एक bioactive, पीसीएल आधारित "स्व-ढाले" आकार मेमोरी पॉलिमर पाड़ के निर्माण

1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Material Science and Engineering, Texas A&M University, 3Institute of Advanced Materials and Technology, University of Science & Technology Beijing
Published 10/23/2015
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Bioengineering

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Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. L., Grunlan, M. A. Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold. J. Vis. Exp. (104), e52981, doi:10.3791/52981 (2015).

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Abstract

Introduction

वर्तमान में cranio-मैक्सिलोफेशियल (सीएमएफ) अस्थि दोष उपचार के सोने के मानक माना जाता है, काटा ऑटोलॉगस ग्राफ्ट के प्रत्यारोपण जटिल ग्राफ्टिंग प्रक्रियाओं, दाता साइट रुग्णता और सीमित उपलब्धता 1 द्वारा रुकावट है। एक विशेष कठिनाई को आकार देने और osseointegration प्राप्त करने के लिए और भ्रष्टाचार के अवशोषण को रोकने के क्रम में दोष में कसकर कठोर ऑटोग्राफ़्ट फिक्सिंग है। ऊतक इंजीनियरिंग एक autografting करने के लिए वैकल्पिक रणनीति और सिंथेटिक हड्डी के विकल्प (जैसे हड्डी सीमेंट) 2,3 के रूप में जांच की गई है। एक ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण संपत्तियों की एक विशिष्ट सेट के साथ एक पाड़ है। सबसे पहले, osseointegration प्राप्त करने के लिए, पाड़ आसन्न हड्डी के ऊतकों 4 के साथ निकट संपर्क फार्म चाहिए। पाड़ भी सेल प्रवास, पोषक तत्व प्रसार और neotissue बयान 4,5 की अनुमति, osteoconductive होना चाहिए। यह व्यवहार आम तौर पर biodegradable के एससीए के साथ हासिल की हैffolds एक अत्यधिक परस्पर ताकना आकृति विज्ञान का प्रदर्शन। हड्डी के ऊतकों 5 आसपास के साथ एकीकरण और संबंधों को बढ़ावा देने के रूप में तो अन्त में, पाड़ बायोएक्टिव होना चाहिए।

यहाँ, हम इन गुणों के साथ एक ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। महत्वपूर्ण बात, इस पाड़ इसका आकार स्मृति व्यवहार 6 के कारण अनियमित सीएमएफ दोष में "आत्म फिट" करने की क्षमता को दर्शाती है। Thermoresponsive आकार स्मृति पॉलिमर (एसएमपीएस) 7.8 गर्मी के लिए जोखिम पर आकार परिवर्तन से गुजरना करने के लिए जाना जाता है। SMPs स्थायी आकार और अस्थायी आकार को बनाए रखने और स्थायी आकार की वसूली जो "स्विचन खंडों" निर्धारित "जो netpoints" (यानी रासायनिक या शारीरिक crosslinks) के शामिल हैं। स्विचिंग खंडों या तो कांच संक्रमण (टी जी) को इसी थर्मल संक्रमण तापमान (टी ट्रांस) दिखा रहे हैं या बहुलक का संक्रमण (टी एम) पिघला। जैसापरिणामस्वरूप, SMPS क्रमिक रूप से टी <टी ट्रांस पर अस्थायी आकार में तय टी> टी ट्रांस पर एक अस्थायी आकार में विकृत, और टी> टी ट्रांस पर स्थायी आकार को बरामद किया जा सकता है। 6 प्रकार के रूप में इस प्रकार, एक SMP पाड़ एक सीएमएफ दोष के भीतर "आत्म-ढाले" को प्राप्त कर सकता है। प्रदर्शन के बाद खारा (टी> टी ट्रांस), एक एसएमपी पाड़ आकार वसूली दोष सीमा को पाड़ के विस्तार को बढ़ावा देने के साथ, हाथ से दबाया एक अनियमित दोष में होने का एक सामान्य रूप से तैयार बेलनाकार पाड़ की अनुमति, निंदनीय बन जाएगा गर्म करने के लिए। (टी <टी ट्रांस) ठंडा करने पर, पाड़ आकार स्थिरता दोष के भीतर अपनी नई अस्थायी आकार को बनाए रखने के साथ, अपने अपेक्षाकृत अधिक कठोर राज्य के लिए वापस कर देगा। इस प्रोटोकॉल में, एक SMP पाड़ एक biodegradable बहुलक ऊतक उत्थान और अन्य जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों 9-11 के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन, पॉलिकैप्रोलैक्टोन (पीसीएल) से तैयार किया जाता है। आकार स्मृति के लिए, वेंपीसीएल के ई टी एम टी किन्नर के रूप में कार्य करता है और पीसीएल 12 की आणविक वजन पर निर्भर करता है, 43 और 60 डिग्री सेल्सियस के बीच होती है। इस प्रोटोकॉल में, पाड़ के टी किन्नर (यानी टी एम) 56.6 ± 0.3 डिग्री सेल्सियस 6 है।

Osteoconductivity को प्राप्त करने के लिए, एक प्रोटोकॉल एक विलायक के कास्टिंग कण-लीचिंग (SCPL) विधि 6,13,14 के आधार पर अत्यधिक परस्पर pores के साथ पीसीएल-आधारित एसएमपी मचानों बनाने के लिए विकसित किया गया था। पॉलिकैप्रोलैक्टोन diacrylate (पीसीएल-डीए) (एम एन = ~ 10,000 जी / मोल) तेजी से, प्रकाश रासायनिक तिर्यक की अनुमति के लिए उपयोग किया गया था और नमक टेम्पलेट से अधिक विलायक कास्टिंग अनुमति देने के लिए क्लोराइड (डीसीएम) में भंग कर दिया गया था। प्रकाश रासायनिक इलाज और विलायक वाष्पीकरण के बाद, नमक टेम्पलेट पानी में leaching द्वारा हटा दिया गया था। औसत नमक आकार पाड़ छेद के आकार को नियंत्रित करता है। महत्वपूर्ण बात है, नमक टेम्पलेट से पहले ताकना interconnectivi को प्राप्त करने के कास्टिंग विलायक के लिए पानी के साथ जुड़े हुए थाTy।

Bioactivity ताकना दीवारों 6 पर एक परत polydopamine की सीटू गठन में से एसएमपी पाड़ को प्रशिक्षण दिया गया। Bioactivity अक्सर गिलास या कांच सिरेमिक fillers 15 के शामिल किए जाने से मचानों में शुरू की है। हालांकि, इन अवांछित भंगुर यांत्रिक गुणों को जन्म दे सकता है। डोपामाइन substrates 16-19 की एक किस्म पर एक पक्षपाती, पतली polydopamine परत के रूप में दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एसएमपी पाड़ सभी ताकना दीवार सतहों 6 पर polydopamine की nanothick कोटिंग के रूप में करने के लिए डोपामाइन का एक थोड़ा बुनियादी समाधान (पीएच = 8.5) के अधीन था। सुधार हुआ कोशिका आसंजन के लिए सतह hydrophilicity बढ़ाने और प्रसार के अलावा, polydopamine नकली शरीर के तरल पदार्थ (एसबीएफ) 18,20,21 के लिए जोखिम पर हाइड्रॉक्सियापटाइट के गठन (पड़ना) के मामले में बायोएक्टिव होना दिखाया गया है। एक अंतिम चरण में, लेपित पाड़ 85 डिग्री सेल्सियस (टी> टी ट्रांस) क में उपचार गर्मी से अवगत कराया हैआईसीएच densification पाड़ की ओर जाता है। गर्मी उपचार पहले से पीसीएल क्रिस्टलीय डोमेन के करीब निकटता से 14 पुनर्गठन शायद की वजह से, पाड़ आकार स्मृति व्यवहार के लिए आवश्यक होने का उल्लेख किया गया था।

हम इसके अतिरिक्त, एक अनियमित मॉडल दोष भीतर आत्म-ढाले व्यवहार की विशेषताएँ संदर्भ में तनाव नियंत्रित चक्रीय थर्मल यांत्रिक संपीड़न परीक्षण स्मृति व्यवहार आकार (यानी आकार वसूली और स्थिरता आकार) के लिए विधियों का वर्णन आकृति विज्ञान ताकना, और इन विट्रो bioactivity में। पाड़ गुण से तैयार करने की रणनीति भी प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Protocol

1. synthesizing पीसीएल-डीए macromer

  1. Acrylation प्रतिक्रिया चलाएँ।
    1. एक Teflon से ढके चुंबकीय हलचल पट्टी से लैस एक 250 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क में पीसीएल-diol (एम एन = ~ 10,000 जी / मोल) की 20 ग्राम वजन।
    2. डीसीएम में पीसीएल-diol भंग।
      1. कुप्पी के लिए 120 mLlof डीसीएम जोड़ें (एकाग्रता = 0.17 छ / एमएल)।
      2. यह भी डीसीएम के वाष्पीकरण को रोकने, जबकि दबाव का निर्माण हुआ से बचने के लिए कुप्पी की गर्दन में शिथिल एक रबर पट रखें।
      3. ~ 250 rpm पर 30 मिनट के ~ लिए हलचल समाधान पूरी तरह से बहुलक भंग करने के लिए।
    3. समाधान के लिए 4-dimethylaminopyridine (DMAP) की ~ 6.6 मिलीग्राम जोड़ें और सरगर्मी के साथ भंग।
    4. कुप्पी की गर्दन में सुरक्षित रूप से एक रबर पट रखें। समाधान सरगर्मी जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं।
    5. रबर पट के माध्यम से, धीरे से एक सकारात्मक एन 2 दबाव सुई इनलेट और एक खुले सुई का उपयोग करके ~ 3 मिनट के लिए एन 2 के साथ कुप्पी शुद्धएक दुकान के रूप में।
    6. एन 2 इनलेट और आउटलेट निकालें।
    7. रबर पट के माध्यम से डाला एक सुई से लैस एक गिलास सिरिंज के माध्यम से triethylamine के 0.56 मिलीलीटर (4.0 mmol) (n एट 3) dropwise जोड़ें।
    8. रबर पट के माध्यम से डाला एक सुई से लैस एक गिलास सिरिंज के माध्यम से acryloyl क्लोराइड dropwise के 0.65 मिलीलीटर (8.0 mmol) जोड़ें।
    9. फ्लास्क एन 2 इनलेट लौटें और सामग्री ~ के लिए सकारात्मक एन 2 दबाव में 30 मिनट के लिए हलचल करने के लिए अनुमति देते हैं।
    10. 55 डिग्री सेल्सियस के लिए एक तेल स्नान पूर्व गर्मी।
    11. आवंटित ~ 30 मिनट के बाद, एन 2 इनलेट हटाने और एक कंडेनसर साथ पट जगह।
    12. पूर्व गर्म तेल स्नान में कुप्पी डूब।
    13. कुप्पी की सामग्री को 20 घंटे के लिए हलचल करने की अनुमति दें।
    14. निर्धारित 20 घंटे के बाद, तेल स्नान से कुप्पी को हटाने और सामग्री आरटी के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
    15. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करना, कुप्पी से डीसीएम विलायक हटा दें।
  2. पीकच्चे तेल की पीसीएल-डीए उत्पाद urify।
    1. फ्लास्क, एथिल एसीटेट की ~ 135 मिलीलीटर जोड़ने और कच्चे तेल पीसीएल-डीए भंग।
    2. गुरुत्वाकर्षण एक स्वच्छ 250 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क में फिल्टर पेपर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर। (नोट: समाधान आसानी से गुजरने वाली नहीं, फिल्टर पेपर पर मोटा होना हो सकता है तो, ध्यान से एक हीटिंग बंदूक के साथ हल्की गर्मी लागू होते हैं।)।
    3. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करना, कुप्पी से विलायक एथिल एसीटेट हटा दें।
    4. फ्लास्क, ~ डीसीएम की 140 मिलीलीटर जोड़ने और कच्चे तेल पीसीएल-डीए भंग।
    5. एक 500 मिलीलीटर जुदा कीप करने के लिए सामग्री हस्तांतरण।
    6. कीप, 2 एम पोटेशियम कार्बोनेट (3 कश्मीर 2 सीओ) की 13.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. कीप टोपी। धीरे पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से दबाव जारी है, देखभाल करने के कीप inverting और धीरे से एक या दो बार घूमता द्वारा दो परतों मिश्रण। 3 बार दोहराएँ।
    8. Parafilm की एक परत के साथ टोपी की जगह और मिश्रण हे / एन (~ 12 घंटा) को अलग करने की अनुमति देते हैं।
    9. नीचे ले लीजिए, याएक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में ganic परत।
    10. कुप्पी के लिए निर्जल मैग्नीशियम सल्फेट के ~ 5 जी (MgSO 4) जोड़ें और धीरे ज़ुल्फ़।
    11. गुरुत्वाकर्षण दौर नीचे कुप्पी गुणात्मक फिल्टर पेपर के माध्यम से और एक साफ 250 मिलीलीटर में मिश्रण फिल्टर।
    12. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करना, कुप्पी से डीसीएम विलायक हटा दें।
    13. उच्च वैक्यूम के अंतर्गत सूखी अवशिष्ट डीसीएम हटाने के लिए। (नोट: पीसीएल-डीए प्रकाश से दूर रखा जाना चाहिए।)
    14. 1 एच एनएमआर 22,23 साथ acrylation की पुष्टि करें।

एसएमपी पाड़ तैयारी 2. (चित्रा 1)

  1. जुड़े हुए नमक टेम्पलेट तैयार करें।
    1. व्यास में ~ 460 ± 70 माइक्रोन सोडियम क्लोराइड (NaCl) कणों को प्राप्त करने के लिए एक 425 माइक्रोन चलनी का प्रयोग करें। (नोट: औसत कण आकार ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [SEM] छवियों से इस बात की पुष्टि की जा सकती है।) 14
    2. एक 3 मिलीलीटर कांच की शीशी (आईडी = 12.9 मिमी) करने के लिए, पहले से sieved NaCl के 1.8 ग्राम जोड़ें।
    3. धीरे धीरे शीशी को चार भागों, 7.5% wt (नमक वजन के आधार पर) डि पानी (0.146 छ) में, जोड़ें। पानी के प्रत्येक भाग के अलावा के बाद एक धातु रंग के साथ मिलाएं।
    4. , शीशी कैप ऊतक में लपेट और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में खड़ी जगह है। 3220 x जी पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. टोपी निकालें और हवा शुष्क हे / एन (~ 12 घंटा) करते हैं।
  2. एक नया कांच की शीशी में, डीसीएम की मिलीलीटर प्रति पीसीएल-डीए के 0.15 छ संयोजन के द्वारा एक "macromer समाधान 'तैयार करते हैं। (नोट:। एक पाड़ के लिए, ~ समाधान के 1 मिलीलीटर तैयार किया जाना चाहिए) कैप और ~ 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर उच्च गति से समाधान मिश्रण।
  3. एक नया 3 मिलीलीटर कांच की शीशी में, 10 भार% 2,2-dimethoxy-2-फिनाइल acetophenone 1-विनाइल-2-pyrrolidinone में (DMP) (एनवीपी) के आधार पर एक "photoinitiator समाधान 'तैयार करते हैं। एनवीपी के 1 मिलीलीटर में DMP के 0.115 ग्राम का मिश्रण। (प्रकाश ब्लॉक करने के लिए) एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट, कैप और एक भंवर मिक्सर पर उच्च गति से समाधान का मिश्रण: (180 μl की आवश्यकता है ~, एक पाड़ के लिए। नोट)~ 1 मिनट के लिए। (नोट: उन्नत में तैयार करते हैं, तो समाधान प्रशीतित और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।)
  4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ (टोपी को छोड़कर) macromer समाधान युक्त शीशी लपेटें (प्रकाश ब्लॉक करने के लिए) और पिपेट के माध्यम से 15 वॉल% जोड़ने photoinitiator समाधान की (macromer समाधान की कुल मात्रा के आधार पर)। कैप और ~ 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर उच्च गति से समाधान मिश्रण।
  5. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ (टोपी को छोड़कर) में जुड़े हुए नमक टेम्पलेट युक्त शीशी लपेटें (प्रकाश ब्लॉक करने के लिए) और पिपेट के माध्यम से पहले से तैयार macromer / photoinitiator समाधान जोड़ने (~ 0.6 मिलीलीटर या टेम्पलेट जब तक पूरी तरह से कवर किया जाता है)।
  6. , शीशी कैप ऊतक में लपेट और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में खड़ी जगह है। टेम्पलेट भर macromer समाधान वितरित करने के लिए 1,260 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  7. , एल्यूमीनियम पन्नी निकालें शीशी खुलना और 3 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम, 25 डब्ल्यू) को बेनकाब। हवा शुष्क हे / एन।
  8. "नमक युक्त scaffol हटायेस्कोरिंग और कांच की शीशी के शीर्ष fracturing के बाद चिमटी के साथ शीशी से डी "।
  9. (1 खंड: खंड 1) एक 400 मिलीलीटर बीकर में, ~ विलायक एक पानी / इथेनॉल के 200 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
  10. दैनिक विलायक परिवर्तन के साथ 4 दिनों के लिए विलायक पानी / इथेनॉल में डूबे हुए पाड़ को बनाए रखें।
  11. विलायक और हवा शुष्क हे / एन से पाड़ निकालें।

3. एसएमपी पाड़ को polydopamine कोटिंग लागू (चित्रा 1)

  1. एक Teflon से ढके हलचल पट्टी से लैस 400 मिलीलीटर बीकर में, एक डोपामाइन हाइड्रोक्लोराइड के समाधान के ~ 200 मिलीलीटर (10 मिमी Tris बफर में 2 मिलीग्राम / एमएल, पीएच = 8.5, 25 डिग्री सेल्सियस) तैयार करते हैं। ~ 150 rpm पर हिलाओ।
  2. आधी दूरी पाड़ के माध्यम से पाड़ में, ~; एक डिस्पोजेबल सुई (गेज = 20 = लंबाई 40 मिमी) रखें। सुई हब के चारों ओर एक तार लपेटें।
  3. बीकर की रिम को तार प्रस्तोता द्वारा सरगर्मी डोपामाइन समाधान में (समाधान सतह से ऊपर सुई हब के साथ) पाड़ डूब।
  4. सुई हब में एक सिरिंज रखने और पाड़ की हवा बाहर खींचने के लिए इसे का उपयोग करके पाड़ देगास। (नोट: कोई और अधिक हवा हटाया जा सकता है और समाधान पूरी तरह से पाड़ घुसपैठ की है जब Degassing पूरा हो गया है।)
  5. 16 घंटे के लिए सरगर्मी डोपामाइन के घोल में डूबे हुए पाड़ को बनाए रखें।
  6. समाधान से पाड़ निकालें और सुई को हटा दें। 24 घंटे के लिए आरटी पर एक वैक्यूम ओवन में डि पानी और सूखे से कुल्ला।
  7. 1 घंटे के लिए एक 85 डिग्री सेल्सियस ओवन में पाड़ रखें।
  8. पाड़ आरटी को शांत करने की अनुमति दें। अंतिम बेलनाकार पाड़ ~ 6 मिमी व्यास x ~ 5 मिमी ऊंचाई हो जाएगा।

4. मूल्यांकन "स्व-ढाले" व्यवहार

  1. जिनकी मोटाई ~ 5 मिमी है कठोर प्लास्टिक की एक शीट का उपयोग कर एक "अनियमित सीएमएफ दोष मॉडल" तैयार करें। चित्रा 2A में प्रदर्शन के रूप में, ~ 6 मिमी की तुलना में थोड़ा कम एक औसत व्यास के साथ प्लास्टिक की चादर के भीतर एक शून्य पैदा करने के लिए एक ड्रिल का प्रयोग करें।
  2. एबी मेंEaker, ~ 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर (खारा के नैदानिक ​​प्रयोग का प्रतिनिधित्व) गर्मी डि पानी।
  3. के बीकर ~ 60 डिग्री सेल्सियस पानी में पाड़ रखें। पानी के लिए सभी क्षेत्रों को उजागर करने, पानी की सतह के नीचे पाड़ पुश करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें। ~ 2 मिनट के लिए या पाड़ काफ़ी (चित्रा 2 बी) नरम है जब तक जारी रखें।
  4. बीकर से पाड़ निकालें और तुरंत मॉडल दोष में (हाथ से) दबाएँ।
  5. आर टी (~ 5-10 मिनट) (चित्रा -2) को शांत करने के लिए अनुमति दें।
  6. नई, तय अस्थायी आकार और अपेक्षाकृत अधिक कठोर राज्य (चित्रा 2 डी) की वापसी का निरीक्षण करने के दोष से निकालें।

5. परीक्षण आकार मेमोरी व्यवहार

  1. एक गतिशील यांत्रिक विश्लेषक का उपयोग (डीएमए, इस के साथ साथ उपयोग के रूप में जैसे एक प्रादेशिक सेना इंस्ट्रूमेंट्स Q800), दो चक्र (एन) के आकार स्थिरता (आर एफ) निर्धारित करने के लिए और अधिक से अधिक एक पाड़ पर एक दबाव नियंत्रित चक्रीय थर्मल यांत्रिक संपीड़न परीक्षण चलानेवसूली (आर आर) (चित्रा 3) आकार।
    1. 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस (टी उच्च) को संतुलित करना।
    2. 50% / मिनट पर एक अधिकतम तनाव मीटर = 50%) करने के लिए संक्षिप्त।
    3. Ε मीटर (5 मिनट) पर पकड़ो।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस (टी कम) के लिए कूल और 10 मिनट के अस्थायी आकार तय करने के लिए बनाए रखें।
    5. लोड निकालें।
    6. (यू ε) तनाव मुक्त राज्य में परम तनाव को मापने।
    7. 60 डिग्री सेल्सियस (टी उच्च) को गर्म कर लें और 10 मिनट के स्थायी आकार को ठीक करने के लिए बनाए रखें।
    8. बरामद तनाव पी) को मापने।
    9. अभी भी (टी उच्च) 60 डिग्री सेल्सियस पर, 2 एन डी चक्र शुरू (एन = 2) 1 सेंट चक्र के बाद बरामद ऊंचाई (एन = 1) के 50% के पाड़ compressing द्वारा है।
    10. 5.1 दोहराएँ.3-5.1.8 एन = 2 के लिए।
    11. निम्न समीकरण का उपयोग एन = 1 और 2 के लिए आर एफ और आर आर की गणना:
      आर एफ (एन) = [यू ε (एन) / ε एम] आर आर (एन) = एम - ε पी (एन)] / एम - ε पी (एन -1)]

6. Visualizing ताकना आकार और ध्यान में लीन होना इंटरकनेक्टिविटी

  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का प्रयोग (SEM, जैसे इस के साथ साथ इस्तेमाल के रूप में एक फी क्वांटा SEM), छेद के आकार का निरीक्षण और इंटरकनेक्टिविटी ताकना।
    1. चिमटी का प्रयोग, एसएमपी पाड़ पकड़ 1 मिनट के लिए तरल एन 2 में डूब।
    2. एक साफ धार के साथ पाड़ के बीच के साथ तरल एन 2 और फ्रैक्चर से निकालें।
    3. कार्बन टेप का उपयोग करना, नमूना पर एसएमपी पाड़ हिस्सों में से एक प्रत्ययखंडित सतह का सामना करना पड़ के साथ मंच।
    4. Au-पंडित (~ 4 एनएम) के साथ कोट धूम।
    5. 10-15 केवी (चित्रा -4 ए) की एक सिफारिश को तेज वोल्टेज पर SEM छवि पर कब्जा।

इन विट्रो bioactivity 7. परीक्षण

  1. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, ~ 1X एसबीएफ 24 से 30 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. अपने मूल, cylindrically-ढाला स्थायी आकार में एक पाड़ प्राप्त करते हैं। एक साफ ब्लेड का उपयोग (परिपत्र बढ़त के पार) छमाही में पाड़ कट।
  3. तैयार अपकेंद्रित्र ट्यूब और टोपी में एक व्यक्ति पाड़ आधा रखें।
  4. कोई एसबीएफ परिवर्तन के साथ स्थिर परिस्थितियों में एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब बनाए रखें।
  5. 14 दिनों के बाद, 24 घंटे के लिए एसबीएफ और शुष्क हवा से पाड़ को हटा दें।
  6. कार्बन टेप का उपयोग करना, खंडित सतह का सामना करना पड़ के साथ नमूना मंच पर पाड़ प्रत्यय।
  7. Au-पंडित (~ 4 एनएम) के साथ कोट धूम।
  8. एक फिर से SEM छवि पर कब्जा10-15 केवी (चित्रा 4 बी) की गति तेज वोल्टेज की सराहना की।

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Representative Results

जिसके परिणामस्वरूप पीसीएल-आधारित एसएमपी पाड़ आत्म-ढाले एक मॉडल सीएमएफ दोष में (चित्रा 2) के लिए सक्षम है। संक्षिप्त प्रदर्शन के बाद खारा (~ 60 डिग्री सेल्सियस) गर्म करने के लिए, बेलनाकार पाड़ पाड़ मैन्युअल में दबाया और मॉडल दोष भीतर का विस्तार करने की अनुमति softens। आरटी के लिए ठंडा करने के बाद, पाड़ दोष से हटाने पर बनाए रखा है जो अपनी नई अस्थायी आकार में तय हो गई है।

एक SMP पाड़ के आकार स्मृति व्यवहार आकार स्थिरता (आर एफ) और आकार वसूली (आर आर) (चित्रा 3) के मामले में तनाव नियंत्रित चक्रीय थर्मल यांत्रिक संपीड़न परीक्षण द्वारा मात्रा निर्धारित है। इस पीसीएल-आधारित एसएमपी पाड़ के लिए, चक्र के लिए मान (%) एन = 1 और 2 प्रकार हैं: आर एफ (1) = 102.5 0.7, आर एफ (2) = 101.8 0.3, आर आर (1) 95.3 0.9, और आर आर (2) 99.8 0.2 6 =।

मनाया के रूप में एसएमपी पाड़ एक अत्यधिक परस्पर ताकना आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता हैSEM इमेजिंग द्वारा (चित्रा 4 क)। इस sieved नमक को पानी की एक छोटी राशि (चित्रा 1) के अलावा द्वारा गठित एक दूसरे से जुड़ने नमक टेम्पलेट का उपयोग करते हैं, के द्वारा प्राप्त किया गया था।

नकली शरीर के तरल पदार्थ के संपर्क में आने के बाद 14 दिनों के लिए (एसबीएफ 1X), SEM इमेजिंग जिससे पाड़ bioactivity का संकेत पड़ना (चित्रा 4 बी) के गठन की पुष्टि करता है।

चित्र 1
Polydopamine। ASMP पाड़ के साथ लेपित एसएमपी पाड़ की तैयारी के लिए चित्रा 1. योजनाबद्ध नमक टेम्पलेट जुड़े हुए रोजगार पॉलिकैप्रोलैक्टोन diacrylate (पीसीएल-डीए) एक विलायक के कास्टिंग कण-लीचिंग (SCPL) विधि का उपयोग कर के प्रकाश रासायनिक इलाज के आधार पर वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से निर्मित है और एक बायोएक्टिव परत polydopamine के आवेदन। 85 डिग्री सेल्सियस (टी> टी ट्रांस) पर अंतिम गर्मी उपचार पाड़ मांद लाती हैsification। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
आत्म-ढाले व्यवहार की चित्रा 2. अवलोकन। एक बेलनाकार एसएमपी पाड़ (~ x ~ 5 मिमी ऊंचाई 6 मिमी व्यास) एक "अनियमित दोष मॉडल" के भीतर लगाया जाता है (ए) के रूप में इस प्रकार है। पानी में हीटिंग पर ~ 60 डिग्री सेल्सियस (टी> टी ट्रांस), पाड़ softens और मॉडल दोष (सी) के भीतर ("फिट") यंत्रवत् दबाया जा सकता है, इस प्रकार (बी) निंदनीय है और हो जाता है। आर टी को ठंडा करने के बाद, एसएमपी पाड़ हटा दिया है और अपने नए, तय अस्थायी आकार (डी) को बरकरार रखे हुए है। ~ 60 डिग्री सेल्सियस पर बाद में हीटिंग पर, पाड़ मूल, जेनेरिक बेलनाकार आकृति के आकार वसूली से होकर गुजरती है।

चित्र तीन
आकार स्मृति व्यवहार की चित्रा 3. मापन। एक एसएमपी पाड़ के आकार स्मृति व्यवहार आकार स्थिरता (आर एफ) पर आधारित है और आकार वसूली (आर आर) निर्धारित करने के लिए एक पाड़ पर एक दबाव नियंत्रित चक्रीय थर्मल यांत्रिक संपीड़न परीक्षण के माध्यम से मात्रा निर्धारित है ε मीटर की माप, ε यू, और ε पी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
पोर 4. अवलोकन चित्राई इंटरकनेक्टिविटी और हाइड्रॉक्सियापटाइट (पड़ना) के गठन। एक uncoated, गर्मी का इलाज एसएमपी पाड़ के प्रतिनिधि SEM छवियों (पैमाने बार = 200 माइक्रोन) (ए) और लेपित, 14 दिनों के लिए एसबीएफ (1X) से संपर्क के बाद गर्मी का इलाज पाड़ (पैमाने पर पट्टी = 50 माइक्रोन) (बी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल, जिसका आत्म-ढाले व्यवहार एक polydopamine में लिपटे, पीसीएल-आधारित पाड़ की तैयारी, साथ ही osteoinductivity और bioactivity का वर्णन अनियमित सीएमएफ अस्थि दोष के इलाज के हित में यह बनाता है। प्रोटोकॉल के पहलुओं विभिन्न पाड़ सुविधाओं को बदलने के लिए बदला जा सकता है।

प्रोटोकॉल यूवी इलाज की अनुमति के लिए एक पीसीएल-diol की acrylation के साथ शुरू होता है। सूचना उदाहरण में, पीसीएल-diol एम एन ~ 10,000 जी / मोल है। हालांकि, उचित रूप से पीसीएल-डीए, क्रमशः वृद्धि हुई है, Crosslink घनत्व में कमी या करने के लिए उपयोग किया जा सकता है एक उच्च या निम्न एम एन के साथ एक पीसीएल diol के संश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया acryloyl क्लोराइड की मात्रा और एट 3 एन समायोजन करके।

जुड़े हुए नमक टेम्पलेट प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है। औसत नमक आकार जिसके परिणामस्वरूप पाड़ छेद के आकार को निर्धारित करता है। वर्णित उदाहरण में, औसत नमक आकार का था ~ 460 ± 70 &# 181; मी। एक छोटे नमक आकार का उपयोग किया जा सकता है, यह पाड़ ताकना आकार कम हो जाएगा, जो अंतिम गर्मी उपचार चरण के दौरान संकोचन से होकर गुजरती है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए। नमक की sieving, इसलिए, ध्यान में लीन होना आकार वितरण नमक आकार के वितरण में कमी करने के लिए उपयोग किया जाता है। अत्यधिक परस्पर pores के साथ एक पाड़ उत्पादन करने के लिए, नमक संलयन पानी की एक छोटी राशि के अलावा द्वारा प्रेरित किया गया था (7.5% wt नमक वजन के आधार पर)। यह आंशिक रूप से एक सतत poragen टेम्पलेट 25,26 में पृथक सोडियम क्लोराइड कणों को भंग करने के लिए जाना जाता है। औसत नमक आकार पर निर्भर करता है, पानी जोड़ा राशि 14 समायोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, नमक संलयन के दौरान, पानी धीरे-धीरे, यांत्रिक मिश्रित और अंत में अपनी भी वितरण के साथ-साथ नमक कणों की पैकिंग सुनिश्चित करने के लिए centrifuged जोड़ा जाना चाहिए।

जुड़े हुए नमक टेम्पलेट का गठन करने के बाद, पीसीएल-डीए विलायक ढलाई के लिए डीसीएम में भंग कर रहा है। वर्णित प्रोटोकॉल में, एक concentratioडीसीएम के 1 मिलीलीटर प्रति पीसीएल-डीए की 0.15 ग्राम के n उपयोग किया गया था। यह एकाग्रता में वृद्धि हुई है या कम किया जा सकता है। सांद्रता में वृद्धि पाड़ मापांक वृद्धि की संभावना है, जबकि हालांकि, यह भी कम ताकना इंटरकनेक्टिविटी 14 के साथ मचानों उत्पादन कर सकते हैं।

अग्रदूत समाधान नमक ढालना पर जोड़ा गया है, centrifugation के खाके में इसका प्रसार में सहयोगी के लिए उपयोगी है। तेजी से यूवी इलाज के बाद, हवा सुखाने डीसीएम विलायक के वाष्पीकरण परमिट। नमक टेम्पलेट दूर करने के लिए 4 दिनों के लिए (खंड: 1 खंड 1) मोल्ड से हटाने के बाद, पाड़ पानी / इथेनॉल में लथपथ है। SEM इमेजिंग एक अत्यधिक परस्पर ताकना आकृति विज्ञान (चित्रा -4 ए) के गठन की पुष्टि करता है।

एक परत polydopamine bioactivity प्रदान करने के लिए पाड़ के ध्यान में लीन होना दीवारों से लागू किया जाता है। कारण है, जिसके परिणामस्वरूप पाड़ संकोचन करने के लिए, यह अंतिम गर्मी उपचार चरण 6 से पहले कोटिंग लागू करने के लिए सबसे अच्छा है। इसके अलावा, degassingजलीय डोपामाइन के घोल में डूबे हुए हैं, जबकि पाड़ घुसपैठ सहायता करता है। समाधान में डूबे हुए degassed पाड़ अवशेष वर्दी polydopamine कवरेज की सुविधा के लिए। एक बार में लिपटे और अच्छी तरह से rinsed, पहले सफेद पाड़ polydopamine 21 के एक भूरे रंग विशेषता दर्शाती है। इस प्रकार, पाड़ भर में कवरेज polydopamine प्रसार की पुष्टि के लिए एक पाड़ संयोग से दृश्य निरीक्षण के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

Polydopamine कोटिंग के आवेदन के बाद, एक अंतिम गर्मी उपचार (85 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटा) किया जाता है। बताया गया है, इस प्रक्रिया पाड़ संकोचन में यह परिणाम है। हालांकि, गर्मी उपचार के लिए करीब निकटता में शायद की वजह से पीसीएल क्रिस्टलीय डोमेन (यानी स्विचन खंडों) का पुनर्गठन करने के लिए, आकार स्मृति व्यवहार 14 को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

चित्रा 2 में दिखाया गया है, एसएमपी पाड़ की वजह से मुझे आकार thermoresponsive इसके लिए आत्म-ढाले एक मॉडल के दोष में हासिल कीMory प्रकृति। एक्सपोजर खारा गर्म करने के लिए (~ 60 डिग्री सेल्सियस) नरम पाड़ मॉडल दोष में दबाया जा सकता है कि इस तरह पीसीएल क्रिस्टलीय डोमेन, प्रेरित पिघलने। मैनुअल दबाव जारी किया गया था, आकार वसूली अनियमित सीमाओं को भरने के लिए पाड़ के विस्तार को बढ़ावा दिया। आर टी को ठंडा करने पर, पीसीएल क्रिस्टलीय डोमेन के दोष से हटाने पर बरकरार रखा गया है, जो अपने नए अस्थायी आकार में पाड़ फिक्सिंग, सुधार। इससे पहले, हम हटा दिया पाड़ के किनारों के साथ pores को ढालना 6 के साथ संपर्क के बावजूद काफी खुला रहा कि पुष्टि की।

तनाव नियंत्रित चक्रीय थर्मल यांत्रिक संपीड़न परीक्षण (चित्रा 3), द्वारा मापा जब आदर्श आकार स्मृति व्यवहार में 100% की आर एफ और आर आर मूल्यों की विशेषता है। वर्णित एसएमपी पाड़ के लिए, चक्र 1 और 2 के लिए आर एफ मूल्यों थोड़ा> 100% 6 थे। आर एफ पहले से थोड़ा जीआर होने के लिए मनाया गया है100% 14,27 से अधिक की वजह से कॉम्पैक्ट संरचनाओं 27 में या पीसीएल के संपीड़न प्रेरित recrystallization से पीसीएल खंडों की recrystallization से आकार निर्धारण के दौरान compressive तनाव में एक मामूली वृद्धि करने के लिए भक्षक। इसके अलावा, आर चक्र 2 से 6 चक्र 1 से बढ़ाकर आर। आर आर मूल्यों में वृद्धि पहले से ठोस 28,29,22 और झरझरा SMPs 13,14,23 के लिए उल्लेख किया गया है। यह पहली बार चक्र के दौरान, प्रसंस्करण से होने वाले अवशिष्ट तनाव अगले चक्र में 7 कि इस तरह के आकार वसूली बढ़ जाती है हटा दिया जाता है कि माना जाता है।

वर्णित ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ सीएमएफ अस्थि दोष के सफल उपचार के लिए महत्वपूर्ण गुण के विशिष्ट सेट प्राप्त होता है। पाड़ एक अनियमित सीएमएफ अस्थि दोष के भीतर अपनी क्षमता को "आत्म फिट" के माध्यम से osseointegration की सुविधा होने की उम्मीद है। Osteoconductivity के साथ ही हासिल ताकना इंटरकनेक्टिविटी पर आधारित भविष्यवाणी की हैपाड़ biodegradability। इन विट्रो परीक्षण (चित्रा 4 बी) के दौरान हा के गठन के संकेत के रूप अंत में, कारण polydopamine कोटिंग करने के लिए, पाड़ बायोएक्टिव है। इस bioactivity हड्डी के ऊतकों के आसपास के साथ एकीकरण और संबंधों की सुविधा के लिए भविष्यवाणी की है। इस प्रकार, इस पाड़ सीएमएफ अस्थि दोष मरम्मत के लिए एक autografting करने के लिए वैकल्पिक और पारंपरिक हड्डी के विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।

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Acknowledgements

लेखकों टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय इंजीनियरिंग का शुक्र है और इस शोध के लिए वित्तीय सहायता के लिए स्टेशन (टीज़) प्रयोग। लिंडसे कील कृतज्ञता अल्पसंख्यक भागीदारी के लिए टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय लुई स्टोक्स गठबंधन (LSAMP) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (GRFP) से समर्थन मानता है। दावेई झांग धन्यवाद टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय निबंध फैलोशिप।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) Sigma-Aldrich 440752
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich D65100 Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma-Aldrich D5640
Triethylamine (Et3N) Sigma-Aldrich T0886
Acryloyl chloride Sigma-Aldrich A24109
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 319902
Potassium carbonate (K2CO3) Sigma-Aldrich 209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) Fisher M65
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) Sigma-Aldrich 196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409
Ethanol Sigma-Aldrich 459844
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502
Tris buffer (2mol/L) Fisher BP1759 Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve VWR 47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) UVP 95-0426-02
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) TA Instruments Q800
High Resolution Sputter Coater Cressington 208HR
Scanning Electron Microscope (SEM) FEI Quanta 600

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References

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