Instillazione e fissaggio Metodi utili in mouse Lung Cancer Research

Medicine

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Summary

L'obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere i metodi semplici che sarà di grande aiuto nella messa a punto e l'analisi dei polmoni del mouse con cancro ai polmoni o altre patologie. Vi presentiamo 3 protocolli modo semplice e affidabile per effettuare instillazioni polmone, la fissazione, e misurazioni del volume polmonare.

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Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. J. Vis. Exp. (102), e52964, doi:10.3791/52964 (2015).

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Abstract

La capacità di infondere agenti dal vivo, cellule o sostanze chimiche direttamente nel polmone senza ferire o uccidere i topi è uno strumento importante per la ricerca sul cancro al polmone. Anche se ci sono una serie di metodi che sono stati pubblicati che mostra come intubare topi per le misure di funzionalità polmonare, nessuno è senza i potenziali problemi per una rapida instillazione tracheale in grandi coorti di topi. Nel presente lavoro, un metodo semplice e rapido è descritto che consente un investigatore effettuare tali instillazioni in modo efficiente. Il metodo non richiede utensili speciali o illuminazione e può essere appreso con molto poca pratica. Si tratta anestetizzante un mouse, una piccola incisione nel collo di visualizzare la trachea, e quindi inserendo direttamente un catetere endovenoso. La piccola incisione viene rapidamente chiuso con tessuto adesivo, ei topi sono autorizzati a recuperare. Uno studente qualificato o tecnico può fare instillazioni ad un tasso medio di 2 min / mouse. Una volta che tegli cancro è stabilito, vi è spesso una necessità di un'analisi istologica quantitativa dei polmoni. Tradizionalmente patologi di solito non si preoccupano di standardizzare inflazione polmone durante la fissazione, e le analisi si basano spesso su un sistema di punteggio che può essere molto soggettiva. Mentre questo può talvolta essere sufficientemente adeguata stime grossolane delle dimensioni di un tumore del polmone, qualsiasi corretta quantificazione stereologica struttura polmone o cellule richiede una procedura di fissazione riproducibile e la successiva volume polmonare. Qui si descrive semplici procedure affidabili per entrambi, che fissa i polmoni sotto pressione e poi misurare con precisione il volume polmonare fisso. L'unico requisito è una bilancia da laboratorio che è accurato in un range di 1 mg-300 g. Le procedure qui presentate quindi potrebbero migliorare notevolmente la capacità di creare, trattare e analizzare tumori polmonari nei topi.

Introduction

Per una serie di ragioni, cancro polmonare non è stata ampiamente studiata nel topo. Una ragione di ciò è che l'accesso al polmone in vivo è molto difficile, e l'analisi quantitativa dei polmoni fissi non viene comunemente fatto. I metodi descritti in questo documento sono stati progettati per porre rimedio a questa situazione. Gli obiettivi sono qui per descrivere i metodi semplici che sarà di grande aiuto nella messa a punto e l'analisi dei polmoni del mouse con cancro ai polmoni o altre patologie. Anche se nessuno di questi approcci sono del tutto nuova, che non sono state presentate insieme come metodi autonomi in maniera semplificata come descritto qui.

Ci sono stati una serie di manoscritti che sono descritti i metodi per l'intubazione del polmone del mouse principalmente al fine di fare della funzione polmonare di ripetizione o lavaggio broncoalveolare nei singoli topi in studi longitudinali. Dato che la carta originale, ci sono stati diversi altri giornali che hanno descritto i diversi approcci per protocolli d'intesae intubazione 1 -9. Mentre tutti questi metodi possono essere usati con successo, di solito richiedono un notevole addestramento, e non sono spesso senza un tasso di fallimento non banale. Inoltre, al fine di effettuare misure di funzionalità polmonare, la cannula deve misura trachea abbastanza saldamente in modo che non ci siano perdite di aria. Tuttavia, un altro uso pratico per intubazione è quello di fornire agenti specifici (le cellule del cancro o altri insulti) o di farmaci terapeutici direttamente al polmone. Tale procedura non richiede una cannula aderente né sofisticate apparecchiature di funzionalità polmonare. La caratteristica innovativa di questo metodo qui illustrato prevede una procedura chirurgica minore che consente intubazione senza possibilità di cannula entrare nell'esofago. Questo semplice approccio consente intubazione di successo con relativamente poca formazione o esperienza. Fino a 30 topi / ora possono essere trattati con questo approccio con un tasso di fallimento si avvicina allo zero.

