En trombotisk stroke modell baserad på gående cerebral hypoxi-ischemi

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stroke forskning har uthärdat många motgångar i översätta neuroprotektiva terapier i klinisk praxis. Däremot verkliga terapi (tPA trombolys) ger sällan fördelar i mekaniska ocklusion baserade experimentella modeller, som dominerar preklinisk strokeforskning. Denna uppdelning mellan bänken och säng föreslår behovet av att anställa tPA-responsiva modeller i preklinisk strokeforskning. För detta ändamål är en enkel och tPA-reaktivt trombotisk stroke modell uppfunnits och beskrivs här. Denna modell består av övergående ocklusion av den ensidiga gemensamma halspulsådern och leverans av 7,5% syre genom en ansiktsmask i vuxna möss under 30 min, medan djuret rektaltemperatur upprätthölls vid 37,5 ± 0,5 ° C. Även reversibel ligering av den ensidiga halspulsådern eller hypoxi varje undertryckt cerebralt blodflöde endast övergående, en kombination av båda förolämpningar orsakat bestående reperfusion underskott, fibrin och avsättning av trombocyter, och stora INFARct i arteria cerebri media-supplied territorium. Viktigt är svans-ven injektion av rekombinant tPA vid 0,5, 1, eller 4 h efter Thi (10 mg / kg) gav tidsberoende minskning av dödligheten och infarktstorlek. Denna nya stroke Modellen är enkel och kan standardiseras över laboratorier för att jämföra experimentella resultat. Vidare inducerar det trombos utan craniectomy eller införa förformade emboli. Med tanke på dessa unika meriter, är thi modellen ett bra komplement till den repertoar av preklinisk strokeforskning.

Introduction

Trombolys och omkanalisering är den mest effektiva terapin av akut ischemisk stroke i klinisk praxis 1. Ändå var de flesta av preklinisk neuroprotektion forskning utförd i en övergående mekaniker hinder modell (intraluminal sutur mitten cerebral artärocklusion) som producerar snabb återhämtning av cerebralt blodflöde vid avlägsnande av vaskulär ocklusion och visar lite att några fördelar av tPA trombolys. Det har föreslagits att den tvivelaktiga valet av stroke modeller bidrog åtminstone delvis, till svårigheten att översätta neuroprotektiv terapi till patienter 2,3. Därför finns det ett ökande intresse för att anställa tPA-responsiva tromboemboliska stroke modeller inom preklinisk forskning, men sådana modeller har också tekniska problem (se diskussion) 4-7. Här beskriver vi en ny trombotisk stroke modell baserad på unilaterala gående hypoxisk-ischemisk (THI) förolämpning och dess svar på intravenös tPA behandling 8.

Thi stroke modell har utvecklats baserat på Levine förfarandet (permanent ligation av den ensidiga gemensamma halspulsådern, följt av exponering för övergående syrebrist i en kammare) som uppfanns för experiment med vuxna råttor 1960 9. Den ursprungliga Levine förfarande bleknat i glömska eftersom det bara producerade variabel hjärnskador, men samma förolämpning orsakade konsekvent neuropatologi i gnagare ungar när det återinfördes av Robert Vannucci och hans kollegor som en modell för neonatal hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE) 1981 10. Under de senaste åren, en del utredare åter anpassat Levine-Vannucci modell vuxna möss genom att justera temperaturen i hypoxisk kammaren 11. Det är troligt att de inkonsekventa hjärnskador i den ursprungliga Levine förfarandet kan uppstå från fluktuerande kroppstemperatur av vuxna gnagare i hypoxisk kammaren. För att testa denna hypotes, ändrade vi Levine förfarande genom att administrera hypoxisk gasgenom en ansiktsmask, medan gnagare kärntemperatur vid 37 ° C bibehållande på operationsbordet 12. Som väntat, stringent kroppstemperaturreglering ökade kraftigt reproducerbarheten för Hl-inducerad hjärn patologi. HI förolämpning utlöser också koagulering, autophagy och grå- och vita saken skada 13. Andra forskare har också använt Hl modell för att undersöka post-stroke inflammatoriska svar 14.

En unik egenskap hos HI stroke modellen är att den noga följer Virchow triad av blodproppsbildning, inklusive stasis av blodflödet, endotelskada (t.ex. på grund av HI-inducerad oxidativ stress), och hyperkoagulering (HI-inducerad trombocytaktivering) ( Figur 1A) 15. Som sådan, kan HI modellen fånga några patofysiologiska mekanismer som är relevanta för verkliga ischemisk stroke. Med denna idé i åtanke, ytterligare förfinat vi HI modell med reversibel ligering av FNilateral gemensamma halspulsådern (därför att skapa en övergående HI förolämpning), och testade sina svar till tPA trombolys med eller utan Edaravone. Edaravone är en fria radikaler som redan har godkänts i Japan för behandling av ischemisk stroke inom 24 timmar av starten 9. Våra experiment visade att så kort som 30 minuter övergående HI utlöser trombotisk infarkt, och som kombinerade tPA-Edaravone behandling ger synergieffekter 8. Här beskriver vi detaljerade kirurgiska ingrepp och metodologiska överväganden Thi modellen, som kan användas för att optimera reperfusion behandling av akut ischemisk stroke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) i Emory University och följer National Institutes of Health riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur.

1. Inställning

  1. Förbered kirurgiska säng på uppvärmningen pad samband med värmepump vid 37 ° C under minst 15 minuter före operationen. Placera en hals rulle med hjälp av fat 3 ml spruta på den kirurgiska sängen. Förbered anestesigas med 2% isofluran i medicinsk luft.
  2. Förbered autoklave pincett, sax, mikro nålhållare, hemostat, bomullspinnar och suturer. Förbered vävnadslim och ögonsalva.
  3. Ställ in hypoxi systemet och temperaturregulatorer med värmelampa och rektalsond. Förbered hypoxi gas med 2% isofluran i 7,5% O 2 viktad 92,5% N2.
  4. En timme före operation, möss analgesized genom subkutan injektion av en långsam frisättning Meloxikam (4,0 mg / kg).
<p class = "jove_title"> 2. Transitorisk cerebral Hypoxi-ischemi (Figur 1B)

  1. Söva 10-13 veckor gamla manliga C57BL / 6-möss som vägde 22 till 30 g i anestesi induktion kammare med 3% isofluran tills djuret inte svarar på fot squeeze, och sedan ta bort hår på höger halsen med hjälp av en elektronisk rakapparat.
  2. Placera möss på den kirurgiska sängen ansluten med 2% isofluran i medicinsk luft vid en flödeshastighet av 2 l / min. Säker framben sträckte ut längs halsen rulle på sidor med medicinsk tejp.
  3. Rengör operationsområdet för snittet med Betadine följt av alkohol och sedan bomullspinnar.
  4. Enligt dissekera mikroskop, göra en 0,5 cm höger livmoderhalscancer snitt med en rak pincett och en mikro sax ca 0,2 cm i sidled från mittlinjen huden.
  5. Använd ett par fina tandade pincett för att dra isär fascia och vävnaden för att exponera rätt gemensamma halspulsådern (RCCA). Försiktigt separera RCCA från vagusnerven med användning av ett par fina släta pincett.
  6. Live knut två färdigskurna 5-0 siden sutur (löstagbar) på RCCA, och sedan sy upp huden med 4-0 Nylon monofilamentsutur (Figur 1C).
  7. Applicera ögonsalva på båda ögonen för att förhindra torrhet.
  8. Snabbt överföra mössen för hypoxi systemet och sätta näsa och mun i ansiktsmasken med 2% isofluran i 7,5% O 2 vid en flödeshastighet av 0,5-1 l / min under 30 min.
    1. Under hypoxi, använd temperaturregulatorer med värmelampor att styra den rektala temperaturen vid 37,5 ± 0,5 ° C. Övervaka andningsfrekvens på 80-120 andetag / min. Upprätthållandet av kroppstemperaturen över 37 ° C under hypoxi är viktigt att skapa en konsekvent hjärninfarkt. Låg andningsfrekvens inträffar oftast efter 20 min hypoxi. Ta bort ansiktsmasken och tillåta normal lufttillförsel om andningsfrekvensen sjunker under till 40. Detta tar 1-2 minuter och räknas inte in i 30 min hypoxi varaktighet.
  9. Efter hypoxi, överföramöss till ett kirurgiskt säng och släpp de två suturer från RCCA. Stäng såret med hjälp av vävnadslim, och sedan återvända möss till buren. Uteslut djuren om både två levande knutar oväntat släpptes efter hypoxi.
  10. Övervaka möss för 5-10 minuter att återhämta sig från hypoxi och anestesi. Placera det fuktade mat i buren och returnera den till djurvård anläggningen.
    Obs: Djur som uppvisar mild till svår cirklande beteende vid 24 timmar efter Thi är korrelerade med hjärnan överträdelse. De flesta djur med krampsymtom dör före 24 tim tidpunkt efter Thi.

3. laser Speckle Contrast Imaging

Obs: Även om detta inte är ett viktigt förfarande för Thi modellen, kan en tvådimensionell laser speckle kontrast avbildningssystemet 16 användas för att karakterisera förändringar i cerebralt blodflöde (CBF) under eller efter gående hypoxi-ischemi. Att dokumentera förändringar av CBF enligt Thi, spela in omedelbart efter step 2.6. Alternativt, att jämföra CBF återhämtning efter Thi förolämpning, dessa förfaranden kan utföras genom att följa steg 2.10.

  1. Placera en sövd mus i liggande läge och utför en 1 cm lång mittlinjen snitt i hårbotten med skallen exponerade men oöppnad.
  2. Övervaka CBF i båda hjärnhalvorna under ett blodflöde avbildare enligt tillverkarens protokoll och börja spela in det cerebrala blodflödet omedelbart efter CCAO operationen (steg 2,6). Fortsätt i 50 min.
  3. Visa CBF bild med godtyckliga enheter i en palett 16 färger och analysera i realtid de valda områdena med hjälp av MoorFLPI programvaran enligt tillverkarens instruktioner (Figur 2).
  4. Efter registrering av CBF bilden, stäng hårbotten med vävnadslim och tillbaka djuret till buren.

4. tPA-administration

  1. Injicera djur vid svansvenen med lösningsmedlet eller 10 mg / kg rekombinant tPA (220-300 &# 956, l av 1 mg / m tPA) vid 0,5, 1, eller 4 h efter tCCAo plus hypoxi (Figur 4).

5. Brain Damage Detection med flera olika alternativ

Obs! För att samla hjärnprover, euthanize möss vid 1, 4 eller 24 timmar efter Thi.

  1. Utför kvantifiering av infarktvolymen med in vivo 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid metoden vid 24 timmar (TTC) efter Thi förolämpning som tidigare beskrivits. 17
    1. Intraperitonealt injicera djur med 1,4 M mannitol lösning (~ 0,1 ml / g kroppsvikt) 30 min före transcardial perfusion. Transcardial perfundera möss med PBS följt av 10 ml av 2% TTC.
    2. Ta bort hjärnan hos djur med kirurgiska instrument efter 10 minuter och placera i 4% paraformaldehyd för fixering över natten och avsnitt i 1 mm tjocklek med en vibratome.
    3. Fäst en serie av fyra sektionerade hjärn glider genom digital mikroskop och quantcera den infarktvolymen som förhållandet av infarktområdet (vita området i den högra sidan) till området för den oskadade, kontralaterala hemisfären med användning ImageJ programvara.
  2. Alternativt, utföra trombosbildning genom immunofluorescens vid 1 timme efter Thi förolämpning.
    1. Frys fast hjärnan i OCT-förening och avsnitt hjärnorna på 12 um tjocklek med hjälp av en kryostat.
    2. Inkubera hjärnan sliden med kanin-anti-fibrinogen-antikropp (1: 100) följt av get-anti-kanin-Alexa Fluro 488 färgämne (1: 200) för att observera fluorescens på ett fluorescensmikroskop.
  3. Alternativt, utföra fartyg obstruktion från svansvenen injektion av 100 ^ 2% Evans blått färgämne vid 4 timmar efter Thi förolämpning.
    1. Euthanize mössen och snabbt skära huvudet för att avlägsna hjärnor i 4% paraformaldehyd efter Evans blå injektion. Obs: Det tar 5-10 minuter för Evans blå omsättning med blå färg på både fram- och bakbenen.
    2. Avspå fasta hjärnor på 100 ìm tjocklek med hjälp av en glidande mikrotom och observera fluorescens med hjälp av en 680 nm emissionsfilter på ett fluorescensmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Två-dimensionell laser specklekontrasten imaging (LSCI) 16 användes för att jämföra de förändringar av cerebralt blodflöde (CBF) med 30 minuter övergående ensidiga karotidocklusion (tCCAO), 30 min exponering för hypoxi (7,5% syre), och 30 min ensidiga hals ligatur enligt hypoxi (THI). Detta experiment visade att tCCAO enligt normoxi tryckte CBF på halspulsådern ligerades halvklotet till ~ 50% av utgångsvärdet, som snabbt återhämtat sig till över 85% efter frisättning av karotidocklusion (R i figur 2A). Exponering för systemisk hypoxi ensam reducerade CBF till cirka 75% av utgångsvärdet, vilket tillfälligt öka till ~ 130% efter återkomsten till den normoxisk atmosfären (Figur 2B). I motsats karotid ligering enligt hypoxi (THI) minskas snabbt CBF i den ipsilaterala hemisfären till mindre än 20% av baslinjevärdet ca 10 min, vilket sällan återhämtat sig till över 30% vid 20 min efter frigöring av den karotiska ligation och återvänder till normoxi. CBF på den kontralaterala hemisfären (L), men varierade mellan 20 och 50% under hypoxi, och snabbt återvände till över 80% efter den Thi insult (figur 2C).

Vid 24 h efter tCCAo (30 min) eller tCCAO plus 30 min hypoxi (THI), var in vivo TTC fläck används för att detektera infarkt 17. Denna analys visade ingen uppenbar skada av tCCAO förolämpning, men betydande infarkt i arteria cerebri media-supplied territorium efter Thi insult (figur 3A). Anti-fibrin (ogen) immunofärgning användes för att jämföra de tCCAO- och THI-skadade hjärnor vid en timme återhämtning och visade utbredd avsättning av fibrin (ogen), en indikator för trombos, i THI-skadade, men inte tCCAO-utmanade mus hjärnor (Figur 3B, C). Svans-ven injektion av Evans blå färgämne användes också för att jämföra vaskulär perfusion av tCCAO- och THI-skadade hjärnor vid 4 h återhämtning. Denna analys visade diminished cerebral perfusion och intensiv extravasation av Evans blå färgämne i THI-skadade, men inte de tCCAO-utmanade mushjärnor (figur 3D, E).

Slutligen, resultatet av THI insult i möss som fick svans-ven injektion av vehikel (vid 0,5 h återhämtning) eller rekombinant humant tPA (Activase, 10 mg / kg, vid 0,5, 1, eller 4 timmar efter THI) jämfördes med användning i vivo TTC fläck vid 24 h återhämtning (Figur 4A). I vehikelbehandlade möss, dödligheten vid 24 timmar efter Thi var 23,8% och endast en i 21 thi skadade möss var bortom medelvärdet och 2 SD (utliggaren). Den 24 timmar dödligheten hos möss som erhöll tPA-behandling vid 0,5 h återhämtning sjönk till 8,3%, men denna effekt förlorades när tPA administrerades vid en eller 4 timmar efter THI insult (figur 4B). Figur 4C plottas infarktstorleken av alla levde möss i de fyra behandlingsgrupperna. Notera både 0,5 och 1 timme tPA administrering significantly reducerad infarktstorlek, när jämfört med behandling vehikel. Den 0,5 h tPA-behandlingsgruppen visade också en signifikant minskad infarktstorlek än 4 timmar tPA-behandlingsgruppen. Figur 4D visade representativa TTC-fläcken resultat efter varje behandling.

Figur 1
Figur 1:. Ordningen för gående cerebral hypoxi-ischemi (THI) förolämpning i vuxna möss (A) Virchow triad som driver trombos innefattar stås av blodflödet, endotelskada, och hyperkoagulerbarhet i blod. (B) Ett schema över Thi stroke förfarandet. Två lösgörbara knutar bands på den högra gemensamma halsartären (CCA), och följs av tillförsel av 7,5% syre via en noskon under 30 min, medan musen rektala temperaturen hölls vid 37-38 ° C. Efter transient systemisk hypoxi, var CCA ligering frigöras genom att dra ut ena änden av det utlösningsbara sutur knop. MCA, mellersta hjärnartären; ICA, inre halspulsådern, ECA, yttre halspulsådern, CCA, gemensamma halsartären. (C) Kirurgiska ingrepp för övergående höger CCA ocklusion. 1. Två färdigskurna sutur (# 1 och # 2) placerades under en isolerad rätt CAA. 2. Två löstagbara knop gjordes. 3. Snittet linjen stängdes av sutur # 3. Se till att ändarna av sutur # 1 och # 2 var tillgänglig utanför snittet linjen. 4. Dra försiktigt sutur # 1 och # 2 från utsidan för att frigöra CCA. När utförs försiktigt, kommer detta förfarande inte orsaka laceration av CCA.

Figur 2
LS Analys av cerebrala blodflödesförändringar under och efter Thi förolämpning En tvådimensionell laser speckle kontrast imaging (: Figur 2.Cl) system användes för att utvärdera cerebralt blodflöde (CBF). R (höger) indikerar carotis-ligerade hemisfären; L (vänster) är den kontralaterala hemisfären. (A) tCCAO enligt normoxi tryckt CBF till ~ 50% av utgångsvärdet på halspulsådern-ligerade hemisfären (R) under minst 30 minuter, som återhämtat sig till över 85% inom 3 minuter vid frigöring av halsligation. (B) I hypoxi (7,5% syre, 30 min) utan halspulsådern ligation, minskade CBF till 76% av utgångsvärdet och tillfälligt återhämtade sig till cirka 130% efter återkomsten till normoxi. (C) I övergående halsligation enligt hypoxi (thi, 30 min), CBF på halspulsådern-ligeras (R) hemisfären snabbt sjunkit till mindre än 20% av baslinjevärdet och det sällan återhämtat sig till över 30% vid frigöring av hals ligering och återvänder till normoxi. Däremot CBF på den kontralaterala (L) hemisfären fluktuerade mellan 20-50% under hypoxi, och snabbt återvände till> 80% av baslinjenvärde efter frigörande av halspulsådern ligation och återvänder till normoxi. Visas är representativa CBF kurvor för n> 4 i varje grupp. De tidpunkter för representativa LSCI fotografier präglades av grå linjer i den representativa spårning.

Figur 3
Figur 3: hjärninfarkt, spontan trombos och kärlobstruktion efter THI insult (A) In vivo TTC-fläck uppvisade ingen synlig infarkt vid 24 h efter 30 minuter övergående ligering av den högra gemensamma halsartären (tCCAO), men tillsatsen av. 30 min hypoxi (7,5% syre) till tCCAO producerade betydande infarkt i ipsilaterala halvklotet (asterisk), främst i mellersta cerebral artär förande området. (B, C) ​​Anti-fibrin (ögen) immunfärgning vid 1 timme efter Thi förolämpning visade utbredda avlagringar iipsilaterala hemisfären. Däremot fanns det ingen fibrin (ögen) insättningar vid en timme efter det att tCCAo (30 min) insult (n> 4 för vardera). (D, E) Cerebral perfusion utvärderades genom svans-ven injektion av Evans Blue färgämne vid 4 h efter tCCAO (30 min) eller THI (30 min) förolämpning. I post-tCCAO hjärna, fyllde Evans Blue färgämne flesta av blodkärlen i den ipsilaterala halvklotet. I motsats, i post-thi hjärna, Evan Blue färgämne fylld färre blodkärlen och läckte in i parenkymet (n> 3). Skala bar: 250 pm.

Figur 4
Figur 4: Verkan av tPA trombolys i THI slag modell (A) Sammanfattning av experiment för att jämföra effekterna av intravenös tPA administrering (10 mg / kg) vid 0,5, 1, eller 4 timmar efter THI insult.. (B) Sammanfattning av antalet drivna djur, mortality i 24 h efter förolämpningar, extremvärden (infarktstorleken utanför medelvärdet +/- 2 SD) och antalet djur som ingår för jämförelse av infarktstorlek. (C) Kvantifiering uppvisade en medelvärdes 32% infarktvolymen i vehikelgruppen och betydande minskning av infarkt i 0,5 h (till 16%) och en timme (till 20%) grupper (Visade är medelvärdet och SEM för varje grupp). P-värden bestäms genom t-test. (D) representant TTC-färgade hjärnan från djur som ifrågasatts av Thi förolämpning och mottagna tPA behandling vid den angivna tidspunkt efter skada. I TTC färgning, levande vävnad visade röd färg; infarktvävnad var blek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stroke är en viktig hälsofråga av växande betydelse för ett samhälle med en åldrande befolkning. Globalt sett är stroke den näst vanligaste dödsorsaken med uppskattningsvis 5,9 miljoner dödliga händelser under 2010, vilket motsvarar 11,1% av alla dödsfall 18. Stroke är också den tredje vanligaste orsaken till funktionsjusterade levnadsår (DALY) förlorade globalt under 2010, stiger upp ur femte plats 1990 19. Dessa epidemiologiska data understryker behovet av mer effektiva behandlingar av akut (ischemisk) stroke. Trots intensiv forskning inom preklinisk neuroprotektiva behandling, förblir tPA-trombolys den enda specifik behandling av akut ischemisk stroke som är godkänd av Food and Drug Administration i USA, medan många en gång lovande neuroprotektiva medel i djurstudier misslyckats i kliniska prövningar. Svårigheten att översätta neuroprotektiva behandlingar till patienter har många faktorer, och den nuvarande tyngdpunkten ligger på god laboratorie practice, meta-analys av flera datamängder, och internationellt samarbete för att förbättra preklinisk strokeforskning 20,21. Det finns dock en minoritet anser tyder på att den translationella svårigheten beror på ett dåligt val av mekaniska kärlocklusion modeller (t.ex. intraluminal sutur MCA ocklusion) i de flesta prekliniska strokeforskning hittills 2,3. Eftersom mekanisk kärlocklusion modeller sällan inducera trombos och cerebral reperfusion sker för fort vid lanseringen av mekanisk obstruktion, dessa modeller varken svara på riktiga ordet terapi (tPA fibrinolys) och inte heller ge ett smalt terapeutiskt fönster som i strokepatienter. Följaktligen är den föreslagna åtgärd för att understryka, åtminstone innefattar, tromboembolisk stroke modeller i preklinisk strokeforskning 3.

Denna rekommendation har dock sina begränsningar eftersom nuvarande tromboemboliska stroke modeller (exogen emboli leverans, MCA-injektion av thrombin och photothrombosis) alla har vissa tekniska nackdelar 4. För den exogena emboli modellen, intravaskulär infusion av gasembolier resulterar i betydande variationer i infarktstorlek och läge, samt oförutsägbara reaktioner på tPA trombolys på grund av skillnader i koagel förberedelse 4,5. Direkt injektion av trombin i MCA grenen kräver craniectomy, och dess användbarhet för att optimera trombolytisk behandling är ännu inte bevisats 4,6. Kemiskt initierad tromboembolism baserat på systemisk injektion av ett fotokänsligt färgämne (t.ex. Rose Bengal eller erytrosin B) och bestrålning genom den exponerade skallen ofta producerar plätt endast aggregat som inte svarar på trombolys 4,7. Sammantaget finns det ett behov av enklare och tPA-responsiva tromboemboliska modeller för preklinisk strokeforskning.

Thi paradigm har fyra unika fördelar som en tromboembolisk stroke modell. Först svingat Thi förolämpningendogena komponenter för att bilda in situ tromber utan hjälp av exogena kemikalier eller förformade embolier. Således är blodproppsbildning i Thi modellen mer relevant för fysiologiska förhållanden. För det andra, svarar gynnsamt för snabb tPA-behandling Thi modellen (vid 0,5 och 1 h efter skada) men inte fördröjd behandling (vid 4 h). Detta terapeutiskt fönster liknar de som observerats hos strokepatienter. Således kan Thi modellen utnyttjas för forskning i syfte att förbättra reperfusionsbehandling vid akut ischemisk stroke. För det tredje, de kirurgiska ingrepp i Thi modellen är enkel och okomplicerad, jämfört med intraluminal suturen MCA ocklusion modell. Varaktigheten av hypoxi i Thi modellen är också kontrollerbar. Dessa attribut gör Thi modell mindre känslig för procedurvariationer mellan olika laboratorier. Slutligen kan THI modellen skjul insikter i mekanismerna för ofullständig reperfusion trots rekanalise av stora artärer efter trombolys, vilket ären unik utmaning i stroke terapi jämfört med hjärtischemi 1,22. Därför ger Thi modellen ett unikt system för att studera mekanismerna bakom den cerebrala kärlbädden specifika dysreglering av hemostas 23.

Alla experimentella hjärnskada modeller har begränsningar, och Thi modellen är inget undantag. Tre stora tekniska begränsningarna i Thi stroke modell har identifierats i experimentet. Först, till skillnad från andra strokemodeller där förolämpning är begränsad till hjärnan, kombinationen av hypoxi och karotidocklusion leder till perifer vasodilatation och en ökad efterfrågan på hjärtminutvolym 12. Således, när man jämför effekterna av mus mutationer eller neuroprotektiva medel mot Thi förolämpning, deras effekter på kardiovaskulära funktioner ska också noggrant jämföras. För det andra, fann vi att olika mus inavlade stammar har varierande svar på Thi-modellen, vilket kan bero på ojämn öppenheten hos den bakre communicating artären 24, olika hjärtfunktion, eller en kombination av båda. Därför rekommenderas att kön, ålder, kroppsvikt, och musstammar mellan två experimentella grupper vara jämförbara i neuroprotektion studier. Slutligen bygger Thi stroke på djur för att andas in den hypoxisk gas under ett lätt sövd tillstånd. Effekterna av narkos på stroke resultaten måste minimeras och hållas konsekvent mellan djur. Ändå så länge forskare är vaksamma av dessa tekniska detaljer och minska variablerna från djur till djur, Thi stroke modellen kan snabbt inrättas för att ge hög konsistens hjärninfarkt.

Sammanfattningsvis är thi en enkel och standardiserad stroke modell som svarar positivt på den verkliga världen terapi (tPA trombolys) i en kliniskt relevant tidsmässigt fönster. Denna nya modell är ett värdefullt tillskott till preklinisk strokeforskning, och kan bidra till att förbättra trombolysbehandling vid akut ischemiskstroke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106, (12), 1563-1569 (2002).
  2. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47, (3), 213-227 (2009).
  3. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, (7), 1310-1316 (2012).
  4. Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164, (4), 1062-1078 (2011).
  5. Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34, (8), 2019-2024 (2003).
  6. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38, (10), 2771-2778 (2007).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66, (5), 748-754 (1987).
  8. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
  9. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
  10. Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9, (2), 131-141 (1981).
  11. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21, (2), 52-60 (2001).
  12. Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169, (2), 566-583 (2006).
  13. Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, (4), 1155-1169 (2011).
  14. Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34, (7), e1-e9 (2014).
  15. Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
  16. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40, (2), 367-377 (2012).
  17. Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203, (1), 122-129 (2012).
  18. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380, (9859), 2095-2128 (2010).
  19. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380, (9859), 2197-2223 (2012).
  20. Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157, (7), 1154-1156 (2009).
  21. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44, (6), 1754-1760 (2013).
  22. Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36, (11), 2400-2403 (2005).
  23. Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340, (20), 1555-1564 (1999).
  24. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, (11), 2707-2714 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics