진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

Bioengineering

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Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

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Abstract

Introduction

탈세 포화하고 recellularization 시험관에 1 작용 성, 이식 가능한 장기의 생성을 가능하게 할 수있다. 제거 세포와 항원 물질에 의해 (예., DNA는 알파 - 갈 에피토프)에서 기관은 이하 비 - 면역 세포 외 기질 (ECM)을 얻을 수있다. 이 행렬은 기관의 입체 microanatomy을 보존하고 다른 가능성이 이종 기원의 세포 다시 채우기위한 이상적인 biomatrix로서 역할을 할 수있다. 따라서, 탈세 포화 된 쥐 간 매트릭스는 인간 간 세포 증식을 할 수있다. 이 인간화 마이크로 간 질환 (예., 선천성 대사 질환, 바이러스 성 질환 또는 악성 종양) 또는 전임상 제약 테스트 3에 대한 연구를위한 생체 모델이 될 수 있습니다.

쥐의 간 관류 탈세 포화에 대한 몇 가지 다른 프로토콜은 이미 4-13 발표되었다. 모든 프로토콜에서, decellular화는 유관 간문맥 통해 알칼리 이온 성 또는 비이 온성 세제의 관류에 의해 달성 하였다. 우리가 아는 한, 우리는 문맥 및 / 또는 쥐 간 동맥 (14)를 통해 선택적 관류에 의해 쥐의 간 탈세 포화를보고 첫 번째 그룹이었다. 간에서 서로 다른 혈관 시스템의 선택적 관류 활성화 셀룰러 다시 채우기에 중요한 역할을 할 수 있고, 또한, 더 나은 결과 탈세 포화를 가능하게하고있다.

여기에서 설명 된 연구에서, 간은 진동 압력 조건 하에서 관류있게 주문품 독점 관류 장치로 관류 하였다. 이러한 압력 조건은 간 생리적 호흡기 의존 관류 모방 : 시츄, 간은 호흡 운동시 간 혈류에 직접적인 영향을 다이어프램의 접합부 아래에 건다. 영감은 특히 최적화, 다이어프램의 저하 및 간 압박에 이르게간세포 정맥 유출 반면 만료 간 상승 및 포털 정맥 유입 15을 최적화하기 복강 내 압력의 저하로 연결.

우리의 목표는 진동 압력 조건은 복강 내 조건 생체를 모방하여 쥐의 간 관류 탈세 포화의 동질성에 영향이 있는지 여부를 알아보고자 하였다. 탈세 포화 과정의 균질성 관류 탈세 포화의 과소 평가 요소 일 수있다. 알려진 모든 에이전트는 ECM에 간 탈세 포화 원인 변경에 사용됩니다. 다른 영역이 이미 완전히 탈세 포화되는 반면 저조한 관류 영역의 세포는 ECM 내에 남아있다. 남아있는 세포를 용해, 관류 시간 또는 압력은 잘 관류 부위에 더 많은 변경을 일으키는 상승되어야한다. 따라서, 탈세 포화에 대한 세제는 기관 내에서 균일하게 분산되어야한다.

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Protocol

동물 실험 의학 (FEM, 샤리 테, 베를린, 독일)의 시설에 보관하고, 모든 실험 프로토콜을 검토하고, 국가 보건 및 지역 담당 사무소 (LAGeSo, 베를린, 독일의 승인을 하였다. 등록 번호 O 0365 / 11).

1. 간 수확

  1. 수술 전 준비
    1. 고정을 위해 코르크 판을 사용합니다. 접시에 의료 드레이프를 넣어. 네 바늘을 사용하여, 수술 흡입 마취의 코르크 판에 흡입 마스크를 고정한다.
  2. 포털 정맥 정맥의 사전 약속
    1. 세 방향 꼭지에 말초 정맥 카테터 (G 20)을 연결합니다. 정맥 카테터는 약의 길이, 비스듬히 절단한다. 1.5 cm.
    2. 드 에어 링거 용액으로 가득 10 ML의 주사기를 사용하여 시스템. 그것은 신중하게 해제 공기 가스 색전증 부정적인 관류 탈세 포화에 영향을 미칠 수 있기 때문에 매우 중요하다.
  3. 사전 약속동맥 정맥의
    1. 나비 캐 뉼러를 사용하여 5 mm의 길이로 절단 바늘. 5mm 바늘과 superglue로 수정, 5cm 튜브 (외경 0.96 mm ID 0.58 mm)를 장착한다. 더 큰 튜브에와 superglue로 수정, 2cm 길이의 튜브 (외경 0.61 mm ID 0.28 mm)를 삽입합니다.
    2. 교대로이 공사를 통해 다른 튜브를 미끄러 superglue로 고정합니다. 드 에어 링거 용액으로 채워진 5 ML의 주사기와 동맥 정맥.
  4. 마취와 진통
    1. 1.5 L / min의 유량으로 산소를 3.5 %의 이소 플루 란으로 마취 유도 챔버에서 래트 마취를 유도한다.
    2. 운전시 안전 진통을 보장하기 위해, 복강 metamizol (100 ㎎ / ㎏ 신체 질량)과 저용량 케타민 / 메데 토미 (kg의 신체 질량 당 10 밀리그램 / 0.1 mg)을 주입.
    3. 수술 마취 이후의 유지 보수를 위해 흡입 마스크를 통해 1 L / 분 산소 1.5 % 이소 플루 란를 제공합니다.
  5. 수술 전 약정 <OL>
  6. 전기 전단 기계와 자유주의로 복부를 면도. 소독 용 70 % 에탄올로 복부에 면도​​ 절개 사이트를 적셔.
  7. , 준비된 접시에 앙와위에서 동물을 배치 흡입 마스크에 머리를 삽입하고 의료 테이프와 핀 사지를 고정합니다. 거즈 압축과 초과 에탄올과 모피를 제거합니다.
  • 마취 평가
    1. 호흡을 보면서 마취 깊이를 평가합니다. 마취가 (40 ~ 60 호흡 / 분)만큼 깊은 것 같다 때, 진통 두 뒷다리의 발가락 사이의 피부를 꼬집어하는 수술 집게를 사용하여 발가락 핀치 반사를 트리거하기 위해 시도하여 충분한 지 여부를 확인합니다.
  • 복부 접근
    1. 방광 위 꼬리 복부 벽에 중간 절개를합니다. V 자형 방식으로 양측 늑골 아치에이 시점에서 잘라. 다이어프램으로 잘라 않도록주의하십시오. 가슴 위에 잘라 복부 벽을 당깁니다. , overholt 클램프와 칼 모양의 수정 두개쪽으로 당겨과 고무 밴드로 고정합니다. 장을 대피 젖은 면봉을 사용합니다. 젖은 거즈 붕대에 장을 감싸. 또한, 젖은 붕대 모든 복부 마진을 커버합니다.
  • 간 준비
    1. 낫 모양의 인대를 해부하다. 두개쪽으로 다이어프램의 돔 아래 중간과 왼쪽 간 로브를 개최 젖은 거즈 붕대를 사용합니다. hepatoduodenal 인대와 상부 대망 간 로브 노출됩니다.
    2. 로브가 이동 될 때까지 조심스럽게 상단 대망 로브에 부착 된 인대를 해부하는 두 microforceps 봄 가위를 사용합니다. 대신에 중간과 왼쪽 엽을 잡고, 거즈 압축에서 젖은 면봉을 사용하여 로브를 이동합니다.
    3. 위 대망 간 엽의 동원 후, 왼쪽으로 배를 이동합니다. 클램프와 위장을 수정하고 microforceps 및 스프링 가위로 작은 대망을 해부하다.
    4. 낮은 omenta를 동원L 간 엽이 이동하고 이후에 그 구멍에 다시 로브를 이동시킬 때까지. 십이지장을 유지하기 위해 박하우스 클램프를 사용합니다. 스트레칭과 hepatoduodenal 인대를 노출 왼쪽으로 십이지장을 이동합니다. 뻗어 hepatoduodenal 인대의 담관을 외접.
    5. 지방 및 췌장 조직에서 담관을 해부하다. 담관에게 담관 분기에서 1.5 cm를 잘라. 주위의 지방 조직에서 문맥을 해부. 십이지장 정맥을 노출.
    6. 실크 6-0로 두 번 십이지장 정맥을 결찰하고 2 합자 사이의 정맥을 나눕니다. 모든 동맥 라미가 공개 될 때까지 주변 조직에서 복강 트렁크 및 공통 간 동맥을 해부하다.
    7. 주변 조직으로부터 십이지장 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 십이지장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 십이지장 동맥을 해부하다.
    8. 비장 동맥을 해방주변 조직으로부터. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 비장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 비장 동맥을 해부하다.
    9. 주변 조직으로부터 왼쪽 위 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 왼쪽 위 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 동맥을 해부하다.
    10. 오른쪽 신장과 오른쪽 측면 간 엽 사이의 열등한 대정맥 정맥을 외접. 복막 공간에서 정맥을 해부하다. 복강 트렁크에 따라 대동맥을 노출.
    11. 복막 지방 조직을 해부하다. 하대 정맥에 1 ml의 생리 식염수 1,000 IE의 헤파린을 주입한다. 캐 뉼러를 후퇴와 화장 솜에 절개를 닫습니다. 헤파린의 전신 효과를 1-2 분을 기다립니다.
    12. 집게로 대동맥을 외접. 대동맥을 해부하고 쥐에게서 피를 뽑다. 또한, 신장에서 원심 하대 정맥을 해부하다.
  • 포털 정맥로 (사용 섹션 1.2에서 제조 된 정맥)
    1. 말단 포털 정맥에 물고기 입 절개를합니다. 집게로 절개를 열고 포털 정맥을 cannulate. 간 탈색 될 때까지 20 ㎖ 링거 용액으로 간을 세척 및 합자 (실크 6-0)와 캐 뉼러를 해결.
  • 동맥 캐 뉼러 (사용 섹션 1.3에서 제조 된 정맥)
    1. 복강 트렁크 위의 대동맥을 해부하다. 복막 공간에서 대동맥 세그먼트를 해방. 대동맥 패치를 생성하기 위해 길이 방향으로 대동맥 세그먼트를 잘라. 정적 홀더에 자체 내장 캐뉼라를 삽입합니다.
    2. 캐 뉼러를 통해 대동맥 패치를 미끄러 2 집게를 사용합니다. 정맥을 통해 실크 6-0로 간 동맥을 결찰하고 지대치에 패치를 수정합니다.
  • 간 외식
    1. 다이어프램을 열고 원형 절개를 주변 구조에서 간을 해부하다.
  • 저장
    1. 스토사용할 때까지 350 ml의 링거 용액으로 가득 멸균 500ml의 탱크에 간 재.
  • 2. 세제 솔루션

    1. 10 % 트리톤 X-100 원액
      1. 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 100 ml의 트리톤 X-100 (99,9 %)를 추가합니다. 트리톤 X-100을 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지.
    2. 1 % 트리톤 X-100
      1. 1000 ㎖의 병에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)를 첨가. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % 트리톤 X-100 용액 필터.
    3. 10 % SDS 원액
      1. 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 과 66.99 g을 SDS (99.9 %, 밀도 0.67)를 추가합니다. SDS를 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지.
    4. 1 % SDS
      1. 1000 ml의 봇에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)을 추가TLE. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % SDS 용액을 필터.

    3. 탈세 포화

    1. 관류 장치의 설정 그림 1

    그림 1 :. 진동 압력 조건에서 선택적 동맥과 네 쥐 간을 포털 정맥 관류에 대한 관류 장치의 제도 (. Struecker 등에서 수정 14)

    1. 삼방 콕 및 충전 레벨을 조절하고 500 mL의 0.9 % NaCl로 반응기를 채우기 위해 Heidelberger 확장 드레인에 링크.
      그림 2

    그림 2. (4) 포털 정맥 액세스 통해 버블 트랩 (5) (2) 또는 동맥 AC 통해 선단 관류 셋업의 반응식 관류 챔버를 연결 (1,400cm 3) (1)운 (3). 기포 트랩 (5)의 말단부에서 폐색 (4) 및 배출구 (6)를 구비한다. Heidelberger 확장 (7)에 버블 트랩 (5)를 연결합니다. 펌프 세그먼트 (8)에 Heidelberger 확장을 연결합니다. 또한, 다른 Heidelberger 확장 (9)에 펌프 세그먼트 (8)를 연결합니다. 세제 (10)의 병에 마지막 Heidelberger 확장 (9)를 삽입합니다. (관류 또는 다수의 경우에 압력 유통로) 관류 챔버에 마스크 (11)를 연결한다. 반응기 유체를 배출, 폐기물 용기 (12)에 대한 유출을 연결한다.

    1. 펌프로 펌프 세그먼트를 삽입합니다. PBS로주기를 채우기 위해 펌프를 시작, 버블 트랩의 선단을 닫고 환기를 엽니 다. 거품의 바닥 안전하게 PBS (2-3 CM)으로 피복되는 경우, 벤트를 닫고 버블 트랩의 말단부를 연다.
    2. 간 설치
      1. 관련 반응기 액세스 문맥 캐 뉼러의 삼방 콕 링크. C동맥 액세스 동맥 정맥 connect를. 공기가 시스템에 입력하지 않도록주의하십시오.
    3. 진동 압력 조건의 적용
      1. 15 BPM의 주파수 및 26 밀리바 (분. 4 밀리바, 최대. 30 밀리바)의 진폭 호흡기를 사용합니다. 압력 분포 챔버로 호흡기를 연결하고 반응기 챔버를 연결합니다. 압력 응용 프로그램을 시작합니다.
    4. 탈세 포화 프로토콜
      1. / 분 5 ㎖의 유속으로 관류 단계를 수행한다. 90 분 동안 1 % 트리톤 X-100 간 관류와 탈세 포화를 시작합니다. 관류 챔버 내부 상수 및 관류 된 간 상기 오일 레벨을 유지하기 위해 관류 장치의 유출을 통해 폐기 유출 물을 허용. 90 분 후, 1 % SDS에 세제를 변경합니다.
        그림 3
        표 1
    <P> 그림 3 : 모든 실험 그룹의 관류 프로토콜.

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    Representative Results

    균질성 따라서 다른 탈세 포화 프로토콜의 효과를 육안 관찰, 조직 학적 분석, 탈세 포화 간 매트릭스 내의 나머지 DNA 함량 분석에 의해 평가 하였다. 또한, 부식 주조 탈세 포화 후 간 손상의 microanatomy을 시각화 하였다.

    Macroscopy

    탈세 포화 동안, 간 세포는 콘텐츠의 제거를 나타내는, 루슨트된다. 문맥을 통해 관류 된 간을 탈세 포화 동안 및 (흰색 화살표) 후에 육안 가시 나머지 세포, 불균일 해명 (따라서 탈세 포화)를 보였다. 간동맥을 통해 관류 간은보다 균일 한 탈세 포화 코스와 눈에 보이는 남아있는 세포를 보였다. 간은 진동 압력 조건의 적용을 관류 한 경우, 나머지 세포는 무관 관류 경로 보이지 않았다.

    그림 4
    그림 4 : 압력 조건을 진동없이 쥐 간 탈세 포화의 육안 결과. 왼쪽 : 간동맥을 통해 탈세 포화 된 쥐의 간. 간은 거시적으로 볼 남아있는 세포없이, 루슨트 나타납니다. 오른쪽 : 포털 정맥을 통해 관류 간. 간은 비균질 거시적으로 볼 수 세포, 탈세 포화 나타납니다

    그림 5
    그림 5 : 진동 압력 조건에서 쥐 간 탈세 포화의 육안 결과. 왼쪽 : 간동맥을 통해 탈세 포화 된 쥐의 간. 오른쪽 : 포털 정맥을 통해 관류 간. 모두 간은 눈에 보이는 나머지 세포없이, 루슨트 나타납니다.

    조직 학적 평가

    탈세 포화 간 매트릭스 지지체의 조직 학적 평가ED는 거시적 인 결과. 간동맥을 통해 관류 된 간을 상관없이 그들이 진동 압력 조건 하에서 관류 여부, 더 남은 세포가 없었다. 문맥을 통해 관류 된 간을 그들이 진동 압력 조건의 적용을 관류 하였다하더라도, 나머지 셀의 영역을 나타내었다. 그러나, 진동 압력 조건의 적용은 문맥을 통해 관류 된 간에서 나머지 셀 질량을 감소시켰다. 간의 ECM은 모든 적용 프로토콜에 걸쳐 눈에 보이는 차이없이, 보존되었다.

    그림 6

    그림 6 : H / 탈세 포화 간 매트릭스의 E 염색. AP : 압력 조건을 진동없이 간동맥을 통해 관류 탈세 포화 간 매트릭스. + P : 진동 압력 조건 하에서 간동맥을 통해 관류 탈세 포화 간 매트릭스. PA-P : 탈세 포화 간 MATRIX 압력 조건을 진동없이 간문맥 통해 관류. PA + P : 진동 압력 조건에서 문맥을 통해 관류 된 간 탈세 포화 된 매트릭스. 화살표 : 세포 클러스터를 남은.

    DNA 콘텐츠

    차이는 통계적으로 유의 한 진동 압력 조건 (; + P 태양 광 발전 + P)에서 관류 그룹에 있었지만 간 매트릭스의 건조 중량 당 DNA 함량은 기본 간에 비해 모든 실험군에서 감소했다. 건조 중량 당 DNA의 가장 낮은 금액은 진동 압력 조건에서 간동맥을 통해 관류 간에서 발견되었다.

    그림 7

    그림 7 : (. Struecker 14 수정) 간 매트릭스의 DNA 콘텐츠 당 건조 중량. 간동맥 쇼를 통해 탈세 포화 간 적은 그 관류보다 DNA가 남아있는포털을 통해 d를 할 정 맥. 진동 압력 조건에서 관류 간은 할이 조건없이 탈세 포화 된 것보다 적은 나머지 DNA를 보여줍니다. 따라서, 진동 압력 조건 하에서 간동맥을 통해 관류 된 간은 최소 잔존 DNA 함량을 나타낸다.

    부식 주조

    탈세 포화 간 행렬들의 부식 캐스팅 (포털 정맥 시스템의 단백질 골격, 동맥 시스템 및 담즙 시스템 포함)의 간 microanatomy 탈세 포화 과정이 보존되어 있음을 확인.

    그림 8
    그림 8 : (. Struecker 14 수정) 탈세 포화 된 쥐 간 매트릭스의 부식 주조의 사진. 모든 셀의 제거에도 불구하고, 포털 정맥 (청색) 동맥 (적색) 시스템을 포함한 기관의 microanatomy는 보존된다. REMA담즙 시스템의 ining 주요 지점은 노란색으로 주조된다.

    표 1
    표 1 : 진동 압력 조건의 효과 및 쥐 간 탈세 포화에 관류 경로를 평가하기위한 실험 그룹.

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    Discussion

    쥐의 간 수확 및 탈세 포화에 대한 발표 기술은 쉽게 재현 할 수 있지만, 고려해야 할 중요한 특정 단계가 있습니다 :

    이 혈액 응고를 활성화하고 간 내 혈전 형성으로 이어질 수 있기 때문에 간 수확을 준비하는 동안, 그것은 심한 출혈을 방지하는 것이 중요하다. 우리의 의견으로, 그 문맥을 통해 관류 동안 간동맥을 통해 혈액의 유입을 방지하기 위해 포털 정맥 삽관 직전 복부 대동맥을 절개하는 것이 바람직하다. 간이 삽관 명확 관류되면, 혈전 형성이 더 이상 문제가 없다.

    관류 원형으로 가스 기포의 유입 가스 색전증을 방지하기 위해 회피되어야하기 때문에 관류 장치 간 교통 수확 후 관류 장치 간 연결의 특히 중요한 공정이다. 또한, 삼방 밸브를 미리 기입하는 것이 유용하다 IPBS를 관류 시스템에 밸브를 연결하기 전에 직접 주사기 및 얇은 캐뉼라를 사용하여, 캐 뉼러 간 접속 s는.

    관류가 설립 된 후, 모든 튜브 커넥터 여부, 밸브 및 튜브가 완벽하게 연결되는 세 방향을 다시 확인해야합니다. 간은 더 이상 기간에 대한 관류하는 경우 (예 :., O / N)는 관련도 작은 오류 따라서 치명적인 관류 결과로 이어지는, 관류 시스템에 빨아 공기로 이어질 수 있습니다.

    제시된 데이터는 최선의 탈세 포화 결과에 대한 진동 압력 변화의 최적 압력과 주파수가 불분명한다는 사실에 의해 제한된다. 또한, 압력 제어 관류 흐름 제어 관류가보다 더 더 안정적인 결과를 초래할 수있다. 압력 제어 관류는 동일한 결과와 다른 크기 및 무게의 간 한 관류 프로토콜의 응용을 가능하게 흐를 자동 B 때문에전자는 적응.

    간동맥과 문맥 크기와 생리적 흐름 속도면에서 크게 다르다. 따라서, 일정한 관류 레이트 (5 ㎖ / 분)를 확실히 두 혈관 시스템 내의 다른 관류 압력을 초래할 것이다. 마찬가지로, 일정한 관류 압력이 다른 관류 요금 발생합니다. 두 경로를 통해 관류 탈세 포화 효능을 비교하기위한 한 가지 방법은 두 경로를 통해 생리 관류 압력 또는 관류 속도로 관류를 수행하는 것이다. 그러나, 본 연구의 결과를 비교하기 위해, 우리는 두 경로에 대한 일정한 관류 속도를 선택했다. 불행히도, 우리의 장치를 사용하여, 우리는 관류 된 간 내의 관류 압을 측정 할 수 없었다.

    차세대 관류 장치는 필요한 관류 매체의 양을 최소화하기 위해 작아야한다. 또한, 펌프 장치는 압력 제어 관류를 사용한다.

    목전자 제시된 기술은 재현성, 균일 한 쥐의 간 탈세 포화에 매우 유용 나타납니다. 제시된 기술은 체외에서 recellularization 및 장기 숙성에 적합 여부는 추가로 해결해야합니다. 진동 압력 조건이 다시 채워 셀에 영향이 있는지 추가 실험의 대상이 될 것이다.

    제시된 기술은 다른 쥐의 간 관류 장치보다 더 정교하고 몇 가지 분명한 장점을 보여줍니다 진동 압력 조건이 적용되는 경우 1) 균일 한 탈세 포화가 좋은 결과로 재현. 2) 관류 장치 밀봉하고 매트릭스 다시 채우기 장기 관류를위한 필수 조건이다 멸균 탈세 포화를 가능하게한다. 3) 제시된 프로토콜은 다른 프로토콜로 출판보다 짧다 여전히 매우 효과적이다. 문맥과 간동맥 4) 선택적 관류가 서로 다른 시스템을 통해 선택적 세포 다시 채우기가 가능한 렌더링,하는 중요한 도구가 될 수 있습니다.

    관류 장치 다듬고 쥐 간 탈세 포화를 최적화하기 위해 상기 탈세 포화 실험에서 적용된다. 압력 제어 관류의 효과는 실험적으로 평가 관류 흐름 제어와 비교한다. 상기 원소의 첨가 (예., "투석 장치」열교환 형산) 다시 채우기, 성숙 배양 실험은 상기 표시 장치를 개발하는 것이 가능하고 합리적인 나타난다.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Self built arterial cannula
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0.28 mm ID 0.61 mm OD
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
    portal vein cannula
    Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
    Three-way stopcock smiths medical 888-101RE
    surgery
    Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
    Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
    Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
     Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000 ml
    10 ml Syringe Braun 4606108V 10 ml/ Luer Solo
    5 ml Syringe Braun 4606061V 5 ml /Luer Solo
    Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
    medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
    surgical instruments
    needle holder Geuder 17570
    micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
    micro-scissors Martin 11-740-11
    micro-forceps S&T  112314
    Clamp Aesculap BH111R
    scissors F S T  14501-14
    surgical forceps Aesculap BD 557
    Decellularisation
    Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
    Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
    peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
    heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
    MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
    bubble trap  custome-made item
    Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
    Detergents
    SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2.5 kg
    Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10 L
    PBS  Gibco 14190-094 DPBS
    staining
    Eosin 1% Morphisto 10177
    Mayer hematoxylin AppliChem A4840
    gomori staining Morphisto 11104
    AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
    Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

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    References

    1. Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
    2. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
    3. Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. (2013).
    4. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
    5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
    6. Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
    7. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
    8. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
    9. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
    10. De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
    11. Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
    12. Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. (2012).
    13. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
    14. Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. (2014).
    15. Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. (2014).

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