Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

1MatTek Corporation, 2MatTek In Vitro Life Science Laboratories
Bioengineering
 

Summary

Biz üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanan bir göz tahrişi testi geliştirdi. Test göz irritan ve korozif malzemeler (GHS kategorileri 1 ve kombine 2) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez olanlar arasında ayrım yapabiliyor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kaluzhny, Y., Kandárová, H., d’Argembeau-Thornton, L., Kearney, P., Klausner, M. Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model. J. Vis. Exp. (102), e52979, doi:10.3791/52979 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

AB Kozmetik Direktifi ve AB REACH mevzuatına Yedinci Değişiklik uymak için, insanda göz toksisite güvenilir ve doğru değerlendirilmesi için geçerli olmayan hayvan alternatif yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz bir göz tahrişi testi normal insan hücrelerine dayanan üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanır (EIT) geliştirdik. EIT göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez o ayrı yapabiliyor. Test, iki ayrı protokolleri, sıvı kimyasal ve katı deney ürünleri için, bir ikinci benzer protokol için tasarlanmış bir kullanır. EIT tahmin modeli, tek bir maruziyet süresi (sıvılar için 30 dakika, katı maddeler için 6 saat) ve tek bir doku canlılığı kesme (MTT testi ile tespit edildiği üzere% 60.0) kullanır. EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 sens elde (44 sıvılar ve 39 katı) 83 kimyasallar için sonuçlara dayanarakiTivity / özgüllük ve doğruluk (SS & A) sıvılar için, katılar için / 68.4 100.0 / ve% 84.6, SS & A, ve 97.6 / 68.3 / ve genel SS & A için% 83.1. EIT düzenleyici test gereksinimlerini karşılamak için hayvanların kullanmadan sıvı ve katı kimyasalların geniş bir yelpazede göz irritasyon potansiyelini sınıflandırmak önemli katkıda bulunacaktır. EpiOcular EIT yöntemi TG 492 olarak OECD Test Rehberi içine 2015 yılında hayata geçirildi.

Introduction

Bu tür kozmetik, deterjan ve ev temizlik gibi tüketici ürünleri onlar gözlerle temas halinde ciddi hasar neden olabilir kimyasalların çeşitli içerir. Bu nedenle, göz tahrişi için bu ajanların test tüketici güvenliğini 1 sağlamak için ABD ve AB düzenleyici kurumlar tarafından talep edilir. Karışımlar ve formülasyonlar göz tahrişi potansiyelinin değerlendirilmesi, aynı zamanda kimyasalların taşınması için AB Kozmetik Direktifi altında kozmetik maddelerin etiketlenmesi için REACH (Kayıt, Değerlendirme, Yetkilendirme ve Kimyasalların Kısıtlanması) ile mevzuat uyum için bir gereklilik olduğunu ve için pestisit ve ev ürünleri 2 etiketlenmesi. Şu anda, düzenleyici kurumlar Kimyasalların Sınıflandırılması ve Etiketlenmesi (GHS) 3 Küresel Uyumlaştırılmış Sistemi kullanılarak göz tehlike değerlendirmesini gerektirir. GHS ağırlıklı Draize göz tahrişi testinde dayalı, en yaygın olarak kullanılan göz tahrişi deneyi hangi yabancı maddeler ve mildemirbaşlar Tavşan gözünde 4 katılgan zar kesesi içine, doğrudan eklenir. GHS sınıflamasına göre, GHS Kategori 1 (göz aşındırıcılar) göz dokularında veya maruz kalma 3,5 izleyen 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olmayan göz ve görme ciddi hasar şiddetli başlangıç ​​yaralanmasına neden kimyasallar test eder. GHS Kategori 2 maruziyet 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olan gözün önemli değişiklikler meydana kimyasallar test eder. Koroziflerin veya tahriş edici olmayan test kimyasalları GHS yok Kategori olarak adlandırılır.

40 yılı aşkın için, Draize tavşan gözü testi kendi tekrarlanabilirlik eksikliği, insani tepkilerin abartılması ve canlı hayvanların 5-8 kullanımı için eleştiriliyor. Bu kaygılar arıtma, indirgeme ve in vivo testte 9 değiştirilmesi için birçok önerilerde teşvik etmiştir. Valide hayvansal olmayan alternatifleri ihtiyacı daha da güçlendirildi(2009) Kozmetik (2005) kozmetik ürünlerinin güvenlik değerlendirmesinde hayvanların kullanılmasını yasakladı Direktifi ve malzemeyi Yedinci Değişiklik kabulü 2.

1996 yılından bu yana, yeniden kornea gibi doku modeli yaygın hammadde, yüzey aktif madde bazlı formülasyonların tahrişi potansiyelini değerlendirmek için, kozmetik endüstrisinde kullanılan ve kullanım için tasarlanmış karışımları birleşik veya gözün yakın olan 10-13. RHCE doku modelinin kullanılması doğal, sulandırılmamış formda doku yüzeyine test malzemesinin doğrudan topikal uygulama sağlar. Bu şekilde, suda çözünür olmayan formülasyonlar çözücüler ile inceltilmeden test edilebilir. Yaygın, uygulanabilir basit ve ekonomik yöntem için istek (Alternatif Yöntemler Doğrulama Avrupa Birliği Referans Laboratuarı Avrupa Merkezi) EURL ECVAM en cevaben Göz tahrişi Testi (EIT) bir singl kullanan hangie maruz kalma süresi ve etiketleme gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif ayırmak mümkün (Şekil 1) 14 geliştirilmiştir. 83 kimyasalların (44 sıvılar ve 39 katı) için sonuçlara dayanarak, EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 duyarlılık / özgüllük ve doğruluk (SS & A) sıvılar için, katılar için 100.0 / 68.4 / ve% 84.6 SS & A ve 97,6 / elde 68.3 / ve genel SS & A için% 83.1.