Una volta che tegli topi sono pronti per essere sacrificato, i polmoni feriti o cancerose possono poi essere rimossi per istologico e l'analisi patologica. Tuttavia, al fine di quantificare correttamente eventuali variabili istologiche per il confronto con altre polmoni, è essenziale standardizzare le procedure di fissaggio e quantificare correttamente il volume polmonare fisso 10. Questo documento descrive in dettaglio le semplici procedure che consentano procedure di fissaggio standardizzati, nonché un metodo per misurare il volume polmonare fisso. Il volume è una metrica essenziale nella quantificazione della istologia, poiché altrimenti la determinazione del volume, solo densità relative possono essere misurati 10. Una volta che il volume polmonare è noto, tuttavia, le misurazioni assolute di cellule e di altre misure strutturali nel polmone possono essere quantificati.

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Protocol

Il protocollo che segue descrive un sistema che funziona bene in 20-35 g topi. Il metodo può essere facilmente adattabile a topi grandi o più piccoli semplicemente modificando la dimensione del catetere. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalla Università cura e l'uso degli animali Comitato Johns Hopkins.

1. Lung instillazione

  1. Selezionare un lungo 20 g cannula commerciale un pollice endovenosa da utilizzare per l'intubazione.
  2. Modificare il catetere punta piegatura manualmente per generare una leggera curvatura all'estremità come illustrato in figura 1.
  3. Anestetizzare il mouse con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg) iniettata IP, e confermare anestesia dall'assenza di movimento riflesso. Applicare una pomata veterinaria sugli occhi subito dopo l'anestesia. Subito dopo l'anestesia applicano unguento veterinario per gli occhi e dare carprofen (5-10 mg / kg SQ) per l'analgesia post-chirurgico e instillazione.
  4. Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma inclinata. Come mostrato in figura 2, un grande raccoglitore ufficio con anse sutura registrato on funziona perfettamente.
  5. Radere la parte ventrale del collo e pulire e disinfettare la zona del collo con il 70% di alcol. Con i nuovi guanti senza senza lattice e a polvere, utilizzare strumenti chirurgici disinfettati con il 70% di alcol.
  6. Utilizzo di forbici affilate fare una piccola incisione chirurgica nel collo circa 12 mm sotto l'incisivo inferiore.
  7. Con una pinza tirare delicatamente la pelle del collo caudale fino a quando la parete ventrale della trachea può essere visto.
  8. Ritrarre delicatamente la lingua e inserire la cannula con la punta piegata inclinato verso la superficie ventrale del mouse. Come in 1.4, tirare delicatamente sulla pelle del collo, e inserire la cannula nella trachea.
    NOTA: Con una poca pratica, il catetere sarà visibile muoversi lungo la trachea. Se va nell'esofago, allora non vi sarà alcuna segnalazione visiva del movimento del catetere. Nessun incisionisono realizzati nella trachea.
  9. Una volta che il catetere è visto nella trachea del collo, avanzato è circa 5 mm di essere affidabile superato le corde vocali ma ancora ben al di sopra della carena.
  10. Preparati a infondere fino a 50 ml di liquido iniettando attraverso il catetere con un puntale caricamento del gel. Posizionare la punta nel mozzo luer, ma prima di iniettare look particolarmente per osservare il movimento del fluido in sincrono con punta respirazione del mouse. Poi iniettare il instillate.
  11. Con una siringa da 1 ml, immediatamente fare una relativamente rapida inflazione di 0,6 ml di aria nei polmoni attraverso il catetere per distribuire il liquido profondità nei polmoni. Rimuovere la cannula.
  12. Rimuovere la cannula.
  13. Utilizzare una piccola quantità di cianoacrilato per chiudere la piccola ferita chirurgica secondo le istruzioni foglietto illustrativo Vetbond. Mettere i topi in gabbie individuali e monitorare visivamente fino a quando si svegliano e si comportano normalmente, senza alcuna indicazione di discomfort.

2. Lung Fissazione

NOTA: Una volta che tutte le procedure sperimentali sono fatte in un mouse, i polmoni per essere pronto per l'elaborazione istologica da fissazione con formaldeide (o qualsiasi altro fissativo desiderato).

  1. Sacrifica il mouse con una procedura accettabile IACUC. Per il mouse rappresentante mostrato nel video, viene utilizzato dislocazione cervicale di un mouse anestetizzato.
  2. Eseguire una tracheostomia (se non già fatto) chirurgicamente esponendo il lato ventrale della trachea, facendo un piccolo taglio, e l'inserimento di uno stub punta dell'ago 18 G nella trachea, e legandola con filo.
  3. Aprire con cautela il torace con una incisione mediana, tagliare via il diaframma, e rimuovere le pareti laterali del torace per esporre i polmoni.
  4. Collegare l'estremità luer dell'ago ad un serbatoio su un supporto ad anello contenente formaldeide. Vedere la Figura 3.
  5. Impostare la superficie superiore della formaldeide 25 cm sopra il livello del mouse. Vedere Figura 3. Successiva assicurarsi che non vi sia aria nel tubo di fissazione eseguendo liquido verso la fine di un rubinetto. Collegare l'estremità luer della cannula tracheale al tubo serbatoio. Aprire il rubinetto per gonfiare i polmoni con la formaldeide. Lasciare i polmoni sotto pressione per almeno 20 min.
  6. Aprire il rubinetto per gonfiare i polmoni con la formaldeide. Lasciare i polmoni sotto pressione per almeno 20 min.
  7. Avanti, legare la trachea oltre la fine dell'ago stub. Essa può contribuire a tirare indietro lentamente sul ferro per esporre più della trachea uncannulated. Quando legato in modo sicuro, togliere il rubinetto.
  8. Sezionare con cautela i polmoni.
  9. Posizionare i polmoni di formaldeide durante la notte. Tempi più lunghi vanno bene, e alcune macchie o procedure possono specificare orari specifici. Anche altri fissativi liquidi, come z-correzione può essere utilizzato per l'instillazione e l'immersione.
  10. Prima di ulteriori elaborazioni istologico, misurareil volume polmonare fissa come descritto in seguito.

3. Misurazione del volume polmonare fisso

  1. Misurare il volume polmonare utilizzando il principio di Archimede, come illustrato nella figura 4. Rimuovere il polmone fissato dalla formaldeide e sezionare il cuore e qualsiasi altro tessuto non-polmonare.
  2. Utilizzare un semplice dispositivo di supporto filo casalingo costruito in precedenza che viene utilizzato per mantenere i polmoni completamente sott'acqua.
    NOTA: Questo dispositivo deve essere reso compatibile con qualunque equilibrio viene utilizzato. Un tipico dispositivo di figura 5 è costituito da una pipetta in plastica e sottile (20 G) fili. Questo sistema funziona bene con la bilancia utilizzata nel video, ma potrebbe essere facilmente adattato alla maggior bilance da laboratorio.
  3. Posizionare un becher con ≈200 ml di acqua sulla bilancia e tarare con la gabbia di supporto in posto in acqua. Vedere Figura 6 Rimuovere la gabbia metallica.; collocare il polmone sulla superficie dell'acqua e premere sott'acquacon la gabbia.
  4. Registrare il peso sulla bilancia. Questo numero riflette il volume di acqua spostata ed è quindi una misura diretta del volume polmonare. Prestare attenzione per assicurarsi che il polmone o di sutura o di qualsiasi parte del gabbietta non toccare i lati o fondo del bicchiere.
  5. Per la precisione, ripetere questa misura. Rimuovere il polmone dall'acqua, e secco su un tessuto. Tarare di nuovo il bicchiere con gabbia in posizione e ripetere la misurazione del volume polmonare. Le due misure di volume devono quindi essere mediate.
    NOTA: Se i polmoni vengono lasciati in formalina per più di una settimana, l'aria nei polmoni sarà dissolto nel liquido. Quando questo accade, il polmone affonderà, quindi non è più necessario utilizzare un qualsiasi dispositivo come in figura 5 per mantenere il polmone sommerso. In tal caso, il volume può essere misurata semplicemente tenendo il polmone da una delle stringhe sutura finché non è completamente sommerso come illustrato nella figura 4.

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Representative Results

Il procedimento descritto nel primo protocollo non di per sé portare ad alcun risultato generalizzati. Esso descrive solo un mezzo molto affidabili per infondere sostanze direttamente nella trachea. Figura 7 mostra un esempio di un polmone in cui è stato instillato trypan blu con il metodo qui descritto. Vi è un'ampia distribuzione del colorante, simile a quanto già visto con altri coloranti o traccianti forniti direttamente in trachea o topi 11,12. Abbiamo usato questo metodo per fornire sia bleomicina o elastasi al polmone, che si traduce nella fibrosi diffusa o enfisema, rispettivamente.

Le procedure descritte per quantificare i cambiamenti strutturali nei polmoni autoptici forniscono dati sui volumi polmonari fissati ad una pressione di 25 cm H 2 O. Tali misurazioni del volume sono essenziali per convertire le successive misurazioni istologiche imparziali di cellule o tessuti densità in numero totale di 10. Questa carta solo describi i mezzi per ottenere un volume polmonare molto accurate. In nove 10-12 settimane di età topi sani Balb / c abbiamo misurato una media (± DS) volume polmonare fisso di 0,82 ± 0,09 ml con il volume polmone sinistro essendo circa il 30% del totale. In topi Balb / c riportato 3 U di elastasi pancreatica (con il metodo descritto in questo documento) per generare l'enfisema sperimentale, il volume fisso polmonare aumentato a 1,15 ± 0,13 ml, con la frazione restante polmone sinistro al 30%.

Figura 1
Figura 1: catetere endovenoso con punta leggermente ricurva utilizzato per l'instillazione.

Figura 2
Figura 2: inclinata raccoglitore dei 3 anelli utilizzati per sostenere i topi per l'intubazione Questo raccoglitore creato per contenere 3 topi..


Figura 3:. Formalina serbatoio riempito sull'anello stand collegato al topo, con la parte superiore di liquido a soli 25 cm sopra il mouse Questa fissazione dovrebbe normalmente essere fatto in una cappa aspirante.

Figura 4
Figura 4:. Archimede Principio Il peso dell'acqua spostata da un oggetto sommerso è uguale al volume dell'oggetto. Poiché il polmone mantiene normalmente alcuni aria residua, è necessario un dispositivo come in figura 5 per mantenere il polmone completamente sommerso.

Figura 5
Figura 5: Lab ha reso il supporto per mantenere i polmoni completamente sott'acqua periferiche.costruita pipette di plastica e filo metallico.

Figura 6
Figura 6: bilancia da laboratorio con bicchiere e dispositivo sommersione tarato pronto per la misurazione del volume polmonare.

Figura 7
Figura 7: Esempio di un polmone in trypan blu attraverso il catetere intubazione.

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Discussion

Le procedure qui descritte hanno diversi vantaggi. Innanzitutto l'attrezzatura necessaria è semplice e poco costoso. In secondo luogo, l'intubazione può essere rapidamente fatto con pochi errori. In terzo luogo, la possibilità di fissare i polmoni a pressione costante, e quindi misurare il volume polmonare numeri consente un'adeguata quantificazione delle strutture o cellule nel polmone 10.

Un possibile inconveniente: l'intubazione è la chirurgia minore. Ciò può limitare la capacità di ripetere la procedura se è richiesta una instillazione 2 nd. Tuttavia, con un'attenta chirurgia e applicazione dell'adesivo siamo stati in grado di fare regolarmente una seconda instillazione una o due settimane dopo. Se continui instillazioni ripetuti sono necessari o se sono necessari ripetuti test di funzionalità polmonare, un altro approccio intubazione può essere più desiderabile 13,14.

Nel fare l'instillazione, ci sono diverse questioni pratiche che dovrebbero essere menzionati. È importante to essere più delicata possibile con movimento della lingua nella prima apertura della bocca. Se si utilizzano pinze, le punte dovrebbero essere coperti con tubi in gomma, poiché è facile ferire la lingua, e questo può portare alla morte del mouse. Anche se i metodi qui sono stati progettati per l'intubazione di topi di età superiore a 6 settimane, potrebbero facilmente essere adattati a giovani topi.

La nostra procedura instillazione stato inizialmente progettato come alternativa al metodo di aspirazione orofaringeo 11. Mentre quest'ultimo metodo può essere facilmente appreso, il volume effettivo consegnato al polmone rimane incerta, poiché alcuni dei instillate rimane nella faringe e viene inghiottita. Con un instillazione diretta nella trachea e il successivo l'inflazione polmone come abbiamo dimostrato qui, la instillate viene consegnato direttamente al polmone. Vale la pena notare che, anche se è possibile utilizzare intubazione per fornire sostanze direttamente alla trachea 11,12, tale da intubazione puòMAGE delle vie aeree superiori o corde vocali, e, in generale, richiede un livello molto più alto di formazione per garantire il tasso di successo del 100% che la nostra procedura consente.

La procedura di fissaggio che descriviamo è simile a quello che molti ricercatori usano. C'è spesso una certa variabilità nella pressione di gonfiaggio utilizzata per il fissativo, ma riteniamo che il 25 cm H 2 O è un ragionevole compromesso che mantiene il polmone completamente gonfio senza possibili danni da eccesso di inflazione. Va notato, tuttavia, che anche se può sembrare che un polmone gonfiato con fluido 25 cm H 2 O dovrebbe avere un volume di quello che la capacità polmonare totale potrebbe essere con inflazione dell'aria a 35 cm H 2 O, questo è lontano dalla verità. Infatti, l'insufflazione di un fissativo comporta generalmente un volume a 70% della capacità polmonare 15,16 dell'aria. E con successivo trattamento con paraffina, il volume polmonare efficace visti in sezioni istologiche è probabile sotto funzionale residua capacità (FRC). Il fissativo più comune è formalina o z-fix, ma per la colorazione immunologica, una miscela glutaraldehye è spesso richiesto. Gli investigatori dovranno scegliere un fissativo a seconda di ciò che si ha bisogno di essere macchiato, ma ulteriori discussioni del fissativo ottimale è oltre la portata di questo metodi carta.

Per fare una corretta analisi quantitativa di sezioni istologiche è essenziale disporre di una misura del volume polmonare 10. Sebbene sia possibile ottenere volume polmonare dalla sequenza completa di sezioni seriali (metodo Cavalieri), nei polmoni del mouse è spesso più semplice misurare semplicemente il volume polmonare fissati come abbiamo descritto in questo documento e video. La procedura che descriviamo sufficienti pochi secondi per fare e deve essere controllata regolarmente fatto con tutte le fissazioni polmonari. Tenere presente, tuttavia, che il volume così misurata non tiene conto di qualsiasi ritiro con successiva lavorazione e incorporamento, e se questo è importante, il metodo dovrebbe Cavalieriessere usato. Una nota finale riguardo a questa misura del volume fisso è che la frazione del volume polmonare nel polmone sinistro nei polmoni fissi è significativamente inferiore a quella che è stata misurata in vivo. CT imaging polmoni in vivo di due ceppi di topi a capacità funzionale residua mostrato il polmone sinistro a circa il 40% del totale 17, che è generalmente solo il 30% nelle suddette misurazioni da polmoni fissati a 25 cm H 2 O . Al momento, non capiamo perché questo dovrebbe essere così diversi, ma dovrebbe essere tenuto presente quando si analizza i cambiamenti nelle analisi istologica quantitativa. Per quanto riguarda gli studi di cancro ai polmoni, aventi una misura del volume polmonare permette un investigatore per normalizzare i dati correttamente su desnsities chimici specifici o la densità di vari tipi cellulari di numeri assoluti in tutta tumore o polmone intero.

In sintesi, la procedura di intubazione descrivere qui è poco costoso da fabbricaree semplice da usare, e dovrebbe consentire la maggior parte dei ricercatori e tecnici di laboratorio per imparare rapidamente a infondere con successo i liquidi nei polmoni del mouse con relativamente poca esperienza. Inoltre, la procedura di fissaggio e volume polmonare misurazione delle analisi istologica dei polmoni fornisce un mezzo per una corretta analisi quantitativa e ripetibile delle cellule polmonari e struttura dei polmoni.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laboratory Balance Ohaus Adventurer Pro Model AV 313  Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter Insylte Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle Various Several other possible vendors

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References

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Comments

1 Comment

  1. First of all great article and it is very informative. I am trying to order supplies to have a setup That is shown approve in Figure 3. I was wondering if you can give a more detailed description of this setup. i.e. the materials and instruments used. I am not sure what the glass reservoir is called and not sure what type of stopcock is being used or the type of tubing. Thanks in advance for your reply.

    Reply
    Posted by: Christina V.
    January 21, 2016 - 3:43 PM

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