Estudar a função da proteína eo papel da expressão proteína alterada pela interferência de anticorpos e reconstruções tridimensionais

1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg
Published 4/21/2016
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Bioengineering

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Summary

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Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

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Abstract

Uma gestão rigorosa da expressão da proteína não é apenas essencial para todos os organismos vivos, mas também uma estratégia importante para investigar as funções das proteínas em modelos celulares. Portanto, a investigação recente inventado ferramentas diferentes para atingir a expressão de proteínas em linhas de células de mamíferos ou mesmo modelos animais, incluindo ARN e interferência anticorpo. Enquanto a primeira estratégia reuniu muita atenção durante as últimas duas décadas, os péptidos medeiam uma translocação de cargas de anticorpos através das membranas celulares e em células, obtido muito menos interesse. Nesta publicação, é proporcionado um protocolo detalhado para utilizar como um transportador de péptido denominado Carruagem em células embrionárias de rim humano, bem como em neurónios do hipocampo primárias para realizar experiências de interferência de anticorpos e ilustrar ainda mais a aplicação de reconstruções tridimensionais em analisar a função da proteína. Nossos resultados sugerem que Chariot é, provavelmente devido ao seu sinal de localização nuclear, particularly bem adequada para alvejar proteínas residentes no soma e o núcleo. Surpreendentemente, quando se aplica Chariot às culturas de hipocampo primários, o reagente acabou por ser surpreendentemente bem aceite pelos neurônios dissociados.

Introduction

Um controlo rigoroso da expressão da proteína é essencial para todos os organismos vivos para comandar o seu desenvolvimento, bem como para reagir a sinais ambientais. Assim, uma multiplicidade de mecanismos foi inventado durante a evolução para regular com precisão o nível de cada proteína codificada pela aplicação expressão. 20000 genes existentes em qualquer célula eucariótica, em determinado momento da sua vida. Levando-se em diferentes fases da produção de proteína, os mecanismos reguladores variar desde a administração da estrutura da cromatina, a transcrição de ARN e de manuseamento à direcção de modificações pós-tradução de proteínas, o transporte e a degradação.

Portanto, não é surpreendente que disfunções no máquinas moleculares e níveis de expressão de proteína alterada subjacente têm sido associados a diversas doenças como o cancro ou deficiência intelectual. Na verdade, olhando para a complexidade excepcional do desenvolvimento neuronal e função do cérebro dos mamíferos, a sensidade desses sistemas sofisticados para alterações na expressão da proteína se manifesta em vários déficits intelectuais bem conhecidos, incluindo Alzheimer e doença de Parkinson (AD e PD), bem como distúrbios do espectro do autismo (ASD) como a Síndrome do X Frágil (FXS). A última doença é caracterizada por uma extensa misexpression de uma variedade de proteínas, o que é devido à perda de uma única regulação de tradução de proteínas, FMRP (Frágil Proteína retardo mental X) 1-4. Proteína Além disso, rearranjos cromossômicos que afetam a carga variável x ligada A (VCXA), uma proteína, que gere a estabilidade do mRNA e tradução modificando mRNA tampando 5, recentemente têm sido associados com déficits intelectuais, enquanto que mutações pontuais não foram identificados em pacientes com deficiências cognitivas a partir de agora 6, 7, sugerindo que as deficiências mentais observados são originários de expressão VCXA alterado e expressão desregulada de sua prote-alvoins. Em linha com esses achados, um estudo investigando se de novo no número de cópias variações de genes estão associados com ASD estabelecido que os novos duplicação gênica e supressões são um fator de risco significativo para ASD 8, apoiando assim a ideia de que os níveis de expressão de proteína elevadas ou diminuídas pode causar déficits intelectuais.

Notavelmente, a investigação recente fornecido mais provas de que o nível de um dado expressão de proteína é ajustada precisamente para impedir a sua agregação como consequência de quantidades elevadas de proteína, com quase sem margens de segurança 9. Por conseguinte, tem sido proposto que mesmo pequenos incrementos são suficientes para induzir doenças, tais como a DA e DP 9. Embora a variedade de máquinas moleculares que contribuem para controlar a expressão de proteínas sugere um regime de regulação complexa à luz destes resultados, um estudo investigando o nível de mais de 5.000 genes 10 de mamíferos expressão demonstrou quenatureza preferido um esquema mais parcimoniosa: A abundância celular de proteínas mostrou-se predominantemente regulada a nível da tradução 10, ilustrando assim que a gestão da disponibilidade RNA serve principalmente para afinar a expressão da proteína.

O estudo da dose de proteínas de interesse (POIs) é, por conseguinte, não é apenas importante para a compreensão das funções endógenos de uma proteína, mas também para a investigação de muitas doenças e o desenvolvimento de terapias. Assim, as últimas décadas viram o avanço de várias estratégias com RNA de interferência para manipular dosagem POI. Apesar de interferência de RNA é amplamente utilizado para estudar a função da proteína e é mesmo a ser aplicada em ensaios clínicos para o tratamento do cancro ou oculares doenças, bem como para perseguir terapias antivirais em pacientes 11-13, algumas dificuldades podem surgir o que pode tornar a estratégia impossível. Por exemplo, a sequência de semente, que acciona o knockdown por homologia é COMPARAefeitos a curto, daí que promovem off-alvo ble. Desde sequências altamente eficientes são raras e devem ser encontrados entre milhares de opções (revisto em 14), identificando a seqüência correta pode ser demorado e caro, mas os resultados ainda podem ser decepcionante.

Uma estratégia alternativa é alvejar diretamente o POI por anticorpos. Aqui, ilustramos a utilização da Carruagem transportador de proteína (fabricado pelo Active Motif) para reduzir a disponibilidade de proteína celular, e o emprego de reconstruções tridimensionais para estudar a função da proteína seguinte knock-down.

O motivo de activa Carruagem, ele próprio um péptido de 2,8 kDa, é utilizado para os péptidos de transporte, proteínas e anticorpos através das membranas de células de mamífero 15. Os associados de peptídeos com POIs através da formação não-ligado de forma covalente complexos macromoleculares utilizando interações hidrofóbicas, quando então complexos Chariot-POI são internalizados em células em uma endosome-indforma ependent. Importante, Carruagem foi indicado para não afectar a localização intracelular de proteínas Transportado, nem de exercer efeitos citotóxicos ou para afectar a actividade biológica da sua carga 15.

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Protocol

1. Soluções de Stock

  1. Ressuspender o pó motivo activo liofilizado estéril em H 2 O para uma concentração final de 2 ug / uL. Toque cuidadosamente para misturar.
  2. Prepare pequenas alíquotas (por exemplo, 12 ul de cada, 2 ul são necessários por reacção) e armazená-las a -20 ° C.

2. Preparação de células

  1. células de mamíferos, tais como células de sementes HEK293 ou neurónios primários sobre um meio de crescimento de placa de 24 poços em 500 ul incluindo antibióticos.
    NOTA: Ao usar os neurônios, semear as células em baixa densidade e usar apenas as duas linhas do meio da placa de 24 poços. Cada poço terá assim uma contrapartida vazio para abrigar o meio durante a incubação (passo 4.2). Ao manusear os neurônios, sempre se certificar de que as células não são mantidos fora da incubadora por mais de alguns minutos.
  2. Cultura das células em condições adequadas (humidificada, 5% de CO 2 e 37 ° C) até que as células são app. 50%confluente.
    NOTA: Ao usar os neurônios, a cultura das células até à fase de desenvolvimento desejado seja atingido e alterar app. 25-50% do meio duas vezes por semana. Meio: meio Neurobasal (1x contendo B27, 5 mM de L-glutamina e penicilina e estreptomicina 1x; comparar com a ref 16).

3. Chariot Formação Complex

  1. Por reacção, dilui-se 0,1-2 ug do PI ou o anticorpo correspondente, bem como a proteína de controlo, ou o anticorpo de controlo, respectivamente, em 50 ul de PBS.
    NOTA: A técnica também funciona com complexos macromoleculares que consiste de anticorpos primários e secundários pré-ligado (cp 'Resultados' representativos, Figura 1.). Misture e rotação.
  2. Para cada amostra, dilui-se 2 ul de solução de estoque Carruagem em 50 ul de PBS utilizando tubos separados, a fim de evitar a auto-associação da carruagem. Misture e rotação.
  3. Transferir o POI ou anticorpo (passo 3.1) diluído para a diluição Chariot por pipetating. Misture e rotação.
  4. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente (complexos Carruagem-POI vai formar).

4. Transfecção de células

  1. Dilui-se a complexos de Carruagem (passo 3.4) em 100 ul de meio de crescimento pré-aquecido (37 ° C, sem qualquer aditivo). Remover o meio e lava-se as células uma vez que utilizam pré-aquecido PBS 1x.
    NOTA: Ao usar os neurônios, não descarte o meio, ele será reutilizado. Mantê-la a 37 ° C. Para a lavagem, utilizar PBS contendo 0,5 mM de MgCl 2 e CaCl 2.
    Sugestão: manter o meio em poços vazios enquanto incubando a placa (passo 4.5).
  2. Aplicar a solução de complexo de Carruagem (passo 4.1) para as células e agitar suavemente as células para assegurar uma distribuição uniforme da solução. Cresça as células em condições padrão (Passo 2.2), durante 1 h. Adicionar a uma concentração sérica final de 10%. Ao usar os neurônios, adicionar a forma do passo 4.1. Crescer as células durante 1 a 2 horas mais.
    Note otempo de incubação óptimo depende do tamanho e propriedades da carga e podem ter de ser ajustadas empiricamente. As seguintes sugestões podem servir como orientação: Para os péptidos, de 1 hora é geralmente suficiente, para as proteínas de 02/01 h são recomendados, para anticorpos de duas horas, e para a transfecção de neurónios com anticorpos de 4 h.
  3. células de processo para a análise, como de costume. Por favor, note: a técnica é compatível com experimentos utilizando protocolos de fixação, bem como imagens ao vivo.

5. Imagiologia

  1. Usando um microscópio de varrimento laser, tomar-z pilhas de células e / ou compartimentos de células de interesse, utilizando, aproximadamente, 0,25-0,5 uM distância. A distância camada precisa depende do tamanho da estrutura a ser reconstruída e deve ser determinada individualmente.

6. Reconstrução

  1. Nas etapas a seguir, use o fundo Esc para alternar entre seleccionar e navegar, Cntr para selecionar vários objetos, clicando on eles e tecla shift para cortar objetos (cp. passo 6.10).
  2. Abra o arquivo lsm em Imaris.
  3. Usando o ajuste de exibição para cada canal, contrastar a imagem até que as estruturas mais brilhantes atingir a saturação. Por favor note que este ajustamento não vai influenciar a construção de superfície, serve apenas para auxiliar o pesquisador em limiarizar a imagem.
  4. Clique no ícone Adicionar novas superfícies. Um assistente será aberta.
  5. Selecione: Segmento apenas uma região de interesse. Vá para a próxima etapa.
  6. Ajustar as margens da caixa de seleção para ajustar seu objeto de interesse. Por favor, tenha em mente que a imagem tem 3 dimensões e que a seleção precisa ser ajustado no plano z também. Se a forma rectangular da caixa de seleção não deve coincidir com o objeto de interesse corretamente, desligue o objeto e / ou ampliar a caixa até que todas as estruturas necessárias estão embutidos. objetos indesejados podem ser removidos mais tarde (cp. passo 6.10). Proceder.
  7. Selecione o ch apropriadaannel. O nível de detalhe da área de superfície ou diâmetro da esfera deve ser definido para coincidir com as estruturas sendo reconstruído. Dependendo das características de sinal, pode ser usado tanto intensidade absoluta ou de contraste local. Geralmente, Contraste local funciona melhor para sinais difusos. Em qualquer caso, as configurações necessitam de ser ajustadas separadamente para cada sinal ou estrutura de interesse, respectivamente.
  8. Usando a ferramenta de Thresholding, reconstruir a estrutura de interesse.
  9. Completar a reconstrução clicando na parte inferior seta verde.
  10. Ajuste o objeto ainda mais usando a ferramenta de lápis para cortar e remover superfícies, conforme necessário. Só é possível cortar no sentido norte-sul, portanto, inclinar a imagem, a fim de cortar o objeto desejado.
  11. Obter medições de volume, área e intensidades para cada superfície, selecionando Estatística, Estatísticas detalhadas e valores médios.
  12. (Etapa opcional) Para observar estatísticas codificadas por cores (cp. Figura 2E F), selecione a guia cor da superfície correspondente e marcar 'Estatística Coded' em vez de 'base'. Várias opções serão exibidas.

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Representative Results

Nos parágrafos seguintes, os resultados exemplares que ilustram um knockdown funcional de um POI (Simiate, para mais pormenores, ver 16, 17) utilizando o reagente Chariot e da interferência de anticorpos são apresentados. Os resultados demonstram que a expressão diminuída de Simiate prejudica a actividade de transcrição, e, de um modo dependente de dosagem, induz a apoptose, culminando nas taxas de mortalidade de mais de 99% se forem aplicadas quantidades de anticorpos mais elevados (> 1? G de anticorpo) (estas descobertas foram publicados anteriormente em 16). Aqui, nós agora apresentar as técnicas e protocolos empregues em detalhe e, além disso, demonstram como reagente Carruagem pode ser utilizado para transfectar neurónios do hipocampo em culturas primárias dissociadas.

A fim de investigar se os péptidos Carruagem permitir um vaivém eficiente de anticorpos e, em particular, se estes anticorpos permanecem funcionais durante o procedimento, que expressa FLAG-Simiate Durante 24 horas em células HEK293, e subsequentemente transfectado nas células utilizando Carruagem acoplado macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figura 1). O constructo FLAG-Simiate é bem expressa por células HEK293 e localiza no somata, bem como os núcleos destas células (Figura 1A). Aqui, FLAG-Simiate aglomerados significativamente (Figura 1B), reflectindo assim a distribuição salpicado de Simiate endógena no núcleo.

Os complexos anticorpo Transportado através da membrana celular aparecem em assemblages (Figura 1A, em vermelho setas, vermelho), mas os anticorpos liberados detectar FLAG-Simiate especificamente, como mostrado por uma profunda co-localização das macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 FLAG-Simiate e (Figura 1B , na seta amarela, amarelo). A partir de nota, o experimento não só demonstra que os anticorpos permanecem funcionais durante uma Chariot Mediadapassagem da membrana, mas que também são capazes de entrar no núcleo. Uma vez que o seu tamanho exclui anticorpos de iniciarem o núcleo através de difusão, é provável que o sinal de localização nuclear presente no próprio Carruagem facilita a translocação de macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 para o núcleo. De facto, os conjuntos de anticorpos também são observados em ou em, respectivamente, no compartimento nuclear (Figura 1B, setas vermelhas).

Usando rbαSimiate-Chariot complexos para esgotar funcionalmente Simiate endógeno em células HEK293 (Figura 2), descobrimos que fomos capazes de atingir até 80% dos sítios de ligação rbαSimiate, usando 2,0 mg de anticorpos 16. Curiosamente, enquanto que os anticorpos de vaivém gtαrbAlexa568 sozinho em células HEK 293 não teve nenhum efeito óbvio sobre a aparência de salpicos nucleares (Figura 2A-C), perda de Simiate funcional arredondados salpicos nucleares (Figura 2D-F </ forte>, CP. 16) tal como ilustrado por reconstruções tridimensionais (Figura 2B, C vs E, F) e, de uma forma dependente da dose, a apoptose induzida (Figura 3, CP. 16).

Dado que as células neuronais são muito sensíveis aos efeitos tóxicos, que também aplicada a técnica em culturas primárias de hipocampo (Figura 4). Usando ensaio TUNEL e coloração MAP2 para analisar a integridade celular, encontramos nenhum efeito sobre a viabilidade dos neurônios quando se comparam as células simuladas ou não tratados e tratados Chariot (app. Células positivas TUNEL 20-25% após 1 + 4 horas de tratamento, cp 4.4. -4,6). Assim, testou-se anticorpo mediada Carruagem de vaivém em culturas neuronais. Seguindo o mesmo regime de aplicação, gtαgpAlexa568 conjuntos de anticorpos foram observadas em diferentes estende-se em cerca de 83% das células, onde ocorreram em somata, bem como os núcleos (Figura 5A). Estas observações são ainda apoiada bya análise tridimensional (Figura 5B) e intimamente remontar a imagem vista em células HEK293, em conjunto ilustrando assim que a técnica Carruagem pode ser utilizado com sucesso para transfectar dissociado neurónios do hipocampo primários.

figura 1
Figura 1. FLAG-Simiate é detectado por anticorpos específicos Simiate transportados para as células HEK293 utilizando o reagente Carruagem. Para as experiências de interferência de anticorpos, anticorpos rbSimiate-gtrbAlexa568 foram pré-montados antes da formação do complexo anticorpo-Carruagem. A) HEK293 células que expressam Simiate marcado com FLAG. assemblages de anticorpos Simiate entrar na soma, bem como o núcleo após a aplicação, onde colocalize especificamente com FLAG-Simiate. pontos redondos: assemblages Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 (setas vermelhas). B) A ampliação de alta potência da região encaixotadoem (A) ilustra a co-localização de FLAG-Simiate e Chariot mediada sinal Simiate (setas amarelas). Por favor, note a presença de um conjunto de anticorpos Chariot no núcleo (seta vermelha). Barra de escala: 10 ^ m.

Figura 2
Figura 2. anticorpos específicos Simiate-Transportado em células HEK293 interferir com as funções celulares do Simiate endógena. A, B) HEK293 células tratadas com Carruagem-gtrbAlexa568 (1 ug), servem como controlo. Em vermelho, endógena Simiate é mostrado na cor falsa, enquanto assemblages Chariot-gtrbAlexa568 não são exibidos. salpicos nucleares foram marcadas usando o SC35 proteína marcadora (em verde), enquanto que as células em apoptose foram identificados pelo ensaio de TUNEL (em azul). B) Reconstrução das manchas nucleares da região encaixotado em A. C) Reconstrução da mesma região que ilustram volumes salpico e áreas de superfíciede uma maneira codificada a cores. D, E) HEK293 células após o tratamento Carruagem-rbSimiate (0,5 ug). Endógena Simiate, bem como Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblages são mostrados em vermelho, enquanto os salpicos nucleares e células em apoptose são exibidos de acordo com A e B. E) speckles Nucleares reconstruídos a partir da região encaixotado D. F) A mesma região é mostrado como delineado para C. por favor, note a aparência arredondada e agregação de manchas (todas as reconstruções: software Imaris). A barra de escala em C, F: 2 uM. Todas as outras barras de escala: 10 ^ m. 1) Para a reconstrução tridimensional, foram usadas apenas as células não apoptóticas.

Figura 3
Figura 3. As doses elevadas de chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 induzir a morte celular massiva. HEK293 células foram tratadas com 2 ug de chariot-gtrbAlexa568 ou chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568, respectivamente (ambos comp lexes mostrados em verde e indicadas pelas setas, bem como ampliações). rotulagem de TUNEL (em azul) foi aplicado para identificar células apoptóticas. Barra de escala: 10 ^ m.

Figura 4
Figura 4. Carruagem não é tóxico para os neurónios do hipocampo primárias. AB) 7 DIV neurónios eram ou simulada tratados (médio, A) ou submetidos a Carruagem reagente (B) como descrito no protocolo para o anticorpo de vaivém (1 + 4 horas, CP. 4,4-4,6). Embora a SC-35, uma proteína marcadora para salpicos nucleares, serviu para identificar a maquinaria de transcrição e de splicing, coloração TUNEL foi aplicado para identificar células apoptóticas (setas verdes). C) Se não for tratada e Chariot tratada DIV 16/17 neurônios. MAP2 coloração foi aplicado para visualizar as árvores dendriticas. Barras de escala: 10 pm.

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Figura 5. Chariot transfecção mediada é compatível com culturas neuronais. A) Um neurônio hipocampo principal representante da div 5. A imagem mostra z-projeções de pilhas tomadas usando um microscópio de varredura a laser (Laser Scanning Microscope 710, Zeiss). Barra de escala: 10 ^ m. Por favor, note a ocorrência de complexos Chariot-gtgpAlexa568 (vermelho) no núcleo ea soma da célula. B) A reconstrução tridimensional (softwares Imaris) do núcleo, bem como montagens gtgpAlexa568 mostrado em A. Soma e dendrites do neurónio são indicadas por pontos cinzentos, que são destilados a partir de rotulagem de Simiate endógena. Barra de escala: 10 ^ m. quantidade de anticorpo transfectadas: 0,25 ug.

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Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o significado dos níveis de expressão de proteína em controlar funções celulares de uma forma orientada dose. O protocolo descrito permite uma manipulação de ajuste entre a expressão da proteína em diferentes tipos de células de mamíferos, incluindo os neurónios do hipocampo, facilitando assim estudos detalhados da função da proteína sobre o nível celular.

Apesar de interferência de RNA representa uma estratégia bem conhecida para regular POIs, ele tem suas desvantagens (cp. 14). Não só a identificação de uma sequência altamente específica e eficiente pode ser dispendiosa e consumidora de tempo, mas também biogénese transcrição no interior da célula pode causar resultados imprevisíveis uma vez que a acumulação de construções de ARN tóxicos, uma sobrecarga das máquinas de exportação nuclear, bem como uma saturação do ARNi endógena sistemas de processamento pode resultar em efeitos fora do alvo ou ineficiência. Além disso, quantidades elevadas de vectores exógenos podem induzir RNAi UNSefeitos ESPECÍFICAS também, e perturbar a homeostase celular.

Os anticorpos, por outro lado, não necessitam de mais processamento pelos mecanismos endógenos, uma vez que tenham entrado na célula, e são eficazes imediatamente, suportando, assim, não apenas a experimentação de economia de tempo, mas também investigações de processos celulares imediatas. Embora possam ter efeitos fora do alvo inespecíficos, também, o aumento do número de anticorpos bem caracterizados e altamente específicas disponíveis torna esta alternativa vale um pensamento. Uma vez que a entrega de complexos macromoleculares em células representa um obstáculo importante, técnicas de transfecção diferentes têm sido desenvolvidos nos últimos anos, incluindo os péptidos azoR8 R8 e 18, bem como 19 microesfera vaivém mediada. Enquanto R8 e azoR8 foram indicados para um comportamento semelhante ao Carruagem 18, as microesferas foram encontrados para exigir 24 horas de absorção 19, que é consideravelmente mais longa do que mem Carruagem mediadapassagens brana e pode causar dificuldades quando se estuda mais rápido e respostas celulares dependentes da dose.

Notavelmente, a técnica Carruagem acabou por ser aplicável a culturas de hipocampo primárias, que são muito sensíveis aos tratamentos e difíceis de transfectar. Até agora, os transportadores Carruagem foram usados ​​para analisar a função da proteína em culturas de osteoblastos primários 20, bem como na linha celular de neuroblastoma-glioma NG108-15 21, pintainho gânglios da raiz dorsal culturas 21, ou em células PC12 22, que se originam a partir do neural crista, mas não há relatos de qualquer aplicação em culturas de células derivadas a partir do sistema nervoso central estão ainda disponíveis. Desde reagentes de transfecção tradicionais, tais como Lipofectamina são ineficientes nestas células e transfections virais intrincados, Chariot pode representar uma alternativa interessante.

Notavelmente, em si Carruagem foi observada para localizar para o núcleo 15, provavelmentedevido à sua PKKKRKV sinal de localização nuclear (cp. 23). Em linha com estas observações, descobrimos que Chariot transfecção mediada por macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 resultou em uma rotulagem clara dos compartimentos nucleares, tais como manchas nucleares. De facto, os anticorpos de controlo, tais como gtαgpAlexa568 também foram detectados no núcleo de ambos, HEK293 e células primárias de hipocampo. Uma vez que os anticorpos, em especial em montagens, é demasiado grande para embarque no núcleo através de difusão e uma vez que em si Simiate não contém qualquer sinal de localização nuclear conhecida, mas sim entra no núcleo através de difusão, é provável que o sinal de Carruagem está envolvido na localização nuclear de anticorpos. Alternativamente, um transporte em conjuntos maiores de proteína podem também ser possível, embora isso não poderia explicar a presença de gtαgpAlexa568 no núcleo de neurónios do hipocampo em cultura a partir de ratos, como não existe qualquer alvo para este anticorpo nestas células. Além disso, SINCE Carruagem foi encontrado que não interfira com a localização natural de péptidos e proteínas 15 Transportado, estas observações sugerem que os anticorpos se comportam de maneira diferente.

Na verdade, quando transportando complexos anticorpo como Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figura 1) ou Chariot-gtαgpAlexa568 (Figura 5) através das membranas celulares, eles aparecem em grupos, o que só se dissolvem, quando as proteínas-alvo adequadas, tais como Simiate endógena ou FLAG-Simiate estão presentes (apenas na Figura 1). Usando Chariot complexos anticorpo em osteoblastos, Selim e faculdades observado o mesmo efeito 20. Dado que Carruagem foi demonstrada a não interferir com a localização de proteínas e péptidos 15, estas observações indicam que Carruagem montados anticorpos desmontar apenas se existe um mecanismo molecular, tal como uma interacção anticorpo-alvo, que supera a inter hidrofóbicoacções entre Carruagem e da sua carga de anticorpo e, deste modo, estimula a desmontagem. Uma vez que os anticorpos são mais pesados ​​do que os péptidos ou a maioria das outras proteínas e têm, devido à sua forma, uma grande superfície, que podem associar-se com um maior número de moléculas de Carruagem e / ou interagir de forma mais firme com péptidos carro, o que, assim, promover um mais Carruagem-driven comportamento de anticorpos. A falta de um mecanismo de desmontagem, por conseguinte, resultar em uma aparência e um conjunto de unidades de localização nuclear da carga de anticorpo (Figura 5).

Tomados em conjunto, os dados mostram que Carruagem é particularmente bem adequada para tratar a função de proteínas residentes no núcleo e que é aplicável numa variedade de tipos de células de mamíferos, incluindo neurónios do hipocampo primárias.

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Acknowledgements

O trabalho apresentado foi suportado em partes por financiamentos do Canadian Institutes of Health Research / X frágil Fundação de Pesquisa do Canadá programa de parceria para RD, a Lejeune Fundação Jerome para RD, a Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung da Universidade Erlangen-Nuremberg a RD e do Deutsche Forschungsgemeinschaft para RD e RE. Os autores agradecem a Ingrid Zenger de assistência técnica com a manutenção de cultura de células, bem como Prof. M. Wegner para fazer um vetor pCMV5-FLAG disponível. Os autores desejam mais para agradecer particularmente Nadja Schroeder para a sustentação útil na gravação de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

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References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

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