간단한 장치는 빠르게 마우스 소장의 전체 마운트를 준비하는 방법

Medicine

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Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).

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Abstract

이후 분석 또는 정량 마우스 소장과 대장의 전체 마운트를 준비하는 것은 시간이 많이 걸리고 어려울 수 있습니다. 우리는 신속하게 손에 의해 달성 될 수있는 그에게 우수하고 균일 한 품질의 전체 마운트 준비를 준비하는 절단 할 수있는 간단한 장치의 사용과 '롤'마우스의 장에 대해 설명합니다. 장치는 4 스테인리스 봉 및 절단 가이드 역할 가기를 보유 염기를 포함한다. 로드는 소장 [분으로 분할] 및 결장의 루멘에 삽입된다. 로드 및 샘플을 다음의 장치를베이스에 유지 슬롯 여과지 또는 카드의 부분 위에 배치된다. 소자의 상단은 위치 및 절단 가이드로서 기능한다. 상부 부분의 중앙에 두 개의 각진 부분이 칼이나 외과 용 메스를 안내하는데 사용 봉의 상부에 종 방향으로 장을 절단한다. 장내 부분이 절단 된 후에, 상부는 제거되고, 카드, 담배 마는UE와로드 부드럽게 장치에서 제거하고 벤치에 배치합니다. 로드는 부드럽게 평평 및 필터 종이 또는 카드의 기본 조각에 장 세그먼트를 막대기 옆으로 롤백됩니다. 최종 제제는 조사 또는 고정하고 나중에 분석을 위해 저장 될 수있다. 준비는 정상 또는 유전자 변형 마우스 모델에서 장 변화의 연구를위한 귀중한 있습니다. 준비는 염증 (대장염), 손상, 전암 병변의 효과에 대한 연구 및 정량화를 위해 사용되어왔다 (비정상적인 토굴 초점 (하는 ACF)과 초점 (MDF에서) 고갈 점액) 및 용종 또는 종양.

Introduction

마우스와 유전자 변형 마우스 1-3 다양한 병리 특히 암과 위장관의 염증과의 관계 연구를위한 귀중한 모델입니다. 이것은 종종 소장 및 / 또는 대장의 전체 마운트의 준비가 필요합니다.

전체 마운트의 제조는 오프셋 위 정밀 쌍으로 수행 될 수 있지만, 마우스를 4 내지 약 20 분 걸릴 수있다. 이 마우스의 상당한 양을 필요로 비교 연구, 매우 실용적되지 않습니다 (통계 분석에 그룹 주제 당 10 말). 또한, 촬영 시간의 길이는 조직의 열화의 위험을 증가시킨다. 이 문제를 완화하려는 시도는 다양한 절단 준비 에이즈의 재판을했다. 첫째는 절단 로브와, 금속판의 시리즈에 기초하지만, 판 조직을 가려 및 절단을 제어하는​​ 것이 곤란 하였다.

통상도우리는 다음 반 연필 모양 메스 (그림 1)에 대한 좋은 가이드를 만들 것입니다 방법을 볼 수 있기 때문에 L 여섯 양면 연필 마지막으로, 절단 장치에 대한 영감을 제공했다. 이 4 개의 절단 가이드 5 프레임의 설계 결과. 도 4의 제제는 가위 제조 및 제조 장치의 차이점을 설명으로이 장치의 효과는 극적이었다.

원래 장치의 상단 금속의 여러 조각, 나중에 사람들로 구성되었으며, 현재의 모델은 두랄루민의 단단한 조각에서 가공했다. 염기는 고품질 고밀도 수지에서 가공 하였다.

장치는 크게 속도 및 넓은 범위의 애플리케이션들을 갖는다는 제제의 품질 및 일관성을 향상으로 마우스의 소장 전체 마운트의 제조에 아주 유용하게 사용될 입증되었다.

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Protocol

다양한 실험 절차 및 인도적인 안락사는 호스트 기관 윤리위원회의 적절한 규제 기관에 의해 승인됩니다. 안락사는 일반적으로 자궁 경부 전위 다음 이산화탄소 질식을 사용하여 달성된다.

1. 장치

  1. 머신이 논문에 기재된 바와 같이 고밀도 아세틸 수지의 고체 블록의 밖으로부터의베이스 장치의 주요부. 양쪽 끝 부분에있는 봉을하려면 다음 2.5 mm의 숲에서 3mm 높은 상승 스트립, 부품 기계를 만드는 (그림 2와 그림 3 참조).
  2. 반올림 끝 2.4 mm 직경의 스테인레스 스틸 봉을 확인합니다.
    참고 : 뚜껑의 주요 프레임은 두랄루민 플레이트에서 가공했다. 마무리 장치의 제한된 수의 박사 Goodlad에서 사용할 수 있습니다.

장치의 2.

  1. 가위를 사용하여 복강에서 소장과 대장을 해부하다그리고 장갑을 낀 손가락. 소장에서 당기고 부드럽게 곡선 집게로 잡고하여 장간막을 제거합니다.
  2. 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4)가 10 또는 20 ml의 루어 피팅 플라스틱 주사기에 맞게 할 수 있도록 자사의 넓은 끝에서 삭감했다 길슨 형 피펫 팁을 사용하여와 창자를 씻어.
  3. 종이 타월의 시트에 소장 (SB)를 배치 및 길이 (근위부, 중간 및 원위부 - SB1, SB2 및 SB3)에서 세 개의 동일한 부분으로 나누어 가위를 사용하여. 맹장을 제거하고 대장을 배치.
  4. 가위로 장 세그먼트로 몇 가지 아주 작은 상처는 유체 탈출과 내장을 통해 종이 타월 한 장을 놓고 부드럽게 유체를 짜내하여 건조시킨다하기 위해 준비를 통해 손가락을 실행할 수 있도록합니다.
  5. 섹션을 들어 올려 이전에 인산염 완충 생리 식염수의 비커에 담가 적신 된 스테인레스 스틸 봉을 삽입합니다.
    주 : 대장이 될 수 있습니다원하는 경우 전향 된 (뒤집어).
  6. 장치의 기준에 맞게 크기로 카드 또는 필터 종이 잘라 조각을 레이블. 그것은 거의 모든 솔루션에 의해 영향을받지 같이 연필, 최고입니다. 부검 날짜 코드 및 실험 동물 식별 번호가 제안된다.
  7. 장치의 기지로 카드 나 종이 필터를 놓습니다. 장치의 자료에있는 슬롯에 막대와 창자를 삽입합니다. 세그먼트의 기단부는 표준화 된 방식으로 배치되어 있는지 확인합니다. 기단부는 카드 라벨 ​​가까이 있어야한다.
  8. 베이스를 통해 장치의 상단 부분을 놓습니다. 길이 방향 부분을 잘라 메스 블레이드를 안내하는 각도 막대를 사용합니다.
    참고 : 조직을 부드럽게하고 신중하게 칼을 움직이지 않도록 손가락으로 유지되는 경우가 있습니다.
  9. 장치의 상단 부분을 제거합니다. 조심스럽게 (자신의 막대에 계속) 필터 종이와 조직을 제거합니다.
    참고 : FIL 아래에 배치 뻣뻣한 카드의 조각터 용지 리프팅에 도움이됩니다.
  10. 세그먼트 (PBS에 담근 장갑 낀 손가락으로) 약간 젖은. 로드 롤, 사이드 장을 열고 평면을 확산 좌우합니다. 조직은 여과지에 부착한다.
  11. 시각적으로 어떤 심한 병변에 대한 준비를 검사합니다.
  12. 얕은 욕조 (또는 샌드 박스)를 함유하는 정착액을 여과지에 부착 된 조직을 옮긴다.
    주 : 조직은 여과지에 부착 또는 카드에 단단히 부착 후에 남아. 고정 제의 다양한 제제를 보존하는 데 사용될 수있다. 그것은 Carnoy의 유체가 최고의 세포 증식에 이상적인 방법이다 장내 정착 세포 증식 (6)의 연구에 사용되는 것을 권장; 그러나 포르말린 또는 다른 엔드 포인트가 필요한 경우 다른 많은 고정 제를 사용할 수도있다.
  13. 고정 (보통 3 시간) 한 후, 70 % 에탄올로 준비를 전송합니다. 요구 될 때까지 샘플을 그 다음에 저장 될 수있다. 준비의 C얼굴 연구 도중 및 / 또는 H & E 염색법 또는 다른 조직 학적 기법, 면역 조직 화학 및 / 또는 계내 혼성화에 대한 조직 학적 샘플의 제조에 사용되는.
    주 : 장기간 고정은 면역 반응 및 / 또는 현장 혼성화 반응에를 줄일 수 있습니다. 폴리 프로필렌 샌드위치 박스 제제의 다수의 저장에 적합하다.
  14. 여러 장 세그먼트에서 고정 조직을 요구하는 경우 '스위스 롤'로 만들어 상술 비롯한 조직 학적 방법 (6)의 전체 범위로 염색 할 수있다. '스위스 롤'을 만들기 위해 장 세그먼트는 곤충학 핀 고정 및 왁스 (6)를 포함에 대해 처리 칵테일 스틱이나 이쑤시개 주위 압연 여과지,에서 제거됩니다.
  15. 필요한 경우, 비정상적인 토굴의 초점 7을 시각화 메틸렌 블루와 대량 조직을 얼룩.
  16. 에 고정 준비 점수레저.

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Representative Results

폴립 (그림 4) 조직을 조명 옆으로 차가운 광원과 실체 현미경 하에서 쉽게 식별 할 수 있습니다. 그것은 용종이 득점 나중에 논의 될 수 있으며, 다른 사업자들이 합의에 도달 할 수 있도록 관찰 할 때 연필 표시가있는 카드를 표시하는 데 도움이됩니다. 조직은 [메틸렌 블루로] 확인하는 염색 대량 될 수 비정상적인 토굴의 초점 8 이상 또는 트랜스 조명에 의해에서 조명에 의해 고갈 초점 (MDF에서) 9 점액 (그림 5).

병변의 위치는 위치 기준으로 8 득점 할 수 있습니다. 이것을 먼저 공지 된 각종 크기로 여러 격자 늘려서 아세테이트 시트에 인쇄 한 다음, 컴퓨터 드로잉 패키지 10 정사각형의 그리드를 준비이 여러 번 복사해야 할 그라비아가 유용하다 [(도 6 참조) 및 이] 수행하기위한 비교적 간단한 프로그램입니다. 하나는 L에 맞는 그리드를 찾을 수 있습니다 섹션의 ength과 관심의 이벤트 점수를 사용합니다.

일단, 득점 일부 또는 조직의 모든 추가 분석을 위해 제거 할 수 있습니다 또는 전체 섹션은 조직 학적 절편을위한 '스위스 롤'로 롤업 할 수 있습니다. 이 과정은 기술적으로 어려운 10로서 설명 하였지만 제제에도 평평한 Nature이 과정이 훨씬 더 간단하게. 매크로 준비는 '매크로 폴립'과 '마이크로 폴립'(11, 12) (그림 7) 점수를 사용하는 스위스 ​​롤을 득점하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1
장치의 영감 연필 온 방법도 1. 절단 가이드 역할을 절반 연필 형상을 사용하는 아이디어에 생물학적 서비스 부 리드 토론.53042 / 53042fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 원래 장치 2. 사진. 원래 장치 손으로 제조 된 금속의 여러 조각으로부터 제조 하였다. (A) 장치를 조립. (B) 장치의 위쪽. 위치에서로드를 보여주는 제거 된 주세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
재 설계된 장치의도 3 사진. (A)의 뚜껑 본체 프레임은 두랄루민 플레이트로부터 기계 가공된다. (B) (흑색으로 보이는)베이스채널 4에 앉아 이동식 봉을 갖는 고밀도 아세틸 수지의 고체 블록으로 이루어진다. . 뚜껑 (A) 분지 (B)의 상단에 배치되어베이스 (블랙)의 상단에 배치 여과지 (화이트) (C) 디바이스의 최종 뷰가 도시되어있다. 센티미터 크기가 표시됩니다. 로드는 반올림 끝 직경 2.4 mm이다. 자세한 내용은 참조 5를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
만든도 4 거트 준비 시저 및 장치를 이용하여 오프셋. (A) 창자 오프셋 가위를 사용하여 준비 하였다. (B) 직감 커터 소화관 전역에도 폭을 도시하고 준비 창자 계산을 만드는 조직의 더 나은 프리젠 테이션, 그리고 더 쉽게 폴립의 관찰. 세포 증식 6 그림 3에서 수정. 유닛과 스케일 바는 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 비정상적인 토굴의 초점은 메틸렌 블루로 염색 대장의 전체 산에서 본입니다. 전체 대장이 대량 화살표로 표시, 비정상적인 토굴의 초점을 식별하기 위해 메틸렌 블루로 염색했다 탑재합니다. 유닛과 스케일 바는 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6. 위치 득점에 대한 아세테이트 시트 템플릿. 10 사각형의 격자의 다양한 크기 아세테이트 시트에 인쇄되어 있습니다. 컷 소장이 섹션의 길이에 맞는 그리드에 배치하고, 관심있는 이벤트가 각 광장에서 병변의 카운트 수와 같은 득점한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 H & E 염색 마우스 소장 7. 스위스 롤. 같이 소장 스위스 롤 잘 장내 종양 기원의 생체 내 모델에있어서, APC (최소 / +) 마우스에서입니다. 화살표 대표 선종을 나타냅니다. 유닛과 스케일 바는 표시됩니다.42 / 53042fig7large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

두 사업자가 완전히 6 분내 마우스를 해부 할 수 있도록 장치는 크게 프로세스 속도. 이것은 분명 심한 병변과 무게와 주요 장기를 고정하기위한 육안 검사가 포함됩니다. 또한 운영자, 린스 오점과 위, 맹장, 소장 및 대장의 무게를 전체 마운트를 준비 할 수 있습니다. 평평 조직은 매우 빠르게 고정 따라서 저하 아티팩트를 방지 할 수 있습니다.

(분리 속도에서) 장치의 주요 이점 중 하나는 디바이스가 후속 분석 및 정량화를 훨씬 용이하게 훨씬 더 나은 품질의 제제의 제조를 생성 할 수 있다는 것이다. 얼굴 득점하기 Ko (예 : 용종 번호, 직경 부담 볼륨 등) 거시적 발암 및 사전 발암 성 병변을 정량화하기에 이상적입니다. 준비도 자연 나중에 '스위스 롤'로 압연 등 '마이크로 P의 조직 학적 분석을 절편에 이상적olyp '번호도 정량화 할 수있다. 비정상적인 토굴 초점과 다른 생물 전 병변은 전체 마운트를 이용하여 가시화 될 수있다.

다양한 대장염 모델에서 염증은 또한 전체 마운트를 사용하여 관찰 될 수있다.

또한 장내의 상이한 영역에서 이러한 이벤트의 양적 및 공간적 위치가 결정될 수있다. 기술의 제한은 상기 장치의 사용이 특히 메스 조직 왔고, 일부 손재주를 필요로한다는 것이다. 대부분의 운영자는 몇 분 연습 후 단시간에 기술을 습득 할 수있다. 제제는 몇 분 밖에 걸리지 만 인스턴트 보존이 필요한 경우, 작은 샘플은 고정 또는 냉동과 같이 제조를위한 통상적 인 조직의 나머지 부분을 취할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delrin Ryan Plastics, Earls Barton, UK High-density acetal resin similar material would suffice
Duralumin plate Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available 
Finished device(s) ready for use Contact Dr Goodlad  r.goodlad@imperial.ac.uk Contact  r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details

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References

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  2. Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
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