Een Trombotische Stroke model op basis van Transient Cerebrale hypoxie-ischemie

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stroke onderzoek heeft vele tegenslagen doorstaan ​​in het vertalen van neuroprotectieve therapieën in de klinische praktijk. In tegenstelling, de echte therapie (tPA trombolyse) produceert nauwelijks voordelen mechanische occlusie gebaseerde experimentele modellen die preklinisch onderzoek beroerte domineren. Deze splitsing tussen de bank en bed suggereert de noodzaak om tPA-responsieve modellen in dienst in preklinische beroerte onderzoek. Hiertoe wordt een eenvoudige en tPA-reactieve trombotische slagmodel uitgevonden en hierin beschreven. Dit model bestaat uit transiënte occlusie van de eenzijdige halsslagader en levering van 7,5% zuurstof via een gezichtsmasker bij volwassen muizen gedurende 30 min, terwijl de rectale temperatuur dier op 37,5 ± 0,5 ° C. Hoewel reversibele ligatie van de eenzijdige halsslagader of hypoxie elke onderdrukte hersenbloedstroom alleen transiënt, de combinatie van beide beledigingen heeft langdurige reperfusie stoornissen, fibrine en bloedplaatjes afzetting en grote infarct in het midden cerebrale slagader geleverd grondgebied. Belangrijk-staartader injectie van recombinant tPA op 0,5, 1, of 4 uur na Thi (10 mg / kg) die tijdsafhankelijke vermindering van de sterfte en de infarctgrootte. Dit nieuwe slagmodel is eenvoudig en kan worden gestandaardiseerd laboratoria experimentele resultaten te vergelijken. Verder induceert trombose zonder craniectomy of invoering voorgevormde embolie. Gezien deze unieke verdiensten, de THI-model is een nuttige aanvulling op het repertoire van preklinisch beroerte onderzoek.

Introduction

Trombolyse recanalization is de meest effectieve behandeling van acute ischemische beroerte in de klinische praktijk 1. Maar de meeste preklinische neuroprotectie onderzoek werd uitgevoerd in een tijdelijke mechanische obstructie model (intraluminale hechtdraad middelste cerebrale arterie occlusie) dat snelle herstel van de cerebrale bloedstroom bij verwijdering van de vasculaire occlusie produceert en vertoont weinig of geen voordelen met tPA trombolyse. Er is gesuggereerd dat de twijfelachtige keuze takt modellen droegen, ten minste gedeeltelijk, de moeilijkheid bij het ​​vertalen neuroprotectieve therapie bij patiënten 2,3. Daarom is er een toenemende roep om het gebruik van tPA-responsieve trombo-embolische beroerte modellen in preklinisch onderzoek, maar dergelijke modellen hebben ook technische problemen (zie Discussie) 4-7. Hier beschrijven we een nieuw trombotische beroerte model gebaseerd op eenzijdige voorbijgaande hypoxie-ischemie (THI) belediging en haar antwoorden op intraveneuze tPA therapie 8.

De THI beroerte model werd ontwikkeld op basis van de Levine procedure (permanente ligatie van de eenzijdige gemeenschappelijke halsslagader, gevolgd door blootstelling aan voorbijgaande hypoxie in een kamer), die werd uitgevonden voor experimenten met volwassen ratten in 1960 9. De oorspronkelijke Levine procedure vervaagde in de vergetelheid, omdat alleen produceerde variabele hersenschade, maar dezelfde insult veroorzaakt consistente neuropathologie knaagdieren pups toen het werd opnieuw geïntroduceerd door Robert Vannucci en zijn collega's als een model van neonatale hypoxisch-ischemische encefalopathie (HIE) in 1981 10. In de afgelopen jaren zijn sommige onderzoekers opnieuw aangepast de Levine-Vannucci model volwassen muizen door het aanpassen van de temperatuur van de hypoxische kamer 11. Het is aannemelijk dat de inconsistente hersenletsels in het oorspronkelijke Levine kunnen opkomen van wisselende lichaamstemperaturen van volwassen knaagdieren in de hypoxische kamer. Om deze hypothese te testen, hebben we de Levine procedure gewijzigd door het toedienen van hypoxische gasvia een gezichtsmasker, terwijl de knaagdieren kerntemperatuur bij 37 ° C op de operatietafel 12. Zoals verwacht stringente lichaamstemperatuur sterk toegenomen reproduceerbaarheid van HI-geïnduceerde hersenpathologie. De HI belediging triggers ook coagulatie, autofagie en grijs- en witte stof letsel 13. Andere onderzoekers hebben ook gebruik van de HI model om na een beroerte ontstekingsreacties 14 onderzoeken.

Een uniek kenmerk van de HI slagmodel is dat volgt de Virchow triade van trombusvorming, waaronder de stasis van de bloedstroom, endotheliale schade (bijvoorbeeld door HI-geïnduceerde oxidatieve stress) en hypercoagulabiliteit (HI-geïnduceerde bloedplaatjesactivering) ( Figuur 1A) 15. Als zodanig kan de HI model sommige pathofysiologische mechanismen om real-world herseninfarct relevant vast te leggen. Met dit idee in het achterhoofd, hebben we verder verfijnd de HI model met omkeerbare ligatie van de VNilateral carotis communis (dus een voorbijgaande HI insult te maken), en getest zijn reacties op tPA trombolyse met of zonder Edaravone. Edaravone is een vrije radicalen die al in Japan goedgekeurd voor ischemische beroerte binnen 24 uur na het begin 9 behandelen. Onze experimenten toonden aan dat zo kort 30 min voorbijgaande HI triggers trombotische infarct, en dat gecombineerd tPA-Edaravone behandeling verleent synergetische 8 voordelen. Hier beschrijven we gedetailleerde chirurgische procedures en methodologische overwegingen van het THI-model, dat gebruikt kan worden om reperfusie behandeling van acute ischemische beroerte optimaliseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol wordt goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Emory University en volgt de National Institutes of Health Leidraad voor Zorg en gebruik van proefdieren.

1. Setup

  1. Bereid de chirurgische bed verwarmingskussen verbonden met warmtepomp bij 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten voor de operatie. Plaats een nek roll met het vat van 3 ml spuit op de chirurgische bed. Bereid de verdoving gas met 2% isofluraan in de medische lucht.
  2. Bereid geautoclaveerd pincet, schaar, micro naald houders, hemostat, wattenstaafjes en hechtingen. Bereid weefsel lijm en oogzalf.
  3. Stel de hypoxie-systeem en temperatuurregelaars met warmtelamp en rectale sonde. Bereid hypoxie gas met 2% isofluraan in 7,5% O 2 evenwicht met 92,5% N 2.
  4. Een uur voor de operatie worden muizen analgesized door subcutane injectie van een langzame-afgifte Meloxicam (4,0 mg / kg).
<p class = "jove_title"> 2. Voorbijgaande cerebrale hypoxie-ischemie (Figuur 1B)

  1. Verdoven 10-13 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen met een gewicht van 22-30 g in de anesthesie inductie kamer met 3% isofluraan totdat het dier niet reageert op de voet knijpen, en verwijder het haar op rechts nek met behulp van een elektronische scheerapparaat.
  2. Plaats muizen op de chirurgische bed verbonden met 2% isofluraan in medische lucht stroomsnelheid van 2 l / min. Secure voorpoten uitgestrekt langs de hals roll aan de zijkanten met behulp van medische tape.
  3. Reinig de chirurgische site voor incisie met betadine, gevolgd door alcohol en vervolgens wattenstaafjes.
  4. Onder dissectiemicroscoop, maken een 0,5 cm rechter cervicale incisie met behulp van een rechte tang en een micro schaar ongeveer 0,2 cm lateraal van de middellijn huid.
  5. Gebruik een paar fijne getande tang om uit elkaar trekken van de fascia en weefsel om de juiste gemeenschappelijke halsslagader (RCCA) bloot te leggen. Zorgvuldig scheiden de RCCA van de nervus vagus met een paar fijne gladde tang.
  6. Levende knoop twee voorgesneden 5-0 zijden hechtdraad (vrijgeefbare) op de RCCA, en naai de huid met behulp van 4-0 nylon monofilament hechtdraad (figuur 1C).
  7. Breng oogzalf beide ogen tot droog voorkomen.
  8. Snel overdracht van de muizen aan hypoxie-systeem en zet de neus en mond in het gezicht-masker met 2% isofluraan in 7,5% O 2 bij stroomsnelheid van 0,5-1 L / min gedurende 30 min.
    1. Tijdens hypoxie, gebruiken temperatuurregelaars met verwarming lampen om de rectale temperatuur regelen op 37,5 ± 0,5 ° C. Bewaken van de ademhaling bij 80-120 ademhalingen / min. Het onderhoud van de lichaamstemperatuur boven 37 ° C tijdens de hypoxie belangrijk is dat de herseninfarct maken. Lage ademhalingsfrequentie gebeurt meestal na 20 min hypoxie. Verwijder de face-masker en laat normale luchttoevoer als de ademhaling lager is dan 40. Dit duurt 1-2 minuten en telt niet mee in de 30 min hypoxie duur.
  9. Na hypoxie, overdragenmuizen om een ​​chirurgische bed en laat de twee hechtingen uit RCCA. Sluit de wond met behulp weefsellijm, en muizen terug naar de kooi. Uitsluiten de dieren als zowel van twee live knopen worden onverwacht vrijgelaten na hypoxie.
  10. Controleer de muizen gedurende 5-10 minuten om te herstellen van hypoxie en anesthesie. Leg de natte voedsel in de kooi en terug te sturen naar dier zorginstelling.
    Opmerking: Dieren die milde tot ernstige cirkelen gedrag op 24 uur na Thi zijn gecorreleerd met de hersenen overtreding. De meeste dieren met epileptische symptomen sterven voordat de 24 uur na het tijdstip THI.

3. Laser Speckle Contrast Imaging

Noot: Hoewel dit geen essentiële werkzaamheden van het THI-model kan een tweedimensionaal laser speckle contrast beeldvormingssysteem 16 worden gebruikt om de veranderingen van de cerebrale bloedstroom (CBF) karakteriseren tijdens of na transiënte hypoxie-ischemie. Om de wijzigingen van de CBF onmiddellijk document onder Thi, record na de step 2.6. Alternatief CBF herstel vergelijken na Thi insult Deze procedures kunnen worden uitgevoerd na de stap 2.10.

  1. Een verdoofde muis in buikligging en uitvoeren van een 1 cm lange middellijn incisie op de hoofdhuid met de schedel bloot maar ongeopend.
  2. Monitor CBF in beide hersenhelften onder een bloedtoevoer imager volgens het protocol van de fabrikant en beginnen met het opnemen van de bloedtoevoer naar de hersenen direct na de CCAO chirurgie (stap 2.6). Doorgaan voor 50 min.
  3. Weergeven CBF afbeelding met arbitraire eenheden in een 16-kleurenpalet en analyseren real-time de geselecteerde gebieden met de MoorFLPI software instructies van de fabrikant (figuur 2).
  4. Na het opnemen van de CBF, sluit de hoofdhuid met weefsellijm en terug te keren het dier naar de kooi.

4. tPA Administration

  1. Injecteer dieren in de staartader met het oplosmiddel of 10 mg / kg recombinant tPA (220-300 &# 956, l van 1 mg / m tPA) en 0,5, 1 of 4 uur na tCCAo plus hypoxia (figuur 4).

5. Brain Damage Detection met verschillende opties

Opmerking: Om de hersenen monsters verzamelen, euthanaseren de muizen op 1, 4 of 24 uur na THI.

  1. Voer kwantificering van infarctvolume door in vivo 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride methode (TTC) bij 24 uur na Thi belediging als eerdere beschreven. 17
    1. Intraperitoneaal injecteren van dieren met 1,4 M mannitol oplossing (~ 0,1 ml / g lichaamsgewicht) 30 minuten vóór transcardial perfusie. Transcardial perfuseren muizen met PBS, gevolgd door 10 ml 2% TTC.
    2. Verwijder de hersenen van dieren met chirurgische instrumenten na 10 minuten en plaats in 4% paraformaldehyde voor bevestiging nachts en in sectie 1 mm dik met een vibratoom.
    3. Snap een serie van vier doorsnede hersenen dia's door digitale microscoop en quantify het infarctvolume als de verhouding van het infarctgebied (wit gebied rechts) op het gebied van de onbeschadigde, contralaterale hemisfeer met de ImageJ software.
  2. Ook het uitvoeren van trombose vorming door immunofluorescentie op 1 uur na Thi belediging.
    1. Bevries de vaste hersenen in oktober verbinding en deel de hersenen bij 12 micrometer dikte met behulp van een cryostaat.
    2. Incubeer de hersenen dia met konijnen anti-fibrinogeen-antilichaam (1: 100) gevolgd door geit anti-konijn Alexa Fluor 488 kleurstof (1: 200) om de fluorescentie mbt een fluorescentiemicroscoop.
  3. Als alternatief voeren vaartuig obstructie door staartader injectie van 100 ul 2% Evans blauwe kleurstof bij 4 uur na THI belediging.
    1. Euthanaseren de muizen en snel snijden het hoofd naar de hersenen te verwijderen in 4% paraformaldehyde na Evans blauw injectie. Opmerking: Het duurt 5-10 minuten voor Evans blauwe circulatie met blauwe kleur van zowel de voor- en achterpoten.
    2. Sectiop vaste hersenen bij 100 micrometer dikte met behulp van een sledemicrotoom en observeer de fluorescentie met een emissie filter 680 nm op een fluorescentiemicroscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tweedimensionaal laser speckle contrast imaging (LSCI) 16 werd toegepast om de veranderingen van de cerebrale bloedstroom (CBF) vergelijken door 30 min transient eenzijdige carotis occlusie (tCCAO), 30 min blootstelling aan hypoxie (7,5% zuurstof) en 30 min eenzijdige carotis ligatie onder hypoxie (THI). Dit experiment toonde dat tCCAO onder normoxie onderdrukte de CBF de carotide geligeerd halfrond ~ 50% boven de basislijn, die snel hersteld tot boven 85% na de vrijgave van de carotis occlusie (R in figuur 2A). Blootstelling aan systemische hypoxie alleen de CBF verminderd tot ongeveer 75% boven de basislijn, die tijdelijk zal toenemen tot ~ 130% na terugkeer in normoxische atmosfeer (Figuur 2B). In tegenstelling carotis ligatie onder hypoxie (THI) snel verminderd CBF in de ipsilaterale hemisfeer tot minder dan 20% van de uitgangswaarde ongeveer 10 min, die zelden hersteld tot boven 30% bij 20 minuten na afgifte van de carotis ligation en terugkeren naar normoxia. CBF op de contralaterale hemisfeer (L), echter schommelde tussen 20 en 50% tijdens hypoxie, en snel terug naar boven 80% na Thi insult (figuur 2C).

Op 24 uur na tCCAo (30 min) of tCCAO plus 30 min hypoxie (THI), werd in vivo TTC kleuring gebruikt infarct 17 detecteren. Deze analyse toonde geen duidelijke verwondingen door de tCCAO belediging, maar aanzienlijke infarct in het midden cerebrale slagader geleverd grondgebied volgende Thi belediging (figuur 3A). Anti-fibrine (fibrinogeen) immunokleuring werd gebruikt om de tCCAO- en THI-verwonde brein vergeleken en 1 uur herstel en toonde brede afzetting van fibrine (fibrinogeen), een indicator van trombose, in het THI-verwonde, maar niet-betwiste tCCAO muis hersenen (Figuur 3B, C). Staart-ader injectie van Evans blauwe kleurstof werd ook gebruikt om vasculaire perfusie van tCCAO- en THI-verwonde hersenen te vergelijken op 4 uur herstel. Deze analyse toonde vermindered cerebrale perfusie en intensieve extravasatie van Evans blauwe kleurstof in THI-verwonde, maar niet de tCCAO uitgedaagd muizenhersenen (figuur 3D, E).

Tenslotte, de resultaten van Thi insult bij muizen die-staartader injectie van drager (0,5 uur herstel) of recombinant humaan tPA (Activase, 10 mg / kg, 0,5, 1 of 4 uur na thi) werden vergeleken met behulp van vivo TTC vlek op 24 uur herstel (Figuur 4A). In de met drager behandelde muizen, het sterftecijfer van 24 uur na thi was 23,8% en slechts één in 21 THI-verwonde muizen was dan het gemiddelde en 2 SD (het outlier). De 24 uur sterftecijfer bij muizen die tPA behandeling op 0,5 uur herstel gedaald tot 8,3%, maar dit effect was verloren toen tPA werd toegediend op 1 of 4 uur na de Thi belediging (Figuur 4B). Figuur 4C uitgezet het infarct grootte van alle overleefden muizen in de vier behandelingsgroepen. Van de nota, zowel de 0,5 en 1 uur tPA-administratie significantly verminderde infarctgrootte in vergelijking met dragerbehandeling. De 0,5 h tPA-behandelingsgroep vertoonden een significant verkleind infarct dan 4 uur tPA-behandelingsgroep. Figuur 4D toonde representatieve TTC-kleuring resultaten na elke behandeling.

Figuur 1
Figuur 1:. Procedure van voorbijgaande cerebrale hypoxie-ischemie (thi) insult bij volwassen muizen (A) de Virchow triade die trombose voortbeweegt omvat stasis van de bloedstroom, endotheelschade en hypercoagulability van het bloed. (B) Een schema van de THI beroerte procedure. Twee losmaakbare knopen werden gebonden op de rechter carotis communis (CCA), gevolgd door levering van 7,5% zuurstof via een neuskegel gedurende 30 min, terwijl de muizen rectale temperatuur werd op 37-38 ° C. Na het transseerde systemische hypoxie, werd de CCA ligatie vrijgemaakt door verwijderen van een uiteinde van de losmaakbare hechting knopen. MCA, midden cerebrale slagader; ICA, interne halsslagader; ECA, externe halsslagader; CCA gemeenschappelijke halsslagader. (C) Chirurgische procedures voor transiënte juiste CCA occlusie. 1. Twee voorgesneden hechtdraad (# 1 en # 2) werden onder een geïsoleerde recht CAA geplaatst. 2. Twee losmaakbare knopen gemaakt. 3. De incisie lijn werd afgesloten door hechtdraad # 3. Zorg ervoor dat de uiteinden van de hechtdraad # 1 en # 2 waren aanspreekbaar buiten de incisie lijn. 4. Trek voorzichtig hechtdraad # 1 en # 2 van buiten naar de CCA los. Bij voorzichtig uitgevoerd, zal deze procedure niet scheuren van de CCA veroorzaken.

Figuur 2
Figuur 2:. Analyse van de cerebrale doorbloeding veranderingen tijdens en na Thi insult A tweedimensionale laser speckle contrast beeldvorming (LSCI) werd gebruikt om cerebrale bloedstroming (CBF) te evalueren. R (rechts) geeft de halsslagader afgebonden halfrond; L (links) is de contralaterale hemisfeer. (A) tCCAO onder normoxie onderdrukt CBF tot ~ 50% van de uitgangswaarde van de carotide-geligeerde hemisfeer (R) gedurende ten minste 30 min, die binnen 3 minuten na loslaten van de carotis ligatie hersteld tot boven 85%. (B) In hypoxia (7,5% zuurstof, 30 min) zonder halsslagader ligatie CBF daalde tot 76% boven de basislijn en voorbijgaand herstelde tot ongeveer 130% na terugkeer tot normoxia. (C) In transient carotis ligatie onder hypoxie (thi, 30 min), CBF op de carotide geligeerd (R) hemisfeer snel daalde tot minder dan 20% boven de basislijn, en zelden hersteld tot boven 30% na loslaten van de carotis ligatie en terugkeren naar normoxia. Daarentegen CBF op de contralaterale (L) hemisfeer varieerde van 20-50% tijdens hypoxie, en snel terug naar> 80% van de basislijnwaarde na de vrijgave van carotis ligatie en terugkeren naar normoxia. Getoond zijn representatief CBF traces voor n> 4 in elke groep. De tijd-punten voor representatieve LSCI foto's werden gekenmerkt door grijze lijnen in de vertegenwoordiger tracing.

Figuur 3
Figuur 3: herseninfarct, spontane trombose en vatobstructie na Thi insult (A) In vivo TTC-kleuring vertoonde geen zichtbare infarct op 24 uur na 30 minuten kortstondige ligatie van de rechter carotis communis (tCCAO), maar de toevoeging van. 30 min hypoxie (7,5% zuurstof) te tCCAO geproduceerde aanzienlijke infarct in de ipsilaterale hemisfeer (asterisk), meestal in de middelste cerebrale slagader area. (B, C) ​​Anti-fibrine (fibrinogeen) immunokleuring op 1 uur na het insult Thi toonden wijdverbreid afzettingen in deipsilaterale hemisfeer. Daarentegen was er geen fibrine (fibrinogeen) tegoeden bij 1 uur na tCCAo (30 min) insult (n> 4 voor elk). (D, E) cerebrale perfusie werd geëvalueerd door-injectie in de staartader van Evans Blue-kleurstof op 4 uur na tCCAO (30 min) of Thi (30 min) insult. Bij post-tCCAO hersenen, Evans Blue kleurstof gevuld meeste van de bloedvaten in de ipsilaterale hemisfeer. In tegenstelling, in post-Thi hersenen, Evan Blue kleurstof gevuld minder bloedvaten en werd gelekt in het parenchym (n> 3). Schaal bar: 250 pm.

Figuur 4
Figuur 4: Effecten van tPA trombolyse in de Thi beroertemodel (A) Overzicht van experimenten om de effecten van intraveneuze tPA toediening (10 mg / kg) vergeleken en 0,5, 1, en ​​4 uur na de Thi insult.. (B) Samenvatting van het aantal geopereerde dieren, mortality binnen 24 uur na beledigingen, uitschieters (de infarctgrootte buiten het gemiddelde +/- 2 SD) en het aantal dieren ter vergelijking opgenomen van de infarctgrootte. (C) Kwantificering vertoonde een gemiddeld 32% infarctvolume in de dragergroep en significante vermindering van infarct in de 0,5 uur (tot 16%) en 1 uur (tot 20%) groepen (worden de gemiddelde en SEM voor elke groep). De p-waarden worden vastgesteld door t-test. (D) Vertegenwoordiger TTC-gekleurd hersenen van dieren die werden uitgedaagd door de THI belediging en ontvangen tPA behandeling in de aangegeven tijd-punt na een blessure. In TTC vlekken, levend weefsel toonde rode kleur; infarct weefsel was bleek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beroerte is een belangrijk gezondheidsprobleem van groeiende betekenis voor elke samenleving met een vergrijzende bevolking. Wereldwijd, een beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak met een geschatte 5,9 miljoen fatale gebeurtenissen in 2010, wat overeenkomt met 11,1% van alle sterfgevallen 18. Stroke is ook de derde belangrijke oorzaak van disability adjusted life years (DALY's) verloren wereldwijd in 2010, een stijging van de vijfde positie in 1990 19. Deze epidemiologische gegevens onderstrepen de noodzaak van meer effectieve therapieën van acute (ischemisch) beroerte. Echter, ondanks intensief onderzoek in preklinische neuroprotectieve behandeling, tPA-trombolyse blijft de enige specifieke behandeling van acute ischemische beroerte, dat is goedgekeurd door de Food and Drug Administration in de Verenigde Staten, terwijl tal keer veelbelovende neuroprotectieve agenten in dierstudies gefaald in klinische studies. De moeilijkheid in het vertalen van neuroprotectieve therapieën in patiënten heeft vele factoren, en de huidige nadruk ligt op goede laboratorium Practice, meta-analyse van veelvoudige datasets en internationale samenwerking om preklinisch beroerte onderzoek 20,21 verbeteren. Er is echter een minderheidsstandpunt suggereert dat de translationele moeilijkheid wordt veroorzaakt door een slechte keuze van mechanische vasculaire occlusie modellen (bijv intraluminale hechtdraad MCA occlusie) in de meeste preklinisch beroerte onderzoek tot op heden 2,3. Omdat mechanische vasculaire occlusie modellen zelden veroorzaken trombose en cerebrale reperfusie gebeurt te snel na de release van mechanische obstructie, deze modellen niet reageren op de real-woord therapie (tPA fibrinolyse), noch zorgen voor een smal therapeutisch venster zoals die bij patiënten met een beroerte. Bijgevolg is de voorgestelde remedie is om te benadrukken, ten minste bevatten, trombo-embolische beroerte modellen in preklinische beroerte onderzoek 3.

Deze aanbeveling heeft echter zijn beperkingen omdat de huidige trombo-embolische beroerte modellen (exogene embolie levering, MCA-injectie van thrombin en photothrombosis) hebben allemaal bepaalde technische 4 nadelen. Voor het exogene emboli model, intravasculaire infusie van emboli resulteert in aanzienlijke variabiliteit in infarctgrootte en locatie, alsmede onvoorspelbare reacties op tPA trombolyse door verschillen in stolsel preparaat 4,5. Directe injectie van trombine in de MCA branch vereist craniectomy en het nut voor het optimaliseren van de trombolytische therapie moet nog worden bewezen 4,6. Chemisch ingeleid trombo de systemische injectie van een fotogevoelige kleurstof (bijv Rose Bengal of erythrosine B) en bestraling door de blootgestelde schedel vaak veroorzaakt slechts bloedplaatjes aggregaten die niet reageren op Trombolyse 4,7. Samengevat bestaat er behoefte aan eenvoudigere en tPA-responsieve trombo preklinische modellen stroke onderzoek.

De THI paradigma heeft vier unieke voordelen als een trombo-embolische beroerte model. Ten eerste, de THI belediging hanteerdeendogene componenten vormen in situ trombi zonder hulp van exogene chemicaliën of voorgevormde embolieën. Zo trombusvorming in de THI-model is meer relevant om fysiologische omstandigheden. Ten tweede, de THI model reageert gunstig snelle tPA-behandeling (bij 0,5 en 1 uur na het letsel), maar niet vertraagde behandeling (at 4 uur). Dit therapeutisch venster is vergelijkbaar met die waargenomen bij patiënten met een beroerte. Aldus kan het THI-model worden gebruikt voor onderzoek gericht reperfusie therapie bij acute ischemische beroerte verbeteren. Ten derde, de chirurgische procedures in de Thi model zijn eenvoudig en duidelijk, in vergelijking met de intraluminale hechting MCA occlusie model. De duur van hypoxie in de Thi model is ook regelbaar. Deze eigenschappen maken het Thi model minder gevoelig voor procedurele verschillen tussen verschillende laboratoria. Tenslotte kan de THI model inzichten in de mechanismen van onvolledige reperfusie stal ondanks rekanalisatie van grote slagaders na trombolyse, wateen unieke uitdaging voor de patiënt therapie in vergelijking met hartischemie 1,22. Vandaar dat de THI model verschaft een uniek systeem om de mechanismen van de cerebrale vasculaire bed-specifieke ontregeling van hemostase 23 bestuderen.

Alle experimentele hersenletsel modellen hebben beperkingen, en de THI-model is geen uitzondering. Drie belangrijke technische beperkingen van de THI slagmodel zijn geïdentificeerd in het experiment. Ten eerste, in tegenstelling tot andere tweetaktmodellen waarbij het ​​insult is beperkt tot de hersenen, de combinatie van hypoxie en carotis occlusie leidt perifere vasodilatatie en een grotere vraag naar cardiale output 12. Dus, bij het vergelijken van de effecten van de muis mutaties of neurobeschermende middelen tegen de THI belediging, hun impact op het cardiovasculaire functies worden eveneens zorgvuldig vergeleken. Ten tweede vonden we dat verschillende muizenstammen inteelt stammen variabele reacties op de THI model, dat kan zijn wegens oneven openheid van het achterste communicating slagader 24, van verschillende hartfuncties, of een combinatie van beide. Daarom verdient het aanbeveling het geslacht, de leeftijd, het lichaamsgewicht en muizenstammen tussen twee experimentele groepen vergelijkbaar in neuroprotectie studies. Ten slotte is de THI slag vertrouwt op dieren om te ademen in de hypoxische gas onder een licht verdoofde toestand. De effecten van narcose op beroerte resultaten moeten worden geminimaliseerd en consistente tussen dieren gehouden. Niettemin, mits onderzoekers waakzaam deze technische gegevens en verminderen de variabelen van dieren dieren, de THI slagmodel snel worden vastgesteld om hoge consistentie van herseninfarct verkregen.

Samengevat, Thi is een eenvoudig en gestandaardiseerd slagmodel die positief reageert op de echte therapie (tPA trombolyse) in een klinisch relevante vensterfuncties. Dit nieuwe model is een waardevolle aanvulling op preklinisch beroerte onderzoek, en kan helpen om trombolyse therapie bij acute ischemische verbeterenberoerte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106, (12), 1563-1569 (2002).
  2. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47, (3), 213-227 (2009).
  3. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, (7), 1310-1316 (2012).
  4. Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164, (4), 1062-1078 (2011).
  5. Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34, (8), 2019-2024 (2003).
  6. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38, (10), 2771-2778 (2007).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66, (5), 748-754 (1987).
  8. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
  9. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
  10. Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9, (2), 131-141 (1981).
  11. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21, (2), 52-60 (2001).
  12. Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169, (2), 566-583 (2006).
  13. Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, (4), 1155-1169 (2011).
  14. Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34, (7), e1-e9 (2014).
  15. Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
  16. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40, (2), 367-377 (2012).
  17. Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203, (1), 122-129 (2012).
  18. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380, (9859), 2095-2128 (2010).
  19. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380, (9859), 2197-2223 (2012).
  20. Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157, (7), 1154-1156 (2009).
  21. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44, (6), 1754-1760 (2013).
  22. Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36, (11), 2400-2403 (2005).
  23. Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340, (20), 1555-1564 (1999).
  24. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, (11), 2707-2714 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics