 के वेतन वृद्धि का उपयोग कर पिछले तख्ते T0 के लिए इसी फ्रेम की पहचान और हटा दें। 2 मिनट के अन्वेषण से अधिक सभी फ्रेम को हटाने के लिए एक ही आदेश का उपयोग करें।
    2. पिंजरे केंद्रित है कि सुनिश्चित करें और आवश्यक उपयोग छवि> रूपांतरण अगर> घुमाएँ कमांड यह पंक्ति में।
  3. ख़बरदारओ प्रसंस्करण
    नोट: वीडियो प्रसंस्करण के लिए पूरी तरह से कंप्यूटर की मदद से है और इस पत्र के साथ मैक्रो को आदेशों का उपयोग करता है।
    1. एक 127 पिक्सल x 218 पिक्सल आकार के पिंजरे पर क्षेत्र को प्रतिबंधित करने के क्रम में प्लगइन> मैक्रो> आदेश चलाएं से चरण 1 मैक्रो चलाते हैं। पिंजरे (चित्रा 2, चरण 1) पर तय की आयत ले जाएँ।
    2. चरण 2 मैक्रो (चित्रा 2, चरण 2) का उपयोग करते हुए ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र पर पिंजरे के क्षेत्र को काटें।
    3. एक सीमा से संकेत बताए despeckling और संकेत विचरण छान कर पृष्ठभूमि से माउस छवि को निकालने के लिए चरण 3 मैक्रो का प्रयोग करें। जेड अक्ष साजिश में उत्पादन मूल्यों 2 मिनट के अन्वेषण के दौरान "पानी चैम्बर" की लागत पर लाभ के भीतर चल माउस छाया की तीव्रता करने के लिए इसी मतलब ग्रे मूल्यों का संकेत मिलता है। एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में रॉय (चित्रा 2, चरण 3) के अनुसार नाम एक वर्कशीट में परिणामों की प्रतिलिपि।
    4. करने के लिए कदम 4 मैक्रो का प्रयोग करेंआरओआई "गंध चैम्बर" में माउस का मतलब ग्रे मूल्यों निकाल सकते हैं। 4.3.3 के रूप में ही स्प्रेडशीट फ़ाइल में रॉय (चित्रा 2, चरण 4) के अनुसार नाम एक वर्कशीट में परिणामों की प्रतिलिपि।
    5. आगे आरओआई "पानी परिधि" में माउस आंदोलन के विश्लेषण को प्रतिबंधित करने के लिए चरण 5 मैक्रो का उपयोग करें। 4.3.3 के रूप में ही स्प्रेडशीट फ़ाइल में रॉय (चित्रा 2, चरण 5) के अनुसार नाम वर्कशीट पर परिणाम कॉपी करें।
    6. आरओआई "गंध परिधि" में माउस आंदोलन का विश्लेषण प्रतिबंधित करने के लिए कदम 6 मैक्रो का उपयोग करें। 4.3.3 के रूप में आरओआई स्प्रेडशीट फ़ाइल (चित्रा 2, चरण 6) के अनुसार नाम वर्कशीट पर परिणाम कॉपी करें।
    7. सभी वीडियो की प्रक्रिया और जानवरों के प्रति फ्रेम की संख्या में स्थिरता के लिए जाँच करें। इधर, एक 2 मिनट अन्वेषण सत्र के लिए इसी 1810 फ्रेम के लिए सभी जानवरों रिकॉर्ड है।
    8. प्रत्येक जानवर के लिए और तरह तख्ते मतलब ग्रे VA के साथ प्रत्येक रॉय के लिएलूस बड़ा 0. फूट डालो की तुलना मूल्यों से तख्ते की संख्या 1 सेकंड के लिए इसी और प्रत्येक रॉय में खर्च सेकंड प्राप्त करते हैं।

5. सांख्यिकी विश्लेषण

  1. प्रत्येक परीक्षा के लिए http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/ पर उपलब्ध सूत्र का उपयोग बार्टलेट के परीक्षण के द्वारा समूहों / जीनोटाइप के भीतर विचरण की एकरूपता की पुष्टि करें।
  2. टाइम्स बार्टलेट के परीक्षण के परिणामों के आधार पर बराबर या असमान प्रसरण मानते हुए एक गैर दिशात्मक छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग कर एक समूह के भीतर गंध बनाम पानी के साथ बिताए के बीच आकर्षण और परिहार परीक्षण में, तुलना के लिए बाहर ले। Bonferroni की पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा द्वारा जीनोटाइप के बीच पानी के साथ बिताए समय से घटाया odors के साथ बिताया बार की तुलना करें।
  3. संवेदनशीलता परीक्षण में wate के साथ बिताए समय से घटाया गंध के साथ बिताए समय की तुलना विश्लेषणBonferroni की पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा से मूत्र की एक विशिष्ट dilutions पर समूहों के बीच आर। Bonferroni की पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ repetitions के साथ 2-तरह एनोवा से बढ़ रही गंध सांद्रता के समूहों के बीच संवेदनशीलता की तुलना करें।
  4. आकर्षण और परिहार की परीक्षा में जीनोटाइप और उपचार के बीच बातचीत Bonferroni की पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ 2-तरह एनोवा द्वारा जांच कर रहे हैं।

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Representative Results

धारणा परीक्षण 2-एमबी एसिड के लिए मूंगफली का मक्खन और परिहार के लिए आकर्षण के उपाय। चूहों के तीन समूहों का परीक्षण कर रहे हैं और पानी की तुलना में "गंध परिधि" में बिताए समय की मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। पानी (टी = 8 2.52, पी <0.05) की तुलना में वरीयता परीक्षण में, नियंत्रण समूह के एक गंध करने के लिए महत्वपूर्ण वरीयता प्रदर्शित करता है। दूसरी ओर, समूह बी मूंगफली का मक्खन करने के लिए किसी भी महत्वपूर्ण आकर्षण नहीं दिखा है और पानी (टी 6 = 3.22, पी <0.05) के साथ अधिक समय खर्च करता है। इस प्रकार, यह नियंत्रण समूह ए (एफ 1,7 = 26.39, पी <0.005) से अलग ढंग से व्यवहार करता है। इसके अलावा, समूह सी कोई भेदभाव से पता चलता है और पानी और मूंगफली का मक्खन (टी = 8 0.78, पी = 0.45) के साथ एक ही समय के बारे में खर्च करता है। कुल मिलाकर, तीन समूहों को अलग ढंग से व्यवहार करते हैं (एफ 2,9 = 19.83, पी <0.005) और जीनोटाइप और उपचार (मूंगफली का मक्खन और पानी) के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत है (एफ 2,1 = 4.90, पी <0.005) (

2-एमबी एसिड के जवाब में नियंत्रण समूह एक परिहार पलटा प्रदर्शित करता है और एक परिणाम के रूप में पानी (टी = 8 2.67, पी <0.05) के साथ अधिक समय खर्च करता है। इसी तरह, समूह बी 2-एमबी एसिड (टी 6 = 3.71, पी <0.01) के लिए एक स्पष्ट परिहार पलटा पता चलता है। दूसरी ओर, समूह सी दो odors के बीच भेदभाव नहीं करता है और 2-एमबी एसिड और पानी (टी = 8 2.2, पी = 0.6) (3B चित्रा) के साथ तुलनीय बार खर्च करता है। कुल मिलाकर, परिहार प्रतिक्रिया की तुलना में तीन समूहों में एक महत्वपूर्ण अलग व्यवहार (एफ 2, 9 = 0.76, पी = 0.49) एक परिणाम के रूप में उपचार और जीनोटाइप के बीच कोई बातचीत (एफ 1, 2 = 0.52, पी वहाँ प्रदर्शित नहीं करते = 0.63)।

महिला मूत्र घ्राण संवेदनशीलता परीक्षण में, वक्र (पानी के साथ बिताए समय से घटाया मूत्र के साथ बिताए पसंद सूचकांक = समय) पानी बनाम अलग सांद्रता में मूत्र को वरीयता प्रदर्शित करता है। वें मेंबढ़ती सांद्रता के साथ मूत्र के लिए आकर्षण में वृद्धि 1,000 और प्रदर्शित करता है: परीक्षा है, हम नियंत्रण समूह एक 1 के कमजोर पड़ने पर मूत्र के लिए एक आकर्षण दहलीज है कि निरीक्षण करते हैं। समूह बी और सी प्रदर्शन एक 100 गुना समूह ए (एफ 2,9 = 4.78, पी <0.05) की तुलना में आकर्षण (1:10) के लिए उच्च दहलीज। समूह बी और सी प्रदर्शन तुलनीय संवेदनशीलता घटता (एफ 1,19 = 0.36, पी = 0.55)। समूहों के बीच संवेदनशीलता की तुलना, यह समूह बी और सी (एफ 2,19 = 7.12, पी <0.01) (चित्रा 4) की तुलना में समूह एक महिला मूत्र करने के लिए उच्च संवेदनशीलता है कि प्रतीत होता है।

चित्र 1
चित्रा 1: घ्राण परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया सेटअप का प्रदर्शन। पिंजरे के ऊपर (ए) कैमरा। (बी) चूहों एक 5 मिनट के आदी होना अवधि के लिए एक पिंजरे में रखा जाता है। (सी) ODOrants के पिंजरे की दीवार पर pipetted हैं। (डी) पानी बनाम एक odorant की खोजपूर्ण गतिविधि एक 2 मिनट खिड़की में परीक्षण किया है।

चित्र 2
चित्रा 2:।। कंप्यूटर की मदद से वीडियो प्रसंस्करण ImageJ में मैक्रो को आदेशों का उपयोग की कार्यप्रवाह उदाहरण 1:10 कमजोर पड़ने पर मूत्र से अवगत कराया समूह एक से एक माउस को दर्शाता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। (समूह सी के लिए समूह बी और एन = 5 के लिए एन = समूह A के लिए 5, एन = 4) घ्राण वरीयता और परिहार परीक्षण के प्रतिनिधि परिणाम तीन समूहों के चूहों (ए) मूंगफली को उजागर किया गया है, लेकिनआतंकवाद और एक 2 मिनट अन्वेषण सत्र के लिए (बी) 2-एमबी एसिड। कुल समय पानी (ग्रे हलकों) बनाम गंध (काले हलकों) की खोज का प्रतिनिधित्व किया है। समूहों के बीच घ्राण व्यवहार में काफी अंतर काली क्षैतिज सलाखों और तारों से संकेत कर रहे हैं। समूहों के भीतर गंध और पानी के बीच कई बार सूँघने में काफी अंतर ग्रे क्षैतिज सलाखों और तारों से दिखाए जाते हैं। * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.01 (ग्रे क्षैतिज सलाखों, छात्र के टी-परीक्षण, काले क्षैतिज पट्टी, एक तरह से एनोवा)। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटियाँ हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4:। महिला मूत्र की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए संवेदनशीलता परीक्षण के प्रतिनिधि परिणाम पानी के साथ बिताए समय से घटाया अलग सांद्रता में मूत्र के साथ अन्वेषण समय के द्वारा दिए गए वरीयता सूचकांक वक्र, उस समूह से पता चलता हैए (एन = 5) समूह बी (एन = 4) और सी की तुलना में मूत्र करने के लिए उच्चतम संवेदनशीलता है (एन = 5)। * पी <0.05 (काली क्षैतिज सलाखों, एक तरह से एनोवा)। त्रुटि सलाखों SEM हैं।

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Discussion

odors के लिए धारणा है, odors के लिए पानी और संवेदनशीलता बनाम odors के बीच भेदभाव: इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित परीक्षण चूहों में जन्मजात घ्राण व्यवहार के विभिन्न पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल में पहले 15 दिखाया वरीयता और परिहार पैमाने के अनुसार किसी भी गंध करने के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल खोजपूर्ण गतिविधि पर आधारित है के बाद से यह चूहों उनके आंदोलन को प्रभावित करते हैं और घ्राण अन्वेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो किसी भी मोटर हानि या चिंता प्रदर्शित नहीं करते कि महत्वपूर्ण है। वर्णित परीक्षण हालांकि वे वयस्क महिलाओं या आयु वर्ग के चूहों में भी महक जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता वयस्क नर चूहों के लिए इरादा कर रहे हैं।

1) कम से कम 3 दिनों के अंतराल पर प्रत्येक परीक्षा का पालन: चूहों में इस तरह के एक अध्ययन की जांच महक शुरू करने से पहले यह निम्नलिखित पहलुओं पर ध्यान देना जरूरी है। परिहार घ्राण स्मृति 20 के हस्तक्षेप को कम करने के लिए पिछले के रूप में परीक्षण किया जाना चाहिए; 2) ई प्रदर्शनचूहों उनके सक्रिय चक्र 21 में हैं और प्रकाश की एक मंद स्रोत का उपयोग करते समय अधिमानतः देर से दोपहर में दिन के एक ही समय में xperiments,। इसके अलावा, घ्राण कार्यों 22 में संभव दैनिक परिवर्तन के लिए परिभाषित बार नियंत्रण में घ्राण परीक्षण का समय निर्धारण; 3) इस तरह के एसिड के रूप में बचाने वाली क्रीम odorants, का उपयोग करता है जो परिहार परीक्षण, शुरू करने से पहले, प्रयोगात्मक सूट में बार में एक ही पिंजरे लाने के लिए और एक लामिना हुड के तहत पिंजरे में रहते हैं। यह कदम odorant करने के आदी होना बचने के लिए और एक ही समूह में एक और अधिक सजातीय प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है; 4) अस्थायी रूप से एक ही पिंजरे के सभी चूहों odorant को उजागर कर रहे हैं जब तक odorant संदूषण को कम करने के लिए, परीक्षण किया गया है, जो चूहों को अलग; 5) विभिन्न प्रकारों के एक odorant 23 से अवगत कराया है जब एक विषम तरीके से व्यवहार कर सकते हैं, के बाद से ही तनाव के पशुओं का उपयोग करें; 6) प्रयोगकर्ता हर समय एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं और गंध मिश्रण को रोकने के लिए जानवरों के बीच दस्ताने में परिवर्तन होना चाहिए; 7)घ्राण अन्वेषण के दौरान चूहों के लिए किसी भी confounding उत्तेजना को रोकने के लिए 1.3 मीटर की दूरी पर धीरे-धीरे दूर पिंजरे से बढ़ना चाहिए ऑपरेटर pipetting के बाद; चूहों विभिन्न डिग्री करने के लिए दोनों कक्षों का पता लगाने की उम्मीद कर रहे हैं के बाद से केवल एक ही कक्ष में मतलब ग्रे मूल्यों को प्रदर्शित 8) चूहों, अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए।

यह तेजी से पूरा करने की है और इस तरह के ImageJ के रूप में खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, का लाभ लेता है, यह स्थापित करने के लिए अत्यंत सरल है सस्ती सामग्री का उपयोग करता है: वर्णित विधि अन्य प्रोटोकॉल पर कई लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा, हम तैयार हैं कि मैक्रो को स्थापित किया जाना है और जो किसी भी क्षेत्र और अधिक से अधिक 2 गंध परिधि करने के लिए कस्टम इस्तेमाल किया और अनुकूलित किया जा सकता है प्रदान करते हैं। यह सौंपा गंध परिधि में बिताए समय के साथ ही घ्राण गतिविधि का एक उपाय है कि ध्यान दिया जाना पड़ता है। प्रत्येक कक्ष में बिताए समय घ्राण व्यवहार का केवल एक मोटा अनुमान माउस की खोजपूर्ण गतिविधि का एक readout देता है और है जबकि। अन्य तरीकों के साथ के रूप में, सांख्यिकीय पावर समूह प्रति पशुओं की संख्या को बढ़ाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

वाष्प के दबाव और प्रसव के समय 12 के लिए स्वचालित रूप से नियंत्रित कर सकते हैं जो olfactometers, का उपयोग कर घ्राण परीक्षण की तुलना में - 14, प्रस्तावित प्रोटोकॉल कम नियंत्रित किया जाता है। बहरहाल, यह सब odors को परिभाषित दूरी पर है और एक ही समय खिड़की के लिए, बराबर मात्रा में लागू कर रहे हैं। इस प्रकार, एक olfactometer परीक्षण इस में, लगातार इन चर रखने की आवश्यकता नहीं है। तख्ते की एक निश्चित संख्या प्राप्त करने के लिए समायोजन और प्रत्येक वीडियो के काटने के लिए आवश्यक समय में मिलकर इस प्रोटोकॉल के लिए एक और संभावित सीमा है। फिर भी, एक ही कंप्यूटर की मदद से विश्लेषण गंध बंदरगाहों विशिष्ट समय पर गंध देने के साथ और अधिक परिष्कृत setups पर भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, वीडियो काटने स्वचालित रूप से सेट किया जा सकता है।

कपास पैड मैं का उपयोग अन्य प्रोटोकॉल की तुलना मेंआकर्षण और परिहार परीक्षण करने के लिए गंध के साथ mpregnated, वर्तमान प्रोटोकॉल एक एकल प्रायोगिक सत्र में एक उपन्यास गंध और एक तटस्थ गंध (जल) 15,16 के बीच घ्राण भेदभाव के बारे में एक अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक चकाचौंध की आवश्यकता नहीं है और पूरी तरह से निष्पक्ष कंप्यूटर की मदद से विश्लेषण का उपयोग कर एक ही प्रयोगकर्ता के द्वारा आयोजित किया जा सकता है।

ये साधारण परीक्षण अल्जाइमर या पार्किंसंस रोग माउस मॉडल में तंत्रिका घाटे की प्रगति की निगरानी करने और घ्राण संचरण के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse cage Italplast (Italy) 1144B 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding Abedd (Austria) LTE E-001 3 cm high
Peanut butter Migros (Switzerland) NA 1:10
2-Methylbutyric Sigma Aldrich (Switzerland) W269514 Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain NA NA Dilution series
Camera Olympus (US) Camedia C-8080 MOV files
Quicktime for Java (Windows) Apple (USA) NA video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows NIH (USA) NA Video Processing/Analysis

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