Etudier la fonction des protéines et le rôle de Altered Expression des protéines par les interférences des anticorps et des reconstructions tridimensionnelles

1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg
Published 4/21/2016
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Bioengineering

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Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

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Abstract

Une gestion rigoureuse de l'expression protéique est non seulement essentiel pour tout organisme vivant, mais aussi une stratégie importante pour étudier les fonctions des protéines dans des modèles cellulaires. Par conséquent, la recherche récente a inventé des outils différents pour cibler l'expression de protéines dans des lignées de cellules de mammifère ou même des modèles animaux, y compris l'ARN et l'interférence d'anticorps. Alors que la première stratégie a recueilli beaucoup d'attention au cours des deux dernières décennies, les peptides médiatrices une translocation de cargaisons d'anticorps à travers les membranes cellulaires et dans les cellules, obtenues beaucoup moins d'intérêt. Dans cette publication, nous fournissons un protocole détaillé comment utiliser un vecteur peptidique nommé Chariot à cellules rénales embryonnaires humaines, ainsi que dans les neurones hippocampiques primaires de réaliser des expériences d'interférence d'anticorps et illustrent en outre l'application des reconstructions tridimensionnelles dans l'analyse de la fonction des protéines. Nos résultats suggèrent que Chariot est, sans doute en raison de son signal de localisation nucléaire, particularly bien adapté à des protéines cibles résidant dans le soma et le noyau. Remarquablement, lors de l'application Chariot à des cultures hippocampiques primaires, le réactif est avéré être étonnamment bien accepté par les neurones dissociés.

Introduction

Un contrôle strict de l'expression des protéines est essentiel pour tous les organismes vivants pour commander son propre développement ainsi que de réagir à des signaux environnementaux. Par conséquent, une multitude de mécanismes a été inventé au cours de l'évolution pour réguler avec précision le niveau de chaque protéine codée par l'application d'expression. 20.000 gènes existants dans une cellule eucaryote à un moment donné de sa vie. Prenant place à différents stades de la production de protéines, des mécanismes de régulation vont de la gestion de la structure de la chromatine, la transcription et l'ARN manipulation à la direction des modifications post-traductionnelles des protéines, du transport et de la dégradation.

Il est donc pas surprenant que des dysfonctionnements dans le sous-jacent mécanismes moléculaires et les niveaux d'expression de protéines modifiées ont été associées à diverses maladies comme le cancer ou une déficience intellectuelle. En effet, en regardant la complexité exceptionnelle de développement neuronal et la fonction cérébrale chez les mammifères, la sensitivité de ces systèmes sophistiqués à des altérations de l'expression de la protéine se manifeste dans plusieurs déficits intellectuels bien connus, y compris la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson (AD et PD), ainsi que des troubles du spectre autistique (TSA) comme le syndrome du X fragile (FXS). Cette dernière maladie est caractérisée par une mauvaise expression d'une large variété de protéines, qui est due à la perte de la régulation de la traduction d' une seule protéine, FMRP (Fragile X Protéines arriération mentale) 1-4. En outre, des réarrangements chromosomiques affectant la charge variable liée à l' X protéine A (VCXA), une protéine, qui gère la stabilité de l' ARNm et la traduction en modifiant l' ARNm de coiffage 5, ont récemment été associée à des déficits intellectuels, alors que des mutations ponctuelles ne sont pas identifiés chez les patients ayant une déficience cognitive dès maintenant 6, 7, ce qui suggère que les déficiences mentales observées proviennent de l' expression VCXA altérée et l' expression dérégulée de son prote cibleins. Conformément à ces résultats, une étude enquête pour déterminer si de novo du nombre de copies des variations de gènes sont associés à ASD a établi que les nouveaux duplications de gènes et les suppressions sont un facteur de risque important pour les TSA 8, soutenant ainsi l'idée que les niveaux d'expression de protéines élevés ou diminués peuvent causer déficits intellectuels.

De manière remarquable, la recherche récente a fourni une preuve supplémentaire que le niveau d'une protéine donnée d'expression est réglée avec précision pour empêcher son agrégation en raison des quantités élevées de protéines presque sans marges de sécurité 9. Il a donc été proposé que même de faibles augmentations sont suffisantes pour induire des maladies telles que la MA et MP 9. Bien que la variété des mécanismes moléculaires contribuant à la maîtrise de l' expression des protéines suggère un système de régulation complexe à la lumière de ces résultats, une étude sur le niveau de plus de 5000 gènes de mammifères 10 d'expression a démontré quela nature a préféré un système plus parcimonieuse: L'abondance cellulaire des protéines a été montré pour être principalement réglementé au niveau de la traduction 10, illustrant ainsi que la gestion de la disponibilité de l' ARN sert principalement à affiner l' expression des protéines.

L'étude de la dose de protéines d'intérêt (POI) est donc non seulement important pour la compréhension des fonctions endogènes d'une protéine, mais aussi à l'enquête de nombreuses maladies et le développement de thérapies. Ainsi, les dernières décennies ont vu l'avance de plusieurs stratégies en utilisant l'interférence ARN pour manipuler le dosage de POI. Bien que l' interférence ARN est largement utilisé pour étudier la fonction des protéines et est même appliquée dans les essais cliniques pour traiter les maladies cancéreuses ou oculaires ainsi que de poursuivre les traitements antiviraux chez les patients 11-13, certaines difficultés peuvent surgir qui pourrait rendre la stratégie impossible. Par exemple, la séquence d'amorçage, qui entraîne l'effet de choc par homologie est comparaeffets à court, donc la promotion hors-cible ble. Depuis des séquences hautement efficaces sont rares et doivent être trouvées parmi des milliers d'options (revue dans 14), l' identification de la bonne séquence peut prendre beaucoup de temps et coûteux, mais les résultats peuvent encore être décevants.

Une autre stratégie consiste à cibler directement le POI par des anticorps. Ici, nous illustrons l'utilisation du Chariot de support protéique (fabriqué par Active Motif) pour réduire la disponibilité des protéines cellulaires, et l'emploi des reconstructions en trois dimensions pour étudier la fonction de la protéine suivante knock-down.

Le motif actif de Charlot, elle - même un peptide de 2,8 kDa, on utilise des peptides de navette, des protéines et des anticorps à travers les membranes des cellules de mammifères 15. Les associés de peptides avec POIs en formant de manière non covalente couplé complexes macromoléculaires utilisant des interactions hydrophobes, après quoi les complexes Chariot-POI sont internalisés dans les cellules dans un endosome-indmanière ependent. Surtout, Charlot a été indiqué ni affecter la localisation intracellulaire des protéines de la navette, ni d'exercer des effets cytotoxiques ou pour affecter l'activité biologique de la cargaison 15.

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Protocol

1. Solutions mères

  1. Remettre en suspension la poudre de motif actif lyophilisé dans H 2 O stérile jusqu'à une concentration finale de 2 ug / ul. Appuyez soigneusement pour mélanger.
  2. Préparer les petites aliquotes (par exemple, 12 ul chacune, 2 ul sont nécessaires par réaction) et les stocker à -20 ° C.

2. Préparation de cellules

  1. Semence des cellules de mammifères telles que des cellules HEK293 ou des neurones primaires sur un milieu de croissance plaque à 24 puits dans 500 ul y compris les antibiotiques.
    REMARQUE: Lorsque vous utilisez les neurones, ensemencer les cellules à faible densité et utiliser uniquement les deux rangées du milieu de la plaque de 24 puits. Chaque puits aura donc une contrepartie vide pour abriter le milieu pendant l'incubation (étape 4.2). Lors de la manipulation des neurones, assurez-vous toujours que les cellules ne sont pas conservés à l'extérieur de l'incubateur pendant plus de quelques minutes.
  2. Cultiver les cellules dans des conditions appropriées (humidifiés, 5% de CO 2 et 37 ° C) jusqu'à ce que les cellules sont appli. 50%confluent.
    REMARQUE: Lorsque vous utilisez les neurones, la culture des cellules jusqu'à ce que le stade de développement souhaité est atteint et changer app. 25 à 50% du milieu deux fois par semaine. Medium: milieu Neurobasal (contenant 1x B27, 5 mM de L-glutamine et 1x Pénicilline et streptomycine; comparer avec ref 16).

3. Chariot complexe Formation

  1. Par réaction, on dilue 0,1-2 ug du point d'intérêt ou de l'anticorps correspondant, ainsi que la protéine de contrôle ou d'un anticorps témoin, respectivement, dans 50 ul de PBS.
    NOTE: La technique fonctionne également avec des complexes macromoléculaires comprenant des anticorps primaires et secondaires pré-lié (cp 'Résultats représentatives, de la figure 1.). Mélanger et de spin.
  2. Pour chaque échantillon, diluer 2 pl Chariot solution mère dans 50 pi de PBS en utilisant des tubes séparés afin d'éviter l'auto-association de Chariot. Mélanger et de spin.
  3. Transférer le POI ou de l'anticorps (étape 3.1) diluée à la dilution Chariot par pipetteting. Mélanger et de spin.
  4. Incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante (complexes Chariot-POI formeront).

4. Transfection de cellules

  1. Diluer les complexes Chariot (étape 3.4) dans 100 ul de milieu de croissance préchauffé (37 ° C, sans additifs). Retirer le milieu et laver les cellules une fois à l'aide de pré-chauffé 1x PBS.
    REMARQUE: Lorsque vous utilisez les neurones, ne jetez pas le moyen, il sera réutilisé. Gardez-le à 37 ° C. Pour le lavage, utiliser du PBS contenant mM MgCl2 et CaCl2 0,5.
    Suggestion: maintenir le milieu dans les puits vides pendant l'incubation de la plaque (étape 4.5).
  2. Appliquer la solution complexe Chariot (étape 4.1) aux cellules et basculer les cellules doucement pour assurer une distribution uniforme de la solution. Cultiver les cellules dans des conditions standard (étape 2.2) pendant 1 heure. Ajouter du sérum à une concentration finale de 10%. Lors de l'utilisation des neurones, ajouter le milieu de l'étape 4.1. Cultiver les cellules pendant 1 à 2 heures de plus.
    Noter lala durée d'incubation optimale dépend de la taille et les propriétés de la cargaison et il peut être nécessaire d'ajuster de manière empirique. Les suggestions suivantes peuvent servir de guide: Pour les peptides, 1 h est généralement suffisante, pour les protéines sont recommandées 1-2 h, pour les anticorps 2 heures, et pour la transfection de neurones avec des anticorps 4 h.
  3. cellules de processus d'analyse, comme d'habitude. S'il vous plaît noter: la technique est compatible avec des expériences en utilisant des protocoles de fixation ainsi que l'imagerie en direct.

5. Imaging

  1. L'utilisation d'un microscope à balayage laser, prenez z-piles de cellules et / ou des compartiments cellulaires d'intérêt à l'aide d'environ 0,25-0,5 um de distance. La distance de la couche dépend de la taille de la structure à reconstruire et doit être déterminée individuellement.

6. Reconstruction

  1. Dans les étapes suivantes, utilisez le fond Echap pour basculer entre Sélectionner et Navigate, Cntr pour sélectionner plusieurs objets en cliquant on eux et touche shift pour couper des objets (cp. étape 6.10).
  2. Ouvrez le LSM-fichier dans Imaris.
  3. Utilisation du réglage de l'affichage pour chaque canal, contraster l'image jusqu'à ce que les structures les plus brillants atteignent la saturation. S'il vous plaît noter que cet ajustement ne sera pas influer sur la construction de la surface, il ne sert à aider l'expérimentateur dans seuillage l'image.
  4. Cliquez sur l'icône Ajouter de nouvelles surfaces. Un assistant ouvrira.
  5. Sélectionnez: Segment seulement une région d'intérêt. Passez à l'étape suivante.
  6. Ajustez les marges de la boîte de sélection pour adapter votre objet d'intérêt. S'il vous plaît garder à l'esprit que l'image a 3 dimensions et que la sélection doit être ajusté au plan z ainsi. Si la forme rectangulaire de la boîte de sélection ne doit pas correspondre à l'objet d'intérêt correctement, mettez l'objet et / ou agrandir la boîte jusqu'à ce que toutes les structures nécessaires sont intégrées. objets indésirables peuvent être enlevés plus tard (cp. étape 6.10). Procéder.
  7. Sélectionnez le ch appropriéannel. Le détail Surface Level ou le diamètre de la sphère devraient être fixés pour correspondre aux structures en cours de reconstruction. En fonction des caractéristiques du signal, soit l'intensité absolue ou le contraste local peuvent être utilisés. En général, le contraste local fonctionne mieux pour les signaux diffus. Dans tous les cas, les paramètres doivent être réglés séparément pour chaque signal ou une structure d'intérêt, respectivement.
  8. Utilisation de l'outil Thresholding, reconstruire la structure d'intérêt.
  9. Terminez la reconstruction en cliquant sur le fond de la flèche verte.
  10. Réglez l'autre objet en utilisant l'outil crayon pour couper et enlever les surfaces selon les besoins. Il est seulement possible de couper dans le sens nord-sud, donc, inclinez l'image afin de couper l'objet désiré.
  11. Obtenir des mesures de volume, surface et intensités pour chaque surface par Statistique sélection, statistiques détaillées et moyennes valeurs.
  12. (Étape optionnelle) Pour observer les statistiques de couleur (cp. Figure 2E F), sélectionnez l'onglet de couleur de la surface correspondante et marquer " La statistique Coded ' au lieu de' base '. Plusieurs options seront affichées.

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Representative Results

Dans les paragraphes suivants, des résultats exemplaires illustrant un effet de choc fonctionnel d'un POI (Simiate, pour plus de détails s'il vous plaît voir 16, 17) en utilisant le réactif de Chariot et l' interférence d'anticorps sont présentés. Les résultats démontrent que l'expression réduite de Simiate altère l'activité de la transcription, et, d'une manière dépendante de la dose, induit l'apoptose, aboutissant à des taux supérieurs à 99% de mortalité si des quantités d'anticorps plus élevés (> 1 ug d'anticorps) sont appliqués (ces découvertes ont été publiées précédemment 16). Ici, nous présentons maintenant les techniques et les protocoles utilisés en détail et en outre montrer comment réactif Chariot peut être utilisé pour transfecter les neurones hippocampiques dissociées dans des cultures primaires.

Afin de déterminer si les peptides de Chariot permettent une la navette efficace des anticorps et, en particulier, si ces anticorps restent fonctionnels pendant la procédure, nous avons exprimé FLAG-Simiate Pendant 24 heures dans des cellules HEK293, et ensuite transfecté les cellules en utilisant Chariot couplés macromolécules rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (figure 1). La construction FLAG-Simiate est bien exprimé par des cellules HEK293 et se localise dans le soma et les noyaux de ces cellules (figure 1A). Ici, les clusters FLAG-Simiate significative (figure 1B), reflétant ainsi la distribution mouchetée endogène Simiate dans le noyau.

Les complexes anticorps la navette à travers la membrane cellulaire apparaissent dans les assemblages (figure 1A, en rouge, flèches rouges), mais les anticorps libérés détectent FLAG-Simiate spécifiquement comme le montre une colocalisation profonde de FLAG-Simiate et les macromolécules rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (figure 1B , en jaune, flèche jaune). Comme la note, l'expérience démontre non seulement que les anticorps restent fonctionnels pendant une Chariot-Mediatedle passage de la membrane, mais ils sont également capables de pénétrer dans le noyau. Étant donné que la taille exclut les anticorps de se lancer dans le noyau par diffusion, il est probable que le signal de localisation nucléaire présente dans Chariot lui-même facilite la translocation de macromolécules rbαSimiate-gtαrbAlexa568 dans le noyau. En effet, les assemblages d' anticorps sont également observées au niveau ou dans, respectivement, le compartiment nucléaire (figure 1B, les flèches rouges).

Utilisation de rbαSimiate-Chariot complexes à épuiser fonctionnellement Simiate endogène dans les cellules HEK293 (Figure 2), nous avons constaté que nous étions en mesure de cibler jusqu'à 80% des sites de liaison rbαSimiate, en utilisant 2,0 pg d'anticorps 16. Fait intéressant, tandis que la navette anticorps gtαrbAlexa568 seul dans des cellules HEK 293 n'a eu aucun effet évident sur ​​l'apparition de mouchetures nucléaires (figure 2A-C), la perte de Simiate fonctionnelle limée mouchetures nucléaire (figure 2D-F </ strong>, cp. 16) comme illustré par les reconstructions en trois dimensions (figure 2B, C par rapport à E, F) et, d'une manière dépendante de la dose, l' apoptose induite (figure 3, cp. 16).

Étant donné que les cellules neuronales sont très sensibles aux effets toxiques, on a également appliqué la technique dans des cultures hippocampiques primaires (Figure 4). Utilisation de dosage TUNEL et MAP2 coloration pour analyser l'intégrité des cellules, nous avons trouvé aucun effet sur la viabilité des neurones lorsque l'on compare les cellules simulées ou non traitées et Chariot traité (app. Cellules positives 20-25% TUNEL après 1 + 4 heures de traitement, cp. 4.4 -4.6). Par conséquent, nous avons testé Chariot anticorps médiée navette dans les cultures neuronales. En suivant le même schéma d'application, gtαgpAlexa568 assemblages d'anticorps ont été observés à différents étend dans environ 83% des cellules, où ils se sont produits dans somata ainsi que les noyaux (figure 5A). Ces observations sont en outre pris en charge bya une analyse en trois dimensions (figure 5B) et étroitement réassembler l'image observée dans les cellules HEK293, en même temps , illustrant ainsi que la technique du char peut être utilisé avec succès pour transfecter dissocie les neurones hippocampiques primaires.

Figure 1
Figure 1. FLAG-Simiate est détectée par des anticorps spécifiques Simiate la navette dans les cellules HEK293 en utilisant le réactif Chariot. Pour les expériences d'interférence d'anticorps, des anticorps rbSimiate-gtrbAlexa568 ont été préassemblés avant la formation du complexe Chariot-anticorps. A) HEK293 cellules exprimant étiquetée FLAG Simiate. assemblages anticorps Simiate entrent dans le soma, ainsi que le noyau après l'application, où ils colocalisent spécifiquement avec FLAG-Simiate. dots rondes: assemblages Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 (flèches rouges). B) Une puissance de grossissement élevé de la région en boîte(A) illustrant la colocalisation de FLAG-Simiate et Chariot signaux Simiate médiée (flèches jaunes). S'il vous plaît noter la présence d'un anticorps assemblage Chariot dans le noyau (flèche rouge). Barre d'échelle: 10 um.

Figure 2
Figure 2. anticorps Simiate spécifiques la navette dans les cellules HEK293 interfèrent avec les fonctions cellulaires de endogène Simiate. A, B) HEK293 cellules traitées avec Chariot-gtrbAlexa568 (1 pg) servent de témoin. En rouge, endogène Simiate est montré dans la fausse couleur, tandis que les assemblages Chariot-gtrbAlexa568 ne sont pas affichés. mouchetures nucléaires ont été marquées à l'aide de la SC35 protéine marqueur (en vert), tandis que les cellules apoptotiques ont été identifiés par un test TUNEL (en bleu). B) Reconstruction de mouchetures nucléaires de la région encadrée dans A. C) Reconstruction de la même région illustrant les volumes de tavelures et les zones de surfaced'une manière codée en couleur. D, E) HEK293 cellules après le traitement Chariot-rbSimiate (0,5 pg). Endogène Simiate ainsi que Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblages apparaissent en rouge, tandis que les mouchetures nucléaires et les cellules apoptotiques sont affichées en fonction de A et B. E) mouchetures nucléaires reconstruites à partir de la région encadrée en D. F) La même région est présentée comme décrit pour C. S'il vous plaît noter l'apparition limée et l'agrégation des mouchetures (toutes les reconstructions: logiciel Imaris). La barre d'échelle en C, F: 2 pm. Tous les autres barres d'échelle: 10 um. 1) Pour la reconstruction tridimensionnelle, seules les cellules non apoptotiques ont été utilisées.

Figure 3
Figure 3. Des doses élevées de Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 induisent une mort cellulaire massive. HEK293 cellules ont été traitées avec 2 pg de Chariot-gtrbAlexa568 ou Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568, respectivement ( les deux comp Lexes en vert et indiquées par des flèches, ainsi que des grossissements). marquage TUNEL (en bleu) a été appliqué pour identifier les cellules apoptotiques. Barre d'échelle: 10 um.

Figure 4
Figure 4. Chariot est pas toxique pour les neurones hippocampiques primaires. AB) DIV 7 neurones étaient soit mock traités (moyen, A) ou soumis à un réactif Chariot (B) , comme indiqué dans le protocole pour l' anticorps navette (1 + 4 heures cp. 04.04 à 04.06). Alors que SC-35, une protéine de marqueur de mouchetures nucléaires, a servi à étiqueter la machinerie de transcription et de l'épissage, la coloration TUNEL a été appliquée pour identifier les cellules apoptotiques (flèches vertes). C) et non traitée Chariot traités DIV 16/17 neurones. MAP2 coloration a été appliquée pour visualiser les arbres dendritiques. Barres d'échelle: 10 um.

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Figure 5. Chariot transfection à médiation est compatible avec les cultures neuronales. A) Un neurone hippocampique primaire représentant de div 5. La photo montre z-projections de piles prises à l' aide d' un microscope à balayage laser (microscope à balayage laser 710, Zeiss). Barre d'échelle: 10 um. S'il vous plaît noter la présence de complexes Chariot-gtgpAlexa568 (rouge) dans le noyau et le soma de la cellule. B) la reconstruction en trois dimensions (logiciel Imaris) du noyau ainsi que des assemblages gtgpAlexa568 indiqué dans A. Soma et dendrites du neurone sont indiqués par des points gris, qui sont distillés à l'étiquetage endogène Simiate. Barre d'échelle: 10 um. quantité d'anticorps transfectées: 0,25 pg.

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Discussion

Ici, nous présentons un protocole visant à étudier l'importance des niveaux d'expression de la protéine dans le contrôle des fonctions cellulaires d'une manière dose entraînée. Le protocole décrit permet une manipulation fine de l'expression des protéines dans divers types de cellules de mammifères, y compris les neurones hippocampiques, facilitant ainsi des études détaillées de la fonction des protéines au niveau cellulaire.

Bien que l' interférence ARN représente une stratégie bien connue pour réguler vers le bas POIs, il a ses inconvénients (cp. 14). Non seulement l'identification d'une séquence hautement spécifique et efficace peut être coûteuse et prend du temps, mais aussi biogenèse transcrit à l'intérieur de la cellule peut provoquer des résultats imprévisibles car l'accumulation de produits d'assemblage d'ARN toxiques, une surcharge de la machine d'exportation nucléaire, ainsi que la saturation de l'ARNi endogène des systèmes de traitement peuvent entraîner des effets hors-cible ou l'inefficacité. En outre, des quantités élevées de vecteurs ARNi exogènes peuvent induire UNSeffets SPECIFIQUES aussi bien, et perturbent l'homéostasie cellulaire.

Les anticorps, d'autre part, ne nécessitent pas de traitement ultérieur par les mécanismes endogènes une fois qu'ils sont entrés dans la cellule, et sont efficaces immédiatement, soutenant ainsi non seulement l'expérimentation de gagner du temps, mais aussi des enquêtes sur les processus cellulaires immédiats. Bien qu'ils puissent avoir des effets hors-cible non spécifiques, aussi, le nombre croissant d'anticorps bien caractérisés et très spécifiques disponibles rend cette alternative mérite une pensée. Depuis la livraison de complexes macromoléculaires en cellules représente un obstacle majeur, différentes techniques de transfection ont été développées dans les dernières années, y compris les peptides R8 et azoR8 18 ainsi que microsphère 19 médiée par la navette. Alors que R8 et azoR8 ont été indiqués à se comporter de façon similaire à Chariot 18, les microsphères ont été trouvés pour exiger 24 heures pour l' absorption 19, ce qui est considérablement plus longue que mem Chariot à médiationpassages branes et peuvent entraîner des difficultés lors de l'étude plus rapidement et les réponses cellulaires dépendantes de la dose.

De manière remarquable, la technique Chariot avéré être applicable aux cultures hippocampiques primaires, qui sont très sensibles aux traitements et difficiles à transfecter. Jusqu'à présent, les transporteurs Chariot ont été utilisées pour analyser la fonction des protéines dans des cultures d'ostéoblastes primaires 20, ainsi que dans la lignée cellulaire de neuroblastome-gliome NG108-15 21, poussin racine dorsale cultures de ganglions 21 ou dans les cellules PC12 22 qui proviennent de neurones crête, mais ne signale aucune application dans les cultures de cellules dérivées du système nerveux central sont encore disponibles. Depuis des réactifs de transfection traditionnels tels que Lipofectamine sont inefficaces dans ces cellules et transfections virales complexes, Chariot pourrait représenter une alternative intéressante.

Notamment, Chariot elle - même était observée pour localiser le noyau 15, probablementen raison de son signal de localisation nucléaire PKKKRKV (cp. 23). Conformément à ces observations, nous avons constaté que Chariot transfection médiée par des macromolécules rbαSimiate-gtαrbAlexa568 a donné lieu à un étiquetage clair des compartiments nucléaires tels que des mouchetures nucléaires. En effet, les anticorps de contrôle tels que gtαgpAlexa568 ont également été détectés dans le noyau des deux, HEK293 et ​​des cellules hippocampiques primaires. Comme les anticorps, notamment dans les assemblages, sont beaucoup trop grands pour s'engager dans le noyau par diffusion et depuis Simiate lui-même ne contient pas de signal connu de localisation nucléaire, mais pénètre dans le noyau par diffusion, il est probable que le signal de char est impliqué dans la la localisation nucléaire d'anticorps. En variante, une protéine de transport dans les grands ensembles pourrait également être possible, bien que cela ne serait pas d'expliquer la présence d'gtαgpAlexa568 dans le noyau des neurones hippocampiques en culture à partir de rats, comme il n'y a pas de cible pour cet anticorps dans ces cellules. En outre, since Chariot a été trouvé pour ne pas interférer avec la localisation naturelle des peptides et des protéines 15 la navette, ces observations suggèrent que les anticorps se comportent différemment.

En effet, lorsque la navette complexes anticorps tels que Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figure 1) ou Chariot-gtαgpAlexa568 (Figure 5) à travers les membranes cellulaires, ils apparaissent en grappes, qui ne se dissolvent, lorsque les protéines cibles appropriées telles que Simiate endogène ou FLAG-Simiate sont présents (uniquement dans la figure 1). Utilisation de Chariot complexes anticorps dans les ostéoblastes, Selim et collèges ont observé le même effet 20. Étant donné que le char a été démontré ne pas interférer avec la localisation des peptides et des protéines 15, ces observations indiquent que les anticorps assemblés Chariot démontent que s'il existe un mécanisme moléculaire tel que l'interaction anticorps-cible, qui surmonte l'interaction hydrophobeactions entre Chariot et sa cargaison d'anticorps et, par conséquent, encourage le démontage. Parce que les anticorps sont plus lourds que les peptides ou la plupart des autres protéines et ont, en raison de leur forme, une grande surface, ils peuvent associer à un plus grand nombre de molécules de Chariot et / ou interagissent plus ferme avec des peptides de Chariot, qui serait ainsi favoriser une plus Chariot-driven comportement des anticorps. L'absence d'un mécanisme de démontage entraînerait donc un aspect en grappe et une localisation nucléaire de la cargaison d'anticorps (figure 5).

Pris ensemble, les données montrent que Chariot est particulièrement bien adaptée pour traiter la fonction des protéines qui résident dans le noyau et qu'il est applicable à une variété de types de cellules de mammifères, y compris les neurones hippocampiques primaires.

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Acknowledgements

Le travail présenté a été soutenu en partie par le financement des Instituts de recherche en santé du Canada / Fondation pour la recherche X fragile programme de partenariat Canada RD de la Fondation Jérôme Lejeune à RD le Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung de l'Université d'Erlangen-Nuremberg à RD et de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à RD et RE. Les auteurs tiennent à remercier Ingrid Zenger pour l'assistance technique à l'entretien de la culture cellulaire, ainsi que le professeur M. Wegner pour faire un vecteur pCMV5-FLAG disponible. Les auteurs souhaitent en outre remercier particulièrement Nadja Schroeder pour le soutien utile à la prise de vue vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

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References

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