Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

protein ekspresyonunun bir sıkı yönetim canlı her organizmada gerekli değil, aynı zamanda hücresel modellerinde protein fonksiyonlarını araştırmak için önemli bir strateji değil sadece. Bu nedenle, son araştırmalar RNA ve antikor enterferans dahil memeli hücre hatları, hatta hayvan modellerinde, protein ifadesini hedef için farklı araçlar icat etti. İlk strateji son yirmi yılda çok dikkat toplamıştır ederken, hücresel membranlar boyunca ve hücre içine antikor kargoların bir translokasyon aracılık peptidler, çok daha az ilgi aldı. Bu yayında olarak, antikor müdahale deneyleri gerçekleştirmek için insan embriyonik böbrek hücrelerinde ve primer hipokampal nöronlar Chariot isimli bir peptit taşıyıcı kullanır ve daha fazla protein işlevi analiz üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulanmasını göstermek için nasıl ayrıntılı protokol sağlar. Bulgularımız Chariot muhtemelen nükleer lokalizasyon sinyali, Particula için olduğunu göstermektedirrly soma ve çekirdeğinde bulunan proteinleri hedef için çok uygundur. Primer hipokampal kültürlere Chariot uygularken Enteresandır, reaktif şaşırtıcı derecede iyi ayrışmış nöronlar tarafından kabul edilmesi ortaya çıktı.

Introduction

her canlı organizma kendi gelişimini komuta yanı sıra çevresel sinyallere tepki için protein ifade Sıkı denetim esastır. Bu nedenle, mekanizmaların çok sayıda hassas uygulama tarafından kodlanan her protein ifade düzeyini düzenleyen evrim sırasında icat edilmiştir. ömrünün herhangi bir zamanda herhangi bir ökaryotik hücre içinde mevcut olan 20.000 genler. Protein üretimi farklı aşamalarında yer alarak, düzenleyici mekanizmaların posttranslasyonel modifikasyonlar proteini, taşıma ve bozulma yönüne taşıma kromatin yapısının, transkripsiyonu ve RNA yönetim arasında değişir.

Moleküler makine ve değiştirilmiş protein ekspresyon düzeyleri altta yatan de arızaları, kanser ya da zihinsel engelli gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu, bu nedenle şaşırtıcı değildir. Nitekim, nöronal gelişim ve memeli beyin fonksiyonlarının olağanüstü karmaşıklığı bakarak, sensiProtein ifadesindeki değişiklikler bu sofistike sistemlerin bilirlik Alzheimer ve Frajil X Sendromu (FXS) gibi Parkinson hastalığı (AH ve PH) yanı sıra otizm spektrum bozukluğu (ASD) dahil olmak üzere birçok tanınmış entelektüel açıkları kendini gösterir. Ikinci hastalığı tek için düzenleyici protein, FMRP (Kırılgan X mental retardasyon Protein) 1-4 kaybına bağlı olan bir çok protein, geniş bir misexpression ile karakterize edilir. Nokta mutasyonları zihinsel engelli olan hastalarda tespit değil iken 5 kapatma mRNA değiştirerek mRNA stabilitesini ve çeviri yönetir Ayrıca, Değişken ücret etkileyen kromozomal yeniden düzenlenmeler bağlantılı x protein A (VCXA), bir protein, son zamanlarda, entelektüel açıkları ile ilişkilendirilmiştir şimdi olduğu gibi 6, 7, gözlenen ruhsal bozuklukları değişmiş VCXA ifadesi ve hedef prote düzensiz ifadesi kaynaklanan düşündürenins. Bu bulgulara, de novo ASD ile ilişkili genlerin kopya sayısı varyasyonları, böylece yüksek veya azalmış protein ekspresyon düzeyleri neden olabileceğini fikrini desteklemektedir, yeni gen duplikasyonlar ve silmeler ASD 8 için önemli bir risk faktörü olduğunun tespit edip araştıran bir çalışma doğrultusunda entelektüel açıkları.

Dikkate değer olarak, son araştırmalar başka bir proteinin ifade seviyesi, tam hemen hiçbir güvenlik marjları 9 yüksek protein miktarlarının bir sonucu olarak, toplanmayı önlemek için ayarlanır ilişkin kanıtlar sağlamıştır. Nedenle, daha küçük artışlarla, AD ve PD 9 gibi hastalıkları indüklemek için yeterli olduğu önerilmiştir. Protein ekspresyon kontrol katkıda moleküler makine çeşitliliği bu bulgular ışığında karmaşık bir düzenleme planı desteklemesine rağmen, 5000'den fazla memeli genlerinden 10 ekspresyon seviyesini araştıran bir çalışma göstermiştirdoğa daha cimri düzeni tercih: Proteinlerin hücresel bolluğu ağırlıklı böylece RNA kullanılabilirlik yönetimi esas ince ayar protein ifadesini hizmet ettiğini gösteren, çeviri 10 seviyesinde düzenlenir gösterilmiştir.

ilgi proteinlerin dozunu incelenmesi (POI) bu nedenle sadece bir proteinin endojen fonksiyonlarının anlaşılmasında önemli değil, aynı zamanda birçok hastalığın araştırılması ve tedavilerin geliştirilmesine değil. Böylece, son on yıl POI dozajı işlemek için RNA girişimi kullanarak çeşitli stratejiler ilerleyişini gördük. RNA enterferans yaygın protein fonksiyonunu incelemek için kullanılır ve hatta kanser ya da göz hastalıkları tedavi etmek yanı sıra hastalarda 11-13 antiviral tedavileri sürdürmeye klinik çalışmalarda uygulanan olmasına rağmen, bazı zorluklar strateji imkansız hale olabilir ortaya çıkabilir. Örneğin, homoloji ile demonte tahrik tohum sırası compara olduğuble kısa, dolayısıyla teşvik dışı hedef etkileri. Yüksek verimli dizileri nadirdir ve zaman alıcı ve masraflı olabilir sağ dizisini tanımlayan, (14 gözden) seçenekler binlerce arasında bulunan gerekir, ancak o zamandan beri sonuçlar yine hayal kırıklığı olabilir.

Alternatif bir strateji doğrudan antikorlar tarafından POI hedef etmektir. Burada, hücresel protein durumunu azaltmak için (Aktif Motif tarafından imal edilmiş), protein taşıyıcı Chariot kullanımını göstermektedir ve üç boyutlu rekonstrüksiyon istihdam knock-down aşağıdaki protein fonksiyonunu incelemek için.

Chariot, kendisi 2.8 kDa peptidinin, aktif motifi memeli hücreleri 15 membranları boyunca Servisi peptidler, proteinler ve antikorlar için kullanılır. Chariot-POI kompleksleri, bunun üzerine hidrofobik etkileşimler, kullanan olmayan kovalent makromoleküler kompleksler oluşturarak İÇN ile peptid ilişkilendirir bir endosome-ind hücrelere içselleştirmiş olanependent şekilde. Önemli olarak, Chariot mekik proteinlerin hücre içi lokalizasyonu etkiler de sitotoksik etkilerini uygulamak için veya yük 15 biyolojik aktivitesini etkilediği de işaret etti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hazır Çözümler

  1. 2 ug / ml bir son konsantrasyona kadar steril H liyofilize aktif motifi toz 2 O yeniden süspanse edin. Karıştırma için dikkatlice dokunun.
  2. (Örneğin, 12 ul, her biri 2 ul reaksiyon başına zorunludur) az miktar hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.

Hücreler 2. Hazırlık

  1. Bu tür antibiyotikler de dahil olmak üzere, bir 24 yuvalı plaka 500 ul büyüme ortamı üzerinde HEK293 hücreleri veya birincil nöronlar gibi tohum memeli hücreleri.
    NOT: nöronlar kullanırken, düşük yoğunluklu hücreleri tohum ve 24 plaka sadece iki orta satır kullanın. Her iyi ve böylece inkübasyon (adım 4.2) sırasında orta liman boş muadili olacaktır. nöronlar ele aldığınızda her zaman hücreler bir kaç dakikadan fazla inkübatör dışında tutulur değil emin olun.
  2. Hücreler uygulama kadar kültür, uygun koşullar altında hücrelerin (nemlendirilmiş% 5 CO2 ve 37 ° C). % 50konfluent.
    NOT: nöronlar kullanırken, kültür istenilen gelişimsel aşamaya kadar hücreler ulaştı ve uygulamayı değiştirecek. ortamda iki kez% 25-50 haftada. Orta (1 x B27, 5 mM L-glutamin ve 1 x penisilin ve streptomisin içeren; ref 16 karşılaştırın), Neuro temelli vasat.

3. Chariot Kompleks Oluşum

  1. reaksiyon başına PBS 50 ul sırasıyla özel hedef veya ilgili antikor, bunun yanısıra kontrol proteini veya kontrol antikoru, 0,1-2 ug seyreltin.
    NOT: Bu teknik aynı zamanda makromoleküler kompleksleri öncesi bağlı primer ve sekonder antikor (. Cp 'Temsilcisi Sonuçlar', Şekil 1) oluşan çalışır. Mix ve sıkma.
  2. Her numune için, Chariot kendi aralarında birleşmelerini engellemek için ayrı bir tüp kullanarak PBS, 50 ul 2 ul Chariot stok solüsyonu seyreltin. Mix ve sıkma.
  3. pipet ile Chariot seyreltme seyreltilmiş POI veya antikor (adım 3.1) aktarınting. Mix ve sıkma.
  4. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı (Chariot-PO kompleksleri oluşturacaktır).

4. Hücrelerin transfeksiyonu

  1. Chariot kompleksleri, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı 100 ul (37 ° C, katkı maddeleri) (aşama 3.4) ile seyreltilir. Ortamı çıkarın ve bir kez önceden ısıtılmış 1 x PBS kullanarak hücreleri yıkayın.
    NOT: nöronlar kullanırken, orta atmayın, bu yeniden yapılacaktır. 37 ° C'de tutun. Yıkama için, PBS, 0.5 mM MgCI2 ve CaCl2 ihtiva eden kullanımı.
    Öneri: plakasını (adım 4.5) kuluçkaya ederken boş kuyularda ortamı tutmak.
  2. hücrelere Chariot kompleksi çözeltisi (aşama 4.1) uygulayın ve çözeltinin eşit bir dağılımını sağlamak için yavaşça hücreler sallayın. 1 saat boyunca standart koşullar (adım 2.2) altında hücreleri büyür. % 10 oranında bir nihai konsantrasyona kadar serum ekleyin. nöronlar kullanıldığında, Adım 4.1 orta ekleyin. 1 ila 2 saat daha hücreleri büyütün.
    NOT:Optimal inkübasyon süresi büyüklüğü ve yük özelliklerine bağlıdır ve tecrübi olarak ayarlanması gerekebilir. Aşağıdaki öneriler bir rehber olarak hizmet edebilir: peptitler için, 1 saat 1-2 saat antikorları için, 2 saat tavsiye ve antikorlar ile nöronların transfeksiyon 4 saat için olan proteinler için, genellikle yeterli olur.
  3. Her zamanki gibi analiz için işlem hücreleri. Lütfen dikkat: teknik sabitleme protokolleri yanı sıra canlı görüntüleme kullanarak deneyler ile uyumludur.

5. Görüntüleme

  1. bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak, yaklaşık 0.25-0.5 mikron mesafe kullanarak hücreleri ve / veya ilgi hücre bölümlerinde z-yığınları alır. hassas tabaka mesafesi yeniden inşa edilmesi yapı büyüklüğüne bağlıdır ve ayrı ayrı tespit edilmesi gerekmektedir.

6. İmar

  1. Aşağıdaki adımlarda, o tıklayarak birden fazla nesneyi seçmek için, seçmek ve gezinmek, Cntr arasında geçiş yapmak için Esc altını kullanmakn onlara ve shift tuşu nesneleri (krş. 6.10 adım) kesmek için.
  2. Imaris içinde LSM-dosyasını açın.
  3. parlak yapıları doygunluk ulaşana kadar her kanal için görüntü Ayarı kullanarak, resim kontrast. Yüzey inşaat etkilemeyeceğini bu ayarlama, sadece görüntü eşikleme de deneyci yardımcı olmak için hizmet ettiğini unutmayınız.
  4. Yeni Yüzeyler Ekle simgesini tıklayın. Bir sihirbaz açılacaktır.
  5. Seçin: İlgi Segment sadece bir bölge. Bir sonraki adıma geçin.
  6. ilgilendiğiniz nesne sığdırmak için seçim kutusunun kenar boşluklarını ayarlayın. Görüntü 3 boyutu vardır akılda ve seçimi de z düzlemde ayarlanması gerektiğini Lütfen ayı. Seçim kutusunun dikdörtgen şekli düzgün ilgi nesnesi eşleşmiyor gerekiyorsa, nesneyi açmak ve / veya gerekli tüm yapılar gömülü kadar kutuyu büyütmek. İstenmeyen nesneler daha sonra kaldırılmış olabilir (cp. 6.10 adım). İlerlemek.
  7. Uygun ch seçinAnnel. Yüzölçümü Detay Seviyesi veya küre çapı yapıları yeniden düzenlenmesi eşleşecek şekilde ayarlanması gerekir. Sinyal özelliklerine bağlı olarak, Mutlak Yoğunluk veya Yerel Kontrast da kullanılabilir. Genellikle, Yerel Kontrast yaygın sinyalleri için daha iyi çalışır. Herhangi bir durumda, ayarlar, sırasıyla, ilgi konusu her bir sinyalin ya da yapı için ayrı ayrı ayarlanabilir olması gerekir.
  8. Eşik aracını kullanarak, ilgi yapısını yeniden.
  9. yeşil ok alt tıklayarak yeniden tamamlamak.
  10. kesme ve gerektiği gibi yüzeylere kaldırmak için kalem aracını kullanarak daha nesne ayarlayın. Istenilen nesneyi kesmek için görüntüyü, bu nedenle, kuzey-güney yönünde kesilir yatırmak için mümkündür.
  11. seçme İstatistik, Ayrıntılı İstatistiklere ve Ortalama Değerler her yüzey için hacim, alan ölçümleri ve yoğunluklarını alın.
  12. Renk kodlu istatistikleri gözlemlemek için (İsteğe bağlı adım) (cp. Şekil 2E F), ilgili yüzey rengi sekmesini seçin ve yerine 'Base' ve 'İstatistik Kodlu' işaretleyin. Çeşitli seçenekler görüntülenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aşağıdaki paragraflarda, POI fonksiyonel demonte gösteren örnek sonuçları Chariot reaktif ve antikor girişim sunulmaktadır kullanarak (Simiate, daha fazla ayrıntı için 16, 17 bakınız). Bulgular Simiate azalmış ekspresyon transkripsiyonel aktivite bozar, ve doz bağımlı bir şekilde, daha yüksek antikor miktarları (> 1 ug antikoru) uygulanması durumunda% 99 üzerinde mortalite oranları ile sonuçlanan, apoptosisi teşvik göstermektedir (Bu keşifler, daha önce yayınlanmış 16). Burada, ayrıntılı olarak kullanılan teknik ve protokoller mevcut ve ayrıca primer kültürlerinde ayrışmış hipokampal nöronlar transfekte etmek için nasıl kullanılabileceğini Chariot reaktif göstermektedir.

Bu antikorlar, prosedür sırasında fonksiyonel kalırsa Chariot peptidler, özellikle de, antikorların etkili bir shuttling izin olup olmadığını araştırmak için, FLAG ifadeDaha sonra HEK293 hücrelerinde 24 saat -Simiate ve Chariot kullanılarak hücreler rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromoleküller (Şekil 1) bağlı transfekte edildi. FLAG Simiate yapısı de HEK293 hücreleri tarafından ifade edilir ve somata yanı sıra, bu hücrelerin çekirdeklerinde (Şekil 1A) lokalize edilir. Burada, bu sayede çekirdeğin endojen Simiate benekli dağılımı yansıtma FLAG Simiate kümeleri belirgin bir şekilde (Şekil 1B).

Hücresel zarından mekik antikor kompleksleri (kırmızı, kırmızı oklarla Şekil 1A) toplulukları görünür, ancak FLAG-Simiate ve rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromoleküllerin derin bir ko (Şekil 1B gösterildiği gibi serbest antikorlar özellikle FLAG-Simiate tespit sarı, sarı ok olarak). not itibariyle deneme sadece antikorları Chariot-aracılığı sırasında işlevsel kalır olduğunu göstermektedirmembran geçiş, ama onlar da çekirdeğe girmek mümkün olduğunu. boyutları difüzyon yoluyla çekirdeği başlamadan antikorlar hariç yana, Chariot kendisinde mevcut nükleer lokalizasyon sinyali çekirdeğine rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromoleküllerin translokasyon kolaylaştırdığı muhtemeldir. Gerçekten de, antikor toplulukları da ya da sırasıyla gözlenir nükleer bölmesi (Şekil 1B, kırmızı oklar).

RbαSimiate-Chariot işlevsel HEK293 hücrelerinde endojen Simiate (Şekil 2) boşaltmak için kompleksleri kullanılarak biz antikorların 2.0 16 ug kullanılarak rbαSimiate bağlanma alanının% 80 kadar hedef mümkün olduğu bulundu. HEK içine yalnız gtαrbAlexa568 antikorları mekik ederken İlginçtir, 293 hücreleri nükleer benekler (Şekil 2A-C) görünümünü belirgin bir etkisi vardı, fonksiyonel Simiate kaybı nükleer benekler radyal (Şekil 2B-F </ strong> cp. 16), üç boyutlu bir rekonstrüksiyon E genel (Şekil 2B, C, F), doza bağımlı bir şekilde, teşvik edilmiş apoptosis (Şekil 3, CP. 16) ile gösterildiği gibi.

Nöronal hücrelerin toksik etkilere karşı çok hassas olduğu göz önüne alındığında, biz de (Şekil 4) Primer hipokampal kültürlerde tekniği uygulandı. Hücre bütünlüğünü analiz TUNEL testi ve map2 boyama kullanarak, tedavi, cp 1 + 4 saat sonra sahte ya da tedavi işlenmemiş ve Chariot hücreleri (app.% 20-25 TUNEL pozitif hücrelerin karşılaştırma nöronların canlılığı üzerinde hiçbir etkisi bulunamadı. 4.4 -4.6). Dolayısıyla, nöronal kültürlerinde mekik Chariot aracılı antikor test edilmiştir. Aynı uygulama şeması takip edilerek, gtαgpAlexa568 antikor toplulukları değişen bu somata olarak çekirdek (Şekil 5A) oluştu hücreler, yaklaşık% 83 uzanır görüldü. Bu gözlemler ayrıca b desteklenmektedirya, üç boyutlu analiz (Şekil 5B) ve yakın bir şekilde bu şekilde Chariot tekniği başarılı bir şekilde kullanılabilir hem de birincil hippokampal nöronlar ayrışmış transfekte bu gösteren, HEK293 hücrelerinde görülen görüntü yeniden birleştirmek.

Şekil 1
Şekil 1. FLAG Simiate Chariot reaktifi kullanılarak HEK293 hücrelerine mekik Simiate spesifik antikorlar tarafından tespit edilir. Antikor girişim deneylerinde, rbSimiate-gtrbAlexa568 antikorlar önce Chariot-antikor kompleksinin oluşumuna önceden oluşturuldu için. A) FLAG-etiketli Simiate ifade HEK293 hücreleri. Simiate antikor toplulukları soma olarak da FLAG Simiate ile spesifik colocalize uygulama aşağıdaki çekirdeğe girdiği. Yuvarlak noktalar: Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 toplulukları (kırmızı oklar). B) kutulu bölgenin bir yüksek güç büyümesiFLAG-Simiate ve Chariot aracılı Simiate sinyali (sarı oklar) ko gösteren (A). çekirdek (kırmızı ok) bir Chariot antikor topluluğu varlığını unutmayın. Ölçek çubuğu: 10 mikron.

şekil 2
HEK293 hücrelerine mekik Şekil 2. Simiate özgü antikorlar endojen Simiate. A hücresel fonksiyonları ile müdahale, B) Chariot-gtrbAlexa568 ile muamele HEK293 hücreleri (1 ug) bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Chariot-gtrbAlexa568 toplulukları gösterilmez ise kırmızı, endojen Simiate, yanlış renkte gösterilmiştir. apoptotik hücreler (mavi) TUNEL testi ile tespit edilmiştir ise nükleer benekler, işaretleyici protein SC35 (yeşil) kullanılarak etiketlendi. Nükleer aynı bölgede Yeniden) A. C kutulu bölgeden benekler gösteren benek hacimleri ve yüzey alanları B) İmarBir renk kodlu şekilde. D, E) Chariot-rbSimiate tedavi (0.5 mg), aşağıdaki HEK293 hücreleri. Nükleer benekler ve apoptotik hücreler) A ve B E'ye göre aynı bölge olarak gösterilmiştir) D. F kutulu bölgeden yeniden Nükleer benekler gösterilir ise Endojen Simiate yanı sıra Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 toplulukları, kırmızı gösterilmiştir C için belirtilen beneklerin yarıçaplı bir görünüm ve toplanmasını (: Imaris yazılımı tüm rekonstrüksiyon) lütfen unutmayın. 2 um: C, F ölçek çubuğu. Diğer tüm ölçek çubukları: 10 mikron. 1) üç boyutlu rekonstrüksiyon için, sadece sigara apoptotik hücreler kullanıldı.

Şekil 3,
Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 Şekil 3. Yüksek dozlarda büyük hücre ölümünü indükler. HEK293 hücreleri 2, sırasıyla Chariot-gtrbAlexa568 ya Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568, ug (her ikisi de comp ile muamele edildi lexes oklar gibi büyütme yeşil gösterilir ve belirtilen). TÜNEL markalama (mavi), apoptotik hücrelerin tespit uygulanmıştır. Ölçek çubuğu: 10 mikron.

Şekil 4,
Şekil 4. Chariot birincil hippokampal nöronlar için toksik değildir. AB mekik antikoru (1 + 4 saat, CP protokolde tarif edilen 7 nöronlar) ya sahte muamele edilmiş (orta, A) ya da Chariot reaktifi (B maruz bırakıldı) DIV. 4,4-4,6). SC-35, nükleer benekler için bir işaretleyici protein, transkripsiyon ve yapıştırma makineleri etiketlemek için hizmet ederken, TÜNEL boyama apoptotik hücreler (yeşil oklar) tanımlamak için uygulandı. Tedavi edilmemiş C) ve Chariot DIV 16/17 nöronlar tedavi. MAP2 boyama dendritik ağaçları görselleştirmek için uygulanmıştır. Ölçek çubukları: 10 mikron.

Güncelle / 53049 / 53049fig5highres.jpg "width =" 700 "/>
Şekil 5. Chariot aracılı transfeksiyon nöronal kültürler ile uyumludur. A) div 5. resimden bir Örnek primer hipokampal nöron, bir lazer tarama mikroskobu (bir lazer tarama mikroskobunu 710, Zeiss) kullanılarak çekilen baca z projeksiyonunu göstermektedir. Ölçek çubuğu: 10 mikron. çekirdeğinde Chariot-gtgpAlexa568 kompleksleri (kırmızı) oluşumu ve hücre soma unutmayınız. A. Soma ve nöronun dendritler gösterilen çekirdeğin yanı sıra gtgpAlexa568 topluluklarının B) Üç boyutlu rekonstrüksiyon (Imaris yazılım) endojen Simiate etiketlenmesi distile gri noktalar ile gösterilir. Ölçek çubuğu: 10 mikron. Antikor miktarı transfekte: 0.25 ug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, bir doz tahrik şekilde hücre işlevlerini kontrol protein sentezleme seviyeleri önemini incelemek için bir protokol mevcut. Açıklanan protokol, dolayısıyla hücresel seviyede protein fonksiyonunun ayrıntılı çalışmalar sağlayarak hipokampal nöronlar dahil olmak üzere çeşitli memeli hücre tipleri, protein ekspresyonunun bir ince ayar manipülasyon sağlar.

RNA interferans özel hedefleri aşağı regüle etmek için bilinen bir strateji temsil eder, ancak, dezavantajları (cp. 14) sahiptir. Sadece son derece spesifik ve etkin dizisinin kimliği, masraflı ve zaman alıcı, aynı zamanda hücre içinde transkript biyogenez toksik RNA yapılarının birikimi, çekirdek ihraç makinelerin bir aşırı gibi bir doygunluğu öngörülemeyen sonuçlara da yol açabilir olabilir endojen RNAi işleme sistemleri hedef dışı etkiler veya verimsizlik neden olabilir. Ayrıca, eksojen RNAi vektörleri yüksek miktarda uns neden olabilirpecific etkiler, hem de hücre homeostazisini perturb.

Antikorlar, diğer taraftan, aynı zamanda acil selüler proseslerin incelenmesi de hücre girdikten sonra, endojen makine tarafından başka işlem gerektiren ve hemen etkili ve böylece sadece zaman tasarrufu sağlayan deney destekleyen fakat. bunlar spesifik hedef dışı etkileri olsa da, çok uygun iyi karakterize edilmiş ve son derece spesifik antikorların artan sayıda bir düşünce bu alternatif değer yapar. Hücrelere makromoleküler komplekslerinin aktarımı önemli bir engel teşkil ettiği için bu farklı transfeksiyon yöntemleri peptidler R8 ve azoR8 18 gibi mikroküre 19 aracılı shuttling de dahil olmak üzere son yıllarda geliştirilmiştir. R8 ve azoR8 18 Chariot benzer şekilde davranmasını gösterilen iken, mikroküreler Chariot aracılı mem çok daha uzun olan, alım 19 24 saat gerektirecek şekilde bulunduDaha hızlı ve doza bağımlı hücresel yanıtlar incelenirken brane pasajlar ve zorluklara neden olabilir.

Dikkate değer olarak, Chariot tekniği çok tedavilere duyarlı transfekte etmek zordur birincil hippokampal kültürler için geçerli olduğu ortaya çıktı. Şimdiye kadar, Chariot taşıyıcılar nöroblastoma-glioma hücre hattı hem de sinir kaynaklanan veyaNG108-15 21 civciv sırt kök ganglion kültürleri 21 veya PC 12 hücreleri 22, birincil osteoblast kültürler 20 protein fonksiyonunu analiz etmek için kullanılmıştır kret, ancak merkezi sinir sistemi türetilen hücre kültürlerinde herhangi bir uygulama hiçbir rapor henüz mevcut bulunmaktadır. Böyle Lipofectamine gibi geleneksel transfeksiyon reaktifleri bu hücrelerin ve viral transfections karmaşık verimsiz olduğundan, Chariot ilginç bir alternatif temsil edebilir.

Özellikle, Chariot kendisi muhtemelen, çekirdeğe 15 lokalize gözlendinedeniyle nükleer lokalizasyon sinyali PKKKRKV için (cp. 23). Bu gözlemler doğrultusunda, biz rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromoleküllerin Chariot aracılı transfeksiyon nükleer benekler olarak nükleer bölmelere net bir etiketleme sonuçlandı bulundu. Gerçekte, bu tür gtαgpAlexa568 gibi kontrol antikorları ayrıca hem çekirdeği, HEK293 ve primer hipokampal hücrelerde tespit edilmiştir. antikorlar için, topluluğu, özellikle de Simiate kendisi bilinen herhangi bir nükleer lokalizasyon sinyali içermez, bunun yerine difüzyon yoluyla çekirdeği girişi sağlanır, Chariot sinyali katılır olasıdır difüzyonla ve çekirdeği atılmak için çok büyük antikorların nükleer lokalizasyon. Bu hücrelerde, bu antikor için bir hedef olduğu gibi bu, sıçanlardan kültürlenmiş hipokampal nöronlar çekirdeğinde gtαgpAlexa568 varlığını açıklamaz da alternatif olarak daha büyük protein toplulukları bir nakil da söz konusu olabilir. Bundan başka, Since Chariot shuttled peptidler ve proteinler 15 doğal lokalizasyonu ile müdahale bulundu, bu gözlemler antikorlar farklı davranır öneririz.

Hücre membranları boyunca (Şekil 5), Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Şekil 1) ya da Chariot-gtαgpAlexa568 gibi antikor kompleksleri mekik Gerçekte, sadece eridiği, kümeler görünür olduğunda, endojen Simiate veya FLAG Simiate uygun hedef proteinler (sadece Şekil 1 'de) bulunmaktadır. Chariot osteoblastlardaki antikor kompleksleri kullanılarak, Selim ve kolejler aynı etkiyi 20 gözlendi. Chariot Peptit ve proteinlerin 15 lokalizasyonu ile müdahale değil gösterildi göz önüne alındığında, bu gözlemler Chariot antikorlar hidrofobik Inter üstesinden bir antikor hedef etkileşimi gibi bir moleküler mekanizma vardır sadece sökmeye monte belirtmekChariot ve antikor yük ve arasındaki eylemleri dolayısıyla, demontaj teşvik eder. antikorlar peptidler ya da en çok diğer proteinler daha ağırdır ve nedeniyle şekli, büyük bir yüzeye sahip olduğundan, Chariot moleküllerinin daha fazla sayıda ilişkilendirmek ve / veya dolayısıyla teşvik edecek, Chariot peptidler daha sağlam etkileşim daha-Chariot tahrik antikorların davranışı. Bir sökme mekanizması olmaması dolayısıyla, kümelenmiş bir görünüm ve antikor yük (Şekil 5) bir nükleer lokalizasyon ile sonuçlanacaktır.

Birlikte ele alındığında, veriler Chariot, özellikle çekirdekte bulunan protein işlevini ele uygun olduğunu gösterir ve primer hipokampal nöronlar dahil memeli hücre tipinde çeşitli tatbik edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

sunulan çalışma Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından finanse edilerek bölgelerinde desteklenmiştir / RD Kanada ortaklık programının Frajil X Araştırma Vakfı, RD, Üniversite Erlangen-Nürnberg Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung Jerome Lejeune Vakfı RD ve Deutsche Forschungsgemeinschaft gelen RD ve RE. Yazarlar pCMV5-FLAG vektör kullanılabilir hale getirmek için teknik hücre kültürü bakımı ile ilgili yardım yanı sıra Prof. Dr. M. Wegner için Ingrid Zenger'i teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, özellikle video çekimi de yararlı destek için Nadja Schroeder teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics