一个简单的设备,迅速准备小鼠肠的全坐骑

Medicine

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Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).

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Abstract

制备小鼠小肠和结肠用于随后的分析或定量的全样载可能是耗时和困难的。我们描述了使用简单的设备的切割和“辊”鼠标肠迅速制备的优良和均匀的质量整装制剂到可以用手来实现。该设备包括一个基座,保存4不锈钢棒和顶部,其作用一切割导向。杆分别插入到小肠[分成三分]和结肠的腔。杆和样品然后放置在一片滤纸或卡到保持狭槽在该装置的底部。该设备的顶部接着被定位并用作切割引导。在顶片的中心的两个成角度的部分被用于引导刀或手术刀切肠子纵向上的杆的顶部。一旦肠部分被切断,顶端被移除,卡,TISSUE和棒从设备上轻轻地取出并放在了替补席上。杆分别然后轻轻压延侧身变平,并坚持的肠段到下伏一片滤纸或卡。最终制剂随后可以检查或固定和存储用于以后的分析。该制剂是无价的正常或转基因小鼠模型肠变化的研究。这些制剂已经用于炎症(结肠炎),损伤,癌前期病变的效应的研究和定量(隐窝病灶(ACF)与粘蛋白和贫化灶(的MDF))和息肉或肿瘤。

Introduction

鼠标和转基因小鼠1-3是对各种病症尤其是癌症和其对炎症在胃肠道的关系的研究中的宝贵的模型。这通常需要小肠和/或结肠的整个支架的制备方法。

整个支架的制备可以用精密对偏移剪刀的进行,但它可以采取每小鼠 4约20分钟。这不是很实用的比较研究,这需要一个显著量的小鼠(例如10每组受统计分析)。此外,时间的长短取增加组织降解的风险。缓解这一问题的尝试导致了各种切削制剂助剂的审判。第一是基于一系列金属板,带切割园,但在板遮蔽组织和切割因此,难以控制。

一个传统领升六面铅笔终于提供了灵感的切割装置,因为我们可以再看到一半的铅笔形状将如何使一个手术刀( 图1)具有很好的指导。这就产生了一个设计为具有四个切削导轨 5的帧。这个装置的有效性是戏剧性在图4中的制剂表现出的剪刀制备和设备制备之间的差异。

原始设备的顶部被从几片金属的,但后来的构造,和当前的模型被加工出来一块实心硬铝组成。该基地加工出最高质量的高密度树脂。

该装置已被证明是对小鼠肠的全样载的制备大量使用,因为它大大加快和提高了制剂,其中有一个广泛的应用的质量和一致性。

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Protocol

在各种实验程序和人性化的安乐死是由主办机构伦理委员会,并通过适当的监管机构的批准。安乐死通过CO 2窒息颈椎脱位正常实现。

1.设备

  1. 机的装置的基座,从出高密度乙酰树脂的固体块,如本手稿描述的主要部分。在每个端部创建3毫米高升高条带,且部分机器这些2.5毫米园采取杆参见图2和图3)。
  2. 建立从2.4毫米直径的不锈钢棒用四舍五入的目的。
    注:盖子的主框架被加工出来杜拉铝板。可从古德莱德博士完成了设备的数量有限。

2.使用设备的

  1. 解剖出小肠和结肠使用剪刀腹腔和戴手套的手指。用弯钳抱着它,轻轻地从肠道向外拉,取出肠系膜。
  2. 冲洗用冷的磷酸盐缓冲盐水使用Gilson型枪头,它被砍倒在其宽端,以便它可以装配到一个10或20 ml的Luer配件塑料注射器(PBS,pH7.4)中的肠。
  3. 铺陈小肠(SB)上,以纸巾的片材,分成三个相等的部分的长度(近端,中间,和远端 - SB1,SB2和SB3)用剪刀。取出盲肠和铺陈结肠。
  4. 做了几个非常小的切入肠段用剪刀,使流体中逸出,并把纸巾的片材在肠子,轻轻地运行一个手指在准备挤出液体并抹干。
  5. 抬起部分,并插入了以前通过浸泡在磷酸盐缓冲盐水的烧杯中湿润的不锈钢棒。
    注:肠道可以在verted如果需要的话(内外翻转)。
  6. 标签一块卡或滤纸切割成尺寸以装配到装置的基座。铅笔是最好的,因为它不会受到几乎所有的解决方案。尸检日期,实验代码和动物识别号建议。
  7. 放置卡或滤纸进入装置的基座。插入杆和肠成在设备的基座上的插槽。确保段的近端位于以标准化的方式。近端应靠近卡的标签。
  8. 放置顶部件的设备在碱。使用成角度的杆引导手术刀刀片纵向切割的部分。
    注意:它帮助,如果组织是轻轻并小心地用手指保持,以确保它不与刀移动。
  9. 卸下顶件设备。小心地取出滤纸和组织(仍然在他们的棒)。
    注:一块硬卡放置在FIL下方之三纸将有助于提升。
  10. 微湿(用戴着手套的指尖蘸PBS)段。滚动杆,一边到另一边去开拓肠道和传播它持平。然后使组织将坚持滤纸。
  11. 目视检查的准备工作任何肉眼病变。
  12. 转移附着在滤纸上的浅槽(或夹心盒)含有固定剂的组织。
    注:在组织附着在滤纸或卡它将保持牢固。种类繁多的固定剂的,可以用来保存的制备。建议在卡诺流体应该用于该研究肠细胞增殖6,这是理想的固定的最佳的细胞增殖的方法;然而福尔马林或许多其它固定剂也可使用,如果其他端点是必需的。
  13. 固定(一般为3小时)后,转移到准备70%的乙醇。样品然后可被储存,直到需要。在制备C一个被研究的连接面和/或用于组织学样品,H&E或其它组织染色技术,免疫组织化学和/ 原位杂交的制备。
    注:长时间固定可以降低免疫反应性和/ 原位杂交反应性。聚丙烯三明治盒子,非常适合存储大量的准备工作。
  14. 如果从各肠段所需的固定组织可制成“瑞士卷”,并用组织学方法6包括那些上述的整个范围。为了使一个“瑞士卷'的肠段从滤纸,围绕鸡尾酒棒或牙签卷起,紧固带昆虫学销和处理用于石蜡包埋6除去。
  15. 如果需要的话,染色大块组织美兰形象化隐窝病灶7。
  16. 分数固定的筹备工作休闲。

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Representative Results

息肉是容易下,用冷光源立体显微镜,以确定到另一边照射所述组织图4)。它是有用的,当一个息肉,以便得分可以再商量,不同运营商就可以达成一致,观察到标记卡的铅笔痕迹。组织还可以批量染色[用亚甲蓝]识别隐窝病灶8或粘蛋白贫化灶(的MDF)9照明从上方或通过反式照明图5)。

病变的位置也可以计分的位置的基础8。要做到这一点首先需要准备10万的网格,计算机绘图包,复制这几次,然后伸几个网格已知的各种大小和打印到醋酸酯片( 见图6)凹版印刷是一种有用的,比较简单的程序这样做。那么我们可以找到适合的升网格节的ength并用它来得分感兴趣的事件。

一旦刻划,部分或全部的组织可以进行进一步的分析被移除或整个部分可以卷成“瑞士卷”用于组织学切片。虽然此步骤已经被描述为技术上具有挑战性10制剂的平坦和均匀性使得该过程更加简单。宏制剂可用于人评分'宏息肉'和用于分数“微息肉”11,12(图7)的瑞士卷。

图1
图1.该装置的灵感来自一支铅笔。讨论在生物服务单位导致使用半铅笔形状充当切割导向的想法。53042 / 53042fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.照片原器件,原始设备是从几片金属的,手工制备构成。(A)中所述的装置装配的。(B)的装置的顶部已被去除,以显示在位置的杆。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.照片重新设计设备的。(A)的盖子的主框架被加工出来杜拉铝板。(B)中的碱(见于黑色)是由高密度的乙酰树脂的固体块,具有4可拆卸杆坐在一个信道。示出的是一个过滤器纸(白色)放置在基座(黑)的顶部(C)的装置的最终视图:盖(A)中被放置在盆(B)的顶部。尺寸在厘米显示。杆分别为2.4毫米,直径与四舍五入端。见参考文献5的更多细节。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.肠道制剂进行偏置剪刀和使用该设备。(一)肠道使用偏移剪刀准备。(B)编写的肠绞显示宽度均匀整个肠道,肠道越好介绍组织,这使得计数,和观察息肉容易得多。 图3中的细胞增殖6修改。与单位比例尺表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.隐窝病灶可见于结肠美蓝染色的整装,整个安装结肠散装美蓝染色,以确定隐窝病灶,如箭头所示。与单位比例尺表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

文件/ ftp_upload / 53042 / 53042fig6.jpg“/>
图6.模板酯片的位置得分。各种尺寸的10平方格打印出来乙张。切割肠道被放置在适合部分的长度网格,感兴趣的事件进行评分,如病变在每平方米的计数值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
图中的H&E染色小鼠小肠7.瑞士卷,显示的小肠瑞士卷是从装甲运兵车(最小/ +)鼠标,以及特征在于,肠道肿瘤发生的体内模型 。箭头指示代表腺瘤。显示与单位比例尺。42 / 53042fig7large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

该器件极大地加快了进程,使两家运营商可以充分尸检鼠标内6分钟。这将包括目视检查是否有明显肉眼病变,体重和固定的主要器官。它还将允许运营商冲洗,吸干,称重胃,盲肠,小肠和结肠,并准备在整个坐骑。该组织扁平化,可以非常迅速修复,从而避免降级的文物。

一的装置(除了速度)的主要优点是,该装置可产生生产远质量更好的准备,然后使随后的分析和定量容易得多。恩面对得分是理​​想的量化宏观致癌和预致癌病变(如息肉数目,直径和负担体积)。该制剂的性质,甚至使它们非常适用于后轧成“瑞士卷”和切片,以便“微磷的组织学分析olyp'号也可以定量。隐窝病灶和其他肿瘤前病变,也可以使用全样载可视化。

在各种结肠炎模型炎症变化也可以使用全样载观察。

此外,在肠道的不同区域,这些事件的数量和空间位置可以被确定。该技术的限制是,使用该设备的需要一些灵巧,尤其是在用手术刀的组织的得分。几分钟后,实际上大多数运营商可以掌握在短时间内的技术。该制剂只需要几分钟的时间,但如果需要即时保存少量样品可采取固定或冷冻,然后准备像往常一样组织的其余部分。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delrin Ryan Plastics, Earls Barton, UK High-density acetal resin similar material would suffice
Duralumin plate Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available 
Finished device(s) ready for use Contact Dr Goodlad  r.goodlad@imperial.ac.uk Contact  r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
  2. Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
  3. Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
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