急速にマウス腸のホールマウントを準備するための簡単​​な装置

Medicine

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Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).

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Abstract

その後の分析や定量化のためのマウス小腸および結腸の全体のマウントの準備には時間がかかり、困難な場合があります。我々は、切断し、「ロール」のマウスの腸は、急速に手で達成できるものよりも優れ、均一な品質の全載標本を調製するために簡単な装置の使用を記載しています。装置4は、ステンレス鋼ロッド、切断ガイドとして作用するトップを保持するベースを備えます。ロッドは、小腸[三分のに分割]および結腸の内腔に挿入されます。ロッド、サンプルは、デバイスのベースに保持スロットにろ紙またはカードの一枚の上に配置されています。装置の上面は、その後に配置され、切断ガイドとして機能します。トップピースの中央に2つの傾斜部分は、ナイフまたはメスを導くために使用され、ロッドの上に縦方向に腸を切断します。腸の切片を切断した後、上部が除去され、カード、TISSUEとロッドを穏やか装置から取り出し、ベンチ上に置きました。ロッドはそっとろ紙またはカードの基礎となる作品に腸部分を平らにし、固執する横ロールバックされます。最終調製物は、次いで、調べまたは固定し、後の分析のために保存することができます。製剤は、正常または遺伝的に改変されたマウスモデルにおける腸の変化の研究のための貴重です。製剤は、損傷、前癌病変は(異常クリプト巣(ACFを)と枯渇病巣(のMDFを)ムチン)、炎症の影響(炎)の研究と定量化のために使用されており、ポリープまたは腫瘍。

Introduction

マウスおよび遺伝子改変マウス1-3は、様々な病理特に癌および胃腸管の炎症との関係の研究のための貴重なモデルです。これは多くの場合、小腸および/または結腸のホールマウントの準備が必要です。

ホールマウントの準備はオフセットはさみの精密ペアで行うことができますが、それはマウス 4当たり約20分を取ることができます。これは、マウスのかなりの量を必要とする比較研究のための非常に実用的ではありません(統計分析にグループ対象ごとに10を言います)。また、撮影した時間の長さは、組織の劣化の危険性を増大させます。この問題を軽減しようとすると、さまざまな切削製剤助剤の試験につながりました。最初は、切削溝と、金属プレートのシリーズに基づいているが、プレートは、組織を不明瞭にし、切断を制御することが困難でした。

conventiona私たちはその後、半分鉛筆の形状はメスのための良いガイド( 図1)を作成する方法を見ることができるようリットル六面鉛筆は、最終的に、切断装置のためのインスピレーションを提供しました。これは、4切断ガイド5とフレームのデザインになりました。 図4の準備がはさみ準備とデバイスの準備の間の差を実証するように、このデバイスの有効性は劇的でした。

元のデバイスの頂部は、金属のいくつかの部分が、後のものから構成され、現在のモデルは、ジュラルミンの固体片から機械加工されました。ベースは、最高品質の高密度樹脂から機械加工しました。

デバイスは、それが大幅に高速化し、広範囲の用途を持つ製剤の品質と一貫性を向上させるように、マウス腸のホールマウントを調製するための非常に有用であることが証明されています。

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Protocol

様々な実験手順と人道的な安楽死は、ホスト機関の倫理委員会によって、適切な規制当局によって承認されています。安楽死は、通常、頸椎脱臼に続いてCO 2窒息を使用して達成されます。

1.デバイス

  1. この原稿に記載されているように、高密度アセチル樹脂の固体ブロックのうちから機械装置の基部の主要部分を、。各終わりに棒を取るために、これらの2.5ミリメートル畑のうち、3ミリメートル、高上昇ストリップ、及び一部のマシンを作成します (図2と3を参照)。
  2. 丸められた端部を備えた2.4ミリメートルの直径のステンレス鋼からの棒を作ります。
    注:蓋のメインフレームは、ジュラルミン板から機械加工されました。完成したデバイスの数は限られて博士グッドラードから入手可能です。

デバイスの2.

  1. はさみを使用して腹腔から小腸および結腸を解剖そして、手袋をはめた指。曲がったピンセットでそれを保持し、ゆっくりと腸から離れて引いて、腸間膜を削除します。
  2. それが10または20ミリリットルルアーフィッティングプラスチックシリンジに合うことができるように、その広い端で切られていたギルソンタイプのピペットチップを使用して、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)で腸を洗浄します。
  3. 紙タオルのシート上に小腸(SB)をレイアウトし、長さ(基端部、中間、および遠位 - SB1、SB2とSB3)に3等分に分割はさみを使用して。盲腸を削除し、コロンをレイアウト。
  4. ハサミで腸のセグメントにいくつかの非常に小さなカットは、流体が脱出し、腸の上に紙タオルのシートを置き、静かに液体を絞り出す、乾燥ブロットする準備の上で指を実行できるようにしてください。
  5. セクションを持ち上げて、以前にリン酸緩衝生理食塩水の入ったビーカーに浸漬して湿らせたステンレス製の棒を挿入します。
    注:腸ですることができます必要に応じて(裏返し)verted。
  6. デバイスのベースに適合するようにサイズにカットカードやフィルター紙のラベルを付けます。それは事実上すべてのソリューションの影響を受けないよう鉛筆は、最高です。剖検日付は、実験的なコードや動物識別番号が提案されています。
  7. 装置の基部にカードまたはろ紙を置きます。デバイスのベースのスロットにロッド、腸を挿入します。セグメントの近位端が標準化された方法で配置されていることを確認します。近位端は、カードのラベルの近くにある必要があります。
  8. ベースの上にデバイスのトップピースを置きます。縦方向のセクションをカットする手術用メスの刃を案内するための角度付きのバーを使用します。
    注:組織を穏やかにし、慎重にナイフで移動しないことを確実にするために指で開催されている場合に役立ちます。
  9. デバイスのトップ部分を削除します。慎重に(その棒の上にまだ)ろ紙と組織を除去します。
    注:FILの下に配置硬いカードの一枚ター紙がリフティングを支援します。
  10. セグメント(PBSに浸した手袋をはめた指先で)やや湿りました。腸を開き、平らそれを広めるために左右にロッド、サイドをロールバックします。組織はその後、ろ紙に付着します。
  11. 視覚的に任意の肉眼的病変の準備を調べます。
  12. 浅い浴(またはサンドイッチボックス)を含む固定液にろ紙に付着した組織を転送します。
    注:組織は、ろ紙に付着するか、カードにそれがしっかりと取り付けられたままになります後。固定剤の広範囲の製剤を保持するために使用することができます。これは、カルノア液が最良の細胞増殖法のための理想的な固定である腸細胞増殖で6、の研究のために使用することをお勧めします。他のエンドポイントが必要な場合は、ホルマリンまたはその他の多くの固定剤を使用することもできます。
  13. 固定(通常3時間)した後、70%エタノールに準備を移します。次いで、試料を、必要になるまで保存することができます。準備のC顔専用検討及び/又はH&Eまたは他の組織学的染色技術、免疫組織化学および/ ​​またはin situハイブリダイゼーションのための組織サンプルの調製のために使用されます。
    注:長期固定および/ ​​またはin situハイブリダイゼーション反応において免疫組織化学的反応性を減少させることができます。ポリプロピレンサンドイッチボックスは、製剤の多数を格納するための理想的です。
  14. 必要に応じて種々の腸セグメントからの固定組織は、「スイスロール」にされ、上述のものを含む組織学的方法6の全範囲を用いて染色することができます。 「スイスロール」を行うには、腸のセグメントは、昆虫学、ピンで固定し、ワックスが6を埋め込 ​​むために処理カクテルスティックや爪楊枝に巻き付けろ紙、から削除されます。
  15. 必要に応じて、異常な陰窩巣7を可視化するためにメチレンブルーとバルク組織を染色します。
  16. 固定された準備をスコアレジャー。

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Representative Results

ポリープは( 図4)は、組織を照らす左右に冷光源と実体顕微鏡下で識別しやすくなっています。これは、ポリープが得点については後述することができ、異なる事業者が合意に達することができるようにするために観察されたときに鉛筆マークのカードをマークすると便利です。組織はまた、上記またはトランス照明( 図5)によってからの照明により病巣(のMDF)9枯渇異常クリプト巣8またはムチンを識別するために[メチレンブルーと]染色バルクすることができます。

病変の位置も位置ベース8で採点することができます。 [( 図6参照)この1つは最初に、コンピュータの描画パッケージで10平方のグリッドを作成し、この数回コピーし、様々な既知のサイズにいくつかのグリッドを伸ばし、アセテートシート上に印刷する必要が行うには、凹版は有用であり、これを行うための比較的簡単なプログラム]。一つは、その後リットルに合うグリッドを見つけることができますセクションのengthとは、目的のイベントを獲得するためにそれを使用。

得点すると、一部または組織のすべてを、さらなる分析のために除去することができるか、または全体のセクションでは、組織切片のための「スイスロール」にロールアップすることができます。この手順は技術的に困難な10のように説明してきたが製剤のさえフラットと性質は、この手順は、はるかに簡単になります。マクロの準備は'マクロポリープ」と「マイクロポリープ」11,12( 図7)を獲得するために使用されるスイスロールを獲得するために使用することができます。

図1
デバイスのインスピレーションは鉛筆から来た方法図1。切断ガイドとして機能するように半分の鉛筆の形を使用するという考えに生物学的サービス単位リードでの議論。53042 / 53042fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図元のデバイスの2枚の写真が。元のデバイスを手で調製した金属のいくつかの部分から構成された。(A)の装置を組み立てる。(B)デバイスの上部位置でロッドを示すために削除されています。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
再設計されたデバイスの図3.写真。(A)蓋のメインフレームはジュラルミン板から機械加工されている。(B)(黒で見られる)ベースチャネルに座っ4取り外し可能なロッドを有する、高密度アセチル樹脂の固形ブロックで構成されています。 。蓋(A)流域(B)の上に配置される:ベース(黒)の上に配置された濾紙(白)、(C)デバイスの最終的な図が示されています。センチメートルで寸法が示されています。ロッドは、丸みを帯びたオフ端部を有する直径2.4ミリメートルでした。詳細については、参考文献5を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
はさみを相殺し、デバイスを使用して作られた図4腸の準備。(A)腸オフセットはさみを使用して作成した。(B)腸を用いて調製腸腸全体でも幅を示すカッターとカウントを行い、組織のより良いプレゼンテーションと、はるかに簡単にポリープの観察。細胞増殖6、図3から変更されました。単位とスケールバーが表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5.異常クリプト巣はメチレンブルーで染色したコロンのホールマウントで見られる。全体は、コロンはバルク矢印で示し、異常クリプト巣を識別するために、メチレンブルーで染色したマウント。単位とスケールバーが表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図6.位置スコアリングのためのアセテートシートのテンプレート。10の正方形の格子のさまざまなサイズは、アセテートシートに印刷されています。カット腸は、セクションの長さに合うグリッド上に敷設されており、興味のあるイベントは、各広場に病変の数をカウントとして記録する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
図7. H&E染色されたマウスの小腸のスイスロール。示す小腸スイスロールはよく腸の腫瘍起源の生体モデルを特徴は、APC(最小/ +)マウスからです。矢印は、代表的な腺腫を示しています。単位とスケールバーが表示されます。42 / 53042fig7large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

2つの演算子が完全に6分以内にマウスを剖検することができるようにデバイスを大幅にプロセスをスピードアップします。これは明らかな肉眼的病変と計量と主要な臓器を固定するための目視検査が含まれます。また、オペレータは、すすぎブロットと胃、盲腸、小腸および結腸の重さと全体のマウントを準備することができます。フラット化組織は非常に迅速に固定され、したがって、分解アーチファクトを回避することができます。

(離れて速度から)デバイスの主要な利点の一つは、デバイスが、その後の分析および定量化をはるかに容易になり、はるかに良い品質の製剤の製造を、生成することができることです。顔スコアリングEN(そのようなポリープ数、直径および負担ボリュームとして)巨視的な発癌性及び前発癌性病変を定量化するための理想的です。製剤の性質があっても、後に「スイスロール」に圧延し、マイクロP 'のように組織学的分析を区画するために理想的ですolyp「数も定量することができます。異常クリプト巣や他の前腫瘍性病変はまた、全体のマウントを使用して可視化することができます。

種々の大腸炎モデルにおける炎症性変化は、全体のマウントを使用して観察することができます。

さらに、腸管の異なる領域におけるこれらの事象の定量的および空間的な位置を決定することができます。技術の制限は、装置の使用は、特に外科用メスで組織の得点に、いくつかの器用さを必要とすることです。ほとんどの事業者は数分の練習後に短時間で技術を習得することができます。製剤は、わずか数分かかるが、インスタント保存が必要な場合は、少量のサンプルは、その後、固定または凍結してのためにいつものように調製した組織の残りの部分を撮影することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delrin Ryan Plastics, Earls Barton, UK High-density acetal resin similar material would suffice
Duralumin plate Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available 
Finished device(s) ready for use Contact Dr Goodlad  r.goodlad@imperial.ac.uk Contact  r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
  2. Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
  3. Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
  4. Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
  5. Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
  6. Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
  7. Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
  8. Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
  9. Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
  10. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
  11. Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
  12. Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).

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