Gransking av Synaptic Tagging / Capture and Cross-fangst ved hjelp Akutt hippocampus Slices fra Gnagere

Neuroscience
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shetty, M. S., Sharma, M., Hui, N. S., Dasgupta, A., Gopinadhan, S., Sajikumar, S. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J. Vis. Exp. (103), e53008, doi:10.3791/53008 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Alle dyre prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra National University of Singapore.

1. Utarbeidelse av kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF)

  1. Klargjør ACSF bestående av (i mM) 124 NaCl, 3,7 KCl, 1,0 MgSO4 .7H 2 O, 2 2,5 CaCl .2H O 2, 1,2 KH 2PO 4, 24,6 NaHCO3, og 10 D-glukose. Sikre at pH-verdien i ACSF er mellom 7,2 til 7,4 når det boblet til metning med 95% O2 og 5% CO 2-blanding (carbogen). 21 Bruk denne ACSF for både disseksjon, skive og forberedelse for perfusjon i løpet av de elektrofysiologiske opptak.
    MERK: Bruk rene apparater for måling og holde ACSF. Ved hjelp av uren apparat kan føre til tåkete løsninger eller dannelse av bunnfall. Bruk deionisert vann for alle forberedelsene.
  2. Forberede en 2 L 10x ACSF lager eksklusiv NaHCO3 MgSO4 .7H 0 2 (4,92 g), CaCl .2H 2 2 0 (7,56 g), KH 2PO 4 (3,28 g) og fyll opp til et volum på 2 L. Omrør kontinuerlig i minst 30 minutter ved hjelp av en magnetisk rører for å sikre at alle reagenser er oppløst. Oppbevar lager i 4 o C og bruk innen 2 uker.
  3. Forut for disseksjon og forsøkene, fortynnes ACSF lager i en volumetrisk kolbe sammen med tilsetning av påkrevde mengder av NaHCO3 og D-glukose. For en L-oppløsning, fortynnes med 100 ml lager til en l etter tilsetning av 2,07 g NaHCO3 og 1,802 g D-glukose. Den ACSF bør være en klar oppløsning fri for eventuell utfelling eller uoppløste partikler.
  4. Avkjøl omtrent 200-300 ml ACSF på is, som skal brukes under dissekering. Sørg for at ACSF brukes for disseksjon er mellom 2-4 ° C. Bruk de rester ACSF for electrophysiological eksperimenter. Boble alle ACSF løsninger til metning med karbogen (5% CO2, 95% O 2) kontinuerlig. Mens du venter på ACSF avkjøles, forberede disseksjon området og skive kammeret.

2. Utarbeidelse av Interface Chamber

MERK: Et grensesnitt hjernen skive kammer, som brukes for inkubasjon skivene og vedlikeholde dem under elektrofysiologiske opptak (figur 2B), består av to avdelinger. Det nedre kammer inneholder destillert vann holdt ved 32 ° C ved en temperaturregulator og kontinuerlig boblet med karbogen.

  1. Slå på temperaturregulatoren og den forhåndsinnstilt ved 32 ° C. Vask det øvre kammer i 10 til 15 min ved å kjøre destillert vann gjennom innstrømningsrøret. Påse at det øvre kammeret er rene før du legger på nettet. Kontroller at vannivået i den nedre kammer er omtrent 70% fylt med destillert vann.
  2. Plassernet i det øvre kammer for å tilveiebringe en hvileflate for skiver (figur 2C). Juster utstrømningen røret for å sikre at løsningen nivået er tilstrekkelig å fukte hele området av nettet. Sett lokket over nettet for å opprettholde en fuktet carbogen atmosfære i det øvre kammeret.
  3. Regulere strømningshastigheten til 1 ml / min. Opprettholde denne strømningshastighet gjennom hele stykket inkubasjonstid og eksperimentet. Begynn carbogenating nylaget 1x ACSF og lev tilsig slangen inn i ACSF. Tillat 20 min for ACSF å være mettet med karbogen og for det øvre kammer for å bli fylt med det.

3. Utarbeidelse av Akutte Hippokampale Slices

MERK: disseksjon protokollen består av (1) Fjerning av hjerne fra dyret i kald ACSF og (2) Isolering og skjæring av hippocampus. For nevroner å være levedyktig, isolere og sette hjernen i kaldt ACSF raskt og fullføre heleprosessen inkludert slicing innen 3-5 min.

  1. Fjerning av hjernen i kald ACSF
    1. Legg ut disseksjon verktøy på den måte som er vist på figur 1A. Ordne verktøyene i henhold til bestillingen av bruk for å lette disseksjon prosessen. Før du starter, må du kontrollere alle disseksjon verktøyene er klar.
    2. Montere et barberblad, rengjøres med etylacetat, absolutt etanol og destillert vann, på den manuelle vev chopper (figur 1B), sikre den godt og sørge for at eggen er jevnt justert. Test hakking et stykke filterpapir for å sikre at bladet er godt sikret. Sett skyve Vernier mikrometer til sin startposisjon.
    3. Avlive dyret ved hjelp av karbondioksid (CO 2) i en induksjon kammer og halshogge med bandasje saks eller Guillotine. Ved hjelp av en iris saks, fjerne hud og pels over skallen. Gjør et kutt gjennom bakre å fjerne brainstem.Make et lite snitt langs the høyre side av hodeskallen og et lengre snitt på venstre side.
      FORSIKTIG! Gjør bare et lite snitt på siden som brukes til eksperimenter for å unngå å skade den. Når du setter saksen, sørg for at kraften er oppover for å unngå skader på hjernen.
    4. Fjern forsiktig skallen med et bein rongeur fra venstre til høyre side av hodeskallen for å avsløre cortex. Et tynt lag av dura kan også sees. Fjerne frontplater med rongeur nøye. Fjerne det meste av dura sammen med frontplatene.
      FORSIKTIG! Vær forsiktig at dura ikke skjære gjennom hjernevevet.
    5. Fjern det gjenværende dura, om noen, særlig i overgangen mellom cortex og cerebellum med den flate enden av en spatel. For trinn 3.1.5 og 3.1.6, opprettholde trykket oppover dvs. bort fra hjernen for å unngå å skade den. Bruke slikkepott, forsiktig scoop hjernen i en petriskål fylt med kaldt og carbogenated ACSF (2-4 ° C), plasert på en aluminiumkjøleblokk.
  2. Isolering av hippocampus
    1. Ved hjelp av en skalpell, gjør et rett kutt for å fjerne lillehjernen og et annet kutt for å fjerne den fremre delen av hjernen (ca. en fjerdedel). Lag en grunne kutt langs midtlinjen.
    2. Fjern forsiktig cortex med en sigd skalering, fra midtlinjen for å avsløre rygg hippocampus. Fjerne lag av hjernebarken ovenfor hippocampus. Bruke fingrene eller vinklet tang for å støtte hjernen. Lag et lite kutt til hippocampus commissure. Fjern forsiktig hippocampus med sigden scaler fra fram hippocampus bruker bølgende bevegelser.
      FORSIKTIG! Vær forsiktig for å unngå strekk og rive hippocampus.
    3. Fjern eventuelle cortex og bindevev rundt den isolerte hippocampus med sigden skalering.
  3. Kutting av hippocampale vev og overføre skivene på grenseflaten kammeret
    1. Legg et stykke ACSF-gjennomvåt filter papir (Grade 1, 30 mm) på slicing stadium av den manuelle høvelen. Scoop og plasser hippocampus vev på filterpapiret. Flytt filterpapir for å justere hippocampus i en riktig orientering i forhold til bladet til deleren, slik at hippocampus skjæres i en vinkel på ca 70 o for å fimbria.
    2. Blot overflødig løsning rundt hippocampus vev med en foldet filterpapir (grad 1, 85 mm) forlater hippocampus litt våt. Begynn å skjære hippocampus tvers. Skive og kast vev fra den ekstreme enden av hippocampus hvor stykke morfologi er ikke klart.
    3. Skjær de resterende vevet inn 400 mikrometer tykke skiver. Plukk opp hippocampus skiver forsiktig fra bladet med en børste med myk bust som bruker milde sveipe bevegelser og legg skivene i en liten beger fylt med kaldt carbogenated ACSF. Utfør trinnene 3.3.1-3.3.3 så raskt som mulig, siden det hippocampale vev blir utsatt for luft.
      MERK: Vanligvis to tredjedeler av hippocampus er skiver, og 4-6 skiver med klar morfologi kan være forberedt.
    4. Overfør skivene forsiktig ned på nettet i utløpskammeret ved hjelp av en ren plast Pasteur pipette med en bred spiss (laget ved å skjære bort 2-3 cm av spissen). Justeres omhyggelig plassering av skivene på nettet ved hjelp av en liten sprøyte med en bøyd spiss. Plasser skivene på en måte som muliggjør plassering elektrode og opptak. Sjekk for å sikre at skivene er tilstrekkelig omgitt av ACSF men som ikke er nedsenket eller flytende (figur 2C-D). Dekk kammeret og inkuber skivene i 2-3 timer.
      MERK: Den pyramidecellelaget i de sunne skiver bør vise litt åpenhet.

4. Opptak av CA3-CA1 synaptiske responser

MERK: elektro oppsett brukes for feltpotensial opptak er vist i figur 2A. En Faradag bur anbefales på det sterkeste hvis den elektriske forstyrrelser er utenfor kontroll etter riktig jording av elektriske innstillinger. Mange forskjellige typer av neddykkede og grensesnitt kamre er kommersielt tilgjengelige. Men grensesnitt kamre foretrukket som skiver utstillingen mer robuste synaptiske responser i dem.

  1. Plassering av elektroder
    1. Slå på det elektriske apparat (stimulatorer og forsterkere) som skal brukes. Mount og sikre stimulerende og opptak elektroder i plexiglass innehavere av micromanipulators.
      MERK: Vi bruker monopolar, lakkerte, rustfritt stål elektroder av 5 Megohm motstand for både stimulerende og opptak formål.
    2. Før bruk, setter disse elektrodene inne trakk glasskapillærer og fest med epoxy lim utsette eneste liten del av elektrodespissen (figur 2E). Dette gir styrke til den ellers slanke elektroder og bidrar til å sikre dem fast i electrode holdere.
    3. Guidet under mikroskop, plasserer stimulerende elektrode (r) i stratum radiatum av CA1 regionen for å stimulere Schaffer sikkerhet fiber og innspillingen elektrode i den apikale dendrittiske regionen CA1 å registrere felt EPSP (fEPSP) svar.
      MERK: Nærmer væskeoverflaten over den skive med elektrodene gir en lyd som hjelper til med å lokalisere raskt på overflaten av skiven (forutsatt, er forsterkeren er koblet til en høyttaler).
    4. I synaptiske tagging og fange eksperimenter, i henhold til behovet av eksperimentet stilling to eller tre stimulerende elektroder (S1, S2 eller S3) på hver side av opptaks elektroden for å stimulere to eller flere uavhengige, men overlappende innganger. Plasser stimulerende og opptaks elektroder ca 200 mikrometer fra hverandre.
    5. Hvis det er nødvendig å finne en annen innspilling elektrode i stratum pyramidale lag for opptak befolkningen spike (figur 3A) .Når bådeelektroder har rørt stykket, etter oppkjøps programvare, gi en test stimulering for å sikre en forsvarlig fEPSP signal.
      MERK: Vi bruker bifasisk, konstant-strømpulser (impuls varighet 0,1 msek / halv-bølge) for test stimulering.
    6. Når en skikkelig fEPSP signal oppnås, senk elektrodene ca 200 mikrometer dyp ved hjelp Nydelig spill knotter av manipulatorer. Tillat 20 minutter for skiver å gjenopprette. Test pathway uavhengighet med en sammenkoblet-puls tilrettelegging protokollen 27,28.
  2. Input-output forhold
    1. Bestem input-output forhold (afferent stimulering vs fEPSP skråningen) for hver inngang ved å måle skråningen verdi på et utvalg av dagens intensiteter. Utfør denne mellom 20 uA 100 uA. Deretter stiller den stimuleringsintensitet for hver inngang for å oppnå 40% av den maksimale fEPSP skråningen. Hold denne konstant gjennom hele forsøket.
    2. Etter 15-20 min, starte opptak grunnlinjen. Overvåke fEPSP skråning tett i denne perioden og tilbakestille stimulus intensitet hvis skråningen svinger mer enn 10% fra innstilt verdi og starte en ny baseline. Spill minst 30 minutter eller en time stabil baseline før du fortsetter.
      MERK: For testen eller baseline stimulering, bruker vi fire sveip av 0,2 Hz bifasisk, konstant strømpulser (0,1 msek pr polaritet) gitt hvert 5 min. En gjennomsnittlig skråningen av disse fire svarene blir da regnet som en rapport. Signalene blir filtrert og forsterket av en differensialforsterker, digitalisert ved hjelp av en analog-til-digital omformer og overvåkes på nettet med skreddersydd programvare.
  3. Induksjon av LTP / LTD bruker stimuleringsregimer
    MERK: Både LTP og LTD har blitt klassifisert som tidlig og sen-LTP / LTD basert på kravene i proteinsyntesen; sistnevnte krever oversettelse og / eller transkripsjon for sin sent vedlikehold [for gjennomgang se 4]. En rekke elektriske stimulerings paradigmer kan specifically indusere ulike former for LTP og LTD.
    1. WTET: 100 Hz, 21 bifasisk konstant strømpulser (0,2 msek pr fase).
    2. STET: Tre pakker med 100 pulser i ett sekund (100 Hz) hvert 10 min (Pulse bredde 0,2 msek per fase).
    3. 900 støt i løpet av en 15 min varighet. En burst består av 3 pulser (0,2 msek bredde) med en interpuls-intervall på 50 ms (20 Hz). Den inter burst intervallet er 1 sek (totalt antall pulser 2700).

5. Rengjøring av Slice Chamber og Perfusjons System

  1. Etter innspillingen er over, samle hippocampus skiver for videre biokjemisk analyse eller annet kast på riktig måte. Slå av carbogen forsyningen og temperaturregulator. Vask carbogen bobleren i destillert vann.
  2. Rengjør netto grundig med en børste og destillert vann. Vask riggen i 15-20 minutter med destillert vann ved en høyere strømningshastighet. En gang i 3-4 dager, endre destillert vann inedre avdeling av kammeret og også rent kammeret regelmessig med 3% hydrogenperoksid løsning for å unngå soppvekst.

Representative Results

Den beskrevne metode har blitt brukt til å studere varige former av LTP / LTD, og dens assosiative interaksjoner som synaptiske merking og på tvers av fangst fra akutte hippokampale skiver av voksne rotter. 23 Denne teknikken har vist seg effektive for eksperimenter med både rotter (Wistar) og en rekke musestammer 30,31. Metodikken har vært brukt med hell for stabile LTP opptak med opptil 8-12 timer. 32

The 'tag' satt av svake tetanization av en inngang (S1) fanger 'Prps' indusert av den sterke tetanization av en annen uavhengig, men overlappende inngang (S2, 3B, fylte sirkler) og dermed forvandle den ellers råtnende form av LTP (tidlig -LTP) i S1 inn i en langvarig ett (figur 3B, åpne sirkler) (For sammenligning av tidlig-LTP indusert av WTET se 20,33). De Prps fanget av den svaketetanization sett tag trenger ikke nødvendigvis komme fra STET-indusert sen-LTP, men kan også gis av SLFS-indusert sent LTD. Denne type av positiv assosierende samvirke mellom LTP og LTD er referert til som "kryss tagging / fange". Den WTET-indusert tidlig-LTP i S1 blir forsterket til sen-LTP (Figur 3C, åpne sirkler) ved å fange de Prps levert av SLFS-indusert sent LTD i S2 (figur 3C, fylt sirkler). Statistisk signifikant potensiering eller depresjon ble opprettholdt i S1 og S2 i begge tilfeller i forhold til sin egen basislinje (Wilcoxon test, P <0,05).