2007 yılında, EURL ECVAM himayesinde Kozmetik Avrupa'da (eski Colipa) tarafından desteklenen bir multi-laboratuar öncesi doğrulama çalışması resmi doğrulama 15 o getirme hedefi ile EIT alaka ve güvenilirliğini değerlendirdi. Bu çalışmada, 298 bağımsız denemeler, yedi bağımsız laboratuvarda yapılmıştır. Çalışma sonuçları katılan tüm laboratuvarlar 15 arasında varyasyon düşük katsayılı tahmininde% 99.7 anlaşmasını gösterdi. Sonuç olarak, 2010 yılında EIT protokol resmi EURL ECVAM girdidoğrulama programı. Doğrulama çalışma, in vivo referans verileri (Draize tahrişi verileri) kullanılabilir hangi bireysel madde ve kimyasal karışımların da dahil olmak üzere 104 kodlu deney kimyasallar, kullandı. Bu çalışmanın başarısına dayanarak, OECD Taslak testi kılavuz It EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin sınıflandırılmasına önemli katkıda olacağı tahmin edilmektedir 2014 yılında sunuldu.

Protocol

Tedavi için RHCE Dokuların 1. Hazırlık - Day 0

  1. Ticari insan kornea gibi epitel (RHCE) kiti aldıktan sonra, üzerinde. EIT tahlil (Tablo 2) gerçekleştirmek için gerekli olan tüm kit bütünlüğü için (kit ayrıntılar için bileşenleri görmek Standart Assay Kit Bileşenleri (Tablo 1) ve Gereçleri ve Malzemeleri kontrol alındığı gün 15 dakika süre ile oda sıcaklığına (, 24 oyuklu bir nakliye konteynerine) dokuları dengeye getirin.

Miktar Ayıraç Koşullar Kaynak Tanım Son kullanma tarihi
1 EpiOcular dokuların contalı 24-çukurlu plaka
(OCL-200)
2-8 ° C Mattek 24 Tiss içerirHücre kültürü ues agaroz üzerinde, paketi ekler 72 saat
1 şişe,
200 mi
EpiOcular Analiz Ortamı
(OCL-200-ASY)
2-8 ° C Mattek DMEM bazlı ortam 21 gün
1 şişe,
100 mi
Mg ++ -Alerjik Dulbecco's-PBS (DPBS) Ca ++ RT Sigma-Aldrich, D5652 veya eşdeğer. Ekler durulama için kullanılır 1 yıl
4 6-delikli plakalardaki RT Şahin Tahlil protokol sırasında dokuları korumak için kullanılır NA
2 12-yuvalı plakalar RT Şahin Deney protokolü sırasında kullanılmış NA
2 24-yuvalı plakalar RT Şahin MTT gerçekleştirmek için kullanılan NA
1 flakon,
0.5 mi
Metil asetat
(CAS # 79-20-9)
RT Sigma-Aldrich,
Cat # 186325
Tahlilde PC olarak kullanılır 1 ay

Tablo 1: Standart Assay Kit Bileşenleri.

<td> nc olarak kullan
Ekipman / Malzeme Için gerekli:
Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO2, 90 ±% 10 nem) Önce ve sırasında enkübe dokular tahliller
Laminar akış kaputu Steril koşullarda güvenli çalışma
Vakum pompası (opsiyonel) Orta ve çözüm çekiş
Plaka okuyucu fotometresi (96 oyuklu plakalar için) Okuma OD
Plaka çalkalayıcı Özütformazanların iyon
Steril, künt kenarlı forseps Doku ekler Taşıma
-Saatler durdurun Protokolde test materyalleri ve diğer zamanlı adımda uygulanması zamanlaması
Su banyosu (37 ± 1 ° C) Isıtma medya ve MTT çözeltisi
Havan ve dibek Taneli katılar Taşlama
Pozitif deplasmanlı pipet (50 ul) Viskoz yarı katı maddelerin ve süspansiyon uygulanması
Ayarlanabilir pipetler (200 ul-2 mi) Sıvı malzemelerin, deney ortamı ve MTT Uygulama
Önceden sterilize edilmiş ipuçları (200 ul ve 20 ul), Rainin Cat # HR-200F ve HR-20F (veya eşdeğeri) Sıvı malzemelerin, deney ortamı ve MTT Uygulama
Geniş menfezli, önceden sterilize edilmiş uçları (250 ul), Rainin Kat # HR-250WS (ya da eşdeğeraynı yağı) Viskoz yarı katı maddelerin ve süspansiyon uygulanması
8 oz / 220 ml kapları numune, Falcon Cat # 3540200 (veya eşdeğeri) Dokuların Durulama
Steril tek kullanımlık şırıngalar (örneğin şırınga Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG kedi Tüberkülin 1 ml. No 9161406V) ~ 50 mg katı malzemelerin teslim edilmesi (opsiyonel)
Ted Pella mikro spatula / kaşık, Ted Pella Inc., Cat # 13504 (veya eşdeğeri, keskin kaşık veya kemik küret, örneğin Aesculap, No: FK 623) ~ 50 mg katı malzemelerin teslim
Ca ++ ve Mg ++ serbest Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (Ca ++, Mg ++ Serbest DPBS): Sigma-Aldrich, Katalog # D5652 (veya eşdeğeri) Tahlil sırasında durulama dokular
Steril deiyonize su, doku kültürü notu (kalite, biyolojik veya eşdeğeri)
96-gözlü düz tabanlı plakalar, Falcon (veya eşdeğeri) OD okuma
Pamuk ucu swapları (steril) Doku yüzeyini kurutma (opsiyonel)
Yapışkan bant veya Parafilm Formazan ekstraksiyon sırasında plakaları kapsayan
MTT-100 deney kiti MTT-Tiazolil mavi tetrazolyum bromürde belirteci (Sigma # M-5655) ve izopropanol özü içerir.

Tablo 2: Ekipman ve EIT gerçekleştirmek için gerekli malzemeler.

