공부 단백질 기능 및 항체의 간섭과 3 차원 재건에 의해 변경 단백질 발현의 역할

1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg
Published 4/21/2016
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Bioengineering

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Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

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Abstract

단백질 발현의 엄격한 관리가 살아있는 유기체의 모든 필수적인 아니라 세포 모델에서 단백질의 기능을 조사하는 중요한 전략뿐만 아니라. 따라서, 최근의 연구는 RNA 및 항체 간섭을 포함하여 포유 동물 세포주 또는 동물 모델에서의 단백질 발현을 대상으로 다른 도구를 발명했다. 첫 번째 전략은 지난 20 년 동안 많은 관심을 수집하고 있지만, 세포막에서 세포에 항체화물의 전위를 매개 펩타이드는, 훨씬 적은 관심을 얻을. 이 공보에서는 항체 간섭 실험을 수행하기 위해, 인간 배아 신장 세포에서뿐만 아니라 차 해마 뉴런 전차라는 펩티드 담체를 이용하고 상기 단백질의 기능을 분석하는 삼차원 재구성의 적용을 설명하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리의 연구 결과는 전차는 아마도 핵 지역화 신​​호, particula에 있음을 시사RLY 소마와 핵에 존재하는 단백질을 대상으로 매우 적합합니다. 차 해마 문화에 전차를 적용 할 때 놀랍게도, 시약은 놀라 울 정도로 잘 해리 신경 세포에 의해 허용 될 밝혀졌다.

Introduction

모든 살아있는 유기체 자체 개발 명령뿐만 아니라 환경 신호에 반응하는 단백질 발현의 엄격한 제어가 필요하다. 따라서, 메커니즘은 다수 정확하게 앱 부호화 각 단백질의 발현을 조절하는 진화 중에 고안되었다. 그 삶의 주어진 시간에 모든 진핵 세포에 존재하는 20,000 유전자. 단백질 생산의 다른 단계에서 발생하는 규제 메커니즘은 번역 후 단백질 수정, 전송 및 분해의 방향으로 처리 크로 마틴 구조, 전사 및 RNA의 관리에 이르기까지 다양합니다.

분자 기계 및 변형 단백질 발현 수준을 기본에 고장이 암 또는 지적 장애 등 다양한 질병과 연관되어 있는지, 따라서 놀라운 일이 아니다. 사실, 신경 세포의 개발 및 포유 동물의 뇌 기능의 뛰어난 복잡성에서 찾고 SENSI단백질 발현의 변화에​​ 이러한 정교한 시스템의 tivity는 알츠하이머와 허약 한 X 증후군 (FXS) 같은 파킨슨 병 (AD 및 PD)뿐만 아니라 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) 등 여러 가지 잘 알려진 지적 적자에서 드러난다. 후자 질병은 하나의 번역 조절 단백질 FMRP (유약 X 정신 지체 단백질) 1-4의 손실로 인한 ​​단백질의 다양한 광범위한 misexpression 특징으로한다. 점 돌연변이는인지 장애 환자에서 식별되지 않은 상태에서 5 캐핑 mRNA의 수정에 의해 mRNA의 안정성과 변환을 관리 또한, 가변 전하에 영향을 미치는 염색체 재구성 연결된 x를 단백질 A (VCXA) 단백질은 최근 지적 결핍과 연관되고 지금과 같은 6, 7, 관찰 된 정신 장애는 변경된 VCXA 발현과 그 대상 보호 자전거의 조절 이상 발현에서 발생한 것을 건의인. 이러한 연구 결과, 드 노보 ASD와 관련된 유전자의 복제 수 변화에 따라서 상승 또는 감소 단백질 발현 수준이 발생할 수 있음을 아이디어를 지원하는 새로운 유전자 중복 및 삭제 ASD (8)의 중요한 위험 인자임을 설립 여부를 조사 연구와 일치 지적 적자.

놀랍게도, 최근의 연구는 또한 특정 단백질의 발현 량을 정확하게 거의 안전 여유도 9 높은 단백질 량의 결과로서 그 응집을 방지하도록 조절되어 있다는 증거를 제공 하였다. 따라서, 심지어 작은 단위는 AD 및 PD (9)과 같은 질병을 유발하기에 충분하다는 것을 제안되었다. 단백질 발현 조절에 기여하는 분자 기계의 다양한 이러한 결과에 비추어 복잡한 조절 방식을 제안했지만, 5000 포유류 유전자 (10)의 발현 량을 조사하는 연구는 것을 증명자연은 더 인색 방식을 선호 : 단백질의 세포 풍요 로움을 주로하여 RNA 가용성 관리는 주로 미세 조정하는 단백질 발현을 제공한다는 설명, 번역 (10)의 수준에서 조절되는 것으로 나타났다.

관심 단백질의 용량을 연구 장소 (POI)를 따라서 만 내인성 단백질의 기능을 이해하는 것이 중요하지만, 또한 많은 질병의 연구 및 치료의 개발이 아니다. 따라서, 지난 수십 년은 POI의 복용량을 조작하는 RNA 간섭을 사용하여 몇 가지 전략의 발전을 보았다. RNA 간섭 널리 단백질의 기능을 연구하기 위해 사용되며, 심지어 암, 안과 질환의 치료뿐만 아니라 환자의 11-13 항 바이러스 요법을 추구하는 임상 시험에 적용되고 있지만, 약간의 어려움이 전략 불가능 렌더링 할 수있는 발생할 수있다. 예를 들어, 상 동성으로 최저 구동 시드 시퀀스는 compara은상상력 짧은, 따라서 홍보 오프 대상 효과. 고효율 서열이 드문 및 시간과 비용이 많이들 수있는 권리 순서를 식별 (14 리뷰) 옵션의 수천 사이에서 발견해야하지만 이후 결과는 여전히 실망 할 수있다.

또 다른 전략은 직접 항체에 의해 POI를 대상으로하는 것입니다. 여기서, 우리는 세포 단백질의 가용성을 감소 (활성 모티프 제조) 단백질 담체 전차의 사용을 설명하고, 삼차원 재구성의 고용 녹다운 따라 단백질의 기능을 연구.

전차, 자체 2.8 kDa의 펩타이드의 활성 모티브, 포유 동물 세포 (15)의 세포막을 가로 질러 셔틀 펩티드, 단백질 및 항체로 사용된다. 전차-POI 단지 가는데, 소수성 상호 작용을 이용하여 비공유 결합 된 거대 분자 복합체를 형성함으로써 관심 장소와 펩타이드 관계자는 엔도 좀-IND 세포에 내장되어 있습니다ependent 방법. 중요한 것은, 전차가 왕복 단백질의 세포 내 위치 파악에 영향을 미치지 않으며, 세포 독성 효과를 발휘하는 또는화물 (15)의 생물학적 활성에 영향을 미치는 것으로도 나타내었다.

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Protocol

1. 재고 솔루션

  1. 2 μg의 / μL의 최종 농도 멸균 H의 동결 건조 활성 모티브 분말 2 O를 재현 탁. 혼합주의 깊게 누릅니다.
  2. (예를 들어, 12 ㎕를 각각 2 μL가 반응에 따라 필요) 작은 분취 량을 준비하고 -20 ° C에 저장합니다.

세포의 2. 준비

  1. 항생제를 포함하여 24 웰 플레이트에 500 μL의 성장 매체에 HEK293 세포 또는 차 신경 세포로 씨 포유 동물 세포.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 낮은 밀도의 세포를 시드 및 24 웰 플레이트의 두 개의 중간 열을 사용한다. 각각의 잘 따라서 배양 (단계 4.2) 동안 매체를 항구 빈 대응을해야합니다. 신경 세포를 취급 할 때는 항상 세포가 몇 분 이상 인큐베이터 밖에 유지되지되어 있는지 확인하십시오.
  2. 세포 앱까지 적절한 배양 조건의 세포 (가습 된 5 % CO 2, 37 ℃). 50 %지류.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 문화 원하는 발달 단계까지 세포에 도달하고 응용 프로그램을 변경할 수 있습니다. 두 매질의 25~50% 주. 매체 (1X B27, 5 mM의 L- 글루타민 및 1X 페니실린 및 스트렙토 마이신을 함유하는 (REF) (16)과 비교)로 Neurobasal 배지.

3. 전차 단지 형성

  1. 반응 당 PBS 50 μL에 각각 POI 또는 해당 항체뿐만 아니라 제어 단백질, 또는 대조군 항체의 0.1 μg의 희석.
    참고 :이 기술은 또한 거대 분자 복합체 사전 구속 일차 및 이차 항체 (. CP '대표 결과'그림 1)으로 구성된 작동합니다. 믹스와 스핀.
  2. 각 샘플에 대해, 전차의 자동 연관을 방지하기 위해 별도의 튜브를 사용하여 PBS 50 μL 2 μL 전차 원액을 희석. 믹스와 스핀.
  3. 피펫에 의해 전차의 희석에 희석 POI 또는 항체 (3.1 단계)를 전송팅. 믹스와 스핀.
  4. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 혼합물 (POI 전차 - 복합체 형성 할 것이다).

셀의 4. 형질

  1. 전차 단지 사전 예열 성장 매체 100 μL (37 ° C, 무첨가)에서 (단계 3.4) 희석. 매체를 제거하고 한 번에 미리 예열 1X PBS를 사용하여 세포를 씻는다.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 배지를 폐기하지 않는 것이 재사용 될 것이다. 37 ℃에서 보관하십시오. 세척, PBS가 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 염화칼슘 (2)를 포함하는 사용합니다.
    제안 : 접시 (4.5 단계)을 배양하는 동안 빈 우물에 매체를 보관합니다.
  2. 세포에 전차 착체 용액 (단계 4.1)를 적용하고, 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 조심스럽게 흔들어 세포. 1 시간 동안 표준 조건 (단계 2.2)에서 세포를 성장. 10 %의 최종 농도로 혈청을 추가한다. 신경 세포를 사용하는 경우, 단계 4.1에서 매체를 추가 할 수 있습니다. 1 ~ 2 시간 이상 세포 성장.
    참고 :최적의 배양 시간은 규모와화물의 특성에 따라 실험적으로 조정할 필요가있다. 다음의 제안은 가이드 라인으로 역할을 할 수있다 : 펩타이드를 들어, 1 시간 ~ 2 시간이 항체, 2 시간을 권장하고, 항체와 신경 세포의 형질 4 시간 동안하는 단백질, 일반적으로 충분합니다.
  3. 평소와 같이 분석을위한 프로세스 세포. 참고 : 기술은 고정 프로토콜뿐만 아니라 라이브 영상을 사용하여 실험과 호환됩니다.

5. 이미지

  1. 레이저 주사 현미경을 사용하여, 약 0.25-0.5 μm의 거리를 사용하여 세포 및 / 또는 관심의 세포 구획 Z-스택을. 정확한 층 거리 재구성 될 구조물의 크기에 따라 개별적으로 결정되어야한다.

6. 재건

  1. 다음 단계에서 O를 클릭하여 여러 개체를 선택하려면 선택과 이동, Cntr을 사이를 전환 할 Esc를 바닥을 사용n은 그들과 Shift 키 객체 (CP를. 6.10 단계) 잘라.
  2. Imaris에서 LSM-파일을 엽니 다.
  3. 밝은 구조가 포화에 도달 할 때까지 각 채널의 표시를 조정하여, 화상을 대조. 표면 구조에 영향을주지 않습니다이 조정은, 그것은 단지 이미지를 임계 화에 실험을 지원하는 역할을 양해 바랍니다.
  4. 새로운 표면 추가 아이콘을 클릭합니다. 마법사가 열립니다.
  5. 선택 : 관심의 세그먼트 만 지역. 다음 단계로 진행합니다.
  6. 관심의 목적에 맞게 선택 상자의 여백을 조정합니다. 이미지는 3 차원이 숙지하고 선택뿐만 아니라 Z 평면에서 조절해야한다는 부담주십시오. 선택 박스의 직사각형이 제대로 관심의 대상이 일치하지 않아야하는 경우, 객체를 회전 및 / 또는 모든 필요한 구조를 포함 할 때까지 선택을 확대. 원치 않는 개체가 나중에 제거 할 수있다 (CP. 6.10 단계). 발하다.
  7. 해당 채널을 선택합니다annel. 표면적의 상세 수준 또는 구 직경은 구조가 재구성되고 일치하도록 설정해야합니다. 상기 신호 특성에 따라 절대 강도 또는 로컬 콘트라스트 중 하나가 사용될 수있다. 일반적으로, 지역 대비 확산 신호에 대한 더 나은 작동합니다. 어떠한 경우에도, 설정이 각각 관심있는 각각의 신호 또는 구조에 대해 개별적으로 조절 될 필요가있다.
  8. 임계 화 도구를 사용하여 관심의 구조를 재구성.
  9. 녹색 화살표 아래를 클릭하여 복원을 완료합니다.
  10. 절단 및 필요에 따라 표면을 제거하기 위해 연필 도구를 사용하여 추가 개체를 조정합니다. 원하는 개체를 절단하기 위해 이미지를 따라서 남북 방향으로 절단 기울에만 가능합니다.
  11. 선택 통계, 자세한 통계 및 평균 값에 의해 각 표면 볼륨 영역의 측정과 강도를 얻습니다.
  12. 색상 코드 통계를 관찰하려면 (선택 단계) (CP. 그림 2E F)는, 해당 표면의 색상 탭을 선택하고 대신 '자료'의 '통계 코딩'을 표시합니다. 몇 가지 옵션이 표시됩니다.

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Representative Results

다음 단락에서, POI의 기능 최저 설명 예시 결과 전차 시약 및 항체의 간섭이되게됩니다 사용 (Simiate는, 자세한 내용은 16, 17 참조). 연구 결과는 Simiate의 감소 발현이 전사 활성을 저해하고, 투여 량 의존적으로 높은 항체 양 (> 1 μg의 항체)을 적용 할 경우 99 %의 사망률에서 남중, 세포 사멸을 유도 입증 (이 발견은 이전에 발표되었다 (16)). 여기서는 상세하게 사용되는 기술과 프로토콜을 제공하고 또한 주 문화 해리 해마 신경 세포를 형질 감염 할 수있는 방법을 보여 전차 시약.

이들 항체는 절차 동안 계속 작동하는 경우 전차 펩티드, 특히 항체를 효율적으로 좌우 이동 가능 여부를 조사하기 위해, 우리는 FLAG를 표명이어서 HEK293 세포에서 24 시간 동안 -Simiate하고는 전차를 이용하는 세포 rbαSimiate-gtαrbAlexa568 거대 분자를 (도 1)에 결합 형질. 국기 - Simiate 구조는 잘 HEK293 세포에 의해 표현과 인 somata뿐만 아니라 이들 세포의 핵 (그림 1A)에 편재되어있다. 여기함으로써 핵의 내생 Simiate의 얼룩덜룩 한 분포를 미러링 FLAG-Simiate 클러스터 크게 (그림 1B).

세포막을 가로 질러 왕복 항체 복합체 (빨간색, 빨간색 화살표의 그림 1A) 군집에 표시하지만, FLAG-Simiate과 rbαSimiate-gtαrbAlexa568의 거대 분자의 깊은 colocalization을 (그림 1B 같이 출시 된 항체는 특히 FLAG-Simiate을 감지 , 노란색, 노란색 화살표에서). 참고로, 실험뿐만 항체는 전차가 중재하는 동안 기능을 유지 것을 보여줍니다막을 통과하지만, 또한 핵을 입력 할 수있다. 크기는 확산을 통해 핵 착수로부터 항체를 배제하기 때문에, 전차 자체에 존재하는 핵 이행 시그널이 핵으로 rbαSimiate-gtαrbAlexa568 거대 분자의 전위를 용이하게하는 것이 쉽다. 사실, 항체 군집도 또는 각각의 관찰, 핵 구획 (그림 1B, 빨간색 화살표).

rbαSimiate-전차는 기능적으로 HEK293 세포에서 내생 Simiate (그림 2) 고갈 복합체 사용하여, 우리는 우리가 항체 (16)의 2.0 μg의를 사용하여 rbαSimiate 결합 부위의 80 %를 대상으로 할 수 있었던 것을 발견했다. HEK 단독으로 gtαrbAlexa568 항체 왕복 흥미롭게도, 293 세포 핵 얼룩 (도 2A-C)의 외관에 명백한 영향을 미치지 않으며, 기능적 Simiate 손실 핵 얼룩이 방사상 (도 2D-F </ strong>을, CP. 16) 삼차원 재구성 E(그림 2B, C, F)과, 용량 의존적으로, 세포 사멸을 유도 (그림 3, CP. 16)에 의해 도시 된 바와 같이.

신경 세포 독성에 매우 민감 감안할 때, 우리는 또한 (그림 4) 차 해마 문화 기술을 적용했다. 세포의 무결성을 분석하기 위해 TUNEL 분석 및 MAP2 염색을 사용하여, 우리는 치료, CP 1 + 4 시간 후 모의 또는 치료 치료 및 전차 세포 (응용 프로그램. 20-25%의 TUNEL 양성 세포를 비교하는 신경 세포의 생존에 영향을 찾을 수 없습니다. 4.4 -4.6). 따라서, 우리는 연결을 문화에 왕복 전차 매개 항체를 시험했다. 동일한 응용 프로그램 방식에 따라, gtαgpAlexa568 항체 군집은 변화에 그들이 인 somata뿐만 아니라 핵 (그림 5A)에서 발생한 세포의 약 83 % 연장 보였다. 이러한 관찰은 더 b를 지원합니다나중에 입체 분석 (도 5b)와 밀접하게 함께 따라서 전차 기술이 성공적으로 사용될 수도 차 해마 뉴런 해리 형질 것을 나타내는, HEK293 세포에서 본 그림을 조립.

그림 1
도 1 FLAG-Simiate 전차는 시약을 이용하여 HEK293 세포 내로 왕복 Simiate 특이적인 항체에 의해 검출된다. 항체 간섭 실험 rbSimiate-gtrbAlexa568 항체 전에 전차 - 항체 복합체 형성에 미리 조립 된 내용. A) FLAG-태그 Simiate을 표현하는 HEK293 세포. Simiate 항체 군집은 소마뿐만 아니라 그들이 FLAG-Simiate 특별히 colocalize 응용 프로그램, 다음 핵을 입력합니다. 라운드 점 : 전차 - rbSimiate - gtrbAlexa568 군집 (빨간색 화살표). B) 박스형 영역의 고출력 배율FLAG-Simiate 및 전차 매개 Simiate 신호 (노란색 화살표)의 colocalization을을 나타낸 (A)이다. 핵 (빨간색 화살표)에서 전차 항체 조립의 존재를주의하시기 바랍니다. 스케일 바 : 10 μm의.

그림 2
HEK293 세포로 왕복 그림 2. Simiate 특정 항체가 내인성 Simiate. (A)의 세포 기능을 방해, B) 전차-gtrbAlexa568 처리 HEK293 세포 (1 μg의) 제어 역할을합니다. 전차-gtrbAlexa568의 군집이 표시되지 않습니다 동안 빨간색으로, 내생 Simiate은 거짓 색상으로 표시됩니다. 사멸 세포 (파란색) TUNEL 분석에 의해 확인 된 반면, 핵 얼룩은 마커 단백질 SC35를 (녹색)를 사용하여 표시 하였다. 핵 같은 지역의 재건) A.의 C에서 박스 지역에서 얼룩 설명 반점 볼륨과 표면 영역의 B) 재건컬러 코딩 방식이다. D, E) 전차 - rbSimiate 처리 (0.5 μg의) 다음 HEK293 세포. 핵 얼룩 및 세포 사멸 세포) A와 B E에 따라 동일한 영역으로 표시됩니다) D. F의 박스 영역에서 재구성 핵 얼룩을 표시하는 동안 내생 Simiate뿐만 아니라 전차-rbSimiate-gtrbAlexa568 군집은 빨간색으로 표시됩니다 C.에 대한 설명은 얼룩의 방사상 모양과 통합 (: Imaris 소프트웨어 모두 복원)을 참고하여주십시오. 2 μm의 : C, F의 스케일 바. 다른 모든 스케일 바 : 10 μm의. 1) 삼차원 재구성을 위해, 단지 비 - 아폽토시스 세포를 사용 하였다.

그림 3
전차-rbSimiate - gtrbAlexa568 그림 3. 높은 용량은 대규모 세포 사멸을 유도한다. HEK293 세포는 2 각각 전차 - gtrbAlexa568 또는 전차-rbSimiate - gtrbAlexa568의 μg의 (모두 빌려 처리 하였다 lexes 화살표뿐만 아니라 배율에 의해 녹색으로 표시 및 표시). TUNEL 라벨링 (파란색) 사멸 세포를 식별하기 위해 적용 하였다. 스케일 바 : 10 μm의.

그림 4
그림 4. 전차 차 해마 신경 세포에 독성이 없습니다. AB 왕복 항체 (1 + 4 시간 (CP)에 대한 프로토콜에 설명 된대로 7 뉴런) 중 하나를 모의 치료 (중간, A) 또는 전차 시약 (B로 하였다) DIV. 4.4-4.6). SC-35, 핵 얼룩 마커 단백질, 전사 및 접합 기계 레이블을 제공하지만, TUNEL 염색은 사멸 세포 (녹색 화살표)를 식별하기 위해 적용되었다. 처리되지 않은 C)와 전차는 DIV 16/17 신경 치료. MAP2 염색 수지상 트리 시각화 적용 하였다. 스케일 바 : 10 μm의.

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그림 5. 전차 매개 형질 전환은 연결을 문화와 호환됩니다. A) 사업부 5. 그림의 담당자 차 해마 신경 세포는 레이저 주사 현미경 (레이저 스캐닝 현미경 (710), 자이스)를 사용하여 촬영 스택의 Z-전망을 보여줍니다. 스케일 바 : 10 μm의. 핵의 전차 - gtgpAlexa568 단지 (적색)의 발생과 세포의 소마주의하시기 바랍니다. A. 소마와 신경 세포의 수상 돌기에 표시된 핵뿐만 아니라 gtgpAlexa568 군집의 B) 3 차원 재구성 (Imaris 소프트웨어) 내인성 Simiate의 라벨에서 증류 회색 도트로 표시됩니다. 스케일 바 : 10 μm의. 항체의 양이 형질 : 0.25 μg의합니다.

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Discussion

여기서는 도즈 구동 방식으로 세포 기능을 조절 단백질 발현 수준의 중요성을 연구 프로토콜을 제시한다. 기술 된 프로토콜은 그러므로 세포 수준에서 단백질 기능의 상세한 연구를 촉진 해마 신경 세포 등 다양한 종류의 포유류 세포에서 단백질 발현의 미세 조정 조작을 허용한다.

RNA 간섭의 POI를 하향 조절하는 공지의 방법을 나타낸다 있지만 단점 (CP있다. 14)를 가진다. 뿐만 아니라 매우 특이적이고 효율적인 시퀀스의 식별은 비용과 시간을 소모 할뿐만 아니라 셀 내부 사체 생합성 독성 RNA 구조의 축적 핵 수출 기계 과부하뿐만 아니라 포화 때문에 예측 결과의 원인이 될 수있다 내생의 RNAi의 처리 시스템은 오프 대상 효과 나 비 효율성이 발생할 수 있습니다. 또한 외래의 RNAi 벡터의 높은 양 UNS을 유도 할 수있다pecific 효과뿐만 아니라, 세포의 항상성을 교란.

항체는 반면에, 즉각적인 세포 과정의 조사가 셀을 입력하면 내생 기계에 의해 더 처리가 필요없고, 즉시 유효 따라서뿐만 아니라 시간 절약 실험을 지원하지만. 들이 불특정 오프 - 타겟 효과를 가질 수 있지만, 역시 사용할 잘 특성화 고도로 특이 적 항체의 증가는 생각이 대안 상당한다. 세포 내로 거대 분자 복합체의 전달이 중요한 장애물을 나타내므로, 다양한 형질 전환 기술은 펩티드 R8 및 azoR8 18뿐만 아니라 미세 매개 셔틀 링 (19)을 포함한 최근에서 개발되었다. R8과 azoR8가 18 전차와 유사하게 동작하도록 지시 동안, 미소는 전차 매개 MEM보다 상당히 이상하다, 흡수 (19) 24 시간을 필요로 발견빠르고 농도 의존적​​ 세포 반응 공부할 때 brane 구절과 어려움의 원인이 될 수 있습니다.

놀랍게도, 전차 기술은 매우 치료에 민감하고 형질하기 어려운 차 해마 문화에 적용 밝혀졌다. 지금까지, 전차 캐리어는 신경 아세포종 - 신경 교종 세포주뿐만 아니라 신경에서 발생한 NG108-15 21 병아리 후근 신경절 배양 21 또는 PC12 세포 (22)를 차 조골 세포 배양 20 단백질 기능을 분석하기 위해 사용되어왔다 무늬 만, 중추 신경계에서 파생 된 세포 배양에서 모든 응용 프로그램에 대한보고는 아직 사용할 수 있습니다. 이러한 리포 펙 타민과 같은 기존의 형질 전환 시약이 세포와 바이러스 성 형질 복잡한에서 비효율적이기 때문에, 전차 흥미로운 대안을 나타낼 수 있습니다.

특히, 전차 자체는 아마, 핵 15 지역화 관찰되었다때문에 핵 지역화 신호 PKKKRKV에 (CP. 23). 이러한 관찰과 일치, 우리는 rbαSimiate-gtαrbAlexa568의 거대 분자의 전차 매개 형질이 핵 얼룩 핵 구획의 명확한 표시 결과 것을 발견했다. 사실, 이러한 gtαgpAlexa568으로 제어 항체는 모두 핵, HEK293 및 기본 해마 세포에서 검출되었다. 항체 때문에 군집에서 특히 Simiate 자체 공지 핵 이행 시그널을 포함하지 않고, 오히려 확산을 통해 핵이 입사하기 때문에,이 전차 신호가 연관되어 있음을 보인다 확산과 핵을 착수 너무 크다 항체의 핵 지역화. 이 세포에서이 항체에 대한 대상이 없기 때문에이 쥐에서 배양 된 해마 신경 세포의 핵에 gtαgpAlexa568의 존재를 설명 할 것이지만 또는 더 큰 단백질 군집의 전송도 할 수도 있습니다. 또한,시후부 전차가 왕복 펩타이드 및 단백질 15의 자연 현지화에 방해가되지 밝혀졌다, 이러한 관찰은 항체가 다르게 동작하는 것이 좋습니다.

세포막에 걸쳐 (그림 5) 전차 - rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (그림 1) 또는 전차-gtαgpAlexa568 같은 항체 복합체를 왕복 할 때 실제로, 그들은 단지 용해하는 클러스터에 표시 할 때와 같은 내인성 Simiate 또는 FLAG-Simiate 적절한 표적 단백질 (만 그림 1) 존재한다. 전차를 조골 세포에서 항체 복합체를 사용하여, 셀림과 대학 같은 효과 (20)를 관찰했다. 전차는 펩타이드와 단백질 (15)의 현지화를 방해하지 입증되었다 감안할 때, 이러한 관찰은 전차가 항체가 소수성 간을 극복 항체 표적 상호 작용 등의 분자 메커니즘이있는 경우에만 분해 조립을 나타냅니다전차와 항체화물 사이의 행동은 따라서 분해를 권장합니다. 항체는 펩티드 또는 대부분의 다른 단백질보다 무거워 그들의 모양, 넓은 표면을 가지고 있기 때문에 전차 분자의 높은 숫자와 연결 및 / 또는 따라서 홍보 것이다, 전차 펩타이드보다 회사를 상호 작용을 더-전차 구동 항체의 행동. 디스 어셈블리 메커니즘의 부족 때문에 클러스터 모양과 항체화물 (그림 5)의 핵 지역화 될 것입니다.

이와 함께, 데이터는 전차가 특히 핵에 존재하는 단백질의 기능을 충족하기에 적합한 것을 나타내고, 그 차 해마 신경 세포를 포함한 포유 동물 세포 종류의 다양한 적용된다.

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Acknowledgements

제시된 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 부분에서 지원 / RD 캐나다 파트너십 프로그램의 허약 한 X 연구 재단, RD, 대학 에를 랑겐 - 뉘른베르크의 Interdisziplinäres 젠트 룸에 대 한 klinische Forschung에 제롬 레조 이네 재단은 Rd 및합니다 독일 연구 협회에서 RD와 RE합니다. 저자는 pCMV5-FLAG 벡터 사용할 수 있도록 기술 세포 배양 유지 보수에 대한 지원뿐만 아니라 교수 M. 웨 그너에 대한 잉그리드 Zenger을 감사드립니다. 저자는 또한 특히 비디오 촬영에 도움이되는 지원을 위해 나디아 슈뢰더을 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

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References

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