क्षणिक मस्तिष्क hypoxia-ischemia के आधार पर एक Thrombotic स्ट्रोक मॉडल

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Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

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Abstract

स्ट्रोक अनुसंधान नैदानिक ​​व्यवहार में न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचारों का अनुवाद करने में कई झटके सहा है। इसके विपरीत, वास्तविक दुनिया थेरेपी (टीपीए थ्रंबोलाइसिस) शायद ही कभी पूर्व नैदानिक ​​अनुसंधान स्ट्रोक पर हावी है, जो यांत्रिक रोड़ा आधारित प्रयोगात्मक मॉडल में लाभ, उत्पादन करता है। बेंच और बिस्तर के बीच यह विभाजन पूर्व नैदानिक ​​स्ट्रोक अनुसंधान में टीपीए उत्तरदायी मॉडल को रोजगार की जरूरत पता चलता है। यह अंत करने के लिए, एक सरल और टीपीए प्रतिक्रियाशील थ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल का आविष्कार किया और यहाँ वर्णित है। 37.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर पशु गुदा तापमान को बनाए रखते हुए यह मॉडल, 30 मिनट के लिए वयस्क चूहों में एक चेहरा मुखौटा के माध्यम से एकतरफा आम मन्या धमनी और 7.5% ऑक्सीजन की डिलीवरी की क्षणिक रोड़ा के होते हैं। एकतरफा मन्या धमनी या हाइपोक्सिया के प्रतिवर्ती बंधाव प्रत्येक केवल क्षणिक मस्तिष्क में रक्त के प्रवाह को दबा दिया है, दोनों के अपमान के संयोजन reperfusion के घाटे, आतंच और प्लेटलेट बयान, और बड़े infar स्थायी वजह सेमध्य मस्तिष्क धमनी की आपूर्ति क्षेत्र में सीटी। महत्वपूर्ण बात है, पूंछ-नस में 0.5, 1, या 4 घंटे के बाद थी (10 मिलीग्राम / किग्रा) पर पुनः संयोजक टीपीए इंजेक्शन मृत्यु दर और रोधगलितांश आकार के समय पर निर्भर कमी प्रदान की है। इस नए स्ट्रोक मॉडल सरल है और प्रयोगात्मक परिणामों की तुलना करने के लिए प्रयोगशालाओं भर में मानकीकृत किया जा सकता है। इसके अलावा, यह craniectomy या पूर्व गठित एम्बोली शुरू करने के बिना थ्रोम्बोसिस लाती है। इन अद्वितीय गुण को देखते हुए, थी मॉडल क्लिनिक पूर्व स्ट्रोक अनुसंधान के प्रदर्शनों की सूची के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त है।

Introduction

थ्रंबोलाइसिस और recanalization नैदानिक ​​अभ्यास 1 में तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के सबसे प्रभावी उपचार है। फिर भी, क्लिनिक पूर्व neuroprotection अनुसंधान के बहुमत संवहनी रोड़ा के हटाने पर मस्तिष्क में रक्त प्रवाह की तेजी से वसूली का उत्पादन और टीपीए थ्रंबोलाइसिस से कोई लाभ के लिए छोटे से पता चलता है कि एक क्षणिक मैकेनिक बाधा मॉडल (intraluminal सीवन मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा) में प्रदर्शन किया गया था। यह स्ट्रोक मॉडल की संदिग्ध पसंद रोगियों 2,3 करने के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव चिकित्सा का अनुवाद करने में कठिनाई करने के लिए कम से कम हिस्से में, योगदान दिया है कि सुझाव दिया गया है। इसलिए, पूर्व नैदानिक ​​अनुसंधान के क्षेत्र में टीपीए उत्तरदायी thromboembolic स्ट्रोक मॉडल को रोजगार के लिए एक बढ़ती हुई कॉल वहाँ है, लेकिन इस तरह के मॉडल भी तकनीकी समस्याओं (चर्चा देखें) 4-7 है। यहाँ हम एकतरफा क्षणिक hypoxic इस्कीमिक (थी) अपमान और नसों में टीपीए चिकित्सा 8 के लिए अपनी प्रतिक्रियाओं पर आधारित एक नई थ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल का वर्णन है।

थी स्ट्रोक मॉडल 1960 9 में वयस्क चूहों के साथ प्रयोगों के लिए आविष्कार किया गया था कि लेविन प्रक्रिया (एक कक्ष में क्षणिक हाइपोक्सिया के लिए जोखिम के द्वारा पीछा एकतरफा आम मन्या धमनी की स्थायी बंधाव) के आधार पर विकसित किया गया था। मूल लेविन प्रक्रिया अंधकार में फीका क्योंकि यह केवल चर मस्तिष्क क्षति का उत्पादन किया है, लेकिन यह 1981 में 10 में नवजात hypoxic इस्कीमिक मस्तिष्क विकृति (जल्दी करना) की एक मॉडल के रूप में रॉबर्ट Vannucci और उनके सहयोगियों द्वारा फिर से पेश किया गया था जब एक ही अपमान कृंतक पिल्ले में लगातार neuropathology कारण होता है। हाल के वर्षों में, कुछ जांचकर्ताओं hypoxic कक्ष 11 में तापमान समायोजन करके वयस्क चूहों को लेविन-Vannucci मॉडल अनुकूलित कर रहे हैं। यह मूल लेविन प्रक्रिया में असंगत मस्तिष्क घावों hypoxic कक्ष में वयस्क कृन्तकों के शरीर के तापमान को अस्थिर से उत्पन्न हो सकती है कि प्रशंसनीय है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम hypoxic गैस प्रशासन द्वारा लेविन प्रक्रिया संशोधितएक facemask के माध्यम से, शल्य चिकित्सा की मेज पर 12 से 37 डिग्री सेल्सियस पर कृंतक कोर तापमान को बनाए रखने। जैसी कि उम्मीद थी, कड़े शरीर का तापमान नियंत्रण बहुत हाय-प्रेरित मस्तिष्क विकृति के reproducibility वृद्धि हुई है। हाय अपमान भी जमावट, भोजी, और gray- और सफेद बात चोट 13 से चलाता है। अन्य जांचकर्ताओं भी पोस्ट-स्ट्रोक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 14 की जांच के लिए हाई मॉडल का इस्तेमाल किया है।

हाय स्ट्रोक मॉडल की एक अनूठी विशेषता यह बारीकी से रक्त प्रवाह, एन्दोथेलिअल चोट (जैसे कारण हाय-प्रेरित oxidative तनाव के लिए), और hypercoagulability (एचआई प्रेरित प्लेटलेट सक्रियण) का ठहराव सहित thrombus गठन की Virchow के त्रय, (है कि इस प्रकार है चित्रा 1 ए) 15। जैसे, हाय मॉडल वास्तविक दुनिया इस्कीमिक स्ट्रोक के लिए प्रासंगिक कुछ pathophysiological तंत्र पर कब्जा कर सकते हैं। मन में इस विचार के साथ, हम आगे की संयुक्त राष्ट्र की प्रतिवर्ती बंधाव के साथ उच्च मॉडल परिष्कृतilateral आम मन्या धमनी (इसलिए एक क्षणिक हाई अपमान बनाने के लिए), और के साथ या Edaravone बिना टीपीए थ्रंबोलाइसिस के लिए अपनी प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया। Edaravone पहले से ही शुरुआत 9 से 24 घंटे के भीतर इस्कीमिक स्ट्रोक के इलाज के लिए जापान में अनुमोदित एक मुफ्त कट्टरपंथी मेहतर है। हमारे प्रयोगों के रूप में संक्षिप्त रूप में 30 मिनट क्षणिक हाई थ्रोम्बोटिक रोधगलन चलाता है पता चला है कि, और कहा कि संयुक्त टीपीए-Edaravone उपचार सहक्रियाशील लाभ 8 प्रदान करता है। यहाँ हम विस्तृत सर्जिकल प्रक्रियाओं और तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के reperfusion की उपचार के अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो थी मॉडल की कार्यप्रणाली विचारों का वर्णन है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल एमोरी विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ने मंजूरी दे दी और देखभाल और प्रयोगशाला के जानवरों के इस्तेमाल के लिए स्वास्थ्य दिशानिर्देश के राष्ट्रीय संस्थान इस प्रकार है।

1. सेटअप

  1. सर्जरी से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी पंप के साथ जुड़ा हुआ वार्मिंग पैड पर शल्य बिस्तर तैयार करें। शल्य बिस्तर पर 3 मिलीलीटर सिरिंज की नली का उपयोग कर एक गर्दन रोल रखें। चिकित्सा हवा में 2% isoflurane के साथ संज्ञाहरण गैस तैयार करें।
  2. Autoclaved संदंश, कैंची, सूक्ष्म सुई धारकों, hemostat, कपास swabs और टांके तैयार करें। ऊतक गोंद और आंख मरहम तैयार करें।
  3. हीटिंग दीपक और गुदा जांच के साथ हाइपोक्सिया प्रणाली और तापमान नियंत्रकों को निर्धारित करें। 92.5% एन 2 से संतुलित 7.5% ओ 2 में 2% isoflurane के साथ हाइपोक्सिया गैस तैयार करें।
  4. एक घंटे की सर्जरी से पहले, चूहों एक धीमी गति से जारी Meloxicam (4.0 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा analgesized कर रहे हैं।
<पी वर्ग = "jove_title"> 2। क्षणिक मस्तिष्क hypoxia-ischemia के (चित्रा 1 बी)

  1. 10-13 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL चतनाशून्य / पशु पैर निचोड़ करने के लिए अनुत्तरदायी है, और फिर एक इलेक्ट्रॉनिक शेवर का उपयोग कर सही गर्दन पर बालों को हटाने तक 3% isoflurane के साथ संज्ञाहरण शामिल कक्ष में 22 ग्राम से 30 वजन 6 चूहों।
  2. 2 एल / मिनट के प्रवाह की दर पर चिकित्सा हवा में 2% isoflurane के साथ जुड़ा हुआ शल्य बिस्तर पर चूहों रखें। सुरक्षित forelimbs चिकित्सा टेप का उपयोग करने के पक्ष में गर्दन रोल के साथ बाहर फैला।
  3. शराब और फिर कपास swabs द्वारा पीछा betadine के साथ चीरा के लिए शल्य साइट को साफ करें।
  4. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक सीधे संदंश और के बारे में 0.2 सेमी midline के त्वचा से पार्श्व एक सूक्ष्म कैंची का उपयोग एक 0.5 सेमी सही-ग्रीवा चीरा बनाते हैं।
  5. सही आम मन्या धमनी (RCCA) को बेनकाब करने के लिए प्रावरणी और ऊतकों के अलावा खींचने के लिए ठीक दाँतेदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। ध्यान से ठीक चिकनी संदंश की एक जोड़ी का उपयोग vagal तंत्रिका से RCCA अलग।
  6. लाइव RCCA पर (Releasable) दो precut 5-0 रेशम सीवन गाँठ, और फिर 4-0 नायलॉन monofilament सिवनी (चित्रा 1C) का उपयोग त्वचा को सीना।
  7. सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
  8. जल्दी हाइपोक्सिया व्यवस्था करने के लिए चूहों को हस्तांतरण और 30 मिनट के लिए / 0.5-1 एल के प्रवाह की दर में 7.5% में 2% isoflurane के साथ चेहरे नकाब में न्यूनतम 2 हे नाक और मुंह में डाल दिया।
    1. हाइपोक्सिया के दौरान 37.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर गुदा तापमान को नियंत्रित करने के लिए हीटिंग दीपक के साथ तापमान नियंत्रकों का उपयोग करें। / मिनट 80-120 साँस में सांस की दर पर नजर रखने। हाइपोक्सिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस से ऊपर शरीर के तापमान के रखरखाव के अनुरूप मस्तिष्क रोधगलन बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। कम श्वसन दर आमतौर पर 20 मिनट हाइपोक्सिया के बाद होता है। चेहरे नकाब हटा और श्वसन दर इस 1-2 मिनट लगते हैं और 30 मिनट हाइपोक्सिया अवधि में गिनती नहीं है 40. करने के लिए नीचे चला जाता है अगर सामान्य हवा की आपूर्ति की अनुमति देते हैं।
  9. हाइपोक्सिया के बाद, हस्तांतरणएक शल्य चिकित्सा बिस्तर पर चूहों और RCCA से दो टांके जारी। पिंजरे में चूहों लौटने तो ऊतक गोंद का उपयोग घाव को बंद करें, और। दो जीवित समुद्री मील की दोनों अप्रत्याशित रूप से हाइपोक्सिया के बाद जारी कर रहे हैं अगर जानवरों को बाहर निकालें।
  10. हाइपोक्सिया और संज्ञाहरण से उबरने के लिए 5-10 मिनट के लिए चूहों की निगरानी करें। पिंजरे में गीला भोजन प्लेस और जानवरों की देखभाल की सुविधा के लिए यह वापसी।
    नोट: Thi के बाद 24 घंटा में गंभीर चक्कर व्यवहार करने के लिए हल्के दिखा पशु मस्तिष्क अतिक्रमण के साथ जोड़ा जाता है। जब्ती के लक्षणों के साथ सबसे अधिक पशुओं थी बाद 24 घंटा timepoint से पहले मर जाते हैं।

3. लेजर धब्बा कंट्रास्ट इमेजिंग

नोट: इस थी मॉडल की एक आवश्यक प्रक्रिया नहीं है, एक दो आयामी लेजर धब्बा विपरीत इमेजिंग प्रणाली 16 के दौरान या क्षणिक हाइपोक्सिया-ischemia के बाद मस्तिष्क में रक्त प्रवाह (CBF) के परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेंट के तुरंत बाद, थी तहत रिकॉर्ड CBF के परिवर्तन दस्तावेज़ईपी 2.6। वैकल्पिक रूप से, इन प्रक्रियाओं 2.10 कदम निम्न प्रदर्शन किया जा सकता है, थी अपमान के बाद CBF वसूली की तुलना करें।

  1. प्रवण स्थिति में एक anesthetized माउस रखें और उजागर लेकिन बंद खोपड़ी के साथ सिर पर एक 1 सेमी लंबे समय midline चीरा प्रदर्शन करते हैं।
  2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक रक्त के प्रवाह को इमेजर के तहत दोनों मस्तिष्क गोलार्द्धों में CBF मॉनिटर और CCAO सर्जरी (कदम 2.6) के तुरंत बाद मस्तिष्क में रक्त प्रवाह की रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। 50 मिनट के लिए आगे बढ़ें।
  3. एक 16-रंग पैलेट में मनमाना इकाइयों के साथ CBF छवि दिखाने के लिए और वास्तविक समय में विश्लेषण निर्माता के निर्देशों (चित्रा 2) निम्नलिखित MoorFLPI सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चयनित क्षेत्रों के।
  4. CBF छवि रिकॉर्डिंग के बाद, ऊतक गोंद के साथ खोपड़ी को बंद करने और पिंजरे में पशु लौटने।