For tag-PRP samhandling skal skje, (svak-før-sterk / strong-før-svak) er den tidsmessige rekkefølgen av de to hendelsene ikke avgjørende så lenge tidsvinduet mellom de to hendelsene forblir innenfor området 30-60 minutter. Det ville være lurt å ta med en tredje, uavhengig, men overlapp synaptic isette og bruke det som en baseline kontroll for å overvåke stabiliteten i opptak. De elektriske stimuleringsprotokoller som brukes for å indusere tidligfase og sene former for LTP / LTD må valideres i enkeltinngangs eksperimenter for konsistens og pålitelighet før du bruker dem i STC eksperimenter. Vi ønsker også å understreke viktigheten av skive forberedelse metodikk beskrevet i protokollen siden suksessen av disse eksperimentene er sterkt avhengig av kvaliteten på skivene.

Figur 1
Figur 1. (A) Verktøy som brukes i disseksjon av hippocampus: (a) bandasje saks (b) Iris saks (c) Bone rongeur (d) Thin spatel, (e) Scalpel nummer 11 (f) Sigd scaler (g) Soft -bristle pensel (h) Plastic Pasteur pipette (i) filterpapir (85mm) (j) filterpapir (30mm) (k) Glass kanner (l) Aluminum kjøle blokkene til å passe petriskål og begre(m) petriskål. (B) Manuell vev chopper. (a) Platform (b) Skjære arm med blad-holder (c) Vernier mikrometer, oppløsning 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Elektro oppsett for feltpotensial opptak bestående av (A) stimulatorer (b) en differensialforsterker (c) en analog-til-digital omformer (d) oscilloskop (e) datamaskin med programvare for anskaffelse (f) Vibrasjons motstandsdyktig table-top (g) mikroskop med> 4x forstørrelse (h) grensesnitt hjerne-skive kammer (i) en perfusjon system for ACSF og carbogen tilførsel (j) Temperaturregulatoren (k) en belysningskilde (l) manipulatorer med elektrodeholdere. (B) Interface hjerne-slicekammer. (C) og (D) Hippokampale skiver i grensesnittet kammeret. (E) Rustfritt stål elektrode forseglet i et glass kapillær. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. (A) Skjematisk representasjon av en tverrgående hippokampalt snitt og plassering elektrode for feltpotensial opptak: I denne representasjonen er to stimulerende elektroder (S1 og S2) som er plassert i stratum radiatum av CA1 regionen for å stimulere to uavhengige, men overlapp synaptiske innganger bort på CA1 pyramidale nevroner. To ekstracellulære opptak elektroder, en til å spille inn felt-EPSP (eksitatoriske postsynaptiske potensial) fra apikale dendrittiske rommet og en annen til å ta opp somatisk befolkning pigg fra pyramidecellelegemer er plassert i stratum radiatum og stratum pyramidale hhv. CA1- Cornu ammonis region 1, CA3- Cornu ammonis region 3, DG- dentate gyrus, SC-Schaffer sikkerhet fibre, S1- stimulerende elektrode 1, S2-stimulerende elektrode 2. (B) Svak før sterk paradigme å studere STC: Svak tetanization (WTET) brukes til S1 (åpne sirkler) for å indusere tidlig-LTP etterfulgt av sterk tetanization (STET) for S2 (fylte sirkler) på 30 min for å indusere sen-LTP. Den tidlige-LTP i S1 blir forsterket til sen-LTP viser tagging og fange interaksjon (n = 6) (C) Svak før sterk paradigme for å studere på tvers av tagging. Early-LTP er indusert av WTET i S1 (åpne sirkler), etterfulgt ved induksjon av sene LTD i S2 (fylte sirkler) ved hjelp av SLFS etter 30 min. I S1, er den tidlige-LTP forvandlet til sen-LTP varig 6 hr viser cross-merking og fangst (n = 6). Én pil representerer svak tetanization søkt om å indusere tidlig-LTP. Triplet av piler representerersterk tetanization for å indusere sen-LTP. Den stiplede pil representerer tidspunktet ved hvilket SLFS ble påført på representative synaptiske inngangs å indusere sent-LTD. Feil Linjene indikerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Akutt hippokampalt snitt er et utmerket modellsystem for studier av LTP og andre funksjonelle plastisitet prosesser som STC og kryss-fangst. Det bevarer mye av den laminære strukturelle nettverket av de hippocampale kretser, tillater presis plassering av elektroder og gir sammen med, en åpen plattform for hurtig nevrofarmakologiske manipulering uten blod-hjerne-barrieren.

Denne artikkelen beskriver metodikk for utarbeidelse av levedyktige akutte hippocampus skiver fra unge voksne rotter og bruke dem til å undersøke STC og cross-tagging. Tidligere forskning har lagt vekt på at kjønn og alder av dyrene er viktige faktorer å vurdere for bruk i elektrofysiologiske studier. 27,28 Derfor unge voksne dyr med fullt uttrykt voksne reseptorfunksjoner (Wistar hannrotter i alderen 5-7 uker) brukes. 23 Asymmetri i forbindelsene mellom venstre og høyre hippocampus har vært registrert hos gnagere 29 ogstore forskjeller i NMDA reseptor uttrykk har blitt rapportert i tillegg 34. Vi har brukt høyre hippocampus for å være i samsvar med våre tidligere LTP studier. 23,32 Imidlertid kan hver av hippocampi kan brukes så lenge konsistens opprettholdes.

Som i enhver protokoll, er det meget viktig å utføre isolasjon og kutting prosedyrer raskt, men tar seg at vevet ikke er strukket, er skadet, gjengitt tørr eller hypoksiske. Variasjonene i pH, temperatur og ionisk sammensetning av oppløsningene kan ha stor effekt på levedyktigheten av de skiver og resultatet. Derfor slike variasjoner bør unngås. Det har blitt observert at glutamat-reseptor-avhengig kalsium-frigivningen som foregår i løpet av fremstillingsfremgangsmåten kan irreversibelt påvirke proteinsyntese i nervevev 35,36, 37. Ved hjelp av manuelle vev høvler kan bidra til å minimere dette ved at prosessen kan fullføres meget raskt sammenlignet med vibraslicers. Men mange laboratorier også effektivt bruke vibraslicers med nødvendige forholdsregler for å bevare skive levedyktighet. En annen viktig faktor å vurdere er den lange inkubasjonstiden før forsøkene. Dette har vært kjent for å være veldig avgjørende for å oppnå stabilitet i metabolske statlige og kinase aktivering nivåer i skiver etter forstyrrelse forårsaket under forberedelse 23. Slik stabilitet er nødvendig for konsistens i langsiktige innspillinger. Vi re-vekt på denne observasjonen og foreslå de lange ruge timer med ca 3 timer.

En rekke stimuleringsparametere er kjent for å indusere LTP, men de molekylære mekanismene som utløses i hvert tilfelle ikke kan være det samme (for oversikt se 38). Dette kan påvirke holdbarhet og andre egenskaper av LTP som i sin tur kan påvirke resultatene av synaptiske tagging og fange eksperimenter. Derfor er det viktig å validere stimulerings paradigmer og egenskaperav fremkalte LTP under betingelsene for laboratoriet utfører og vedlikeholde konsistens.

Vi vanligvis ikke vurdere eksperimenter med svært store presynaptiske fiber salver og med maksimal fEPSPs mindre enn 0,5 mV og eksperimenter med betydelige endringer i fiber volley under opptakene blir også avvist. Videre, mens de utfører eksperimenter to sti-eller tre-sti, er det viktig å sikre veien uavhengighet. Dette kan utføres med en sammenkoblet-puls tilrettelegging protokoll 28.

En ulempe med de grensesnitt opptakssystemer er dannelsen av kondensdråper på elektrodene under den lange innspillings timer på grunn av temperatur og luftfuktighet forskjeller mellom kammeret og omgivelsene. Disse dråpene må nøye utslettet fra tid til annen. Ellers dråpene kan dryppe på skivene og forårsake forstyrrelser eller til og med tap av signaler. Vi pleier å takle dette by dyktig blotting dråpene guidede under mikroskopet med en slank filter papir veke, uten å berøre elektrodene. Imidlertid vil den beste løsningen være å bruke en sentralisert varmesystem, som for eksempel ETC-system utviklet av University of Edinburgh forskere.

På en avsluttende notat, en rekke metoder eksisterer i laboratoriene i verden som brukes til fremstilling av hippocampus skiver for ulike eksperimentelle formål. Hver av fremgangsmåten byr på noen fordeler i forhold til den andre. Man trenger å optimalisere nøye minutt detaljer om protokollen som passer formålet med forsøket. Vi håper at denne artikkelen hjelper i å forbedre noen aspekter av metodikk for å studere sene-assosiative prosesser som STC og cross-fangst.

Disclosures

Åpen tilgang for denne videoen artikkelen er sponset av Cerebos Pacific Limited.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Dissection Tools
1. Bandage scissors KLS Martin, Germany 21-195-23-07
B-Braun/Aesculap, Germany LX553R
2. Iris scissors B-Braun/Aesculap, Germany BC140R,
BC100R
3. Bone rongeur World Precision Instruments (WPI), Germany 14089-G
4. Scalpel World Precision Instruments (WPI), Germany; 500236-G
B-Braun/Aesculap, Germany
BB73
5. Scalpel blade#11 B-Braun/Aesculap, Germany BB511
6. Sickle scaler KLS Martin, Germany 38-685-00
7. Angled forceps B-Braun/Aesculap, Germany BD321R
8. Anesthetizing/Induction chamber MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon AS-01-0530-LG
II. ACSF component chemicals
1. Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
2. Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) Sigma-Aldrich M1880
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma-Aldrich C3881
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) Sigma-Aldrich G7021
III. Electrophysiology Instruments
1. Microscope Olympus, Japan Model SZ61
2. Temperature Controller Scientific Systems Design Inc. Canada PTC03
3. Differential AC Amplifier AM Systems, USA Model 1700
4. Isolated Pulse Stimulator AM Systems, USA Model 2100
5. Oscilloscope Rhode & Schwarz HM0722
6. Digital-Analog Converter Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK CED-Power 1401-3
7. Interface Brain Slice Chamber Scientific Systems Design Inc. Canada BSC01
8. Tubing Pump Ismatec, Idex Health & Science, Germany REGLO-Analog
9. Carbogen Flowmeter Cole-Parmer 03220-44
10. Fiber Light Illuminator Dolan-Jenner Industries Fiber Lite MI-150
11. Micromanipulators Marzhauser Wetzlar, Germany 00-42-101-0000 (MM-33)
00-42-102-0000 (MM-32)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  2. Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. Learning-related synaptic plasticity: LTP and LTD. Current Opinion in Neurobiology. 1, 113-120 (1991).
  3. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual review of neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  4. Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: An Embarrassment of Riches. Neuron. 44, 5-21 (2004).
  5. Krug, M., Lossner, B., Ott, T. Anisomycin blocks the late phase of long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats. Brain research bulletin. 13, 39-42 (1984).
  6. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin blocks an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain research. 452, 57-65 (1988).
  7. Otani, S., Marshall, C. J., Tate, W. P., Goddard, G. V., Abraham, W. C. Maintenance of long-term potentiation in rat dentate gyrus requires protein synthesis but not messenger RNA synthesis immediately post-tetanization. Neuroscience. 28, 519-526 (1989).
  8. Frey, U., Frey, S., Schollmeier, F., Krug, M. Influence of actinomycin D, a RNA synthesis inhibitor, on long-term potentiation in rat hippocampal neurons in vivo and in vitro. The Journal of physiology. 490, (3), 703-711 (1996).
  9. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. A macromolecular synthesis-dependent late phase of long-term potentiation requiring cAMP in the medial perforant pathway of rat hippocampal slices). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 3189-3198 (1996).
  10. Manahan-Vaughan, D., Kulla, A., Frey, J. U. Requirement of translation but not transcription for the maintenance of long-term depression in the CA1 region of freely moving rats. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 8572-8576 (2000).
  11. Frey, U., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385, 533-536 (1997).
  12. Frey, U., Morris, R. G. Weak before strong: dissociating synaptic tagging and plasticity-factor accounts of late-LTP. Neuropharmacology. 37, 545-552 (1998).
  13. Redondo, R. L., Morris, R. G. Making memories last: the synaptic tagging and capture hypothesis. Nature reviews. Neuroscience. 12, 17-30 (2011).
  14. Martin, K. C., Kosik, K. S. Synaptic tagging -- who's it? Nature reviews. Neuroscience. 3, 813-820 (2002).
  15. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging: implications for late maintenance of hippocampal long-term potentiation. Trends in neurosciences. 21, 181-188 (1998).
  16. Martin, K. C. Synaptic tagging during synapse-specific long-term facilitation of Aplysia sensory-motor neurons. Neurobiology of learning and memory. 78, 489-497 (2002).
  17. Shires, K. L., Da Silva, B. M., Hawthorne, J. P., Morris, R. G., Martin, S. J. Synaptic tagging and capture in the living rat. Nature communications. 3, (2012).
  18. Ramachandran, B., Frey, J. U. Interfering with the actin network and its effect on long-term potentiation and synaptic tagging in hippocampal CA1 neurons in slices in vitro. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12167-12173 (2009).
  19. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Identification of compartment- and process-specific molecules required for 'synaptic tagging' during long-term potentiation and long-term depression in hippocampal CA1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 5068-5080 (2007).
  20. Sajikumar, S., Navakkode, S., Sacktor, T. C., Frey, J. U. Synaptic tagging and cross-tagging: the role of protein kinase Mzeta in maintaining long-term potentiation but not long-term depression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 5750-5756 (2005).
  21. Redondo, R. L., et al. Synaptic Tagging and Capture: Differential Role of Distinct Calcium/Calmodulin Kinases in Protein Synthesis-Dependent Long-Term Potentiation. The Journal of Neuroscience. 30, 4981-4989 (2010).
  22. Sajikumar, S., Frey, J. U. Late-associativity, synaptic tagging, and the role of dopamine during LTP and LTD. Neurobiology of learning and memory. 82, 12-25 (2004).
  23. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Current Opinion in Neurobiology. 15, 607-613 (2005).
  24. Villers, A., Ris, L. Improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation. Journal of visualized experiments : JoVE. (2013).
  25. Pohle, W., Reymann, K., Jork, R., Malisch, R. The influence of experimental conditions on the morphological preservation of hippocampal slices in vitro. Biomedica biochimica acta. 45, 1145-1152 (1985).
  26. Reymann, K. G., et al. The duration of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampal slice preparation. Brain research bulletin. 15, 249-255 (1985).
  27. Sajikumar, S., Korte, M. Different compartments of apical CA1 dendrites have different plasticity thresholds for expressing synaptic tagging and capture. Learning & Memory. 18, 327-331 (2011).
  28. Li, Q., et al. Making Synapses Strong: Metaplasticity Prolongs Associativity of Long-Term Memory by Switching Synaptic Tag Mechanisms. Cerebral Cortex. 24, 353-363 (2014).
  29. Sajikumar, S., Frey, J. U. Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro. Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).
  30. Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron. The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).
  31. Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).
  32. Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).
  33. Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).
  34. Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nature. 14, 1413-1415 (2011).
  35. Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons. Science. 260, 1661-1664 (1993).
  36. Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -A. The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro. Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).
  37. Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia. Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).
  38. Park, P., et al. NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics