Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Bioengineering

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Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

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Abstract

Introduction

Dezellularisierung und Rezellularisierung kann die Erzeugung von funktionellen, transplantierbaren Organen in vitro 1 zu ermöglichen. Durch Entfernung von Zellen und antigenes Material (z. B. DNA, Alpha-Gal Epitope) von einem Organ, das nicht oder weniger immunogen extrazellulären Matrix (ECM), erhalten werden. Diese Matrix konserviert die dreidimensionale Mikroanatomie eines Organs und kann als ideal Biomatrix zur Repopulation mit Zellen einer anderen, möglicherweise xenogenen Ursprungs 2 dienen. Somit könnte eine dezellularisierte Rattenleber Matrix mit menschlichen Leberzellen wiederbesiedelt wird. Dieser humanisierte Mikro Leber könnte als Ex-vivo-Modell für die Erforschung von Krankheiten (z. B. angeborene Stoffwechselkrankheiten, Viruserkrankungen oder malignen Erkrankungen) oder für präklinische Arzneimittelprüfung 3 dienen.

Mehrere verschiedene Protokolle für die Rattenleberdurchblutung Dezellularisierung wurden bereits veröffentlicht 13.04. In allen Protokollen decellularsierung wurde durch Perfusion von Alkali ionische oder nichtionische Detergentien über kanülierten Pfortader erreicht. Um das Beste aus unserem Wissen, wir waren die erste Gruppe, Rattenleber Dezellularisierung über die Pfortader und / oder dem Rattenleberarterie 14 zu melden durch selektive Perfusion. Aktivieren der selektiven Perfusion der verschiedenen Gefäßsysteme in der Leber besser Dezellularisierung Ergebnisse ermöglichen und darüber hinaus eine wichtige Rolle in der zellulären Wiederbesiedelung zu spielen.

In der Studie detailliert hier wurden Lebern in einem maßgeschneiderten proprietären Perfusionsvorrichtung perfundiert, wodurch die Perfusion unter oszillierenden Druckbedingungen. Diese Druckbedingungen imitieren die physiologische Atemabhängigen Perfusion der Leber: in situ hängt der Leber unter dem Copula der Membran, deren Bewegung während der Atmung hat einen direkten Einfluss auf die Leberperfusion. Inspiration führt insbesondere zu einer Verringerung der Membran und Zusammendrücken der Leber, zu optimierenLeber-venösen Abfluss, führt in der Erwägung, Ablauf, um Höhe der Leber und der Absenkung der intraabdominellen Druck portal-venösen Zufluss 15 zu optimieren.

Unser Ziel war es festzustellen, ob oszillierenden Druckbedingungen einen Einfluss auf die Homogenität der Rattenleber Perfusion Dezellularisierung durch die Nachahmung von intraabdominellen Bedingungen ex vivo haben. Die Homogenität der Dezellularisierung Prozess kann ein unterschätzter Faktor bei Perfusion Dezellularisierung sein. Alle bekannten Mittel verwendet für Leber Dezellularisierung Ursache Änderungen an der ECM. Zellen in schlecht durchbluteten Gebieten bleiben im ECM, während andere Bereiche bereits vollständig dezellularisiert. Um die restlichen Zellen zu lösen, muss der Perfusion Dauer oder Druck erhöht werden, was zu mehr Veränderungen an den gut durchbluteten Bereichen. Daher sollten Reinigungsmittel für Dezellularisierung homogen innerhalb des Organs verbreitet werden.

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Protocol

Die Tiere wurden nach der Fazilität für Experimentelle Medizin (FEM, Charité, Berlin, Deutschland) gehalten wird, und alle Versuchsprotokolle wurden überprüft und durch das Landesamt für Gesundheit und lokale Angelegenheiten (LAGeSo, Berlin, Deutschland zugelassen; Reg. No. O 0365 / 11).

1. Liver Harvesting

  1. Präoperative Vorbereitung
    1. Verwenden Sie eine Korkplatte zur Fixierung. Setzen Sie ein medizinisches Tuch auf dem Teller. Mit vier Nadeln, fix eine Inhalationsmaske auf der Korkplatte zur intraoperativen Inhalationsnarkose.
  2. Vorbereitung des Portalvenenkanüle
    1. Anschluss eines peripheren Venenkatheters (G 20) mit einem Dreiwegehahn. Der Katheter sollte schräg abgeschnitten werden, mit einer Länge von rd. 1,5 cm.
    2. De-Luft das System mit einem 10-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt. Es ist sehr wichtig, sorgfältig zu entlüften, da Gasembolie kann sich negativ auf die Durchblutung Dezellularisierung.
  3. Vorbereitungder Arterienkanüle
    1. Verwenden Sie ein Schmetterlingskanüle und schneiden Sie die Nadel auf eine Länge von 5 mm. Setzen Sie einen 5 cm Schlauch (ID 0,58 mm, AD 0,96 mm) auf die 5 mm Nadel setzen und mit Sekundenkleber. Legen Sie eine 2 cm lange Rohr (ID 0,28 mm, AD 0,61 mm) in das größere Rohr montieren und mit Sekundenkleber.
    2. Gleiten Sie einen anderen Schlauch über diese Konstruktion als Anschlag montieren und mit Sekundenkleber. De-Luft die Arterienkanüle mit einem 5-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt.
  4. Anästhesie und Analgesie
    1. Induzieren Narkose der Ratte im Narkoseinduktionskammer um 3,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,5 L / min.
    2. Um sicher zu Analgesie während des Betriebs zu gewährleisten, injizieren Metamizol (100 mg / kg Körpergewicht) und Niedrigdosis Ketamin / Medetomidin (10 mg / 0,1 mg pro kg Körpergewicht) intraperitoneal.
    3. Liefern 1,5% Isofluran in 1 l / min Sauerstoff über der Inhalationsmaske für die spätere Wartung der chirurgischen Anästhesie.
  5. Präoperative Arrangements <ol>
  6. Rasieren Sie den Bauch zügig mit einer elektrischen Schermaschine. Feuchten Sie die rasierte Einschnittstelle auf dem Bauch mit 70% Ethanol zur Desinfektion.
  7. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem vorbereiteten Platte, legen Sie den Kopf in die Inhalationsmaske und die Extremitäten mit medizinischem Klebeband und Stifte zu befestigen. Entfernen Sie überschüssiges Ethanol und Fell mit einem Gazekompresse.
  • Anästhesie-Bewertung
    1. Beurteilen Sie die Narkose Tiefe durch die Beobachtung der Atemfrequenz. Wenn die Betäubung scheint tief genug (40-60 Atemzüge / min), zu prüfen, ob Analgesie ist, indem Sie versuchen, um die Zehe Prise Reflex mit chirurgische Pinzette, um die Haut zwischen den Zehen beider Hinterbeine klemmen auslösen ausreichend.
  • Bauch-Ansatz
    1. Machen Sie eine Medianschnitt in die Schwanzbauchdecke über der Blase. Von diesem Punkt an beiden seitlichen Rippenbögen in einer V-förmig geschnitten. Achten Sie darauf, in die Membran geschnitten. Ziehen Sie die Bauchdecke schneiden auf der Brust. Befestigen Sie den Schwertfortsatz mit einem Overholt Klemme, ziehen Sie es nach kranial und fixieren Sie sie mit einem Gummiband. Verwenden nassen Wattestäbchen, um den Darm zu evakuieren. Wickeln Sie den Darm in einem feuchten Mullbinde. Darüber hinaus decken alle Bauchränder mit nassen Verband anlegen.
  • Liver Vorbereitung
    1. Präparieren Sie die Ligamentum falciforme. Verwenden Sie einen feuchten Mullbinde auf die mediale und linken Leberlappen kranial unter der Kuppel der Membran zu halten. Setzen Sie das Ligamentum hepatoduodenale und die obere omental Leberlappen.
    2. Verwenden Sie zwei microforceps und Frühjahr Schere sorgfältig sezieren das Band an der oberen omental Lappen angebracht, bis der Lappen ist mobil. Bewegen Sie den Lappen mit feuchten Wattestäbchen unter der Gazekompresse, halten die medialen und linken Lappen vorhanden.
    3. Nach Mobilisation der oberen omental Leberlappen, bewegen Sie den Bauch auf der linken Seite. Befestigen Sie den Magen mit einer Klemme und sezieren die kleinere Netz mit microforceps und den Feder Schere.
    4. Mobilisierung der unteren Omental Leberlappen, bis es ist mobil und anschließend die Lappen in seinem Hohlraum zu bewegen zurück. Benutzen Sie einen Haken, um den Backhaus Zwölffingerdarm zu behalten. Bewegen Sie den Zwölffingerdarm nach links zu dehnen und setzen den Ligamentum hepatoduodenale. Umschreiben den Gallengang in der gestreckten Ligamentum hepatoduodenale.
    5. Präparieren Sie die Gallengang aus dem Fettgewebe und Pankreasgewebe. Schneiden Sie den Gallengang 1,5 cm aus dem Gallengang Bifurkation. Präparieren Sie die Pfortader aus dem umgebenden Fettgewebe. Setzen Sie das gastro-Vene.
    6. Ligieren der gastroduodenalen Vene zweimal mit Seide 6-0 und teilen Sie die Vene zwischen 2 Ligaturen. Präparieren Sie die Zöliakie-Stamm und die gemeinsame Leberarterie aus dem umgebenden Gewebe, bis alle arteriellen rami enthüllt werden.
    7. Befreiung der gastroduodenalen Arterie aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastroduodenalis zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die gastroduodenalen Arterie zwischen 2 Ligaturen.
    8. Befreien Sie die Milzarterievon dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die Milzarterie zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Milzarterie zwischen den 2 Ligaturen.
    9. Befreien Sie die A. gastrica sinistra aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastrica sinistra zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Arterie zwischen 2 Ligaturen.
    10. Umgrenzen die Vena cava inferior zwischen der rechten Niere und der rechten seitlichen Leberlappen. Präparieren Sie die Vene aus dem Retroperitoneum. Expose der Aorta durch Befolgen des Truncus coeliacus.
    11. Präparieren Sie die retroperitonealen Fettgewebe. Injizieren 1000 IE Heparin in 1 ml Kochsalzlösung in die untere Hohlvene. Ziehen Sie die Kanüle, und schließen Sie den Schnitt mit einem Wattebausch. Warten Sie 1-2 Minuten für die systemische Wirkung von Heparin.
    12. Umschreiben die Aorta mit einer Pinzette. Präparieren Sie die Aorta und exsanguinate die Ratte. Weiterhin sezieren die untere Hohlvene sich distal von der Niere.
  • Portal Venen-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.2 zubereitet)
    1. Machen Sie eine Fisch-Mund-Schnitt in der distalen Pfortader. Öffnen Sie die Schnittführung mit einer Pinzette und kanülieren die Pfortader. Spülen Sie die Leber mit 20 ml Ringer-Lösung, bis die Leber entfärbt und befestigen Sie die Kanüle mit Ligaturen (6-0 Seide).
  • Arterien-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.3 zubereitet)
    1. Präparieren Sie die Aorta oberhalb des Truncus coeliacus. Befreien Sie die Aorta Segment aus dem Retroperitoneum. Schneiden Sie die Aorta Segment in Längsrichtung, um einen Aorten-Patch zu erzeugen. Legen Sie die selbst gebauten Kanüle in einen statischen Halter.
    2. Verwenden Sie 2 Pinzette, um die Aorta-Patch über der Kanüle gleiten. Ligieren die Leberarterie mit Seide 6-0 über die Kanüle und befestigen Sie den Patch auf den Anschlag.
  • Liver Explantation
    1. Öffnen Sie die Blende, einen Zirkelschnitt und sezieren die Leber von den umgebenden Strukturen.
  • Lagerung
    1. Store der Leber in einem sterilen 500 ml-Tank mit 350 ml Ringer-Lösung bis zur Verwendung gefüllt.
  • 2. Waschmittellösungen

    1. 10% Triton X-100-Stammlösung
      1. Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen Sie 100 ml Triton X-100 (99,9%). Verwenden Sie einen Rührer, die Triton X-100 zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist.
    2. 1% Triton X-100
      1. 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000-ml-Flasche. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% Triton X-100-Lösung durch ein Sterilfilter.
    3. 10% SDS-Stammlösung
      1. Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen 66,99 g SDS (99,9%, Dichte 0,67). Verwenden Sie ein Rührwerk, das SDS zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist.
    4. 1% SDS
      1. 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000 ml bottle. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% SDS-Lösung durch ein Sterilfilter.

    3. Dezellularisierung

    1. Aufbau von Perfusionsvorrichtung Abbildung 1

    Abb. 1: Schematische Darstellung der Perfusion Gerät zur Tiefen Arterielle und venöse Portal Perfusion von Four Rattenlebern unter oszillierenden Druckbedingungen (. Von Struecker et al modifiziert 14)

    1. Verknüpfen Sie die Drain mit einem Dreiwegehahn und einem Heidelberger Verlängerung, um den Füllstand zu regulieren und füllen den Reaktor mit 500 ml 0,9% NaCl.
      Figur 2

    Abb. 2: Schema der Perfusion Set-Up-Link-Perfusionskammer (1.400 cm 3) (1) zum distalen Ende (4) der Luftfalle (5) über die Pfortader Zugriff (2) oder über die arterielle acProzess (3). Die Blasenfalle (5) ist mit einem Verschließen (4) am distalen Ende und einer Entlüftungsöffnung (6) ausgestattet sein. Schließen Sie die Blasenfalle (5) zu einer Heidelberger Verlängerung (7). Verknüpfen Sie die Heidelberger Verlängerung der Pumpstrecke (8). Darüber hinaus schließen Sie das Pumpensegment (8) zu einem anderen Heidelberger Verlängerung (9). Legen Sie die letzten Heidelberger Verlängerung (9) in die Flasche Spülmittel-Lösung (10). Verbinden das Beatmungsgerät (11) an der Perfusionskammer (oder an den Druckverteiler in dem Fall von mehreren Infusionen). In den Reaktor Flüssigkeiten ablaufen, schließen Sie den Abfluss in die Abfallflasche (12).

    1. Setzen Sie die Pumpensegment in die Pumpe. Starten Sie die Pumpe, um den Zyklus mit PBS füllen, schließen Sie das distale Ende der Blasenfalle und öffnen Sie das Entlüftungs. Wenn der Boden der Blase fest mit PBS (2-3 cm) bedeckt ist, schließen Sie das Entlüftungs und öffnen Sie das distale Ende der Blasenfalle.
    2. Liver Installations
      1. Verknüpfen Sie den Dreiwegehahn der Pfortader Kanüle dem Stand der Reaktorzugang. Cerbinden die Arterienkanüle mit dem arteriellen Zugang. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass keine Luft in die Systeme.
    3. Anwendung des oszillierenden Druckbedingungen
      1. Atemschutz mit einer Frequenz von 15 Schlägen pro Minute und einer Amplitude von 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Schließen Sie das Beatmungsgerät an die Druckverteilungskammer und schließen Sie die Kammer in den Reaktor. Starten Sie Druckanwendung.
    4. Dezellularisierung Protocol
      1. Zuführen Perfusion Stufen mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min. Starten Sie die Dezellularisierung mit Perfusion der Leber mit 1% Triton X-100 für 90 min. Erlauben Abfall Ausfluß über den Abfluss der Perfusionsvorrichtung bis der Flüssigkeitsstand im Inneren der Perfusionskammer konstant und über der perfundierten Leber halten. Nach 90 Minuten, ändern Sie das Reinigungsmittel auf 1% SDS.
        Figur 3
        Tabelle 1
    <p> Abbildung 3: Perfusion Protokoll für alle Versuchsgruppen.

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    Representative Results

    Die Homogenität und damit die Wirksamkeit der verschiedenen Dezellularisierung Protokolle wurden durch makroskopische Beobachtung histologischen Analyse und Analyse der verbleibenden DNA-Gehalt innerhalb dezellularisierte Leber Matrizen ausgewertet. Darüber hinaus wurde Korrosionsgießtechnik geführt, um die intakte Mikroanatomie der Leber nach Dezellularisierung visualisieren.

    Makros

    Während Dezellularisierung, Leber geworden Lucent, was die Entfernung von Zellgehalt. Lebern über die Pfortader perfundiert zeigte inhomogenen Aufklärung (und somit Dezellularisierung) mit makroskopisch sichtbaren verbleibenden Zellen während und nach der Dezellularisierung (weiße Pfeile). Livers über die Leberarterie durchbluteten zeigte eine homogenere Dezellularisierung Platz und keine sichtbaren übrigen Zellen. Wenn Lebern wurden bei der Anwendung der oszillierenden Druckbedingungen perfundiert wurden keine restlichen Zellen sichtbar ist, unabhängig von der Perfusion Route.

    Figur 4
    Abbildung 4: Makroskopische Ergebnisse von Rattenleber Dezellularisierung ohne oszillierenden Druckbedingungen. Links: Rattenleber über die Leberarterie dezellularisiert. Die Leber wird Lucent, ohne makroskopisch sichtbare übrigen Zellen. Rechts: Leber über die Pfortader perfundiert. Die Leber erscheint inhomogen dezellularisiert mit makroskopisch sichtbaren Zellen

    Figur 5
    Abbildung 5: Makroskopische Ergebnisse der Rattenleber Dezellularisierung unter oszillierenden Druckbedingungen. Links: Rattenleber über die Leberarterie dezellularisiert. Rechts: Leber über die Pfortader perfundiert. Beide Lebern erscheinen Lucent, ohne sichtbare übrigen Zellen.

    Histologische Bewertung

    Die histologische Auswertung der dezellularisiert Leber Matrizen Unterstützunged die makroskopischen Befunde. Livers über die Leberarterie durchbluteten zeigte keine restlichen Zellen, unabhängig davon, ob sie unter oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. Lebern über die Pfortader perfundiert zeigte Zonen der übrigen Zellen, auch wenn sie mit der Anwendung von oszillierenden Druckbedingungen perfundiert wurden. Allerdings ist die Anwendung von oszillierenden Druckbedingungen reduziert die Restzellmasse in der Leber über die Pfortader perfundiert. Das ECM der Lebern wurde konserviert, ohne sichtbare Unterschiede in allen angewendet Protokolle.

    Figur 6

    Abbildung 6: H / E-Färbung der Dezellularisierte Liver Matrices. AP: Dezellularisierte Lebermatrix über die Leberarterie ohne oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. A + P: dezellularisierte Leber Matrix über die Leberarterie unter oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. PA-P: dezellularisierte Leber matrix über die Pfortader ohne oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. PA + P: Dezellularisierte Lebermatrix über die Pfortader unter oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. Arrows: Verbleibende Zellhaufen.

    DNA-Gehalt

    Der DNA-Gehalt pro Trockengewicht der Lebermatrix sank in allen Versuchsgruppen verglichen mit der in nativen Leber, obwohl Unterschiede waren statistisch signifikant nur in den Gruppen unter oszillierenden Druckbedingungen (PV + P; A + P) perfundiert. Die geringste Menge an DNA pro Trockengewicht wurde in der Leber über die Leberarterie unter oszillierenden Druckbedingungen durchströmt gefunden.

    Figur 7

    Abbildung 7: DNA-Gehalt pro Trockengewicht der Leber Matrix (von Struecker et al 14 modifiziert.). Livers über die Leberarterie Show dezellularisiert weniger verbleibende DNA als jene perfused über die Pfortader zu tun. Livers unter oszillierenden Druckbedingungen durchbluteten weniger anzeigen restlichen DNA als dezellularisiert ohne diesen Bedingungen zu tun. So, Leber über die Leberarterie unter oszillierenden Druckbedingungen durchbluteten zeigen die mindestens verbleibende DNA-Gehalt.

    Korrosions Casting

    Korrosions Gießen dezellularisierte Leber Matrizen bestätigt, dass die Mikroanatomie der Leber (einschließlich des Proteins Rahmen der Pfortader-System, das Arteriensystem und Gallensystems) während Dezellularisierung konserviert.

    8
    Abbildung 8: Fotographie eines Korrosions Casting eines Dezellularisierte Rattenleber Matrix (von Struecker et al 14 modifiziert.). Trotz Entfernung aller Zellen, die Mikroanatomie des Organs, einschließlich der Pfortader (blau) und arterielle (rot) Systemen werden konserviert. REMAining Hauptzweige des Gallensystems sind gelb gegossen.

    Tabelle 1
    Tabelle 1: Versuchsgruppen zur Bewertung der Auswirkungen von oszillierenden Druckbedingungen und die Perfusion Strecke auf Rattenleber Dezellularisierung.

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    Discussion

    Obwohl die hier beschriebene Methode zur Rattenleber Ernte und Dezellularisierung wird leicht reproduzierbar, gibt es bestimmte kritische Schritte zu berücksichtigen:

    Während der Herstellung von Leber Ernte, ist es wichtig, zu schweren Blutungen zu vermeiden, da es die Blutgerinnung aktiviert und kann zu der Bildung von Blutgerinnseln in der Leber führen. Unserer Meinung nach ist es vorteilhaft, um die Bauchaorta direkt einzuschneiden vor Kanülierung der Pfortader, um den Blutzufluss über die Leberarterie während der Perfusion über die Pfortader zu vermeiden. Sobald die Leber einer Kanüle versehen und klar durchströmt, ist die Bildung von Blutgerinnseln kein Thema mehr.

    Nach einer Leber Ernte und Transport zum Perfusionsvorrichtung ist die Verbindung von Lebern zur Perfusionsvorrichtung ein besonders kritischer Schritt, da der Eintrag von Gasblasen in das Perfusionssystem Kreis muß vermieden werden, um Gasembolie zu verhindern. Es ist sinnvoll, um das Dreiwegeventil prefill, die ichs in die Leber Kanüle verbunden ist, mit PBS unter Verwendung einer Spritze und eine dünne Kanüle direkt vor dem Anschluss des Ventils an das Perfusionssystem.

    Nach Durchblutung festgestellt, ob alle Schlauchverbinder, Drei-Wege-Ventile und Rohre sind perfekt verbunden sollte neu überprüft werden. Wenn Lebern sind für längere Laufzeiten durchbluteten (z. B. O / N), auch ein kleiner Fehler in Verbindung, um Luft in den Siphon-Perfusion Systems führen, was zu tödlichen Perfusion Ergebnissen führen.

    Die vorgelegten Daten sind durch die Tatsache, dass der optimale Druck und die Frequenz des oszillierenden Druckänderungen für die besten Ergebnisse Dezellularisierung unklar beschränkt. Ferner kann druckgesteuert Perfusion bessere und stabilere Ergebnissen führen als stromgeregelte Perfusion tut. Druckgesteuerten Perfusion ermöglicht die Anwendung einer Perfusion Protokoll zu Lebern von unterschiedlicher Größe und Gewicht, mit dem gleichen Ergebnis, da die Strömung automatisch be angepasst.

    Die Leberarterie und Pfortader sind in Bezug auf Größe und physiologischen Flussraten signifikant unterschiedlich. Somit wird eine konstante Perfusionsgeschwindigkeit (5 ml / min) mit Sicherheit in verschiedenen Perfusionsdrücken innerhalb der beiden vaskulären Systemen führen. Ebenso wird ein konstanter Perfusionsdruck in verschiedenen Perfusionsraten führen. Eine Methode, um die Wirksamkeit Dezellularisierung über die beiden Durchblutung Routen vergleichen wäre, um die Perfusion bei physiologischem Perfusionsdrücke oder Perfusionsraten über beide Strecken durchzuführen. Allerdings sind die Ergebnisse vergleichbar in der aktuellen Studie zu machen, haben wir uns für eine konstante Perfusionsrate für beide Routen. Leider mit unserem Gerät waren wir nicht in der Lage, den Perfusionsdruck in perfundierten Leber zu messen.

    Perfusionsmodell Vorrichtungen der nächsten Generation wird kleiner, um die Menge an Perfusionsmedium notwendig minimieren. Darüber hinaus werden Pumpvorrichtungen ermöglichen druckgesteuerten Perfusion.

    The vorgestellte Technik wird sehr nützlich für die reproduzierbare, homogene Rattenleber Dezellularisierung. Ob die vorgestellte Technik für Rezellularisierung und Organreifung in vitro geeignet ist muss weiter behandelt werden. Ob oszillierenden Druckbedingungen einen Einfluss auf die Zellen neu besiedelt werden Gegenstand weiterer Experimente sein.

    Die vorgestellte Technik ist anspruchsvoller als andere Ratten Leberperfusion Geräten und zeigt mehrere entscheidende Vorteile: 1) Die homogene Dezellularisierung reproduzierbar ist, mit guten Ergebnissen bei oszillierenden Druckbedingungen angewendet werden. 2) Die Perfusion Gerät ist versiegelt und können sterile Dezellularisierung, die eine Voraussetzung für die Matrixwiederbevölkerung und langfristigen Durchblutung ist. 3) Das vorgestellte Protokoll ist kürzer als andere veröffentlichten Protokollen ist aber immer noch sehr effektiv. 4) Selektive Durchblutung der Pfortader und der Leberarterie macht selektiven Zellwiederbevölkerung über verschiedene Systeme möglich,was kann ein wichtiges Instrument sein.

    Die Perfusion Gerät wird in weiteren Dezellularisierung Experimente angewendet werden, um zu verfeinern und zu optimieren Rattenleber Dezellularisierung. Die Wirkung der druckgesteuerten Perfusion wird experimentell ermittelt und im Vergleich mit strömungsgesteuerten Perfusion werden. Der Zusatz von weiteren Elementen (z. B. ein "Dialyseeinheit", einem Wärmetauscher, ein Oxygenator) erscheint für Bestandsaufstockung, Kultur und Reifung Experimente möglich und zumutbar wäre, die vorgestellt Gerät weiter zu entwickeln.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Self built arterial cannula
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0.28 mm ID 0.61 mm OD
     Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
    portal vein cannula
    Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
    Three-way stopcock smiths medical 888-101RE
    surgery
    Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
    Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
    Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
     Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000 ml
    10 ml Syringe Braun 4606108V 10 ml/ Luer Solo
    5 ml Syringe Braun 4606061V 5 ml /Luer Solo
    Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
    medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
    surgical instruments
    needle holder Geuder 17570
    micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
    micro-scissors Martin 11-740-11
    micro-forceps S&T  112314
    Clamp Aesculap BH111R
    scissors F S T  14501-14
    surgical forceps Aesculap BD 557
    Decellularisation
    Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
    Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
    peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
    heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
    MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
    bubble trap  custome-made item
    Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
    Detergents
    SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2.5 kg
    Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10 L
    PBS  Gibco 14190-094 DPBS
    staining
    Eosin 1% Morphisto 10177
    Mayer hematoxylin AppliChem A4840
    gomori staining Morphisto 11104
    AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
    Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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