Studera proteiners funktion och rollen av förändrade proteinuttryck av antikropp Störningar och Tredimensionella Rekonstruktioner

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En strikt förvaltning av proteinuttryck är inte bara viktigt att varje organism levande, men också en viktig strategi för att undersöka protein funktioner i cellulära modeller. Därför uppfanns senaste forskningen olika verktyg för att rikta proteinuttryck i däggdjurscellinjer eller ens djurmodeller, inklusive RNA och antikropps interferens. Medan den första strategin har samlat mycket uppmärksamhet under de senaste två decennierna, peptider förmedlar en translokation av last antikropps över cellmembran och i celler, som erhållits mycket mindre intresse. I denna publikation, ger vi ett detaljerat protokoll hur man kan använda en peptidbärare som heter Chariot i humana embryonala njurceller samt i primära hippocampus neuroner att utföra antikropp störnings experiment och ytterligare illustrera tillämpningen av tredimensionella rekonstruktioner att analysera proteiners funktion. Våra resultat tyder på att Chariot är, förmodligen på grund av dess nukleär lokaliseringssignal, particularly väl lämpad till målproteiner som bor i soma och kärnan. Anmärkningsvärt, vid tillämpningen Chariot primära hippocampus kulturer, visade reagens sig vara förvånansvärt väl accepteras av dissocierade neuroner.

Introduction

En strikt kontroll av proteinuttryck är viktigt för alla levande organismer att befalla sin egen utveckling såväl som att reagera på signaler från omgivningen. Följaktligen har en mängd mekanismer uppfunnits under evolutionen för att exakt reglera uttrycksnivån för varje protein som kodas av app. 20.000 gener som finns i varje eukaryot cell vid varje given tidpunkt av sitt liv. Som äger rum på olika stadier av proteinproduktion, regleringsmekanismer sträcker sig från förvaltningen av kromatinstrukturen, transkription och RNA hantering riktningen för posttranslationella proteinmodifieringar, transport och nedbrytning.

Det är därför inte förvånande att störningar i den underliggande molekylära maskinerier och förändrad proteinexpressionsnivåer har satts i samband med olika sjukdomar såsom cancer eller intellektuella funktionsnedsättningar. Faktum är att titta på den enastående komplexitet neuronal utveckling och däggdjurs hjärnfunktion, Sensivitet av dessa sofistikerade system för att förändringar i proteinuttryck yttrar sig i flera välkända intellektuella skador, inklusive Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom (AD och PD) samt autismspektrumstörningar (ASD) som Fragile X-syndrom (FXS). Den senare sjukdom kännetecknas av en omfattande misexpression av en mängd olika proteiner, vilket beror på förlusten av en enda översättningsreglerande protein, FMRP (fragilt X utvecklingsstörning Protein) 1-4. Dessutom kromosomala omflyttningar påverkar Variabel avgift X-bundet protein A (VCXA), ett protein, som hanterar mRNA-stabilitet och översättning genom att ändra mRNA kapslings 5, har nyligen satts i samband med intellektuella skador, medan punktmutationer inte identifierats hos patienter med kognitiva funktionsnedsättningar som nu 6, 7, vilket tyder på att de observerade psykiska funktionshinder härrör från förändrad VCXA uttryck och oreglerad uttryck för sitt mål proteins. I linje med dessa resultat, en studie som undersökte huruvida de novo kopietal varianter av gener är associerade med ASD konstaterat att nya genduplikationer och strykningar är en betydande riskfaktor för ASD 8, vilket stöder tanken att förhöjda eller minskade proteinuttrycksnivåer kan orsaka intellektuella underskott.

Anmärkningsvärt, den senaste forskningen gav ytterligare bevis att uttrycksnivån för ett givet protein är exakt justeras för att förhindra dess aggregation som en följd av höga proteinmängder med nästan inga säkerhetsmarginaler 9. Det har därför föreslagits att även små ökningar är tillräcklig för att inducera sjukdomar såsom AD och PD 9. Även om olika molekylära maskiner som bidrar till proteinuttryck kontroll antyder en komplex reglering programmet i ljuset av dessa resultat, en studie som undersökte expressionsnivån av över 5000 däggdjursgener 10 visade attnatur föredragit en mer snål schema: Det cellulära överflöd av proteiner visade sig till övervägande del regleras på nivå översättnings 10, vilket visar att hanteringen av RNA tillgänglighet syftar främst till att finjustera proteinuttryck.

Studera dosen av proteiner av intresse (POI) är därför inte bara viktigt för förståelsen av de endogena funktionerna hos ett protein, men också för utredningen av många sjukdomar och utveckling av terapier. Således har senaste decennierna sett förväg flera strategier som använder RNA-interferens för att manipulera doserings POI. Även RNA-interferens används i stor utsträckning för att studera proteiners funktion och även tillämpas i kliniska prövningar för behandling av cancer eller ögonsjukdomar samt att fullfölja antivirala behandlingar hos patienter 11-13, kan vissa svårigheter uppstå som skulle kunna göra strategin omöjlig. Till exempel, är fröet sekvensen, vilken driver knockdown genom homologi förhållanbara kort, därmed främja off-mål effekter. Eftersom högeffektiva sekvenser är sällsynta och måste hittas bland tusentals alternativ (översikt i 14), identifiera rätt ordning kan vara tidskrävande och kostsamt, men resultaten kan ändå vara en besvikelse.

En alternativ strategi är att direkt rikta POI av antikroppar. Här visar vi användning av proteinbäraren Chariot (tillverkad av Active Motif) för att minska cellulärt protein tillgänglighet och anställning av tredimensionella rekonstruktioner för att studera proteiners funktion efter knock-down.

Den aktiva motiv av Chariot, självt en kDa peptid 2,8, används för att pendel peptider, proteiner och antikroppar över membran av däggdjursceller 15. Peptid associerar med POI genom att bilda icke-kovalent kopplade makromolekylära komplex som utnyttjar hydrofoba interaktioner, varpå komplex Chariot-POI intern i celler i en endosom-independent sätt. Viktigt var Chariot indikerade att varken påverka den intracellulära lokaliseringen av shuttled proteiner, och inte heller för att utöva cytotoxiska effekter eller för att påverka den biologiska aktiviteten hos dess last 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stamlösningar

  1. Resuspendera den lyofiliserade aktiva motivet pulver i sterilt H2O till en slutlig koncentration av 2 ug / ul. Knacka försiktigt för blandning.
  2. Förbereda små alikvoter (t.ex., 12 | j, l vardera, 2 | il krävs per reaktion) och lagra dem vid -20 ° C.

2. Beredning av celler

  1. Utsädesdäggdjursceller såsom HEK293-celler eller primära neuroner på en 24-brunnsplatta i 500 | il tillväxtmedium innefattande antibiotika.
    OBS: När du använder neuron, utsäde cellerna vid låg densitet och endast använda de två mellersta raderna i 24 brunnar. Varje brunn kommer således att ha en tom motsvarighet till hamnen mediet under inkubation (steg 4,2). Vid hantering av nervceller, alltid se till att cellerna inte hålls utanför inkubator för mer än ett par minuter.
  2. Odla cellerna vid lämpliga betingelser (befuktad, 5% CO2 och 37 ° C) till dess att cellerna är app. 50%konfluenta.
    OBS: När du använder neuroner, odla cellerna tills den önskade utvecklingsstadiet har nåtts och ändra app. 25-50% av mediet två gånger i veckan. Medium: Neurobasal-medium (innehållande 1x B27, 5 mM L-glutamin och 1x penicillin och streptomycin; jämför med ref 16).

3. Chariot Complex Formation

  1. Per reaktion, späd 0,1-2 pg av POI eller den motsvarande antikroppen såväl som kontrollprotein, eller kontrollantikropp, respektive, i 50 fil PBS.
    OBS: Tekniken fungerar även med makromolekylära komplex bestående av pre-bundna primära och sekundära antikroppar (cp "Representativa resultat", Figur 1).. Blanda och spinn.
  2. För varje prov, späd 2 pl Chariot stamlösning i 50 fil PBS med användning av separata rör för att undvika självassociation av Chariot. Blanda och spinn.
  3. Överför den utspädda POI eller antikropp (steg 3,1) till Chariot utspädning med pipettting. Blanda och spinn.
  4. Inkubera blandningen under 30 minuter vid rumstemperatur (komplex Chariot-POI kommer att bilda).

4. Transfektion av celler

  1. Späd Chariot komplex (steg 3,4) i 100 pl förvärmda tillväxtmedium (37 ° C, inga tillsatser). Avlägsna mediet och tvätta cellerna en gång med användning av förvärmda 1x PBS.
    OBS: När du använder neuroner, inte kasta mediet, kommer det att återanvändas. Håll det vid 37 ° C. För tvättning, använda PBS innehållande 0,5 mM MgCl2 och CaCl2.
    Förslag: hålla mediet i tomma brunnar medan inkubation plattan (steg 4,5).
  2. Applicera Chariot komplex lösning (steg 4,1) till cellerna och rock cellerna försiktigt för att säkerställa en jämn fördelning av lösningen. Odla cellerna under standardbetingelser (steg 2,2) under 1 timme. Lägg serum till en slutkoncentration av 10%. Vid användning av nervceller, lägga mediet från steg 4,1. Odla cellerna under 1 till 2 timmar till.
    OBS!optimala inkubationstiden beror på storleken och egenskaperna hos lasten och kan behöva justeras empiriskt. Följande förslag kan fungera som en riktlinje: För peptider, är vanligen tillräcklig en timme, för proteiner 1-2 h rekommenderas, för antikroppar två timmar, och för transfektion av nervceller med antikroppar fyra timmar.
  3. Processceller för analys som vanligt. Observera: tekniken är kompatibel med experiment med användning av fixeringsprotokoll såväl som levande bilder.

5. Imaging

  1. Med användning av ett laserscanningsmikroskop, ta z-staplar av celler och / eller cellavdelningar av intresse med användning av ca 0,25-0,5 | j, m avstånd. Den exakta lagret avstånd beror på storleken av strukturen som ska rekonstrueras och måste bestämmas individuellt.

6. Rekonstruktion

  1. I de följande stegen, använd Esc botten för att växla mellan Select och Navigera Cntr att välja flera objekt genom att klicka on dem och Skift-tangenten för att klippa objekt (jfr. steg 6,10).
  2. Öppna LSM-filen i Imaris.
  3. Använda bildskärmen Justering för varje kanal, kontrast bilden tills de ljusaste strukturerna nå mättnad. Observera att denna justering kommer inte att påverka ytan konstruktion, endast tjänar det att bistå försöks i tröskel bilden.
  4. Klicka på Lägg till nya ytor ikonen. En guide öppnas.
  5. Välj: Segment endast en region av intresse. Gå vidare till nästa steg.
  6. Justera marginalerna i urvalsrutan för att passa din föremål för intresse. Tänk på att bilden har 3 dimensioner och att valet måste justeras i Z-planet också. Om den rektangulära formen på markeringsrutan inte ska matcha föremål för intresse, stäng av föremålet och / eller förstora lådan tills alla nödvändiga strukturer är inbäddade. Oönskade objekt kan tas bort senare (jfr. Steg 6,10). Fortsätt.
  7. Välj lämplig lmAnnel. Ytarean detaljnivå eller sfärdiameter bör sättas för att matcha de strukturer som rekonstrueras. Beroende på signalegenskaper, kan användas antingen Absolut intensitet eller lokal kontrast. Generellt fungerar lokalt Kontrast bättre för diffusa signaler. I varje fall inställningarna behöva justeras separat för varje signal eller strukturen av intresse, respektive.
  8. Med hjälp av Tröskling verktyget, rekonstruera strukturen av intresse.
  9. Slutföra återuppbyggnaden genom att klicka på den gröna pilen längst ned.
  10. Justera objektet ytterligare genom att använda penna verktyg för att skära och ta bort ytor som krävs. Det är bara möjligt att skära i nord-sydlig riktning, därför luta bilden för att skära det önskade objektet.
  11. Erhålla mätningar av volym, yta och intensiteter för varje yta genom att välja statistik, detaljerad statistik och medelvärden.
  12. (Valfritt steg) att observera färgkodade statistik (jfr. Figur 2E F), välj fliken färg på motsvarande yta och markera "Statistik Coded" i stället för "Base". Flera alternativ visas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I de följande styckena, exempel på resultat som visar en funktionell knockdown av en POI (Simiate, för ytterligare information se 16, 17) med hjälp av Chariot reagens och antikropp störningar presenteras. Resultaten visar att minskad expression av Simiate försämrar transkriptionsaktivitet, och, i en dos beroende sätt, inducerar apoptos, som kulminerade i dödlighet på över 99% om större mängder antikropp (> 1 mikrogram antikropp) tillämpas (dessa upptäckter har tidigare i den publicerade 16). Här presenterar vi nu de tekniker och protokoll som används i detalj och dessutom visa hur Chariot reagens kan användas för att transfektera dissocierade hippocampala neuroner i primära kulturer.

För att undersöka om Chariot peptider möjliggöra en effektiv skytteltrafik av antikroppar och i synnerhet om dessa antikroppar vara funktionella under förfarandet, uttryckte vi FLAG-Simiate I 24 timmar i HEK293-celler, och därefter transfekteras cellerna med användning av Chariot kopplad rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler (Figur 1). FLAG-Simiate konstruktet uttrycks väl HEK293-celler och lokaliserar till somata samt kärnorna hos dessa celler (Figur 1A). Här, FLAG-Simiate kluster signifikant (Figur 1B) och återspeglade den spräckliga fördelningen av endogen Simiate i kärnan.

Komplexen antikropps skytteltrafik över cellmembranet visas i sammansättningar (Figur 1A, i rött, röda pilar), men de frigjorda antikropparna detekterar FLAG-Simiate specifikt som visas med en djup colocalization av FLAG-Simiate och rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler (Figur 1B , i gult, gul pil). Som att notera, experimentet inte bara visar att antikropparna vara funktionella under en Chariot-medieradmembranpassage, men att de också kunna komma in i kärnan. Eftersom deras storlek utesluter antikroppar från att inleda kärnan via diffusion, är det troligt att den nukleära lokaliseringssignalen är närvarande i Chariot självt underlättar translokationen av rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler in i kärnan. I själva verket är assemblage antikropps också observerats vid eller i respektive kärnfacket (Figur 1B, röda pilar).

Använda rbαSimiate-Chariot komplex att funktionellt utarma endogena Simiate i HEK293-celler (Figur 2), fann vi att vi kunde rikta upp till 80% av de rbαSimiate bindningsställena, med hjälp av 2,0 mikrogram av antikroppar 16. Intressant medan skytteltrafik gtαrbAlexa568 antikroppar ensam i HEK 293-celler hade ingen uppenbar effekt på förekomsten av nukleära fläckarna (Figur 2A-C), förlust av funktionell Simiate radie nukleära fläckarna (Figur 2D-F </ strong>, cp. 16) som illustreras av tredimensionella rekonstruktioner (Figur 2B, C vs E, F) och, på ett dosberoende sätt, inducerad apoptos (Figur 3, cp. 16).

Med tanke på att nervceller är mycket känsliga för toxiska effekter, tillämpade vi också tekniken i primära hippocampus kulturer (Figur 4). Använda TUNEL analys och MAP2 färgning för att analysera cellernas integritet, fann vi ingen effekt på lönsamheten av nervceller vid jämförelse mock eller obehandlade och Chariot behandlade celler (app. 20-25% TUNEL-positiva celler efter 1 + 4 timmars behandling, cp. 4.4 -4,6). Hence, testade vi Chariot förmedlad antikropp shuttling i neuronala kulturer. Enligt samma ansökan systemet, var gtαgpAlexa568 assemblage antikropps sett varierande sträcker sig i ca 83% av cellerna, där de inträffade i somata samt kärnor (figur 5A). Dessa observationer ytterligare stöd bya tre-dimensionell analys (figur 5B) och noga återmontera bilden ses i HEK293-celler, tillsammans därmed illustrerar att Chariot teknik kan användas med framgång för att transfektera dissocierade primära hippocampala neuroner samt.

Figur 1
Figur 1. FLAG-Simiate detekteras av Simiate specifika antikroppar shuttled in i HEK293-celler med användning av Chariot reagens. För antikroppsinterferens experiment rbSimiate-gtrbAlexa568 antikroppar förmonterade före Chariot-antikropp komplexbildning. A) HEK293 celler som uttrycker FLAG-märkt Simiate. Simiate assemblage antikropps in i soma liksom kärnan efter applicering, där de colocalize specifikt med FLAG-Simiate. Runda punkter: Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblage (röda pilar). B) En hög effekt förstoring av den inramade regioneni (A) illustrerar colocalization av FLAG-Simiate och Chariot medierad Simiate signal (gula pilar). Observera närvaron av en Chariot antikropp assemblage i kärnan (röd pil). Skala bar: 10 pm.

figur 2
Figur 2. Simiate-specifika antikroppar shuttled in i HEK293-celler interferera med cellulära funktionerna för endogent Simiate. A, B) HEK293 celler behandlade med Chariot-gtrbAlexa568 (1 ^ g) tjäna som kontroll. I rött är endogen Simiate visas i falsk färg, medan Chariot-gtrbAlexa568 assemblage inte visas. Nukleära fläckarna märktes med användning av markörproteinet SC35 (i grönt), medan apoptotiska celler identifierades genom TUNEL-analys (i blått). B) Rekonstruktion av nukleära fläckarna från den inramade regionen A. C) Rekonstruktion av samma region som illustrerar speckle volymer och ytori en färg kodat sätt. D, E) HEK293 celler efter Chariot-rbSimiate behandling (0,5 mikrogram). Endogen Simiate liksom Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblage visas i rött, medan kärn prickar och apoptotiska celler visas enligt A och B. E) Kärn fläckar rekonstruerade från den inramade regionen D. F) Samma region visas som beskrivs för C. Observera avrundade utseende och aggregering av prickar (alla rekonstruktioner: Imaris programvara). Skalstrecket i C, F: 2 | j, m. Alla andra skal barer: 10 | j, m. 1) För tredimensionell rekonstruktion, var endast icke-apoptotiska celler används.

Figur 3
Figur 3. Höga doser av Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 inducera massiv celldöd. HEK293 celler behandlades med 2 ^ g av Chariot-gtrbAlexa568 eller Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568, respektive (båda komp lexes visas i grönt och indikerade med pilar samt förstoringar). TUNEL-märkning (i blått) applicerades för att identifiera apoptotiska celler. Skala bar: 10 pm.

figur 4
Figur 4. Chariot är inte giftigt för primära hippocampala neuroner. AB) DIV 7 neuroner var antingen mock-behandlade (medium A) eller utsattes för Chariot reagens (B) som beskrivs i protokollet för antikropps shuttling (1 + 4 timmar, cp. 4,4-4,6). Medan SC-35, en markörprotein för nukleära fläckar, tjänade till att märka transkription och splits maskiner, var TUNEL-färgning används för att identifiera apoptotiska celler (gröna pilar). C) Obehandlad och Chariot behandlade DIV 16/17 nervceller. MAP2 färgning applicerades för att visualisera de dendritiska träd. Skalstrecken: 10 ^ M.

pload / 53049 / 53049fig5highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 5. Chariot medierad transfektion är kompatibel med neuronala kulturer. A) En representant primär hippocampus neuron från div 5. Bilden visar z-projektioner av staplar tagits med en laserskanning mikroskop (Laser Scanning Microscope 710, Zeiss). Skala bar: 10 pm. Observera förekomsten av Chariot-gtgpAlexa568 komplex (röda) i kärnan och soma av cellen. B) Tredimensionell rekonstruktion (Imaris programvara) av kärnan samt gtgpAlexa568 assemblage visas i A. Soma och dendriter av neuron anges med grå prickar, som är framställd av märkning av endogena Simiate. Skala bar: 10 pm. Antikropp mängden transfekterad: 0,25 pg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för att studera betydelsen av proteinuttrycksnivåer i styra cellulära funktioner i en dos driven sätt. Protokollet som beskrivs möjliggör en finjusteras manipulering av proteinuttryck i olika däggdjurscelltyper, inklusive hippocampus nervceller, vilket underlättar detaljerade studier av proteiners funktion på cellnivå.

Även RNA-interferens representerar en välkänd strategi för att nedreglera POI, har den sina nackdelar (jfr. 14). Inte bara identifieringen av en mycket specifik och effektiv sekvens kan vara kostsamt och tidskrävande, men också avskrift biogenes inuti cellen kan orsaka oförutsägbara resultat eftersom ansamling av farliga RNA-konstruktioner, en överbelastning av kärnexport maskiner samt en mättnad av den endogena RNAi behandlingssystem kan leda till off-mål effekter eller ineffektivitet. Dessutom kan höga halter av exogena RNAi vektorer inducerar unsÄRSKILDA effekter också, och störa cell homeostas.

Antikroppar, å andra sidan, kräver ingen ytterligare bearbetning av endogena maskinerier när de har kommit in i cellen, och är med omedelbar verkan och därmed stödja inte bara tidsbesparande experiment, men även undersökningar av omedelbara cellulära processer. Även om de kan ha ospecifika off-mål effekter, även det ökande antal väl karakteriserade och mycket specifika antikroppar tillgängliga gör detta alternativ värt en tanke. Eftersom leveransen av makromolekylära komplex i celler utgör ett stort hinder, har olika transfektion tekniker utvecklats inom de senaste åren, bland peptiderna R8 och azoR8 18 samt mikrosfären 19 medierad skytteltrafik. Medan R8 och azoR8 angavs att bete sig på samma sätt som Chariot 18, har mikrosfärerna befanns kräver 24 timmar för upptag 19, vilket är betydligt längre än Chariot-medierad membrane passager och kan orsaka svårigheter när man studerar snabbare och dosberoende cellulära svar.

Anmärkningsvärt, vände Chariot tekniken ut att vara tillämplig på primär hippocampus kulturer, som är mycket känsliga för behandlingar och svåra att transfektera. Hittills har Chariot Carriers använts för att analysera proteiners funktion i primära osteoblast kulturer 20 liksom i neuroblastom-gliom cellinje NG108-15 21, chick dorsalrotsganglier kulturer 21, eller i PC12-celler 22, som har sitt ursprung från den neurala vapen, men inga rapporter om alla program i cellodlingar som härrör från det centrala nervsystemet finns tillgängliga ännu. Eftersom traditionella transfektionsreagens såsom Lipofectamine är ineffektiva i dessa celler och virala transfektioner intrikata, kanske Chariot representerar ett intressant alternativ.

Noterbart var Chariot själv observerade att lokalisera till kärnan 15, förmodligenpå grund av dess nukleära lokaliseringssignalen PKKKRKV (cp. 23). I linje med dessa observationer, fann vi att Chariot medierad transfektion av rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler resulterade i en tydlig märkning av kärn fack såsom nukleära fläckarna. Indeed, kontrollantikroppar såsom gtαgpAlexa568 detekterades också i kärnan av båda, HEK293 och primära hippocampala celler. Eftersom antikroppar, i synnerhet i sammansättningar, är alldeles för stora för att gå ombord på kärnan genom diffusion och sedan Simiate själv inte innehåller något känt kärnlokaliseringssignal, utan snarare kommer in i cellkärnan via diffusion, är det troligt att den Chariot signalen är involverad i nukleär lokalisering av antikroppar. Alternativt kan en transport i större protein assemblage också vara möjligt, även om detta inte skulle förklara förekomsten av gtαgpAlexa568 i kärnan av odlade hippocampus nervceller från råttor, eftersom det inte finns något mål för denna antikropp i dessa celler. Vidare, siiou Chariot befanns inte interferera med den naturliga lokalisering av shuttled peptider och proteiner 15, dessa iakttagelser tyder på att antikroppar beter sig annorlunda.

Det är när skytteltrafik antikroppskomplex såsom Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figur 1) eller Chariot-gtαgpAlexa568 (Figur 5) över cellmembran, visas de i klungor, som endast upplöses, när lämpliga målproteiner såsom endogena Simiate eller FLAG-Simiate är närvarande (endast i fig 1). Använda Chariot antikroppskomplex i osteoblaster, Selim och högskolor observerade samma effekt 20. Med tanke på att Chariot demonstrerades inte störa lokaliseringen av peptider och proteiner 15, dessa observationer tyder på att Chariot sammansatta antikroppar isär endast om det finns en molekylär mekanism, såsom en antikropp-mål-interaktion, som övervinner den hydrofoba interåtgärder mellan Chariot och dess last antikropp och därmed uppmuntrar demontering. Eftersom antikroppar är tyngre än peptider eller de flesta andra proteiner och har på grund av sin form, en stor yta, kan de associerar med högre antal Chariot molekyler och / eller interagera fastare med Chariot peptider, som därmed skulle främja en mer Chariot driven beteendet hos antikroppar. En brist på en demonteringsmekanism skulle därför resultera i ett klustrat utseende och en nukleär lokaliserings av lasten antikroppen (fig 5).

Sammantaget visar data att Chariot särskilt väl lämpad att ta itu med funktionen av proteiner som bor i kärnan och att den är tillämplig i en mängd av däggdjurscelltyper inklusive primära hippocampusneuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

De presenterade arbete stöddes i delar genom finansiering från den kanadensiska Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation of Canada partnerskapsprogram till RD, Jerome Lejeune Foundation till RD, den Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung vid University Erlangen-Nürnberg till RD och från Deutsche Forschungsgemeinschaft till RD och RE. Författarna vill tacka Ingrid Zenger för teknisk assistans med cellodlings underhåll samt professor M. Wegner för att göra en pCMV5-FLAG vektor tillgängliga. Författarna vill vidare till särskilt tacka Nadja Schroeder för den hjälpsamma stöd vid videoinspelning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics