استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J. Vis. Exp. (101), e52983, doi:10.3791/52983 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ويتكون الدماغ البشري ما يقدر ب 85 مليار خلية عصبية وأخرى 85 مليار الخلايا غير العصبية بما في ذلك الدبقية 1. بالنسبة للجزء الأكبر من السنوات ال 100 الماضية ركزت علماء الأعصاب في الغالب على سكان الخلية العصبية، واعتبرت الخلايا الدبقية أن يكون أكثر قليلا من خلايا الدعم السلبي التي قدمت الدعم الهيكلي للخلايا العصبية - وبالتالي انجليزيه اليوناني "الدبق" مترجمة إلى الإنجليزية "الغراء". في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن العصبية الدبقية التفاعلات قد تكون أكثر أهمية بكثير من الجوانب الأساسية لعلم الأعصاب، علم وظائف الأعصاب، ونشأة وتطور العديد من الأمراض العصبية. خلايا المخيخ الحبيبية (CGCs)، والأكثر وفرة السكان العصبية متجانسة في الدماغ البشري، تهيمن على المخيخ ويشكلون أكثر من 90٪ من مكونات الخلوية لها. ونتيجة لذلك، وقد استخدمت هذه الخلايا على نطاق واسع في المختبر كنظام نموذج لروقال انه دراسة التنمية العصبية، وظيفة، وعلم الأمراض 2-6.

ومع ذلك، ثقافات CGC لا تزال تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الأخرى بنسب كبيرة يمكن القول. ونتيجة لذلك، البيانات CGC عرض مزعومة الردود العصبية المباشرة للعلاجات مختلفة من الخلايا في الواقع قد تنشأ - في جزء أو في المجموع - من الاستجابة الثانوية غير المباشرة للالدبقية المجاورة في الثقافة. لتقييم ذلك، فإننا القضاء بشكل انتقائي دبيقي من CGC الثقافات العصبية بمساعدة-L يسين استر الميثيل (LME). LME هو عامل lysomotropic في الأصل تستخدم لتدمير انتقائي الضامة ومنذ ذلك الحين استخدمت لتستنزف أيضا بشكل انتقائي الخلايا الدبقية الصغيرة من العصبية، نجمية، والثقافات الدبقية مختلطة 8،9،10. والمنضوية LME الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة، حيث أنه يسبب اضطراب الليزوزومية وموت الخلايا المبرمج اللاحقة 13،14. الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة غنية مميز في الجسيمات الحالة، مما تسبب لها أن تكون particulaعرضة RLY عند التعرض للعلاج LME. يوفر هذا البروتوكول وسيلة قوية، ولكن بسيطة وسهلة للتأكد من مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في التجارب باستخدام CGC وغيرها من نظم ثقافة الدبقية / العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع التجارب الموصوفة هنا وفقا للالمملكة المتحدة الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986.

1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

  1. إعداد اثنين مختبر الفولاذ المقاوم للصدأ مقص تشريح واثنين من الفولاذ المقاوم للصدأ ملقط المختبر. الأوتوكلاف جميع الصكوك ومكان في O الثقافة هود / N تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) النور للتعقيم.
  2. جعل 500 مل من وسائل الإعلام الحد الأدنى الضروري (MEM) مستنبت (10٪ من الجنين مصل بقري [FBS]، 20 ملي بوكل، 25 ملي NaHCO 30 ملي مد الجلوكوز، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين و 6 ميكروغرام / مل الأمبيسلين) وفلتر تعقيم. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة أشهر.
  3. إعداد 24 لوحات ثقافة جيدا تحتوي على 14 مم، عدد 1 coverslips سمك. الأوتوكلاف لل coverslips ومعطف في 100 ملغ / L بولي د يسين (PDL) كما هو موضح سابقا 3. ضوء الأشعة فوق البنفسجية تعقيم O / N.

2. إعداد حلول CGC الثقافة

  1. إعداد 'حل A' (100 مل) في تعقيمها، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية المعالجة، درهم العقيمة 2 O تحتوي على 250 ملغ من الجلوكوز، 300 ملغ من الأبقار مصل الزلال [BSA]، 955 ملغ من الفوسفات مخزنة المالحة [PBS] (كا 2+ و ملغم + مجاني)، و 1 مل من 3.8٪ MgSO 4 · 7H 2 O.
  2. إعداد 'حل B' (10 مل) تحتوي على 1 مل من 5 ملغ / مل التربسين المخفف في 9 مل من محلول A.
  3. إعداد 'حل C "(10 مل) التي تحتوي على 1000 وحدة الدناز، و 0.5 ملغ من مثبط التربسين فول الصويا، و 100 ميكرولتر من 3.8٪ MgSO 4 · 7H 2 O، تضعف إلى 10 مل مع حل A.
  4. إعداد 'الحل D' (20 مل) تحتوي على 3.2 مل من محلول C، مخففة إلى 20 مل مع حل A.
  5. تحضير محلول الملح المتوازن (EBSS) حل BSA / ايرل تحتوي على EBSS، 25 ملي NaHCO 3 ملي MgSO 4 · 7H 2 O، و4٪ BSA، ودرجة الحموضة 7.4، كما هو موضح سابقا 3.
  6. إعداد LME بإضافة النقي LME إلى 5 مل من MEM مستنبت لإعطاء تركيز النهائي من 150 ملي LME، وعودة حل لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام الفوق متر الرقم الهيدروجيني، وتصفية تعقيم باستخدام 28 ملم البولي سلفون (PES) 0.2 ميكرومتر حقنة التصفية.

3. استزراع CGCs

  1. جمع مخيخات من الجراء 4-7 يوم الفئران القديمة كما هو موضح سابقا 3. المكان على الفور في طبق بتري تحتوي على 5 مل من محلول A على الجليد.
  2. تخلصي حل الزائدة من مخيخات ومكان الأنسجة في طبق بتري غطاء.
  3. ختم الأنسجة بدقة بشفرة حلاقة ملتهب بشكل جيد على الأقل في ثلاثة اتجاهات مختلفة.
  4. إضافة الأنسجة المفروم إلى حل B (شطف طبق بيتري مع حل لضمان الأنسجة محدودة، خسر) ومكان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يهز بلطف كل بضع دقائق.
  5. إضافة الحل D (20 مل) إلى أنبوب لتحييد التربسين، ويهز المائةrifuge في 65 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. تخلصي من طاف.
  7. resuspend في 4 مل من محلول C. يسحن جيدا (ما يقرب من 10 في كل مرة) مع ثلاثة الماصات الزجاجية ملتهب من تناقص القطر، وحتى تعليق غير متجانسة بقدر الإمكان.
  8. ببطء وبلطف إضافة بضع قطرات من هذا جناسة على رأس BSA / EBSS. إذا كان يبدأ في الغرق خلال BSA / EBSS، يسحن أكثر و / أو إضافة أكثر من ذلك بقليل حل C. جناسة يجب الجلوس في طبقة على رأس BSA / EBSS. لا تهزه. تدور في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
  9. إزالة وطاف Resuspend بيليه (لينة) في 1 مل من MEM المتوسطة.
  10. عد الخلايا باستخدام haemocytometer وطبق على 800000 خلية / ساترة في 500 ميكرولتر من MEM المتوسطة. مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 6٪ CO 2.
  11. تغيير المتوسطة في اليوم التالي (24-36 ساعة بعد الإعدادية). جعل حل MEM المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر من دورة الخلية المانع arabinofuranosyl سيتيدين (أراك).
    1. لكلساترة، في الحفاظ على 250 ميكرولتر من متوسط ​​العمر في طازجة 24 لوحة جيدا، نضح بقية، إضافة 250 ميكرولتر من الطبيعي المتوسطة MEM ونضح هذا لغسل الخلايا، ثم إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​القديم مرة أخرى إلى الخلايا وتصل أعلى مع 250 ميكرولتر من التي تحتوي على أراك المتوسطة.
      ملاحظة: خلايا يمكن استخدامها من 6 أيام في المختبر (DIV).

4. انتقائي استنزاف الخلايا الدبقية الصغيرة (أجريت في 6 DIV)

  1. إضافة LME النقي إلى 5 مل من قسامة منفصلة من MEM المتوسطة لإعطاء تركيز النهائي من 150 ملي LME.
  2. العودة الحل لدرجة الحموضة 7.4 وتصفية تعقيم باستخدام 28 ملم البولي سلفون (PES) مرشح 0.2 ميكرومتر حقنة.
  3. تمييع الحل إلى تركيز من 50 ملم (2 × LME) في MEM المتوسطة ومكان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع العادي المتوسطة MEM للثقافات السيطرة.
  4. إزالة نصف (250 ميكرولتر) وسيلة MEM من الثقافات CGC والاحتفاظ بها في 37 ° C.
  5. خلايا علاجمع MEM المتوسطة التي تحتوي على 2 × LME (250 ميكرولتر)، أي المخفف 1: 1 إعطاء تركيز جيد من 25 ملم، أو مع درجة حرارة متوسطة قبل MEM دون LME (250 ميكرولتر) للثقافات السيطرة.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع CO 2 6٪ لمدة 1 ساعة.
  7. غسل الخلايا مرتين في جديدة قبل حرارة متوسطة MEM لإزالة LME التي تحتوي على وسائل الإعلام، ومن ثم استبدال مستنبت المدورة وحجم مساو من جديد قبل حرارة متوسطة MEM إلى الآبار المقابلة.
  8. عودة الثقافات إلى الحاضنة (مرطب مع CO 2 6٪ عند 37 درجة مئوية) وتترك لبقية لمدة 24 ساعة قبل أي علاج آخر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قدرة هذه التقنية للقضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي من CGC و / أو ثقافات مختلطة تعتمد على قدرة لاحقة من المحقق لتحديد بدقة وتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة من الخلايا المحيطة بها. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام صانع خلية دبيقي محددة، مثل isolectin-B4، كما هو موضح في الشكل رقم 1. وكما هو موضح في الشكل رقم 2، لم تسجل أية التغيرات الملحوظة في نجمية وكثافة الخلايا العصبية والتشكل مع الاحترام لكل مجموعة العلاج الرئيسي. الأهم من ذلك، لوحظ عدم حدوث تغير كبير في مورفولوجيا الخلايا العصبية أو نجمي الخلايا عندما تعامل مع الثقافات LME وحده، ودعم العمل دبيقي محددة للمجمع. الشكل 3A يظهر أي تغييرات ملحوظة في كثافة نجمية والتشكل من القوارض الأساسي ثقافة نجمية 12، ولكن لا عرض فقدان الخلايا الدبقية الصغيرة الملوثة. في الشكل 3B، كما هو الحال في A، أي تغييرات في astrocyوشوهدت كثافة الشركة المصرية للاتصالات والتشكل. ومع ذلك، لوحظ وجود خسارة في تلويث عدد دبقية للتفاعل. للحصول على وصف موجز للبروتوكول (ICC) مناعية المستخدمة في هذه المخطوطة، يرجى أنظر المرجع 11.

الشكل 1
الشكل 1: توصيف العلاج LME من CGCs. (A) صور الممثل من مناعية (ICC) التجارب التي أجريت على الثقافات CGC بعد العلاج مع 25-75 ملم LME لمدة 1 ساعة، يليه غسل حالا. تم تنفيذ ICC مع دابي (الأزرق) لتقدير من إجمالي عدد الخلايا وتلك التي تعرض التشكل أفكارك، وisolectin-B4 (IB 4) (الأخضر) لتحديد دبقية النوعي والكمي. = شريط نطاق 30 ميكرون. (B) الكمي من الخلايا التي تظهر التشكل أفكارك، الذي يعرف بأنه لونين التكثيف النووي (القضبان الرمادية؛٪ منعدد الخلايا في الميدان) ومجموع عدد دبقية، كنسبة مئوية من مستويات الرقابة (أشرطة خضراء). أجريت ر -tests طالب المفردة بين الضوابط ذات الصلة وعلاج محدد من LME. * P <0.05، ** p <0.01، *** P <0.001؛ ن = 3. (أي 3 يكرر مستقلة).

الرقم 2
الشكل 2: توصيف آثار العلاج 25 ملي LME على الخلايا العصبية والخلايا النجمية في الثقافات CGC. لوحة من الصور التمثيلية من التجارب التي أجريت على المحكمة الجنائية الدولية الثقافات CGC بعد العلاج مع 25 ملي LME لمدة 1 ساعة. تم تنفيذ ICC مع دابي (الأزرق)، ومكافحة β-III-تويولين (الخضراء) لتحديد التغيرات في كثافة الخلايا العصبية ومكافحة GFAP (الحمراء) لتحديد التغيرات في كثافة نجمي والتشكل. السيطرة السلبية (CTR هاء) وصور تمثل ثقافات CGC حيث أن antibodie الأساسيتم حذف الصورة. = شريط نطاق 30 ميكرون.

الشكل (3)
الرقم 3: مزيد من توصيف فعالية العلاج 25 ملي LME في إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافات نجمي. (A) لوحة من الصور التمثيلية من التجارب التي أجريت على المحكمة الجنائية الدولية الثقافات نجمية الأولية بعد معالجة مسبقة مع 25 ملي LME لمدة 1 ساعة. تم تنفيذ ICC مع دابي (الأزرق)، ومكافحة GFAP (الحمراء) لتحديد التغيرات في كثافة نجمي والتشكل، ومكافحة ED1 (الأخضر) لتحديد عدد دبقية. (B) صور الممثل من التجارب التي أجريت على المحكمة الجنائية الدولية الثقافات نجمية الأولية بعد العلاج مع LPS (1 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة عقب ما قبل المعالجة مع 25 ملي LME لمدة 1 ساعة. تم إجراء المحكمة الجنائية الدولية كما هو موضح في A ولكن مع مكافحة GFAP (الخضراء) ومكافحة iNOS (أحمر) لتحديد ميكروغرام تفعيلهاليا. السيطرة السلبية (هاء CTR) صور تمثل ثقافات CGC حيث حذفت الأجسام المضادة الأولية. = شريط نطاق 30 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أهم الخطوات لضمان القضاء الانتقائي الناجح الخلايا الدبقية الصغيرة من CGC و / أو الثقافات المختلطة هي: 1) الحفاظ على الثقافة CGC معقمة وصحية؛ 2) فلتر تعقيم المتوسطة LME التي تحتوي على والعودة الحل لدرجة الحموضة 7.4. 3) الحفاظ على وسائل الإعلام CGC المدورة وLME التي تحتوي على وسائل الإعلام في 37 ° C لتجنب الصدمة الحرارية. و4) تعمل بسرعة للحد من الوقت يتم الاحتفاظ الخلايا خارج الحاضنة.

كنا 25 ملم LME في استنزاف الخلايا الدبقية الصغيرة من ثقافاتنا CGC - تركيز الأمثل سابقا في مختبرنا. ومع ذلك، فإن بعض الخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال في الثقافة بعد العلاج LME، التي يعتقد البعض قد تعكس سكان متباينة، غير المتكاثرة الخلايا الدبقية الصغيرة. في الواقع، Hamby وآخرون (2006). وقد وجدت أن هناك حاجة 50-75 ملم LME للقضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة من ارتفاع الكثافة الطبقات الوحيدة نجمية 13. لقد أظهرنا سابقا أيضا أنه في نقية ج دبقيةultures، كان 10 ملي LME كافية لقتل جميع الخلايا الدبقية الصغيرة، ولكن فقط مع 24 ساعة حضانة الساعة 14.

وتأتي وسائل بديلة للتخلص نماذج الثقافة خلية من الخلايا الدبقية الصغيرة تلويث مؤخرا إلى النور. أظهرت كروكر وآخرون (2008) نهجا جديدا للقضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافات نجمية من خلال تشجيع العصبية الخلايا الجذعية (NSC) التمايز في الخلايا النجمية في ما بعد الولادة (P0-P2) الفئران 15. ووجد الباحثون أن هذه التقنية القضاء عليها كليا الخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافات، على الرغم من أن الآليات الكامنة وراء الظواهر غير معروفة. وبالإضافة إلى ذلك، كومامارو وآخرون (2012) المستخدمة liposomal clodronate - لbiophosphonate المعروف للحث على موت الخلايا المبرمج في الضامة - للقضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافات نجمية الأولية من الفئران P3 16. هذا المركب يعمل بطريقة مماثلة وعلى نفس المستوى من الكفاءة كما LME. على الرغم من أن الكتاب يجادل بأنه LME يمكن أن تكون سامة إلى الخلايا النجمية في ظل ظروف معينةبسبب نشرها مجانا على شكل خلايا - تعطيل نجمية قدرة التصاق 13 - clodronate liposomal يمثل طريقة محسنة لاستنزاف الخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافة. نحن، ومع ذلك، وجدت أن 25 ملي LME لايؤثر على حيوية نجمية أو الانتشار.

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم تركيز معين من LME للقضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي من الثقافات التخصيب الخلايا العصبية من CGCs. ويمثل هذا المنهج التجريبي قوية لتحديد تأثير الخلايا الدبقية الصغيرة على الخلايا العصبية في ظل ظروف مختلفة، وتستمر في تقديم البيانات الهامة للباحثين التحقيق في دور neuroinflammation في الاضطرابات العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps  Sigma-Aldrich F4142 The curved end facilitates removal of the cerebellum 
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146 Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection 
L-leucine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich 7517-19-3
EBSS solution  Sigma-Aldrich E7510-500 ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich 27964-99-4 Coat coverslips 1 day before use 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
DNase Sigma-Aldrich D5025
Soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich T6414
Mouse anti-ED1 antibody  Abcam ab31630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26, (109), 10661-10668 (2012).
  2. Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11, (1), 279-292 (1999).
  3. Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73, (2), 538-547 (1999).
  4. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1, (1), 41-55 (2002).
  5. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  6. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
  7. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131, (5), 2282-2290 (1983).
  8. Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13, (1), 29-37 (1993).
  9. Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49, (5), 576-591 (1997).
  10. Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56, (2), 189-198 (1999).
  11. Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7, (583), 92-97 (2014).
  12. Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105, (4), 1144-1152 (2008).
  13. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, (1), 128-137 (2006).
  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90, (1), 89-101 (2004).
  15. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, (11), 1187-1198 (2008).
  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics