अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल संस्कृतियों से Microglia के चुनिंदा रिक्तीकरण एल Leucine मिथाइल एस्टर का प्रयोग

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Neuroscience

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Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J. Vis. Exp. (101), e52983, doi:10.3791/52983 (2015).

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Abstract

Introduction

मानव मस्तिष्क एक अनुमान के अनुसार 85 अरब न्यूरॉन्स और glia 1 सहित 85000000000 एक और गैर neuronal कोशिकाओं शामिल हैं। के रूप में अंग्रेजी में अनूदित 'glia' इसलिए ग्रीक व्युत्पत्ति - neuroscientists न्यूरोनल सेल की आबादी पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया है पिछले 100 वर्षों से अधिक से अधिक भाग के लिए, glial कोशिकाओं विश्वास न्यूरॉन्स के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान की जाती है कि निष्क्रिय समर्थन कोशिकाओं की तुलना में थोड़ा अधिक हो 'गोंद'। हाल ही में, हालांकि, यह न्यूरोनल-glial बातचीत तंत्रिका जीव विज्ञान, Neurophysiology, और कई neurodegenerative रोगों की उत्पत्ति और प्रगति के बुनियादी पहलुओं के लिए कहीं अधिक मौलिक हो सकता है कि तेजी से स्पष्ट हो गया है। अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल कोशिकाओं (CGCs), मानव मस्तिष्क में सबसे प्रचुर मात्रा में समरूप न्यूरोनल आबादी, सेरिबैलम पर हावी है और अपने सेलुलर घटकों में से अधिक से अधिक 90% तक है। नतीजतन, इन कोशिकाओं टी के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इन विट्रो में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया हैवह न्यूरोनल विकास, समारोह, और विकृति 2-6 से अध्ययन करते हैं।

हालांकि, CGC संस्कृतियों अभी भी यकीनन महत्वपूर्ण अनुपात में microglia और अन्य glia होते हैं। नतीजतन, कथित अलग सेल उपचार के लिए सीधी न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित CGC डेटा वास्तव में उत्पन्न हो सकती है - भाग में या कुल में - संस्कृति में glia पड़ोसी के अप्रत्यक्ष माध्यमिक प्रतिक्रिया से। इस आकलन करने के लिए, हम चुनिंदा एल Leucine मिथाइल एस्टर (एलएमई) की सहायता से CGC neuronal संस्कृतियों से microglial सफाया कर दिया। एलएमई मूल रूप से चुनिंदा मैक्रोफेज 7 को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल एक lysomotropic एजेंट है, और के बाद से भी चुनिंदा तंत्रिका, अस्थिकणिका, और मिश्रित glial संस्कृतियों 8,9,10 से microglia खलाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एलएमई यह लाइसोसोमल विघटन और बाद में एपोप्टोसिस 13,14 का कारण बनता है, जिसमें मैक्रोफेज और microglia से भली भाँति है। मैक्रोफेज और microglia उन्हें particula होने के कारण, लाइसोसोम में विशेषता से समृद्ध कर रहे हैंएलएमई उपचार के लिए जोखिम पर रेलवे की चपेट में। इस प्रोटोकॉल CGC और अन्य न्यूरोनल / glial संस्कृति प्रणालियों का उपयोग प्रयोगों में microglia के योगदान का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली, अभी तक सरल और आसान तरीका प्रदान करता है।

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Protocol

इस के साथ साथ वर्णित सभी प्रयोगों यूनाइटेड किंगडम एनिमल्स (वैज्ञानिक प्रक्रिया) 1986 के अधिनियम के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

उपकरण, संस्कृति, मीडिया, और व्यंजन के 1. तैयारी

  1. दो स्टेनलेस स्टील प्रयोगशाला विदारक कैंची और दो स्टेनलेस स्टील प्रयोगशाला संदंश तैयार करें। एक संस्कृति हुड ओ में सभी उपकरणों और जगह आटोक्लेव / एन नसबंदी के लिए पराबैंगनी प्रकाश (यूवी) प्रकाश के तहत।
  2. न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य) संस्कृति के माध्यम से (500 मिलीलीटर बनाओ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], 20 मिमी KCl, 25 मिमी 3 NaHCO, 30 मिमी डी ग्लूकोज, 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 6 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन) और फिल्टर बाँझ। महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. 14 मिमी, नंबर 1 मोटाई coverslips युक्त 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों की तैयारी। पहले से 3 में वर्णित के रूप में 100 मिलीग्राम / एल पाली-D-लाइसिन (पीडीएल) में coverslips और कोट आटोक्लेव। यूवी प्रकाश ओ / एन बाँझ।

CGC संस्कृति समाधान की 2. तैयारी

  1. इलाज किया autoclaved, पराबैंगनी प्रकाश, बाँझ dh में 'समाधान के लिए एक' (100 मिलीलीटर) तैयार ग्लूकोज की 250 मिलीग्राम, गोजातीय सीरम albumin [बीएसए] की 300 मिलीग्राम, फॉस्फेट बफर खारा [पीबीएस] (सीए 2 + और ​​की 955 मिलीग्राम से युक्त 2 हे मिलीग्राम) + नि: शुल्क है, और 3.8% के 1 मिलीलीटर MgSO 4 · 7H 2
  2. समाधान ए के 9 मिलीलीटर में पतला / एमएल trypsin के 5 मिलीग्राम के 1 मिलीलीटर युक्त 'समाधान बी' (10 एमएल) तैयार करें
  3. 'समाधान' सी '1,000 इकाइयों DNase, सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के 0.5 मिलीग्राम, समाधान ए के साथ 10 मिलीलीटर पतला 3.8% MgSO 4 · 7H ओ 2 के 100 μl युक्त (10 एमएल) तैयार करें
  4. समाधान ए के साथ 20 मिलीलीटर के लिए पतला समाधान सी की 3.2 मिलीलीटर, जिसमें 'समाधान डी' (20 मिलीलीटर) तैयार करें
  5. · 7H 2 हे EBSS, 25 मिमी 3 NaHCO, 3 मिमी MgSO 4 युक्त बीएसए / अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS) समाधान तैयार है, और4% बीएसए, पीएच 7.4, के रूप में पहले 3 में वर्णित है।
  6. 150 मिमी एलएमई के अंतिम एकाग्रता देने के लिए सदस्य संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर में शुद्ध एलएमई जोड़कर एलएमई की तैयारी एक benchtop पीएच मीटर का उपयोग कर 7.4 पीएच का हल वापसी, और फिल्टर एक 28 मिमी polyether sulfone (पी इ एस) 0.2 माइक्रोन सिरिंज का उपयोग कर बाँझ फिल्टर।

3. CGCs संवर्धन

  1. पहले से 3 के रूप में वर्णित 4-7 दिन पुराने चूहे पिल्ले से cerebella लीजिए। बर्फ पर 5 मिलीलीटर समाधान के लिए एक से युक्त पेट्री डिश में तुरंत रखें।
  2. पेट्री डिश ढक्कन में cerebella और जगह के ऊतकों से अतिरिक्त समाधान डालो।
  3. कम से कम तीन अलग अलग दिशाओं में एक अच्छी तरह से flamed धार के साथ पतले ऊतक जल्द।
  4. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नहाने के पानी में घोल (खो दिया है सीमित ऊतक सुनिश्चित करने के लिए समाधान के साथ पेट्री डिश कुल्ला) बी और जगह के लिए कटा हुआ ऊतक जोड़ें। मिनट का धीरे हर जोड़े को हिला।
  5. ट्रिप्सिन, शेक और प्रतिशत बेअसर करने के लिए ट्यूब का हल डी (20 मिलीलीटर) जोड़ें5 मिनट के लिए 65 XG पर rifuge।
  6. सतह पर तैरनेवाला डालो।
  7. निलंबन के रूप में संभव के रूप में समरूप है, जब तक व्यास घटते के तीन flamed कांच pipettes के साथ अच्छी तरह से समाधान सी महीन चुर्ण बनाना के 4 मिलीलीटर (लगभग 10 बार प्रत्येक) में resuspend।
  8. और धीरे धीरे बीएसए / EBSS के शीर्ष पर इस homogenate के कुछ बूँदें जोड़ें। यह बीएसए / EBSS के माध्यम से सिंक करने के लिए शुरू होता है, अधिक triturate और / या homogenate बीएसए / EBSS के शीर्ष पर एक परत में बैठना चाहिए एक छोटे से अधिक समाधान सी जोड़ें। हिला नहीं करते। 5 मिनट के लिए 100 XG पर स्पिन।
  9. सतह पर तैरनेवाला और सदस्य माध्यम से 1 मिलीलीटर में resuspend गोली (मुलायम) निकालें।
  10. सदस्य माध्यम के 500 μl में 800,000 कोशिकाओं / coverslip पर एक रुधिरकोशिकामापी और प्लेट का उपयोग कोशिकाओं की गणना। 6% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रखें।
  11. मध्यम अगले दिन (प्रस्तुत करने के बाद 24-36 घंटा) बदलें। सेल चक्र अवरोध करनेवाला arabinofuranosyl cytidine (ARAC) का 10 माइक्रोन से युक्त सदस्य मध्यम का समाधान करें।
    1. प्रत्येक के लिएcoverslip, वापस कोशिकाओं और टॉप-अप करने के लिए पुराने मध्यम के 250 μl जोड़ने के लिए, एक ताजा 24 अच्छी तरह से थाली में पुराने मध्यम के 250 μl बनाए रखने के बाकी महाप्राण, सामान्य सदस्य माध्यम के 250 μl जोड़ने और फिर, कोशिकाओं को धोने के लिए इस महाप्राण ARAC युक्त मध्यम के 250 μl के साथ।
      नोट: कोशिकाओं इन विट्रो (DIV) में 6 दिन से इस्तेमाल किया जा सकता है।

4. चुनिंदा Microglia क्षयकारी (6 DIV पर प्रदर्शन)

  1. 150 मिमी एलएमई के अंतिम एकाग्रता देने के लिए सदस्य माध्यम की एक अलग विभाज्य के 5 मिलीलीटर को शुद्ध एलएमई जोड़ें।
  2. 7.4 पीएच का हल लौटें और फिल्टर एक 28 मिमी polyether sulfone (पी इ एस) 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर बाँझ।
  3. नियंत्रण संस्कृतियों के लिए सामान्य सदस्य मध्यम के साथ 10 मिनट के लिए 37 सी पर एक पानी के स्नान में सदस्य मध्यम और जगह में 50 मिमी (2 एक्स एलएमई) के एक एकाग्रता का हल पतला।
  4. आधे (250 μl) CGC संस्कृतियों से सदस्य मध्यम निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर बरकरार रहती है।
  5. दावत कोशिकाओंया नियंत्रण संस्कृतियों के लिए एलएमई बिना पूर्व गर्म सदस्य मध्यम (250 μl) के साथ 25 मिमी की एक अच्छी तरह से एकाग्रता दे रही है 1: यानी 2 एक्स एलएमई (250 μl) युक्त सदस्य मध्यम, के साथ 1 पतला।
  6. 1 घंटे के लिए 6% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. दो बार नए सिरे से पूर्व गर्म सदस्य माध्यम में धो कोशिकाओं एलएमई युक्त मीडिया को हटाने, और फिर बरकरार रखा संस्कृति के माध्यम से और इसी कुओं के लिए नए सिरे से पूर्व गर्म सदस्य मध्यम के एक बराबर मात्रा बदलने के लिए।
  8. (37 डिग्री सेल्सियस पर 6% सीओ 2 के साथ humidified) इनक्यूबेटर संस्कृतियों लौटें और किसी भी आगे के इलाज से पहले 24 घंटे के लिए आराम करने के लिए छोड़ दें।

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Representative Results

चुनिंदा CGC और / या मिश्रित संस्कृतियों से microglia खत्म करने के लिए इस तकनीक की क्षमता को सही पहचान और उनके आसपास की कोशिकाओं से microglia अंतर करने के लिए अन्वेषक के बाद की क्षमता पर निर्भर करता है। चित्रा 1 में सचित्र के रूप में इस तरह के isolectin-बी 4 के रूप में, एक microglial विशेष सेल बनाने की मशीन का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 2 में प्रदर्शन के रूप में, अस्थिकणिका और neuronal घनत्व और आकृति विज्ञान के लिए कोई नमूदार परिवर्तन प्रत्येक मुख्य उपचार समूह के संबंध में दर्ज किए गए। संस्कृतियों परिसर के एक microglial-विशिष्ट कार्रवाई का समर्थन करते हुए अकेले एलएमई के साथ इलाज किया गया जब महत्वपूर्ण बात है, न्यूरोनल या astrocytic आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन मनाया गया। चित्रा 3A अस्थिकणिका घनत्व और प्राथमिक कृंतक अस्थिकणिका संस्कृति 12 से आकृति विज्ञान में कोई नमूदार परिवर्तन से पता चलता है, लेकिन करता है दूषित microglia की एक हानि प्रदर्शित करते हैं। चित्रा 3 बी में, एक के रूप में कोई बदलाव नहीं astrocy मेंते घनत्व और आकृति विज्ञान में देखा गया था; हालांकि, microglial संख्या और जेट contaminating में एक नुकसान मनाया गया। इस पांडुलिपि में इस्तेमाल immunocytochemistry (आईसीसी) प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त विवरण के लिए, 11 का संदर्भ देखें।

चित्र 1
चित्रा 1: CGCs की एलएमई उपचार की विशेषता। Immunocytochemistry से (ए) प्रतिनिधि छवियों (आईसीसी) के प्रयोगों धोने बंद, जिसके बाद 1 घंटे के लिए 25-75 मिमी एलएमई के साथ उपचार के बाद CGC संस्कृतियों पर प्रदर्शन किया। आईसीसी microglial पहचान और मात्रा का ठहराव के लिए कुल सेल नंबर की मात्रा का ठहराव के लिए DAPI (नीला) और उन प्रदर्शित करने apoptotic आकृति विज्ञान, और isolectin-बी 4 (आईबी) 4 (हरा) के साथ प्रदर्शन किया गया था। स्केल बार 30 माइक्रोन =। परमाणु क्रोमेटिन संक्षेपण के रूप में परिभाषित apoptotic आकृति विज्ञान, (धूसर बार प्रदर्शित करने कोशिकाओं (बी) की मात्रा; का%नियंत्रण स्तर (हरे रंग की सलाखों) के एक प्रतिशत के रूप में क्षेत्र में कुल सेल नंबर) और कुल microglial संख्या,। अयुगल छात्र के टी -tests प्रासंगिक नियंत्रण और एलएमई की एक विशेष उपचार के बीच प्रदर्शन किया गया; * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001; एन = 3. (यानी 3 स्वतंत्र दोहराता)।

चित्र 2
चित्रा 2: CGC संस्कृतियों में न्यूरॉन्स और astrocytes पर 25 मिमी एलएमई उपचार के प्रभाव की विशेषता। 1 घंटे के लिए 25 मिमी एलएमई के साथ उपचार के बाद CGC संस्कृतियों पर प्रदर्शन आईसीसी प्रयोगों से प्रतिनिधि छवियों के पैनल। आईसीसी astrocytic घनत्व और आकृति विज्ञान में परिवर्तन की पहचान के लिए DAPI (नीला) न्यूरोनल घनत्व और विरोधी GFAP (लाल) में परिवर्तन की पहचान के लिए, विरोधी β-III ट्यूबिलिन (हरा) के साथ प्रदर्शन किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण (-ve सीटीआर) छवियों CGC संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसमें प्राथमिक antibodieएस छोड़े गए थे। स्केल बार 30 माइक्रोन =।

चित्र तीन
चित्रा 3: astrocytic संस्कृतियों से microglia को हटाने में 25 मिमी एलएमई उपचार के प्रभाव के आगे लक्षण वर्णन। 1 घंटे के लिए 25 मिमी एलएमई के साथ पूर्व उपचार के बाद प्राथमिक अस्थिकणिका संस्कृतियों पर प्रदर्शन आईसीसी प्रयोगों से प्रतिनिधि छवियों के (ए) के पैनल। आईसीसी astrocytic घनत्व और आकृति विज्ञान, और microglial संख्या की पहचान के लिए विरोधी ED1 (हरा) में परिवर्तन की पहचान के लिए DAPI (नीला), विरोधी GFAP (लाल) के साथ प्रदर्शन किया गया था। (बी) के 1 घंटे के लिए 25 मिमी एलएमई के साथ पहले से इलाज के बाद 24 घंटे के लिए LPS (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ इलाज के बाद प्राथमिक अस्थिकणिका संस्कृतियों पर प्रदर्शन आईसीसी प्रयोगों से प्रतिनिधि छवियाँ। सक्रिय microg पहचान के लिए एक में, लेकिन विरोधी GFAP (हरा) और विरोधी iNOS (लाल) के साथ के रूप में वर्णित आईसीसी प्रदर्शन किया गया थाLia। प्राथमिक एंटीबॉडी छोड़े गए थे जिसमें नकारात्मक नियंत्रण (-ve सीटीआर) छवियों CGC संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार 30 माइक्रोन =।

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Discussion

सबसे महत्वपूर्ण कदम CGC से microglia की सफल चयनात्मक उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए और / या मिश्रित संस्कृतियों हैं: 1) एक बाँझ और स्वस्थ CGC संस्कृति को बनाए रखने; 2) फिल्टर एलएमई युक्त मध्यम स्टरलाइज़ और 7.4 पीएच का हल लौटने; 3) को बरकरार रखा CGC मीडिया रखने और 37 पर मीडिया एलएमई युक्त गर्मी सदमे से बचने के लिए सी °; और 4) कोशिकाओं को इनक्यूबेटर बाहर रखा जाता है समय को कम करने के लिए जल्दी से काम कर रहा है।

पहले से हमारी प्रयोगशाला में अनुकूलित एकाग्रता - हम अपने CGC संस्कृतियों से microglia ख़ाली 25 मिमी एलएमई इस्तेमाल किया। बहरहाल, कुछ microglia अभी भी कुछ विभेदित, गैर proliferating microglia की आबादी के प्रतिबिंबित हो सकता है जो मेरा मानना ​​है एलएमई उपचार, निम्नलिखित संस्कृति में रहते हैं। दरअसल, Hamby एट अल। (2006) 50-75 मिमी एलएमई उच्च घनत्व अस्थिकणिका monolayers के 13 से microglia को खत्म करने के लिए आवश्यक था कि मिल गया है। हम भी पहले से पता चला शुद्ध microglial सी में है कि हैultures, 10 मिमी एलएमई सभी microglia को मारने के लिए पर्याप्त है, लेकिन केवल एक 24 घंटा ऊष्मायन समय 14 के साथ था।

Microglia contaminating के सेल संस्कृति मॉडल मुक्त करने के लिए वैकल्पिक तरीकों हाल ही में प्रकाश में आया है। क्रोकर एट अल। (2008) (P0-p2) चूहों 15 प्रसव के बाद में astrocytes में तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) भेदभाव को बढ़ावा देकर अस्थिकणिका संस्कृतियों से microglia को खत्म करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया। वे घटना अंतर्निहित तंत्र अज्ञात हैं, हालांकि इस तकनीक को पूरी तरह से, संस्कृतियों से microglia सफाया कर पाया। इसके अलावा, Kumamaru एट अल (2012) liposomal clodronate इस्तेमाल किया - मैक्रोफेज में apoptosis प्रेरित करने के लिए जाना जाता है एक biophosphonate - पी 3 चूहों 16 से प्राथमिक अस्थिकणिका संस्कृतियों में microglia खत्म करने के लिए। इस परिसर में एक समान फैशन में और एलएमई के रूप में प्रभावकारिता का एक ही स्तर पर काम करता है; लेखकों एलएमई कुछ शर्तों के तहत astrocytes के लिए विषाक्त हो सकता है के रूप में तर्क है कि यद्यपिअस्थिकणिका आसंजन क्षमता 13 में खलल न डालें - - कारण कोशिकाओं में अपनी स्वतंत्र प्रसार करने के लिए liposomal clodronate संस्कृति से microglia खलाना करने के लिए एक बेहतर तरीका का प्रतिनिधित्व करता है। हम फिर भी, 25 मिमी एलएमई कोई अस्थिकणिका व्यवहार्यता या प्रसार पर प्रभावित किया है कि पाया।

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल चुनिंदा CGCs के न्यूरॉन समृद्ध संस्कृतियों से microglia खत्म करने के लिए एलएमई की एक विशिष्ट एकाग्रता का उपयोग करता है। यह विभिन्न शर्तों के तहत न्यूरॉन्स पर microglia के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, और तंत्रिका संबंधी विकारों में neuroinflammation की भूमिका की जांच शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण डेटा उपलब्ध कराने के लिए जारी है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps  Sigma-Aldrich F4142 The curved end facilitates removal of the cerebellum 
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146 Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection 
L-leucine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich 7517-19-3
EBSS solution  Sigma-Aldrich E7510-500 ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich 27964-99-4 Coat coverslips 1 day before use 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
DNase Sigma-Aldrich D5025
Soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich T6414
Mouse anti-ED1 antibody  Abcam ab31630

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References

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