Instilação e fixação métodos úteis no mouse Lung Cancer Research

Medicine

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Summary

O objetivo deste artigo é descrever métodos simples que vai ajudar muito na configuração e análise dos pulmões do rato com câncer de pulmão ou outras patologias. Nós apresentamos 3 protocolos simples e confiável para realizar injeções de pulmão, fixação e medidas de volume pulmonar.

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Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. J. Vis. Exp. (102), e52964, doi:10.3791/52964 (2015).

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Abstract

A capacidade de incutir agentes vivos, células ou produtos químicos diretamente para o pulmão sem ferir ou matar os ratos é uma ferramenta importante na investigação do cancro do pulmão. Embora haja um certo número de métodos que foram publicados mostrando como a entubar ratinhos para medição da função pulmonar, nenhum é sem problemas potenciais para instilação traqueal rápida em grandes grupos de ratinhos. No presente trabalho, um método simples e rápida é descrito que permite que um investigador para realizar tais injeções de uma maneira eficiente. O método não requer ferramentas especiais ou de iluminação e pode ser aprendido com muito pouco prática. Trata-se de anestesia de um rato, fazendo uma pequena incisão no pescoço para visualizar a traqueia, e em seguida a inserção de um cateter intravenoso directamente. A pequena incisão é fechada rapidamente com adesivo de tecido, e os ratos são deixados a recuperar. Um estudante qualificado ou técnico pode fazer instillations a uma taxa média de 2 min / mouse. Uma vez que tele câncer é estabelecida, há freqüentemente uma necessidade de análise histológica quantitativa dos pulmões. Tradicionalmente patologistas normalmente não se preocupam em padronizar a inflação do pulmão durante a fixação, e as análises são muitas vezes baseadas em um sistema de pontuação que pode ser bastante subjetiva. Embora isso possa ser suficiente em algum momento adequado para estimativas grosseiras do tamanho de um tumor do pulmão, qualquer quantificação estereologia adequada de estrutura pulmonar ou células requer um procedimento de fixação e reprodutível de medição do volume pulmonar subsequente. Aqui nós descrevemos procedimentos confiáveis ​​simples para ambos, que fixa os pulmões sob pressão e, em seguida, medir com precisão o volume de pulmão fixo. O único requisito é uma balança de laboratório que é preciso ao longo de uma gama de 1 mg-300 g. Os procedimentos aqui apresentados, portanto, poderia melhorar significativamente a capacidade de criar, tratar e analisar os cânceres de pulmão em camundongos.

Introduction

Por uma série de razões, o câncer de pulmão não tem sido amplamente estudada no mouse. Uma razão para isto é que o acesso ao pulmão é muito difícil in vivo, e a análise quantitativa de pulmão fixo não é normalmente feito. Os métodos descritos neste artigo são projetados para remediar esta situação. Os objetivos aqui são para descrever métodos simples que vai ajudar muito na configuração e análise dos pulmões do rato com câncer de pulmão ou outras patologias. Embora nenhuma dessas abordagens são inteiramente novas, que não tenham sido apresentadas em conjunto como métodos autônomos na forma simplificada, tal como descrito aqui.

Tem havido um grande número de manuscritos que foram descritos métodos para a intubação do pulmão do rato principalmente com a finalidade de fazer a função pulmonar de repetição ou lavado bronco-alveolar em camundongos individuais em estudos longitudinais. Desde que o papel original, houve vários outros documentos que descrevem abordagens diferentes para mouse intubação 1 -9. Apesar de todos esses métodos podem ser usados ​​com sucesso, eles geralmente exigem formação considerável, e não são muitas vezes sem uma taxa de falha não trivial. Além disso, a fim de efectuar as medições da função pulmonar, a cânula tem de se encaixar na traqueia força suficiente de modo que não há nenhuma fuga de ar. No entanto, um outro uso prático para a entubação é a entrega de agentes específicos (células de cancro ou outros insultos) ou fármacos terapêuticos directamente para o pulmão. Tal procedimento não requer uma cânula apertadas nem qualquer equipamento sofisticado de função pulmonar. A nova característica deste método mostrado aqui envolve um pequeno procedimento cirúrgico que permite que a intubação sem qualquer possibilidade de a cânula entrar no esófago. Esta abordagem simples permite intubação bem sucedida com relativamente pouco treinamento ou experiência. Como muitos como 30 ratinhos / h pode ser tratada usando esta abordagem com uma taxa de falha próximos de zero.

Uma vez que tele ratos estão prontos para serem sacrificados, os pulmões ou feridas cancerosas podem, então, ser removida para análise histológica e patológica. No entanto, a fim de quantificar adequadamente todas as variáveis ​​histológicas para comparação com outros pulmões, é essencial para padronizar os procedimentos de fixação e quantificar correctamente o volume de pulmão fixo 10. Este artigo descreve em detalhes os procedimentos simples que permitem que os processos de fixação padronizados, bem como uma maneira de medir o volume pulmonar fixa. O volume é uma métrica essencial na quantificação da histologia, uma vez que sem um tal determinação do volume, apenas densidades relativas pode ser medida 10. Uma vez que o volume do pulmão é conhecido, no entanto, as medições absolutas de células e outras medidas estruturais no pulmão pode, então, ser quantificada.

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Protocol

O protocolo seguinte descreve um sistema que funciona bem em 20-35 g ratinhos. O método pode ser facilmente adaptável a ratinhos maiores ou menores simplesmente mudando o tamanho do cateter. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Johns Hopkins University Animal Care e Use.

1. A instilação pulmonar

  1. Selecione um comercial de uma polegada de comprimento 20 g cânula intravenosa usar para a intubação.
  2. Modificar a ponta do cateter dobra-lo manualmente para gerar uma ligeira curvatura na ponta como ilustrado na Figura 1.
  3. Anestesiar o rato com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), injectada IP, e confirmar a anestesia pela ausência do reflexo do movimento. Aplicar pomada veterinária sobre os olhos imediatamente após a anestesia. Imediatamente após a anestesia aplicar pomada veterinária sobre os olhos e dar carprofeno (5-10 mg / kg SQ) para analgesia pós-operatória e instilação.
  4. Coloque o mouse em decúbito dorsal sobre uma plataforma inclinada. Como mostrado na Figura 2, uma grande ligante escritório com laçadas da sutura gravado em funciona perfeitamente bem.
  5. Raspar a parte ventral do pescoço e limpar e desinfectar a área do pescoço com álcool 70%. Com as novas luvas de latex e gratuitos a pó, usar instrumentos cirúrgicos desinfetados com álcool a 70%.
  6. Usando uma tesoura afiada fazer uma pequena incisão cirúrgica no pescoço aproximadamente 12 mm abaixo do incisivo inferior.
  7. Com uma pinça puxe a pele no pescoço caudalmente até que a parede da traqueia ventral pode ser visto.
  8. Suavemente retrair a lingueta e inserir a cânula com a ponta dobrada inclinada para a superfície ventral do rato. Como em 1.4, puxe suavemente sobre a pele no pescoço, e inserir a cânula na traquéia.
    NOTA: Com um pouco de prática, o cateter será visível se movendo para baixo na traquéia. Se ele vai no esófago, então não haverá nenhuma observação visual do movimento do cateter. Não há incisõessão feitos na traqueia.
  9. Uma vez que o cateter é visto na traqueia no pescoço, avançada que cerca de 5 mm a ser transmitido de forma fiável as cordas vocais, mas ainda bem acima da carina.
  10. Prepare-se para incutir até 50 l de líquido injectando através do cateter com uma pipeta de ponta de carga gel. Coloque a ponta no hub luer, mas antes de injetar olhar cuidadosamente para observar o movimento do fluido na ponta síncrona com a respiração do mouse. Em seguida, injetar o instilado.
  11. Com uma seringa de 1 ml, imediatamente fazer uma relativamente rápida inflação de 0,6 ml de ar para os pulmões através do cateter para ajudar a distribuir o líquido no fundo dos pulmões. Remover a cânula.
  12. Remover a cânula.
  13. Use uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato para fechar a pequena ferida cirúrgica, conforme as instruções bula para Vetbond. Coloque os ratos em gaiolas individuais e monitorá-los visualmente até que acordem e se comportar normalmente, sem qualquer indicação de discomfort.

2. Fixação Lung

NOTA: Uma vez que todos os procedimentos experimentais são feitas em um rato, os pulmões pode ser preparado para o processamento histológico pela fixação com formaldeído (ou qualquer outro fixador desejado).

  1. Sacrifique o mouse com um procedimento IACUC aceitável. Para o rato representativo mostrado no vídeo, deslocamento cervical de um rato anestesiado é usado.
  2. Executar uma traqueostomia (se não tiver feito), expondo cirurgicamente o lado ventral da traquéia, fazendo um pequeno corte, e inserindo uma agulha 18 G stub ponta na traquéia, e amarrando-o com fio.
  3. Cuidadosamente abra o tórax com uma incisão na linha média, cortar o diafragma, e remover as paredes laterais de tórax para expor os pulmões.
  4. Ligar a extremidade do luer da agulha para um reservatório de um suporte de anel contendo formaldeído. Veja a Figura 3.
  5. Definir a superfície de topo do formaldeído a 25 cm acima do nível do mouSE. Veja a Figura 3. Em seguida verifique se não há ar na tubulação fixação executando fluido para fora no final de uma torneira. Ligar a extremidade do luer da cânula traqueal para o tubo do reservatório. Abra a torneira para inflar os pulmões com o formaldeído. Deixar os pulmões sob pressão para, pelo menos, 20 min.
  6. Abra a torneira para inflar os pulmões com o formaldeído. Deixar os pulmões sob pressão para, pelo menos, 20 min.
  7. Em seguida, amarre a traqueia para além do final da agulha topo. Ela pode ajudar a puxar para trás lentamente na agulha para expor mais da traquéia canulados. Quando amarrado com segurança, remova a torneira.
  8. Dissecar cuidadosamente para fora dos pulmões.
  9. Coloque os pulmões em formol durante a noite. Tempos mais longos são bons, e algumas manchas ou procedimentos podem especificar horários específicos. Além disso, quaisquer outros fixadores líquidos, tais como Z-fix pode ser utilizada para a instilação e imersão.
  10. Antes de mais processamento histológico, mediro volume de pulmão fixo, como descrito a seguir.

3. A medição do volume pulmonar fixa

  1. Medir o volume pulmonar utilizando o princípio de Arquimedes, conforme ilustrado na Figura 4. Remover o pulmão fixo a partir do formaldeído e dissecar o coração e qualquer outro tecido não-pulmonar.
  2. Usar um simples dispositivo de suporte de arame caseiro previamente construído que é usada para manter os pulmões completamente debaixo de água.
    NOTA: Este dispositivo tem de ser compatível com qualquer saldo está sendo utilizado. Um dispositivo típico mostrado na Figura 5 é feita a partir de pipetas de plástico e finos (20 g) do fio. Este sistema funciona bem com o equilíbrio usado no vídeo, mas pode ser facilmente adaptado à maioria das balanças de laboratório.
  3. Coloque um copo com ≈200 ml de água sobre o equilíbrio ea tara com a gaiola de apoio no lugar na água. Veja a Figura 6 Retire a gaiola de metal.; coloque o pulmão na superfície da água e pressione sob a águacom a gaiola.
  4. Grave o peso na balança. Este número reflecte o volume de água deslocado e é assim uma medida directa do volume do pulmão. Tenha cuidado para garantir que o pulmão ou sutura ou qualquer parte da gaiola de arame não toca nos lados ou no fundo do copo.
  5. Para maior precisão, repetir esta medição. Remover o pulmão a partir da água, e seca sobre um tecido. Convulsionou o copo com gaiola no lugar novamente e repita a medição do volume pulmonar. As duas medições de volume deve então ser calculada a média.
    NOTA: Se os pulmões são deixados no formalina para mais do que cerca de uma semana, o ar nos pulmões irá ser dissolvido no líquido. Quando isto acontece, o pulmão irá afundar-se, por isso, já não é necessária a utilização de qualquer dispositivo, tal como na Figura 5 para manter o pulmão submerso. Em tais casos, o volume pode ser medido por simplesmente segurando o pulmão por um dos fios de sutura, até que esteja completamente submerso tal como ilustrado na Figura 4.

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Representative Results

O procedimento descrever no primeiro protocolo não por si só levar a qualquer resultado generalizadas. Ele descreve somente um meio muito fiáveis ​​para incutir substâncias directamente na traqueia. A Figura 7 mostra um exemplo de um pulmão em que azul de tripano foi instilado com o método descrito aqui. Há ampla distribuição do corante, semelhante ao que foi observado com outros corantes ou marcadores dadas directamente na traqueia ou ratinhos 11,12. Também têm utilizado este método para entregar ou bleomicina ou elastase para o pulmão, o que resulta em fibrose generalizada ou enfisema, respectivamente.

Os procedimentos descritos para quantificar as alterações estruturais nos pulmões fornecem dados post-mortem nos volumes pulmonares fixados a uma pressão de 25 cm de H 2 O. Tais medidas de volume são essenciais para converter medidas histológicas imparciais subsequentes de células ou tecidos em densidades totais números 10. Este papel somente deos secretários meios para obter um volume pulmonar muito precisas. Em nove 10-12 semanas de idade, ratinhos saudáveis ​​Balb / c medimos uma média (± SD) de volume pulmonar fixa de 0,82 ± 0,09 ml com o volume do pulmão esquerdo sendo cerca de 30% do total. Em ratinhos BALB / c dada 3 L de elastase pancreática (com o método descrito no presente documento) para gerar enfisema experimental, o volume fixo de pulmão aumentou para 1,15 ± 0,13 mL, com a fracção restante do pulmão esquerdo em 30%.

Figura 1
Figura 1: cateter intravenoso com a ponta ligeiramente curvada utilizado para instilação.

Figura 2
Figura 2: inclinado pasta de 3 anéis utilizados para apoiar os ratos para a intubação Esta pasta criada para conter 3 ratos..


Figura 3:. Formalin preenchido reservatório em anel de suporte ligado à rato, com a parte superior do líquido ajustado de 25 cm acima do rato Essa fixação deve ser feito normalmente em um exaustor.

Figura 4
Figura 4:. O princípio de Arquimedes em peso, de água deslocado por um objecto submerso é igual ao volume do objecto. Porque o pulmão normalmente retém algum ar residual, um dispositivo, tal como na Figura 5 é necessário para manter o pulmão totalmente submerso.

Figura 5
Figura 5: Lab feita apoio para manter os pulmões completamente debaixo d'água de dispositivos.construído a partir de pipetas de plástico e fio de metal.

Figura 6
Figura 6: Balanças de laboratório com taça e dispositivo de submersão tarado pronto para a medição do volume pulmonar.

Figura 7
Figura 7: Exemplo de um pulmão de azul de tripano dada através do cateter intubação.

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Discussion

Os procedimentos descritos aqui têm várias vantagens. Primeiro, o equipamento necessário é simples e barata. Em segundo lugar, a intubação pode ser feito rapidamente, com poucos erros. Em terceiro lugar, a capacidade de fixar os pulmões a uma pressão constante, e, em seguida, medir o volume pulmonar fixo permite a quantificação adequada das estruturas ou células no pulmão 10.

Uma possível desvantagem para a intubação é a pequena cirurgia. Isso pode limitar a capacidade de repetir o procedimento se a instilação é necessária. No entanto, com a cirurgia cuidadosa e aplicação do adesivo, temos sido capazes de fazer rotineiramente um segundo instilação de uma ou duas semanas mais tarde. Se instilações contínuas utilizadas são necessárias ou se são necessários os testes de função pulmonar repetidas, uma outra abordagem intubação pode ser mais desejável 13,14.

Ao fazer a instilação, há várias questões práticas que devem ser mencionados. É importante to ser tão suave quanto possível com o movimento da língua na abertura inicial da boca. Se são utilizados fórceps, as pontas devem ser cobertos com um tubo de borracha, uma vez que é fácil de ferir a língua, o que pode conduzir à morte do rato. Embora os métodos aqui foram projetados para intubação de ratos mais velhos do que 6 semanas, eles poderiam facilmente ser adaptado para ratos mais jovens.

O nosso processo de instilação foi inicialmente concebido como uma alternativa ao método de aspiração 11 orofaríngea. Enquanto este último método pode ser facilmente aprendido, o volume real entregue ao pulmão permanece incerta, uma vez que alguns dos instilado permanece na faringe e é engolido. Com uma instilação direta na traquéia e pulmão inflação subsequente como demonstramos aqui, o instilado é entregue diretamente para o pulmão. Vale a pena notar que, embora seja possível utilizar substâncias intubação para entregar directamente para a traqueia 11,12, tais intubação da latamago das vias aéreas superiores ou cordas vocais, e em geral exige um nível muito mais elevado de formação para assegurar a taxa de sucesso de 100% que o nosso processo permite.

O procedimento de fixação descrevemos é semelhante ao que usam muitos investigadores. Muitas vezes existe alguma variabilidade na pressão de inflação utilizado para o fixador, mas nós sentimos que 25 cm H 2 O é um compromisso razoável que mantém o pulmão totalmente inflado sem possíveis danos causados ​​por excesso de inflação. Deve notar-se, no entanto, que, apesar de que possa parecer que um pulmão insuflado com o fluido a 25 cm de H2O deve estar a um volume próximo do que a capacidade pulmonar total pode estar com insuflação de ar, a 35 cm de H2O, este é longe de ser verdade. Na verdade, a insuflação com fixador resulta geralmente num volume de 70% da capacidade pulmonar 15,16 ar. E com o processamento posterior com parafina, o volume pulmonar eficaz visto em cortes histológicos é provável abaixo funcional ca residualpacidade (FRC). O mais comum é o fixador formalina ou Z-fix, mas para a coloração imunológica, uma mistura glutaraldehye é muitas vezes necessária. Os investigadores terá que escolher um fixador, dependendo do que está precisando de ser marcadas, mas uma discussão mais aprofundada do fixador óptimo está além do escopo deste artigo métodos.

A fim de fazer uma análise quantitativa adequada de cortes histológicos é essencial dispor de uma medição de volume pulmonar 10. Embora seja possível para obter o volume de pulmão a partir da sequência completa das secções em série (o método Cavalieri), em pulmões de ratinho que é muitas vezes mais simples para simplesmente medir o volume pulmonar fixada como já descrito no presente documento e vídeo. O procedimento que descrevemos leva apenas alguns segundos para fazer e deve ser feito rotineiramente com todas as fixações do pulmão. Tenha em mente, contudo, que o volume medido, assim, não conta para qualquer encolhimento com o processamento e incorporação posterior, e se isso é importante, o método deve Cavalieriser usado. Uma observação final relativamente a esta medição de volume fixo é que a fracção do volume do pulmão no pulmão esquerdo nos pulmões fixos é significativamente menor do que a que foi medida in vivo. CT imagem dos pulmões in vivo de duas estirpes de ratinhos na capacidade residual funcional mostrou o pulmão esquerdo para ser cerca de 40% do total 17, que é geralmente de apenas 30% nas medições acima do pulmão fixo a 25 cm de H2O . No presente momento, não entendemos por que isso deve ser tão diferente, mas ele deve ser mantido em mente quando se analisa mudanças nas análises histológica quantitativa. No que se refere a estudos de cancro do pulmão, com uma medição do volume pulmonar permite que um investigador para normalizar adequadamente dados sobre desnsities químicos específicos ou a densidade de vários tipos de células de números absolutos no todo ou todo o tumor de pulmão.

Em resumo, o procedimento de intubação descrever aqui é barato para fabricare simples de usar, e deve permitir que a maioria dos investigadores e técnicos de laboratório para aprender rapidamente para incutir com êxito líquidos para os pulmões do rato com relativamente pouca experiência. Além disso, a medição e os processos de fixação do volume pulmonar para análise histológica de pulmões fornecem um meio para a análise quantitativa e repetível apropriada de células do pulmão e de pulmão estrutura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laboratory Balance Ohaus Adventurer Pro Model AV 313  Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter Insylte Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle Various Several other possible vendors

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References

  1. Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
  2. Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).
  3. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).
  4. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory. 41, 128-135 (2007).
  5. Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab animal. 35, 39-42 (2006).
  6. Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
  7. Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).
  8. Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).
  9. Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
  10. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
  11. Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).
  12. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of visualized experiments : JoVE. e50601 (2013).
  13. Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of visualized experiments : JoVE. (2013).
  14. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).
  15. Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).
  16. Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives. Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).
  17. Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. In vivo measurement of lung volumes in mice. Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).

Comments

1 Comment

  1. First of all great article and it is very informative. I am trying to order supplies to have a setup That is shown approve in Figure 3. I was wondering if you can give a more detailed description of this setup. i.e. the materials and instruments used. I am not sure what the glass reservoir is called and not sure what type of stopcock is being used or the type of tubing. Thanks in advance for your reply.

    Reply
    Posted by: Christina V.
    January 21, 2016 - 3:43 PM

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