  1. Steril koşullar altında, RHCE dokularla 24 oyuklu plaka içeren plastik torba açık ve steril gazlı bezi. Agarozjeli arasındaki hava kabarcıkları tüm dokuları kontrol edin ve takın. Insert alanı, kusurlu dokular veya doku WHI>% 50 ekleme kaplaması altında hava kabarcıkları ile kültürleri kullanmayın ch tamamen sıvı ile kaplıdır.
  2. Test maddesi veya kontrol kodları ve pozlama süreleri ile 6-kuyucuğu etiketleyin. (Takım ile birlikte verilme), Analiz Ortamı alikosu 1.0 mi, önceden etiketlenmiş 6 oyuklu plakalara ait kuyucuklar içerisine, yaklaşık olarak 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış.
  3. Etiketli 6-plaka insert RHCE doku içeren her parçayı çıkarmak ve yerleştirmek için steril forseps kullanın. Bu adım sırasında, steril filtre kağıdı üzerine hafifçe blotting ile ucun dış tarafına yapışır kalan nakliye agaroz kaldırmak. Ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları serbest bırakın.
  4. 1 saat boyunca (37 ± 1 ° C 'de 5 ± 1% CO2 ile SCC, nemli bir atmosferde) standart kültür koşulları 6 oyuklu plakalar içinde RHCE dokuları önceden inkübe edin.
  5. 1 saat sonra, 37 ° C'ye ön ısıtılmıştır yeni tahlil ortamı içinde 1.0 ml analiz ortamı yerine ve SCC koşullarında RHCE dokuları inkübe (gece boyunca = O / N) (16-24 saat).
. ove_title "> 2 Ön tedavisi - 1. Gün

  1. O / N inkübasyondan sonra, uygun bir pipetleme cihazı (Resim DPBS) Ca 2 + Mg2 + içermeyen-Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin 20 ul geçerlidir. DPBS dokulara yayılmış değil, hafifçe DPBS tüm doku yüzeyi ıslatan sağlamak için plaka üzerinde insert dokunun.
  2. 30 ± 2 dakika süreyle SCC at RHCE dokuları inkübe.
    Bu adım, doku hidrasyonu için gerekli olan ve in vivo koşullarında taklit etmek için: edin.

3. Test Malzeme Pozlama İşlemleri

  1. RHCE dokuları çoğaltmak için her test makale ve kontrolleri uygulayın (n = 2). Test maddesi dozajlama işlemi sıvı ve katılar için farklıdır. Topikal olarak uygulanan, bir pipet kullanılarak, sıvı test maddesi 50 ul uygulanır. Sıvılar için maruz kalma süresi 30 dakikadır. (Sodyum klorür 50 mg tutmak için kalibre) bir tesviye kaşık kullanılarak katı deney makalelerin 50 mg uygulayın. Eskikatılar için maruz kalması süresi 6 saattir.
    Not: Sıvılar, bir pipetleme cihazı kullanılarak uygulanabilir sıvı maddeler (örneğin, sıvılar, jeller, kremler) gibi tanımlanmıştır. Katılar, bir pipet kullanılarak tatbik edilemez sıvı olmayan maddeler (örneğin, tozlar, reçineli veya mumlu malzemeler) olarak tanımlanır.
    1. Test ürünlerinin fiziksel durumu belirlemek için kolay değilse, 15 dakika boyunca (37 ° C) bir su banyosu içinde test maddesi ile şişeleri yerleştirin. 37 ° C 'de sıvı hale bu deney ürünleri için, sıvılar için EIT protokol takip edin.
    2. Özellikle viskoziteli maddeler için bir pozitif yer değiştirme pipeti kullanarak.
  2. İlk negatif kontrol ve pozitif kontroller Doz ve daha sonra test makaleleri doz.
    1. Negatif kontrol (NC) ve standart bir pipet kullanarak RHCE dokulara pozitif kontrol için (PC), 50 ul uygulayın. Kuzey Carolina, steril deiyonize sudur; PC metil asetat (CAS # 79-20-9) 'dir. Zaman testi, 30 dakika boyunca NC ve PC UygulaSıvı testi makaleler ing ve 6 saat boyunca katı testi makaleleri test ederken.

4. Test Madde Pozlama - 1. Gün

  1. Sıvı testi makalelerin tedavisi için. Tablo 3'te verilen zamanlama programı izleyin bütün dokularda eşit pozlama sağlamak için her test maddesinin uygulamalar arasında 1 dakika aralıklarla bırakın.
    1. 30 ± 2 dakika ön işleme tabi DPBS sonra topik olarak topik uygun bir pipetleme cihazı kullanılarak RHCE dokusu üzerine 50 NC ve PC ul, ve her bir sıvı test ürününü uygular.
    2. Üst yüzeyi kapak doğrudan doku üzerine sıvı test maddesi 50 ul uygulanır. Viskoz malzemeler için ağzını genişletmek için pipet dar noktasını kes. Çok yapışkan malzemeler için, bir dozlama aygıtına test ürününü (doku ekleme veya plastik raptiye iç çapından biraz daha küçük bir çapa sahip bir düz başlı bir silindir) uygulanır, dozaj d terscıhazla ve doku üzerine yerleştirin test maddesi eşit temas doku yüzeyine böylece.
    3. Test makale dokusu yayılmış etmezse, hafifçe tüm doku yüzeyinde yayılır emin olmak için ekleme dokunun. Mekanik (bir pipet ile, örneğin) testi makalelerin yayılması bu dokulara zarar verebilir çünkü tavsiye edilmez.
    4. 30 ± 2 dakika süreyle SCC de dokuları inkübe.
  2. Katı deney makalelerin tedavisi için -. Gün 1, Tablo 4'te verilen zamanlama programı izleyin bütün dokularda eşit pozlama sağlamak için her test maddesinin uygulamalar arasında 2 dk aralıklarla bırakın.
    1. 30 ± 2 dk öncesi tedavi DPBS sonra topikal uygun bir pipet cihazı kullanarak RHCE dokular üzerindeki 50 NC ul ve PC uygulayın.
    2. Katı test maddesi uygulaması için, insert çıkarın (n = 2) oyuk ve (steril bir yüzey üzerine yerleştirmek ör am kapağıultiwell plaka) ortama dökülüp bir test makale önlemek için.
    3. Düzletilmiş bir kaşık kullanılarak, topik olarak, doku yüzeyine test ürününün yaklaşık 50 mg uygulanır; doku yüzeyi tamamen test maddesi kapsamında olduğundan emin olun. Test makale dokusu yayılmış yoksa, doku tamamen test maddesi kapsamında olduğundan emin olmak için yan yana gelen hafifçe insert sallayın. Mekanik (bir pipet ile, örneğin) testi makalelerin yayılması bu dokulara zarar verebilir çünkü tavsiye edilmez.
      1. Gerekirse, test maddesi ile doku arasında daha iyi bir temas sağlamak için, bir havan ve havan tokmağı ile kristalin toz öğütün.
      2. Alternatif olarak, kafası olan bir 1 ml şırınga ile geçme kabı içinde doku kültürü doğrudan yer tozlar kesti. Şırıngaya Stuff tozları piston geri çekilir ve sonra aşağı pistonu basarak başvuruda zaman.
      3. Insertin dış duvar c iseontaminated örneğin, tozlar ile, bir steril gazlı bez ile parçacıkları silin.
    4. Dozlama sonrasında, kültür aracı maddesi içeren 6 oyuklu plakalara dokuların geri ve 15 dakika ± 6 saat boyunca SCC inkübe edilir.

5. Durulama

  1. Test maddesi başına üç temiz bardak (150 ml kapasiteli) bir dizi hazırlamak ve DPBS 100 ml her biri doldurun. Her test yazıda, üç bardak farklı bir dizi kullanmaktadır.
  2. 30 ± 2 dakika, sıvı malzemeler için maruz kalma ya da katı maddeler için 15 dakika maruz kalma ± 6 saat sonunda, kaldırma ve kullanılması durumunda dozaj cihazı atın.
  3. Ince forseps ile plastik 'yaka' üst kenarını tutarak orta üzerinden RHCE doku içeren ekler kaldırın. Kullanım ve şişeden kolaylaştırmak için kavisli bir forseps kullanın. Forseps kullanarak yaka bir araya yinelenen ekler tutarak bir anda dokuları iki durulayın. Dikkatli olun nforseps ile dokulara zarar ot.
  4. Temiz emici malzeme üzerine doku yüzeyine test makaleleri veya kontrolleri (kağıt havlu, gazlı bez, vb) Durusu
  5. DPBS, yaklaşık 2 saniye DPBS dairesel hareketlerle girdap birinci çanak içine ekler Dip çoğunlukla DPBS ile doldurulur ve böylece ekler kaldırın ve tekrar beher içine sıvı süzün. Birinci cam kaba, bu işlem, üç kez tekrarlayın.
  6. Aynı şekilde üç kez DPBS, her ikinci ve üçüncü kap içinde uçlar durulayın.
  7. Emici malzeme üzerine ekleme kalan herhangi bir sıvı süzün. Yaklaşık 45 ° açı (açık uca aşağı) elemanını döndürün ve emici malzeme üst dudak dokunun.
    Not: Görünür test malzemesinin kaldırmak mümkün değilse, daha fazla durulama aşırı kullanım doku hasarı önlemek için yapılmalıdır.

6. Post-emmek

  1. Durulamadan sonra,Hemen önce, önceden etiketlenmiş 12-oyuklu bir plaka içerisinde, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı Analiz Ortamı içinde 5 ml dokuları bırakın.
  2. Sıvı malzemeler için 12 ± 2 dakika ya da herhangi bir artık test ürününün uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için oda sıcaklığında bir katı malzeme için daldırılmış 25 ± 2 dakika boyunca doku inkübe edin.

7. Post-inkübasyon

  1. Sonunda, daldırma süresi Post-Soak dokulardan analiz ortamında süzün ve bir emici malzeme üzerine ekler leke.
  2. Sıcak Analiz Ortamı içinde 1 ml ihtiva eden, önceden etiketlenmiş 6 oyuklu bir plakaya ekler aktarın.
    1. Sıvı test materyalleri için SCC 120 ± 15 dakika boyunca dokuları inkübe.
    2. Katı test materyalleri için SCC 18 ± 0.25 saat dokuları inkübe.

8. MTT Canlılık Testi - 1. Gün (Sıvılar için Protokolü) ve 2. Gün (Katılar için Protokolü)

  1. 120 Sonrası İnkübasyon sonrasında MTT gerçekleştirme77; Sıvılar için 15 dakika ve sırasıyla katılar için 18 ± 0.25 saat.
  2. Bir ön-etiketli 24-kuyulu plakanın her oyuğuna 1.0 mg / ml MTT solüsyonu ve çözeltinin kısım 0.3 ml hazırlayın.
    1. Ticari MTT kiti (Tablo 5) kullanın:
    2. Kullanmadan önce 2 saat, oda sıcaklığında MTT konsantresi Çözülme. 2 MTT konsantresi ml ve 1.0 mg / ml MTT solüsyonu elde etmek için MTT seyreltici 8 ml birleştirin.
    3. Kullanılana kadar karanlıkta 4 ° C'de MTT çözeltisi saklayın. 1 günden fazla için MTT solüsyonu tutmayın.
  3. Mesaj İnkübasyon sonunda, 6-çukurlu plaka her ekleme çıkarıp hafifçe bir emici madde üzerinde kurutunuz.
  4. MTT çözeltisi 0,3 ml içeren 24 oyuklu bir plakaya ekler yerleştirin. Ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları serbest bırakın. SCC 180 ± 10 dakika boyunca plaka inkübe edin.
  5. MTT çıkarma
    1. MTT çözeltisi içinde 180 ± 10 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, her bir ekleme kaldırma24 oyuklu plaka arasında bir emici malzemenin üzerine ucun alt bekletin.
    2. Olmayan renklendirici, sıvı test maddeleri (su altına batırılma ekstraksiyon) için: bu ekleme submerges böylece bir ekstraktan çözelti (izopropanol) 2.0 ml ihtiva eden bir ön-etiketli 24-çukurlu plaka içine ekler aktarın.
    3. Katı ve sıvı renklendirici için (non-dalgıç, özü çıkarılan çözeltinin kirlenmesini önlemek için ekstraksiyon): Bu ekleme daldırın etmez, böylece, özü çıkarılan çözeltinin 1,0 ml (izopropanol) ihtiva eden bir ön-etiketli 6-çukurlu plaka içine ekler aktarın.
      Not: İlgili negatif ve pozitif kontroller için aynı olmayan batık çıkarma gerçekleştirin.
  6. (Plaka kapağı ve kuyu üst kenarı arasındaki veya standart bir plaka kapatıcı ile parafilm, gibi) plakalar kapatın. Orbital plaka karıştırıcısı üzerinde tabak yerleştirin ve MTT ayıklamak için 2 saat oda sıcaklığında 3 için sallayın.
    1. Alternatif olarak, 2-8 ekstraksiyon O / N gerçekleştirmek76; sallayarak olmadan karanlıkta C.
  7. Olmayan renklendirici sıvı testi makaleleri (batık çıkarma) için: çıkarma süresinin sonunda, her sıvı geri kuyuya yerleştirin ve RHCE dokular ile ekler atmak süzün.
    1. Ekstre çözeltisi karıştırın ve plaka konfigürasyonu (Şekil 2) 'ye göre bir ön-etiketli 96-çukurlu plaka ihtiva eden uygun oyuklara İki 200 ul alikotları aktarın.
  8. Katı ve sıvı renklendiriciler (non-batık çıkarma) için: çıkarma süresinin sonunda, dokular (dokuları delmek için emin olun) atın.
    1. Dokulardan ekstre çözeltisi ihtiva eden 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, özü çıkarılan çözeltinin 1,0 ml ilave edilir. Özütleyici çözelti karıştırılır ve plaka konfigürasyonu (Şekil 2) 'ye göre bir ön-etiketli 96-çukurlu plaka ihtiva eden uygun oyuklara İki 200 ul alikotları aktarın.
  9. T belirlemeO 550 590 nm arasında, tek bir dalga boyunda ekstre örneklerin optik yoğunluk (OD), bir plaka okuyucu ya da bir spektrofotometre ile (bir laboratuar içinde tutarlı olmalıdır).
    1. Çözünmeyen katılar nedeniyle bulanık ekstre çözeltilerinin santrifüj OD (buharlaşmayı önlemek için 4 ° C'ye kadar santrifüj soğumaya) ölçüm öncesinde çözüm durumunda. Olgu durulama, test makale (TA) kaldırmaz ve TA MTT azaltma müdahale, ek kontroller kullanılmalıdır. MTT azaltma 16 düzeltmek için detaylı bir SOP bakınız.
    2. Durumda, bir TA olması veya MTT ölçümü ile etkileşim renk elde etmek için gösterilmiştir, ilave deneysel bağlı renk miktarını belirlemek için yapıldı ve daha sonra dokulardan ekstre edilmelidir. Renkli deney Kanunun 16 düzeltmek için detaylı bir SOP bakınız.

Doku Canlılık Testi (Tablo 6 ve Şekil 3) & # 9. Hesaplamalar160;

  1. Genel hesaplamalar
    1. Her bir deney için boş kontrol kuyuları (OD Blk) ortalama OD değerini hesaplayın.
    2. Aynı deney (Blk veriler düzeltilmiş) her OD değeri OD Blk çıkarın.
    3. Her doku (= düzeltilmiş OD) için iki eşit ortalama değerini hesaplayın.
  2. Ortalama negatif kontrol (% 100 kontrol) her bir kontrol ve test maddesi göreceli olarak, iki kopya dokuların her biri yüzde canlılığı hesaplayın.
    Kalabilirlik (%) = [düzeltilmiş OD işlenmiş dokular / düzeltilmiş OD negatif kontrol] x% 100
  3. Canlılığı (iki suret dokular arasındaki canlılığı fark) farkını hesaplayın.
  4. Ortalama Test makale canlılığını (TA canlılığı) hesaplayın ve tahmin modeline göre deney makale sınıflandırır.

10. Tahmin Modeli (Şekil 3)

  1. TA ile tedavi edilen doku canlılığı NC-muamele edilmiş ince v> 60,0 göreliyseiability, tahriş edici (NI) olarak deney makale (GHS No Kategori) etiket.
  2. TA-işlenmiş doku canlılığı NC-muamele doku canlılığı 60.0 akrabası ≤ ise, tahriş edici (I) olarak deney makale etiket (GHS Kategoriler 1 ve 2).
    Not: EIT test sonuçları ise nitelikli olarak kabul edilir:
    • EIT NC OD> 0.8 ve <2.5;
    • (NC göre%) EIT PC doku canlılığı ≤50.0% olduğu;
    • İki çoğaltmak dokularda (NC, PC ve test maddesi) arasındaki fark% 20.0 <olduğunu.

Representative Results

10 Test makaleleri (TA) ve negatif ve pozitif kontroller ile yapılan Temsilcisi EIT sonuçları Tablo 6 ve Şekil 3'te sunulmuştur. NC% 100 doku canlılığı karşılık OD = 1.31 için, bu nedenle bilgisayar (OD ortalama = 0.41) ortalama vardı % 31,2 göreli doku canlılığı. EIT protokol katı pozlama protokolünü kullanarak, 4 laboratuvarda sıvı poz protokolü ve 8 bağımsız geçerli deneylerde kullanılarak 7 laboratuvarda 15 geçerli bağımsız deneylerde yapıldığında, sıvı protokolünü kullanarak PC için ortalama doku canlılığı 36.4 ± 4.0 idi ve% katı protokol için 32.3 ± 6.4%. Her durumda, pozitif kontrol sonuçları 60,0% 15 arasında kesme değerinin altında idi.

Şekil 3'te, TA1, TA2, TA4, TA7 gösterilen ve TA8 doku canlılıkları> 60.0% vardı ve bu nedenle "NI" olarak sınıflandırıldı kadar. TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10 dokusu Yaşama kabiliyetleri X vardı04;% 60.0 ve bu nedenle "ben" olarak sınıflandırıldı. Yinelenen dokular arasındaki doku canlılığının fark TA2 bir istisna ile tüm TA için <% 20.0 idi. Hepsi EIT kabul kriterlerini (Bölüm 10.2) tanıştığımızdan beri nedenle, TA2 bir istisna ile tüm test makaleleri, sonuçları, "nitelikli" olarak kabul edildi. Çünkü İlk deneyde, TA2 yinelenen dokular arasındaki yüksek değişkenlikten dolayı, ikinci bir deney kalifiye EIT sonuçları elde etmek için gerekli idi.

Burada RHCE doku modeli kullanılarak açıklandığı gibi EIT test yöntemi EURL ECVAM / Kozmetik Europe 15,17-19 tarafından resmi doğrulama dahil olmak üzere birçok Multilaboratory geçerlilik çalışmalarında, oküler irritasyon değerlendirilmesi için kullanıldı. Çalışmaların tümünde, EIT tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir ve doğru kimyasallar (madde ve karışımlar her ikisi) göz tahrişi veya ciddi göz hasarı ac ​​için sınıflandırma ve etiketleme gerektirmeyen tespit başardıBM GHS 15,17-19 kadar Cording. EIT test yöntemi duyarlılık, özgüllük ve genel doğruluk için göz tahrişi için Doğrulama Yönetim Grubu (VMG) kabul kriterlerini yerine getirmiş ve şu anda in vivo tavşan Draize testi 19 için kısmi yerine resmi uygulanmasını bekliyor.

Figür 1
Şekil 1: Sıvı ve katı deney ürünler için EIT protokol Anahat Kullanılan kısaltmalar: AM, tahlil ortamı;. SCC, standart kültür koşulları; PBS, Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin, RT, oda sıcaklığı.

Şekil 2,
Şekil 2:. MTT dokusu canlılık testinde, standart 96 oyuklu plaka konfigürasyonu iki 200 ul tam bölünen miktarları, trabir ön-etiketli 96-kuyucuklu bir plakanın uygun oyuklarına nsferred. Kullanılan kısaltmalar: NC, negatif kontrol; PC, pozitif kontrol; TA1-TA20 test makaleleri 1-20; Blank, ekstraksiyon maddesi. 96- MTT plaka konfigürasyonu RHCE doku canlılığını ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış Excel ile kullanılır.

Şekil 3,
Şekil 3: EIT sonuçlar 10 deney makale, NC ve RHCE doku modeli kullanılarak PC kontrolleri için elde edilen grafik EIT sonuçlarını sunmak için tasarlanmış bir Excel elektronik oluşturulur.. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları "tahriş edici (" I ", TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı> 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8).

EIT protokol iş adımları için zaman (bir operatör için bir günlük iş) başlatın
Her bir satır dokuların bir çift tekabül
Adımların sırası: 1 2 3 4 5 6 7
Sıvılar: PBS TA
Pozlama
Sonrası
Islatmak
Sonrası
MTT
Reaksiyon
MTT
Ekstraksiyon
Tedbir
30 dakika 30 dakika 12 dk 120 dakika 180 dakika 120 dakika OD
NC 09:00 09:30 10:00 10:12 00:12 15:12 sonra
PC 09:01 09:31 10:01 10:13 00:13 15:13 17:30
TA-1 09:02 09:32 10:02 10:14 00:14 15:14
TA-2 </ strong> 09:03 09:33 10:03 10:15 00:15 15:15
TA-3 09:04 09:34 10:04 10:16 00:16 15:16
TA-4 09:05 09:35 10:05 10:17 00:17 15:17
TA-5 09:06 09:36 10:06 10:18 00:18 15:18
TA-6 09:07 09:37 10:07 10:19 00:19 15:19
TA-7 09:08 09:38 10:08 10:20 00:20 15:20
ng> TA-8 09:09 09:39 10:09 10:21 00:21 15:21
TA-9 09:10 09:40 10:10 10:22 00:22 15:22
TA-10 09:11 09:41 10:11 10:23 00:23 15:23

Tablo 3:. Sıvı test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi de dahil olmak üzere Protokol adımları ön ıslatma DPBS Test Makaleler Uygulama (TA), durulama ve dokuları ile Post-ıslatın, Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT çıkarması, ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. Tüm tahlil test 10 TA ve kontroller bir günde bitmiş olabilir.

e_content ">

(2 gün, bir operatör için çalışmak) EIT protokol adımlar için başlangıç ​​zamanı
Her bir satır dokuların bir çift tekabül
1.gün 2. Gün (ertesi gün)
Adımların sırası: 1 2 3 4 5 6 7
Katılar: PBS TA
Pozlama
Sonrası
Islatmak
Sonrası
Incubaction
MTT
Reaksiyon
MTT
Ekstraksiyon
Tedbir
30 dakika 6 saat 26 dk 18 saat 180 dakika 120 dakika OD
NC 09:00 09:30 15:30 15:56 09:56 00:56 sonra
PC 09:02 09:32 15:32 15:58 09:58 00:58 15:30
TA-1 09:04 09:34 15:34 16:00 10:00 13:00
TA-2 09:06 09:36 15:36 16:02 10:02 13:02
TA-3 09:08 09:38 15:38 16:04 10:04 13:04
TA-4 09:10 09:40 15:40 16:06 10:06 13:06
TA-5 09:12 09:42 15:42 16:08 10:08 </ td> 13:08
TA-6 09:14 09:44 15:44 16:10 10:10 13:10
TA-7 09:16 09:46 15:46 16:12 10:12 13:12
TA-8 09:18 09:48 15:48 16:14 10:14 13:14
TA-9 09:20 09:50 15:50 16:16 10:16 13:16
TA-10 09:22 09:52 15:52 16:18 10:18 13:18

Tablo 4: Katı Test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi. Dahil Protokol adımlar ön ıslatma Durulama ve Post-ıslatın Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT Ekstraksiyon ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur DPBS'de Test Makaleler Uygulaması ile dokuları. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. 10 TA ve kumanda elemanlarının kontrol edilmesi Bütün tahlil, bir, iki günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir.

Miktar Ayıraç Saklama Koşulları Kaynak Tanım Son kullanma tarihi
1 flakon,
2 mi
MTT Konsantre (MTT-100-CON) Işıktan koruyarak (-20ºC) Mattek Dondurulmuş MTT konsantre 2 ay
1 flakon,
8 mi
MTT seyreltici 2-8-# 186; C Mattek MTT konsantrasyonuna seyreltilmesi için, önceden MTT tahlilinde kullanma 2 ay
1 şişe,
60 mi
İsopropanol
(CAS # 67-63-0)
RT Sigma-Aldrich Ekstraksiyon maddesi NA

Tablo 5: MTT-100 Assay Kit Bileşenleri.

Kod N ° Doku İşlenmemiş veri Boş düzeltilmiş veri OD demek Canlılığının%
n Aliq. 1 Aliq. 2 Aliq. 1 Aliq. 2
NC 1 1,316 1,352 1,316 1,352 1,334 101.6
2 1,277 1,309 1,277 1,309 1,293 98.4
PC 1 0,379 0.397 0,379 0.397 0.388 29.6
2 0.419 0,442 0.419 0,442 0,431 32.8
TA1 1 1,213 1,244 1,213 1,244 1,229 93.5
2 1,355 1,355 1,355 1,355 1,355 103.2
TA2 1 1,210 1,122 1,210 1,122 1,166 88.7
2 0,828 0,837 0,828 0,837 0,833 63.4
TA3 1 0,167 0.168 0,167 0.168 0,167 12.7
2 0.138 0.136 0.138 0.136 0.137 10.4
TA4 1 1,137 1,160 1,137 1,160 1,149 87.4
2 1,262 1,191 1,262 1,191 1,227 93.4
TA5 1 0.610 0,621 0.610 0,621 0.616 46.9
2 0.480 0.484 0.480 0.484 0.482 36.7
TA6 1 0,502 0,513 0,502 0,513 0.508 38.7
2 0.396 0.407 0.396 0.407 0.402 30.6
TA7 1 1,048 1,050 1,048 1,050 1,049 79.9
2 1,149 1.150 1,149 1.150 1.150 87.5
TA8 1 1,032 1,034 1,032 1,034 1,033 78.7
2 0,941 0.935 0,941 0.935 0,938 71.4
TA9 1 0.022 0.022 0.022 0.022 0.022 1.7
2 0.144 0.149 0.144 0.149 0,147 11.2
TA10 1 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150 11.4
2 0.254 0.255 0.254 0.255 0.255 19.4
ortalama Dif. ortalama Dif. Dif. / 2 Sınıflama
OD OD Yaşama kabiliyetleri [%] canlılığında bir
NC 1,314 0.041 100.0 3.12 1.56 NI nitelikli
PC 0.410 0.043 31.2 3.23 1.62 BEN nitelikli
TA1 1,292 0.127 98.3 9.63 4.81 NI nitelikli
TA2 0.999 0.333 76.1 25.36 12.68 NI D> 20
TA3 0.152 0.030 11.6 2.32 1.16 BEN nitelikli
TA4 1,188 0.078 90.4 5.94 2.97 NI nitelikli
TA5 0,549 0.134 41.8 10.16 5.08 BEN nitelikli
TA6 0,455 0.106 34.6 8.07 4.03 BEN nitelikli
TA7 1.100 0.101 83.7 7.65 3.82 NI nitelikli
TA8 0,986 0.095 75.0 7.23 3.62 NI nitelikli
TA9 0.085 0.125 6.4 9.48 4.74 BEN nitelikli
TA10 0.203 0.105 15.4 7.95 3.98 BEN nitelikli

Tablo 6:. 10 deneme makale için elde edilen sonuçlar EIT, NC ve PC kontrolleri tabloları eşya vardırDoku canlılığı ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış bir Excel elektronik tarafından uced. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları "tahriş edici (" I ", TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı> 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8).

Discussion

Biz EpiOcular doku modeli için geliştirilen Göz tahrişi Testi (Şekil 1) sunduk. GHS Kategori ayırt etmez, burada sunulan EIT duyarlılığı ve özgüllüğü 17. EIT yüksek derecesi ile etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ayırmak mümkün 1 Kategori 2 kimyasallar. EIT sınıflandırma ve kozmetik ve farmasötik maddeler dahil olmak üzere kimyasal, geniş bir oküler tahriş potansiyelinin etiketlenmesi için doğrulanmıştır. In vitro testlerde diğer ile birlikte, EIT in vivo tavşan göz tahrişi testi için bir yedek olarak hizmet verecek.

EIT maruz kalma ve maruz kalma sonrası kuluçka süresi (Şekil 1) uzunluğu değişir sıvı ve katı maddelerin, iki benzer ama farklı protokoller kullanmaktadır. EIT kullanılan son noktadaha önceden belirlenmiş bir insan epitel doku modellerinde 20,21 kullanılmıştır MTT testi ile tespit doku canlılığı vardır. Bu testte gerçekleştirmek için, standart hücre kültürü ekipmanları dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Nedeniyle yüksek doku-doku tekrarlanabilirliği seviyesinde, n = 2 dokuların yerine, genellikle tavsiye n = 3 kullanılır. Yetenek n kullanmak = nedeniyle bireysel dokuların 14 farklı kullanım için, böylece ortaya çıkabilecek tahlil değişkenliği en aza deneyimli bir operatör aynı anda iki dokuları işlemek için izin verir çünkü 2 dokular, protokolün önemli bir yönüdür. Ayrıca, pozitif ve negatif kontroller ile birlikte, test maddesi başına n = 2 dokuları, aynı fiziksel durumuna (sıvı ya da katı madde), 10 test maddelerinin tahriş kullanarak, bir kit (24 dokular) kullanılarak değerlendirilebilir.

Malzemelerin güvenilir sınıflandırılmasını sağlamak Diğer önemli noktalar pozitif kontrol su için özellikleri vardırbstance (doku canlılığı ≤50.0%), yinelenen dokularda (fark <% 20.0) ve negatif kontrol OD okumaları (> 0,8 ile <2,5) arasındaki tekrarlanabilirlik.

EIT testi yaparken kuluçka dönemlerinde protokol veya değişikliklerden sapma değişmiş sonuca neden olabilir, çünkü o, valide protokol ve önerilen doz ve durulama programları (Tablo 3 ve 4) kalınması önemlidir. Aynı şekilde, MTT inkübasyon için 3 saat süre sapmalar farklı MTT okumalarına neden olur ve tahlil sonucunu etkileyebilir.

Bazen, bir test kimyasal MTT dokusu canlılığı deneyi veya MTT nedeni azaltılmasına engel olabilir, optik veya diğer özelliklere sahip olabilir. Örneğin, bir test bir kimyasal ile doğrudan mavi-mor reaksiyon ürünü olarak MTT azaltabilir veya MTT formazana (~ 570 nm) ile aynı aralıkta ışığı emen renkli bir madde olabilir. Ancak bu test kimyasalları pr olacakMTT tahlili esnasında, malzemenin yeterli miktarda de ince üzerinde mevcut olan (ya da tarafından emilen) ise, sadece bir sorun ESENT. Bu girişimi önlemek için, geniş durulama prosedürleri EIT protokole dahil edilmiştir. TA kaldırmaz durulama ve TA MTT azaltma karışıyorsa, ek kontroller tespit etmek için kullanılan ve bunun için doğru olmalıdır. Test kimyasal doğrudan MTT indirgemesi şüphesi varsa Kısaca, söz konusu kimyasal madde 50 ul (ya da katı maddeler için 50 mg), SCC (NC steril deiyonize su, 50 ul çalışma MTT çözeltisi ile 3 saat süre ile inkübe edilir, olmalıdır ) aynı anda çalışacak. MTT çözeltisi mavi-mor dönerse, test maddesi MTT azalttı tahmin edilmektedir. Bu durumda dondurularak öldürülmüş doku kontrolleri kullanarak işlevsel bir onay test malzemesi dokuya bağlanmasının ve bir sahte MTT indirgemesi bir sinyal verilmesine yol olup olmadığını değerlendirmek için gerçekleştirilmelidir. TA-maruz kalan, öldürülen doku kontrolünde kayda değer MTT azalma varsa(Tedavi edilmeyen canlı dokuda miktarına göre), test maddesi ortalama dokusu canlılığı öldürülmüş kontrolün ortalama canlılığını çıkarılarak düzeltilmelidir.

Yalancı negatif sınıflandırmalar 14,15,18 azlığı gösterdiği gibi EIT, güvenlik tarafında errs. Önemlisi, göze aşındırıcı ve GHS Kategori 1 kimyasallar, hiçbiri, en ciddi oküler tehlike temsil Bu deneyde 14,15,18,19 olarak tahriş edici olmayan olarak sınıflandırılmıştır. Son olarak, nitro test yönteminde RHCE önemli avantajlarından biri düzgün sıvı ve (iki boyutlu, su altı hücre kültürleri ile mümkün değildir) katı maddeleri test olasılığıdır.

EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunacaktır. Hayvanların yerine o belirlenmesiküler toksisite yıllardır toksikolojik araştırma hedefi olmuştur. EIT test yöntemi 2014 yılında EURL ECVAM tarafından desteklenen bir resmi doğrulama çalışması yapmıştır ve EpiOcular EIT 2015 yılında OECD TG 492 olarak OECD test Rehberi içine uygulanmıştır.

Disclosures

Bu yazı için Yayın ücretleri Mattek Corporation tarafından ödendi.

Acknowledgements

Yazarlar EIT projeye adanmış yaptığı bilimsel destek ve zaman Dr John Harbell teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, Beiersdorf AG şirketi (Almanya), IIVS (ABD), Mary Kay Inc (ABD), Avon Products Inc (ABD), Procter & Gamble / COSMITAL (İsviçre), Laboratoire Pierre Fabre (Fransa) teşekkür etmek istiyorum Harlan Laboratuvarları (United Kingdom), ve Göz tahrişi Testi 15 Multi-merkezi International Pre-Doğrulama ve doğrulama Çalışmaları katılım için LVMH Parfüm (Fransa).

References

  1. National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72, (109), 31582-31583 (2007).
  2. Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396, (49), European Commission. 1-849 (2006).
  3. Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
  4. Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
  5. Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
  6. Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
  7. Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
  8. Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
  9. Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
  10. McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243 (2002).
  11. Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249 (2007).
  12. Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378 (2009).
  13. Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
  14. Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
  15. Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. (2013).
  16. MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. MatTek Corporation. (2014).
  17. Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43, (2), 101-127 (2015).
  18. Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
  19. Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. (2014).
  20. Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, (2003).
  21. Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics