Eine einfache Vorrichtung, um schnell vorbereiten Whole Mounts des Mausdarm

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Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).

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Abstract

Herstellung Gesamtpräparate der Maus-Dünndarm und Dickdarm zur nachfolgenden Analyse oder Quantifizierung kann zeitaufwendig und schwierig sein. Wir beschreiben die Verwendung einer einfachen Vorrichtung zu schneiden und zu 'roll' Maus Darm ganze Berg Zubereitungen von Superior und gleichbleibende Qualität zu dem, was von Hand erreicht werden kann schnell vorzubereiten. Die Vorrichtung umfasst eine Basis, die 4 Edelstahlstangen und eine Oberseite, die eine Schneidführung wirkt hält. Die Stäbe werden in das Lumen des Dünndarms [gedrittelt] und den Dickdarm eingelegt. Die Stäbe und die Proben werden dann in einem Stück Filterpapier oder einer Karte in die Halteschlitze in der Basis der Vorrichtung platziert. Die Oberseite des Gerätes wird dann positioniert und dient als Schnittführung. Die beiden Abwinkelungen in der Mitte des Oberteils werden verwendet, um ein Messer oder Skalpell führen und schneiden den Darm in Längsrichtung auf der Oberseite der Stangen. Sobald die Darmabschnitte geschnitten worden sind, wird der Kopf abgetrennt und die Karte, tissue und Stangen leicht aus der Vorrichtung entnommen und auf die Bank gelegt. Die Stäbe werden dann sanft zur Seite gerollt, um zu glätten und kleben die Darmsegmente auf die darunterliegende Stück Filterpapier oder Karte. Die endgültige Präparation kann dann untersucht oder befestigt werden und für eine spätere Analyse gelagert. Die Zubereitungen sind von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von Veränderungen der intestinalen normalen oder genetisch modifizierte Mausmodellen. Die Vorbereitungen für die Untersuchung und Quantifizierung der Auswirkungen der Entzündung (Colitis), Schäden, Krebsvorstufen verwendet (anomale Kryptenherden (ACFs) und Mucin erschöpft Brennpunkten (MDF)) und Polypen oder Tumoren.

Introduction

Die Maus und die genetisch veränderte Maus 1-3 sind eine unschätzbare Modell für die Untersuchung von verschiedenen Pathologien, insbesondere Krebs und seine Beziehung zu Entzündungen im Magen-Darm-Trakt. Dies erfordert oft die Herstellung von Gesamtpräparate des Dünndarms und / oder Dickdarm.

Die Herstellung von Gesamtpräparate mit einer Genauigkeit Paar versetzter Schere gemacht werden, aber es kann etwa 20 min pro Maus 4 nehmen. Dies ist nicht sehr praktisch für Vergleichsstudien, die eine erhebliche Menge an Mäusen benötigen (etwa 10 pro Gruppe für die statistische Analyse). Darüber hinaus ist die Länge der Zeit erhöht das Risiko von Gewebeabbau. Ein Versuch, dieses Problem zu lindern führte zu der Studie von verschiedenen Schneidvorbereitung Hilfen. Die erste auf einer Reihe von Metallplatten basiert, mit Schneidhainen, aber die Platten verdeckt das Gewebe und die Schneid war daher schwierig zu kontrollieren.

Ein Konventionel sechseckigen Bleistift schließlich Inspiration zur Verfügung gestellt für die Schneideinrichtung, wie wir könnten dann sehen, wie eine halbe Stiftform wäre eine gute Führung für ein Skalpell (Abbildung 1) zu machen. Dies führte zu einem Design für einen Rahmen mit vier Schneidführungen 5. Die Wirksamkeit dieser Vorrichtung war dramatisch wie die Präparate in Figur 4 veranschaulichen den Unterschied zwischen der Scheren Zubereitung und der Vorrichtung Zubereitung.

Die Oberseiten der Originalgeräte wurde aus mehreren Metallstücke, aber späteren aufgebaut, und das aktuelle Modell wurde aus einem massiven Stück Duraluminium gefertigt. Die Basis wurde von höchster Qualität mit hoher Dichte Harz bearbeitet.

Das Gerät hat sich als von großem Nutzen für die Herstellung von ganzen Bergen von Mausdarm, da es erheblich beschleunigt und verbessert die Qualität und Konsistenz der Präparate, die eine breite Palette von Anwendungen.