4. टीपीए प्रशासन

  1. (220-300 एवं किलो पुनः संयोजक टीपीए / विलायक या 10 मिलीग्राम के साथ पूंछ नस में जानवरों इंजेक्षन# 956; 1 मिलीग्राम / मी टीपीए) के एल 0.5, 1, या tCCAo प्लस हाइपोक्सिया के बाद 4 घंटे में (चित्रा 4)।

कई विभिन्न विकल्पों के साथ 5. मस्तिष्क क्षति का पता लगाने

, मस्तिष्क के नमूने एकत्र करने के लिए थी के बाद 1, 4 या 24 घंटा में चूहों euthanize: ध्यान दें।

  1. वर्णित पिछले के रूप में थी अपमान के बाद 24 बजे इन विवो 2,3,5-Triphenyltetrazolium क्लोराइड द्वारा रोधगलितांश मात्रा की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करना (टीटीसी) विधि। 17
    1. Intraperitoneally 1.4 एम mannitol समाधान (~ 0.1 मिलीग्राम / छ शरीर के वजन) transcardial छिड़काव से पहले 30 मिनट के साथ जानवरों इंजेक्षन। पीबीएस के साथ Transcardial छिड़कना चूहों 2% टीटीसी के 10 एमएल द्वारा पीछा किया।
    2. 10 मिनट के बाद शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ पशुओं के मस्तिष्क निकालें और एक vibratome साथ 1 मिमी मोटाई में रात भर निर्धारण और खंड लिए 4% paraformaldehyde में जगह है।
    3. डिजिटल माइक्रोस्कोप और क्वांट से चार sectioned मस्तिष्क स्लाइड्स की एक श्रृंखला स्नैपImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर undamaged, contralateral गोलार्द्ध के क्षेत्र के लिए infarcted क्षेत्र (सही पक्ष में सफेद क्षेत्र) के अनुपात के रूप रोधगलितांश मात्रा Ify।
  2. वैकल्पिक रूप से, थी अपमान के बाद 1 घंटे में immunofluorescence द्वारा थ्रोम्बोसिस गठन करते हैं।
    1. अक्टूबर यौगिक और खंड एक cryostat का उपयोग 12 माइक्रोन मोटाई पर दिमाग में तय मस्तिष्क फ्रीज।
    2. एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर प्रतिदीप्ति निरीक्षण करने के लिए: बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा Fluro 488 डाई (200) 1 से: (100 1) निम्नलिखित खरगोश विरोधी फाइब्रिनोजेन एंटीबॉडी के साथ मस्तिष्क स्लाइड सेते हैं।
  3. वैकल्पिक रूप से, थी अपमान के बाद 4 घंटे में 100 μl 2% इवांस नीले रंग की पूंछ नस में इंजेक्शन द्वारा पोत रुकावट प्रदर्शन करते हैं।
    1. इवांस नीले इंजेक्शन के बाद 4% paraformaldehyde में दिमाग को दूर करने के सिर में कटौती जल्दी से चूहों euthanize और। नोट: यह दोनों fore- के नीले रंग के साथ इवांस नीले संचलन के लिए 5-10 मिनट लगते हैं और हाथ पैर हिंद।
    2. SECTI100 माइक्रोन मोटाई पर तय दिमाग पर एक रपट सूक्ष्म का उपयोग कर और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर एक 680 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति निरीक्षण करते हैं।

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Representative Results

दो आयामी लेजर धब्बा विपरीत इमेजिंग (LSCI) 16 से 30 मिनट के क्षणिक एकतरफा मन्या रोड़ा (tCCAO), हाइपोक्सिया के लिए 30 मिनट के लिए जोखिम (7.5% ऑक्सीजन), और 30 मिनट के एकतरफा से मस्तिष्क में रक्त प्रवाह (CBF) की परिवर्तन तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था हाइपोक्सिया (थी) के तहत बंधाव मन्या। इस प्रयोग tCCAO normoxia के तहत मन्या ligated गोलार्द्ध पर CBF दबा पता चला है कि करने के लिए ~ जल्दी से मन्या रोड़ा (2A चित्रा में आर) की रिहाई के बाद 85% से ऊपर को बरामद, जो आधारभूत मूल्य का 50%। प्रणालीगत हाइपोक्सिया के संपर्क में अकेले क्षणिक normoxic वातावरण (चित्रा 2 बी) की ओर लौटने के बाद 130 ~% तक पलटाव जो आधारभूत मूल्य का लगभग 75% करने के लिए CBF कम कर दिया। जल्दी से शायद ही कभी मन्या ligatio की रिहाई के बाद 20 मिनट में 30% से अधिक को बरामद, जो 10 मिनट, चारों ओर आधारभूत मूल्य के कम से कम 20% करने के लिए ipsilateral गोलार्द्ध में CBF कम हाइपोक्सिया के तहत विपरीत मन्या बंधाव (थी) मेंn और normoxia की ओर लौटने। CBF contralateral गोलार्द्ध (एल) पर है, तथापि, हाइपोक्सिया के दौरान% के बीच 20 और 50 fluctuated, और जल्दी थी अपमान (चित्रा -2) के बाद 80% से ऊपर के लिए लौट आए।

TCCAo (30 मिनट) या tCCAO के बाद 24 घंटा से अधिक 30 मिनट हाइपोक्सिया (थी) में, इन विवो टीटीसी दाग रोधगलन 17 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विश्लेषण में थी अपमान (चित्रा 3) निम्न मध्य मस्तिष्क धमनी की आपूर्ति के क्षेत्र में कोई tCCAO अपमान से स्पष्ट चोट है, लेकिन बड़े आकार का रोधगलन दिखाया। एंटी आतंच (ogen) immunostaining के 1 घंटे वसूली पर tCCAO- और थी-घायल दिमाग तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया और आतंच (ogen) के व्यापक बयान से पता चला है, थ्रोम्बोसिस का सूचक है, थी-घायल में है, लेकिन माउस tCCAO को चुनौती दी नहीं था दिमाग (चित्रा 3 बी, सी)। इवांस नीले रंग की पूंछ-नस में इंजेक्शन भी 4 घंटा वसूली पर tCCAO- और थी-घायल दिमाग की नाड़ी छिड़काव तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विश्लेषण कम से पता चलामें प्रमस्तिष्क छिड़काव और इवांस नीले रंग की तीव्र परिस्त्राव एड tCCAO को चुनौती दी माउस दिमाग (चित्रा 3 डी, ई) थी-घायल हो गए, लेकिन नहीं।

अंत में, वाहन की पूंछ-नस में इंजेक्शन प्राप्त चूहों में थी अपमान का परिणाम या पुनः संयोजक मानव टीपीए (Activase, 10 मिलीग्राम / किग्रा, 0.5, 1, या 4 घंटे के बाद थी) (0.5 घंटा वसूली पर) में उपयोग कर की तुलना में थे 24 घंटा वसूली (चित्रा -4 ए) में टीटीसी दाग vivo। वाहन का इलाज चूहों में, 24 घंटा के बाद थी पर मृत्यु दर 23.8% थी और केवल एक 21 में थी-घायल चूहों मतलब है और 2 एसडी (ग़ैर) से परे था। 0.5 घंटा वसूली में टीपीए उपचार प्राप्त चूहों में 24 घंटे मृत्यु दर 8.3% से गिरा दिया, लेकिन टीपीए थी अपमान (चित्रा 4 बी) के बाद 1 या 4 घंटे में प्रशासित किया गया था जब इस आशय खो गया था। चित्रा 4C सभी का रोधगलितांश आकार साजिश रची चार उपचार समूहों में चूहों से बच गया। ध्यान से, 0.5 और 1 घंटे टीपीए-प्रशासन के दोनोंignificantly वाहन उपचार की तुलना में जब रोधगलितांश आकार, कम कर दिया। 0.5 घंटा टीपीए उपचार समूह में भी 4 घंटा टीपीए-इलाज के समूह की तुलना में काफी कम रोधगलितांश आकार दिखाया। चित्रा 4D प्रत्येक उपचार के बाद प्रतिनिधि टीटीसी-दाग नतीजे बताते हैं।

चित्र 1
चित्रा 1:। वयस्क चूहों में क्षणिक मस्तिष्क hypoxia-ischemia (थी) अपमान की प्रक्रिया (ए) Virchow के त्रय थ्रोम्बोसिस आगे बढाती है कि रक्त का रक्त प्रवाह, एन्दोथेलिअल चोट, और hypercoagulability का ठहराव भी शामिल है। (बी) में थी स्ट्रोक प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख। माउस गुदा तापमान 37-38 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था, जबकि दो Releasable समुद्री मील, सही आम मन्या धमनी (सीसीए) पर बंधा है, और 30 मिनट के लिए एक नाक शंकु के माध्यम से 7.5% ऑक्सीजन की डिलीवरी के द्वारा पीछा किया गया था। ट्रांस के बादient प्रणालीगत हाइपोक्सिया, सीसीए बंधाव Releasable सिवनी समुद्री मील के एक छोर से बाहर खींच कर जारी किया गया था। एमसीए, मध्य मस्तिष्क धमनी; आईसीए, आंतरिक मन्या धमनी; ईसीए, बाह्य मन्या धमनी; सीसीए, आम मन्या धमनी। (सी) क्षणिक सही सीसीए रोड़ा के लिए सर्जिकल प्रक्रियाओं। 1. दो precut सिवनी (# 1 और 2 #) एक अलग सही सीएए के तहत रखा गया था। 2. दो Releasable समुद्री मील किए गए थे। 3. चीरा लाइन सिवनी # 3 द्वारा बंद कर दिया गया था। सिवनी # # 1 और 2 के सिरों चीरा लाइन के बाहर पहुंचा जा रहे थे कि सुनिश्चित करें। 4. ध्यान सीसीए जारी करने के लिए बाहर से सिवनी # 1 और # 2 खींच। धीरे प्रदर्शन किया, इस प्रक्रिया सीसीए का पंगु बनाना कारण नहीं होगा।

चित्र 2
चित्रा 2:। के दौरान और थी अपमान के बाद मस्तिष्क में रक्त प्रवाह परिवर्तन का विश्लेषण एक दो आयामी लेजर धब्बा विपरीत इमेजिंग (राससीआई) प्रणाली मस्तिष्क में रक्त प्रवाह (CBF) का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। आर (दाएं) मन्या-ligated गोलार्द्ध इंगित करता है; एल (बाएं) contralateral गोलार्द्ध है। (ए) tCCAO normoxia के तहत दबा CBF को ~ मन्या बंधाव की रिहाई पर 3 मिनट के भीतर 85% से ऊपर को बरामद, जो कम से कम 30 मिनट के लिए मन्या-ligated गोलार्द्ध (आर), पर आधारभूत मूल्य का 50%। कैरोटिड धमनी बंधाव बिना हाइपोक्सिया (7.5% ऑक्सीजन, 30 मिनट) (ख), CBF आधारभूत मूल्य के 76% की गिरावट आई है और क्षणिक normoxia की ओर लौटने के बाद लगभग 130% करने के लिए rebounded। हाइपोक्सिया के तहत क्षणिक मन्या बंधाव में (सी) (थी, 30 मिनट), CBF मन्या-ligated (आर) गोलार्द्ध पर जल्दी से आधारभूत मूल्य के कम से कम 20% से गिरा दिया, और यह शायद ही कभी की रिहाई पर 30% ऊपर बरामद बंधाव और normoxia की ओर लौटने मन्या। इसके विपरीत, प्रतिपक्षी (एल) गोलार्द्ध पर CBF हाइपोक्सिया के दौरान 20-50% के बीच fluctuated, और जल्दी से आधारभूत की> 80% करने के लिए लौट आएमन्या बंधाव की रिहाई के बाद मूल्य और normoxia की ओर लौटने। प्रत्येक समूह में N> 4 के लिए प्रतिनिधि CBF ट्रेसिंग दिखाया गया। प्रतिनिधि LSCI तस्वीरों के लिए समय अंक प्रतिनिधि पता लगाने में ग्रे लाइनों द्वारा चिह्नित किया गया।

चित्र तीन
चित्रा 3: मस्तिष्क रोधगलितांश, सहज घनास्त्रता और पोत सही आम मन्या धमनी (tCCAO) के 30 मिनट के क्षणिक बंधाव के बाद 24 घंटे में नहीं दिखाई रोधगलन दिखाया में विवो टीटीसी-दाग थी अपमान के बाद रुकावट (ए), लेकिन इसके अलावा के। tCCAO करने के लिए 30 मिनट हाइपोक्सिया (7.5% ऑक्सीजन) ज्यादातर मध्य मस्तिष्क धमनी-आपूर्ति के क्षेत्र में, ipsilateral गोलार्द्ध (तारांकन) में खासी रोधगलन का उत्पादन किया। थी अपमान के बाद 1 घंटे में immunostaining (बी, सी) विरोधी आतंच (ogen) में बड़े पैमाने पर जमा दिखायाipsilateral गोलार्द्ध। इसके विपरीत, tCCAo के बाद 1 घंटे (30 मिनट) अपमान (प्रत्येक के लिए N> 4) में कोई आतंच (ogen) जमा किया गया था। (डी, ई) सेरेब्रल छिड़काव tCCAO (30 मिनट) या थी (30 मिनट) अपमान के बाद 4 घंटे में इवांस नीले रंग की डाई की पूंछ-नस में इंजेक्शन द्वारा मूल्यांकन किया गया था। पोस्ट-tCCAO मस्तिष्क में इवांस नीले रंग की डाई ipsilateral गोलार्द्ध में रक्त वाहिकाओं के सबसे भर दिया। इसके विपरीत, बाद में थी मस्तिष्क में, इवान नीले रंग की डाई कम रक्त वाहिकाओं भरा है और पैरेन्काइमा (एन> 3) में लीक किया गया। स्केल बार: 250 माइक्रोन।

चित्रा 4
चित्रा 4: थी स्ट्रोक मॉडल में टीपीए थ्रंबोलाइसिस के प्रभाव में थी अपमान के बाद 0.5, 1, या 4 घंटे में नसों में टीपीए एडमिनिस्ट्रेशन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के प्रभाव की तुलना करने के प्रयोगों की (ए) को रेखांकित करें।। संचालित पशुओं की संख्या (बी) सारांश, मोअपमान के बाद 24 घंटे में rtality, outliers (मतलब +/- 2 एसडी बाहर रोधगलितांश आकार), और पशुओं की संख्या रोधगलितांश आकार की तुलना करने के लिए भी शामिल है। (सी) मात्रा समूहों (दिखाया प्रत्येक समूह के लिए मतलब है और SEM) कर रहे हैं (20%) के लिए एक वाहन समूह में औसतन 32% रोधगलितांश मात्रा और 0.5 घंटा (16%) में रोधगलन की महत्वपूर्ण कमी और 1 घंटा दिखाया। पी-मूल्यों टी परीक्षण के द्वारा निर्धारित किया जाता है। (डी) प्रतिनिधि थी अपमान द्वारा चुनौती दी है और चोट के बाद संकेत समय-बिंदु पर टीपीए उपचार प्राप्त किया गया है कि जानवरों से मस्तिष्क टीटीसी से सना हुआ। टीटीसी धुंधला में, लाइव ऊतक लाल रंग से पता चला है; रोधगलितांश ऊतक पीला था।

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Discussion

स्ट्रोक एक उम्र बढ़ने की आबादी के साथ किसी भी समाज के लिए महत्व बढ़ के एक प्रमुख स्वास्थ्य समस्या है। विश्व स्तर पर, स्ट्रोक सभी लोगों की मृत्यु 18 वर्ष की 11.1% के बराबर 2010 में एक अनुमान के अनुसार 5.9 मिलियन घातक घटनाओं, के साथ मौत का दूसरा प्रमुख कारण है। स्ट्रोक भी विकलांगता से समायोजित जीवन वर्ष की तीसरी प्रमुख कारण है (DALYs) 1990 19 में पांचवें स्थान से बढ़ रहा है, 2010 में विश्व स्तर पर खो दिया है। ये महामारी विज्ञान के डेटा तीव्र (इस्कीमिक) स्ट्रोक के और अधिक प्रभावी उपचार की आवश्यकता पर प्रकाश डाला। हालांकि, पूर्व नैदानिक ​​न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचार में गहन अनुसंधान के बावजूद, टीपीए-थ्रंबोलाइसिस जानवरों के अध्ययन में कई एक बार होनहार न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों क्लिनिकल परीक्षण में विफल रहा है, जबकि संयुक्त राज्य अमेरिका में खाद्य एवं औषधि प्रशासन ने मंजूरी दे दी है कि तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के केवल विशिष्ट चिकित्सा बनी हुई है। रोगियों में न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचारों का अनुवाद करने में कठिनाई कई कारक है, और वर्तमान जोर अच्छा प्रयोगशाला व्यावहारिक पर हैसीई, कई डेटासेट के मेटा-विश्लेषण, और अंतरराष्ट्रीय सहयोग को क्लिनिक पूर्व स्ट्रोक अनुसंधान 20,21 में सुधार होगा। हालांकि, translational को कठिनाई के कारण तारीख 2,3 करने के लिए पूर्व नैदानिक ​​स्ट्रोक अनुसंधान के बहुमत में यांत्रिक संवहनी रोड़ा मॉडल की एक गरीब पसंद (जैसे intraluminal सीवन एमसीए रोड़ा) करने के लिए सुझाव है कि एक अल्पसंख्यक राय नहीं है। मैकेनिकल संवहनी रोड़ा मॉडल शायद ही कभी थ्रोम्बोसिस प्रेरित और मस्तिष्क reperfusion की यांत्रिक रुकावट की रिहाई पर भी तेजी से होता है, क्योंकि इन मॉडलों को न तो वास्तविक शब्द थेरेपी (टीपीए फाइब्रिनोलयन) का जवाब है और न ही स्ट्रोक रोगियों में उन लोगों के रूप में एक संकीर्ण चिकित्सकीय खिड़की प्रदान करते हैं। नतीजतन, सुझाव दिया उपाय कम से कम thromboembolic स्ट्रोक मॉडल क्लिनिक पूर्व स्ट्रोक अनुसंधान 3 में शामिल हैं, पर जोर देना है।

यह सिफारिश, हालांकि, इसकी मजबूरी है क्योंकि टी के वर्तमान thromboembolic स्ट्रोक मॉडल (बहिर्जात एम्बोली वितरण, एमसीए इंजेक्शनhrombin, और photothrombosis) सब कुछ तकनीकी कमियां 4 है। बहिर्जात एम्बोली मॉडल के लिए, कारण थक्का तैयारी 4,5 में मतभेद के रोधगलितांश आकार और स्थान में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता, साथ ही टीपीए थ्रंबोलाइसिस को अप्रत्याशित प्रतिक्रिया में एम्बोली परिणामों की intravascular आसव। एमसीए शाखा में थ्रोम्बिन के प्रत्यक्ष इंजेक्शन craniectomy आवश्यकता है, और thrombolytic चिकित्सा के अनुकूलन के लिए अपनी उपयोगिता साबित 4,6 जाना अभी बाकी है। रासायनिक उजागर खोपड़ी के माध्यम से प्रणालीगत एक सहज डाई के इंजेक्शन (जैसे गुलाब बंगाल या Erythrosine बी) और विकिरण पर आधारित thromboembolism शुरू की अक्सर 4,7 थ्रंबोलाइसिस का जवाब नहीं है कि प्लेटलेट ही समुच्चय पैदा करता है। पूर्व नैदानिक ​​स्ट्रोक अनुसंधान के लिए सरल और टीपीए उत्तरदायी thromboembolic मॉडलों में से एक की जरूरत है, साथ में ले ली।

थी प्रतिमान एक thromboembolic स्ट्रोक मॉडल के रूप में चार अद्वितीय फायदे हैं। सबसे पहले, थी अपमान ताकतेंअंतर्जात घटकों बहिर्जात रसायन या पूर्व गठित एम्बोली की मदद के बिना सीटू थ्रोम्बी में बनाने के लिए। इस प्रकार, थी मॉडल में thrombus गठन शारीरिक स्थितियों को और अधिक प्रासंगिक है। दूसरा, थी मॉडल तेजी से टीपीए उपचार के लिए अनुकूल प्रतिक्रिया करता है, लेकिन देरी नहीं इलाज के लिए (4 में मानव संसाधन) (0.5 और 1 घंटे बाद चोट पर)। यह चिकित्सकीय खिड़की स्ट्रोक रोगियों में मनाया उन लोगों के लिए समान है। इस प्रकार, थी मॉडल तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक में reperfusion की चिकित्सा में सुधार करने के उद्देश्य से अनुसंधान के लिए उपयोग किया जा सकता है। Intraluminal सीवन एमसीए रोड़ा मॉडल की तुलना में जब तीसरा, थी मॉडल में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं, सरल और सीधा कर रहे हैं। थी मॉडल में हाइपोक्सिया की अवधि भी चलाया हुआ है। इन विशेषताओं विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच में प्रक्रियात्मक बदलाव के लिए थी मॉडल कम संभावना है। अंत में, थी मॉडल है, जो थ्रंबोलाइसिस के बाद बड़ी धमनियों की recanalization के बावजूद अधूरा reperfusion के तंत्र में अंतर्दृष्टि डाला सकता हैस्ट्रोक चिकित्सा में एक अद्वितीय चुनौती हृदय इशेमिया 1,22 की तुलना में। इसलिए, थी मॉडल रक्तस्तम्भन 23 के मस्तिष्क संवहनी बिस्तर-विशिष्ट अनियंत्रण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अनूठी प्रणाली प्रदान करता है।

सभी प्रयोगात्मक मस्तिष्क की चोट मॉडल सीमाएं हैं, और थी मॉडल कोई अपवाद नहीं है। थी स्ट्रोक मॉडल के तीन प्रमुख तकनीकी बाधाओं प्रयोग में पहचान की गई है। सबसे पहले, अपमान मस्तिष्क तक ही सीमित है, जहां अन्य स्ट्रोक मॉडलों के विपरीत, हाइपोक्सिया और मन्या रोड़ा के संयोजन परिधीय वाहिकाप्रसरण और कार्डियक आउटपुट 12 के लिए अधिक से अधिक मांग की ओर जाता है। माउस म्यूटेशन या थी अपमान के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों के प्रभाव की तुलना इस प्रकार, जब हृदय कार्यों पर उनके प्रभाव को भी ध्यान से तुलना की जाएगी। दूसरा, हम अलग माउस जन्मजात उपभेदों के कारण पीछे commun करने के असमान प्रत्यक्षता के लिए जो हो सकता है, थी मॉडल के लिए चर प्रतिक्रियाओं में पाया गया किicating धमनी 24, भिन्न हृदय कार्य, या दोनों के संयोजन। इसलिए, यह दो प्रयोगात्मक समूहों के बीच लिंग, उम्र, शरीर के वजन, और माउस उपभेदों neuroprotection पढ़ाई में बराबर हो सिफारिश की है। अंत में, थी स्ट्रोक एक हल्के anesthetized शर्त के तहत hypoxic गैस में सांस लेने के लिए जानवरों पर निर्भर करता है। स्ट्रोक परिणामों पर संज्ञाहरण के प्रभाव को कम से कम और जानवरों के बीच लगातार रखा जाना चाहिए। बहरहाल, जब तक शोधकर्ताओं ने इन तकनीकी जानकारी के सतर्क हैं और पशुओं के लिए जानवरों से कम चर के रूप में, थी स्ट्रोक मॉडल जल्दी से मस्तिष्क रोधगलन के उच्च स्थिरता उपज के लिए स्थापित किया जा सकता है।

सारांश में, थी एक नैदानिक ​​प्रासंगिक अस्थायी खिड़की में वास्तविक दुनिया थेरेपी (टीपीए थ्रंबोलाइसिस) के लिए अनुकूल प्रतिक्रिया करता है कि एक सरल और मानकीकृत स्ट्रोक मॉडल है। इस नए मॉडल को क्लिनिक पूर्व स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त है, और तीव्र इस्कीमिक में थ्रंबोलाइसिस चिकित्सा में सुधार करने में मदद कर सकता हैस्ट्रोक।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

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References

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