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Protocol

Die verschiedenen experimentellen Verfahren und die humane Sterbehilfe werden von der gastgebenden Einrichtungen Ethikkommission und von den zuständigen Aufsichtsbehörden genehmigt. Sterbehilfe ist in der Regel unter Verwendung von CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte erreicht.

1. Vorrichtung

  1. Maschine der Hauptteil des Bodens der Vorrichtung von aus einem festen Block aus hochdichtem Acetyl-Harz, wie in diesem Manuskript beschrieben. An jedem Ende zu erstellen 3 mm hoch erhöhten Streifen, und ein Teil Maschine aus diesen 2,5 mm Haine, um die Stangen zu nehmen (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3).
  2. Machen Stangen aus einem 2,4 mm Durchmesser aus Edelstahl mit abgerundeten Enden.
    HINWEIS: Der Hauptrahmen des Deckels wurde aus Duralumin Platte gefräst. Eine begrenzte Anzahl von fertigen Vorrichtungen sind von Dr. Goodlad erhältlich.

2. Verwendung des Geräts

  1. Sezieren den Dünndarm und Dickdarm aus der Bauchhöhle mit einer Schereund behandschuhten Fingern. Entfernen Sie das Mesenterium, indem Sie sie mit einer gebogenen Pinzette und leichtes Ziehen sie weg aus dem Darm.
  2. Spülen Sie den Darm mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) mit einer Pipettenspitze Gilson-Typ, der sich an seinem breiteren Ende geschnitten worden war, so dass er auf ein 10 oder 20 ml Luer-Fitting-Kunststoffspritze passen.
  3. Legen Sie den Dünndarm (SB) auf einem Blatt Papier Handtuch und teilen sich in drei gleiche Abschnitte in der Länge (proximalen, mittleren und distalen - SB1, SB2 und SB3) mit einer Schere. Entfernen Sie den Blinddarm und legen Sie den Doppelpunkt.
  4. Machen Sie mehrere sehr kleine Schnitte in das Darmsegmente mit einer Schere, damit die Flüssigkeit entweichen und legen Sie ein Blatt Papier Handtuch über den Darm und sanft laufen mit dem Finger über die Vorbereitungen zu verdrängen die Flüssigkeit und trocken tupfen.
  5. Heben Sie die Abschnitte und legen Sie die Edelstahlstäbe, die zuvor durch Eintauchen in ein Becherglas mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung benetzt wurden.
    HINWEIS: Der Darm kann sein,umgewandelt, wenn dies gewünscht (innen nach außen gedreht).
  6. Beschriften Sie ein Stück Karton oder Filterpapier auf Maß geschnitten, um in die Basis des Geräts passen. Bleistift ist am besten, da sie unbeeinflusst von nahezu allen Lösungen ist. Autopsy Datum, experimentellen Code und Tieridentifikationsnummer vorgeschlagen.
  7. Legen Sie die Karte oder Filterpapier in die Basis des Geräts. Setzen Sie die Stangen und Darm in die Schlitze in der Basis des Gerätes. Sicherzustellen, dass das proximale Ende der Segmente in einer standardisierten Weise positioniert. Die proximalen Enden sollten in der Nähe der Karte Etiketten sein.
  8. Legen Sie das Oberteil des Gerätes über die Basis. Mit den abgewinkelten Bars, ein Skalpell zu führen, um die Abschnitte längs geschnitten.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, wenn das Gewebe vorsichtig und mit einem Finger gehalten werden, um sicherzustellen, dass sie nicht mit dem Messer zu bewegen.
  9. Entfernen Sie das Oberteil des Gerätes. Das Filterpapier und Gewebe vorsichtig entfernen (immer noch auf ihre Stäbe).
    HINWEIS: Ein Stück steifen Karte unter dem fil platziertter Papier Hebehilfe.
  10. Leicht feucht (mit einer behandschuhten Fingerspitze in PBS getaucht) der Segmente. Rollen Sie die Stange, von Seite zu Seite zu öffnen, die gut und breitete sie flach. Das Gewebe wird dann auf das Filterpapier haftet.
  11. Visuell untersuchen die Vorbereitungen für alle makroskopischen Veränderungen.
  12. Übertragen des Gewebes auf das Filterpapier haftet in eine flache Wanne (oder Sandwichbox) enthaltenden Fixiermittels.
    HINWEIS: Nachdem das Gewebe hält sich an das Filterpapier oder auf die Karte wird es bleiben, fest angebracht. Eine Vielzahl von Fixierungsmitteln kann verwendet werden, um die Herstellung zu bewahren. Es wird empfohlen, Carnoy-Flüssigkeit sollte für die Untersuchung von Darmzellwucherungen 6, die die ideale Fixierung für den besten Zellproliferation Verfahren verwendet wird; jedoch Formalin oder viele andere Fixierungsmittel verwendet werden, wenn andere Endpunkte erforderlich sind.
  13. Nach der Fixierung (in der Regel 3 h), übertragen Sie die Präparate in 70% Ethanol. Die Proben können dann gelagert, bis sie benötigt werden. Die Vorbereitungen cen face eine untersucht und / oder für die Herstellung von histologischen Proben für H & E oder andere histologische Färbetechniken Immunhistochemie und / oder in situ-Hybridisierung verwendet werden.
    HINWEIS: Längerer Fixierung kann immunhistochemische Reaktivität und / oder in situ Hybridisierung Reaktivität zu reduzieren. Polypropylen-Sandwich-Boxen sind ideal für die Speicherung einer großen Anzahl der Zubereitungen.
  14. Bei Bedarf die fixierten Gewebe aus den verschiedenen Darmabschnitten kann in "Rouladen" gemacht und mit dem gesamten Bereich der histologischen Methoden 6 einschließlich der oben beschriebenen gefärbt werden. Um einen "Swiss roll" machen die Darmsegmente werden aus dem Filterpapier gerollt um einen Cocktail-Stick oder einem Zahnstocher, mit einer entomologischen Stift gesichert und für Wachs Einbetten 6 verarbeitet entfernt.
  15. Falls erforderlich, beflecken den Großgewebe mit Methylenblau zu abweichenden Kryptenherden 7 visualisieren.
  16. Note die festen Zubereitungen, die aufFreizeit.

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Representative Results

Polypen sind einfach, unter einem Stereomikroskop mit einer Kaltlichtquelle zu identifizieren, um die Seite zu beleuchten das Gewebe (Abbildung 4). Es ist hilfreich, um die Karte mit Bleistiftmarkierungen kennzeichnen, wenn ein Polyp, damit Scoring kann später diskutiert und verschiedene Betreiber kann Einigung beobachtet. Das Gewebe kann auch Groß sein befleckt [mit Methylenblau] zu identifizieren anomale Kryptenherden 8 oder Mucin erschöpft Brennpunkten (MDF) 9 durch Beleuchtung von oben oder von trans-Beleuchtung (Abbildung 5).

Der Ort der Läsionen kann auch auf einer Positionsbasis 8 erzielt werden. Um dies zu tun muss man zuerst ein Raster von 10 Quadratmeter in einem Computerzeichenprogramm vorzubereiten, dies mehrmals kopieren und dann strecken die verschiedenen Netze, verschiedene bekannte Größen und drucken Sie auf ein Acetat Blatt (siehe Abbildung 6) [Intaglio ist ein nützliches und relativ einfaches Programm, dies zu tun]. Man kann dann finden Sie ein Raster, das die l passt ength des Abschnitts und verwenden Sie es, um die Ereignisse von Interesse zu erzielen.

Einmal hat, einen Teil oder alle der Gewebe kann zur weiteren Analyse entnommen werden oder die ganze Teile können in eine "Swiss roll" für die histologische Schnitte aufgerollt werden. Während dieses Verfahren wurde als technisch anspruchs 10 beschrieben wurde die Wohnung und auch die Natur der Vorbereitungen macht dieses Verfahren viel einfacher. Die Makro-Erstellung verwendet werden, um "Makro Polypen" und der Schweizer Rollen verwendet werden, um "Mikro Polypen '11,12 (Abbildung 7) Partitur punkten werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Wie die Inspiration des Gerätes kam von einem Bleistift. Die Diskussionen in der Einheit führen Biologische Dienst an der Idee, mit einem halben Stiftform als Schneidführung zu handeln.53042 / 53042fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 Fotos von der Original-Gerät. Das ursprüngliche Gerät wurde aus mehreren Metallstücke, von Hand zubereitet aufgebaut. (A) Das Gerät montiert. (B) Die Oberseite des Geräts entfernt wurde, um die Stangen in Position zu zeigen. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Fotos von neu gestalteten Gerät. (A) Der Hauptrahmen des Deckels ist aus Duraluminium Platte bearbeitet wird. (B) Die Basis (in Schwarz zu sehen)wird von einem festen Block der High-Density-Acetyl-Harz, mit 4 abnehmbaren Stangen sitzen in einem Kanal. Gezeigt ist ein Filterpapier (weiß) auf der Oberseite der Basis (schwarz) gesetzt (C) die letzte Ansicht der Vorrichtung. Der Deckel (A) auf der Oberseite des Beckens (B) angeordnet ist. Maße in cm angezeigt. Die Stäbe wurden 2,4 mm Durchmesser, mit abgerundeten Enden. Siehe Referenz 5 für weitere Details. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Gut Vorbereitung mit gemacht Offset Scheren und Verwendung des Geräts. (A) Die Därme mit Offset-Schere bereit. (B), die mit der Darm Schneider, die die sogar Breite im gesamten Darm und Darm hergestellt die bessere Darstellung des Gewebes, das Zählen macht, und Beobachtung von Polypen viel einfacher. Geändert aus 3 bei der Zellproliferation 6. Maßstabsleiste mit dem Gerät angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Aberrant Kryptenherden in ganze Berg des Dickdarms mit Methylenblau gefärbt gesehen. Die gesamte Halterung Doppelpunkt wurde Groß mit Methylenblau angefärbt, um anomale Kryptenherden zu identifizieren, die durch Pfeile dargestellt. Maßstabsleiste mit dem Gerät angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. Vorlage für Acetat Blätter für Positions Scoring. Verschiedene Größen von Raster von 10 Plätzen werden auf Acetat Blätter gedruckt. Der Schnitt Darm in der Startaufstellung, die die Länge des Abschnitts passt gelegt, und die Ereignisse von Interesse sind, hat wie Zählen Anzahl der Läsionen in jedem Quadrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7. Swiss roll eines H & E gefärbten Maus Dünndarm. Die gezeigte Dünndarm Swiss roll ist von einer APC (Min / +) der Maus, ein gut in vivo-Modell von Darmtumorgenese gekennzeichnet. Die Pfeile zeigen repräsentative Adenomen. Maßstabsleiste mit dem Gerät angezeigt wird.42 / 53042fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das Gerät erheblich beschleunigt den Prozess, so daß zwei Bediener kann vollständig eine Maus Autopsie innerhalb von 6 min. Dazu gehört auch eine Sichtkontrolle auf offensichtliche makroskopischen Veränderungen und einem Gewicht von und zur Festsetzung der wichtigsten Organe. Es ermöglicht auch die Betreiber zu spülen, trocknen und wiegen den Magen, Blinddarm, Dünndarm und Dickdarm und bereiten die gesamte Reittiere. Der abgeflachte Gewebe sehr schnell behoben werden und somit zu vermeiden Abbau Artefakte.

Einer der wichtigsten Vorteile der Vorrichtung (mit Ausnahme der Geschwindigkeit) ist, dass die Vorrichtung die Herstellung von qualitativ weit überlegen Zubereitungen, der dann die nachfolgende Analyse und Quantifizierung wesentlich einfacher zu erzeugen. En face Scoring ist ideal für die Quantifizierung von makroskopischen krebserzeugende und Pre-karzinogene Läsionen (wie Polypenzahl, Durchmesser und Belastung Volumen). Die auch die Natur der Vorbereitungen macht sie ideal für den späteren Rollen in "Biskuitrollen" und Schneiden, so dass die histologische Analyse der "Mikro polyp 'Nummer kann auch quantifiziert werden. Aberrant Kryptenherden und andere präneoplastische Veränderungen können auch mit den ganzen Halterungen visualisiert werden.

Entzündliche Veränderungen in verschiedenen ulcerosa Modelle können auch unter Verwendung der Gesamtpräparate beobachten.

Ferner die quantitative und räumliche Position dieser Ereignisse in unterschiedlichen Bereichen des Darms kann bestimmt werden. Einschränkung der Technik ist, dass die Verwendung der Vorrichtung erfordert eine gewisse Geschicklichkeit, insbesondere in der Scoring des Gewebes mit dem Skalpell. Die meisten Betreiber kann die Technik in kurzer Zeit nach ein paar Minuten der Praxis zu meistern. Die Vorbereitungen ein paar Minuten nur, aber wenn sofortige Konservierung erforderlich kleinen Proben kann zur Fixierung oder gefroren und dann den Rest der wie üblich vorbereitet Gewebe entnommen werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delrin Ryan Plastics, Earls Barton, UK High-density acetal resin similar material would suffice
Duralumin plate Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available 
Finished device(s) ready for use Contact Dr Goodlad  r.goodlad@imperial.ac.uk Contact  r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details

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References

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