Studerer Protein Funksjon og rolle Altered Protein Expression av antistoff Interferens og Tredimensjonal Rekonstruksjoner

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En streng styring av protein uttrykk er ikke bare viktig i enhver organisme lever, men også en viktig strategi for å undersøke protein-funksjoner i cellemodeller. Derfor nyere forskning oppfunnet forskjellige verktøy for å målrette protein ekspresjon i pattedyrcellelinjer, eller til og med dyremodeller, inkludert RNA og antistoffer interferens. Mens den første strategien har samlet mye oppmerksomhet i løpet av de siste to tiårene, peptider medier en translokasjon av antistoff last over cellemembraner og inn i cellene, fikk mye mindre interesse. I denne publikasjonen gir vi en detaljert protokoll hvordan å utnytte et peptid carrier heter Chariot i humane embryonale nyreceller samt i primær hippocampus nevroner å utføre antistoff interferens eksperimenter og videre illustrere anvendelsen av tredimensjonale rekonstruksjoner i å analysere protein funksjon. Våre funn tyder på at Chariot er, sannsynligvis på grunn av sin kjernefysiske lokalisering signal, particularly godt egnet til å målrette proteiner bosatt i soma og kjernen. Bemerkelsesverdig Ved anvendelse av vognen primære hippocampale kulturer, reagenset viste seg å være overraskende godt akseptert av dissosierte neuroner.

Introduction

En streng kontroll av protein ekspresjon er viktig for alle levende organisme for å kommandere sin egen utvikling, samt for å reagere på miljøsignaler. Derfor har en rekke mekanismer blitt oppfunnet under utvikling til nettopp regulerer uttrykket nivå av hvert protein kodet av programmet. 20.000 gener eksisterer i noen eukaryote celle til enhver tid av sitt liv. Finner sted på ulike stadier av proteinproduksjon, reguleringsmekanismer spenner fra styring av kromatinstruktur, transkripsjon og RNA håndtering til retningen av posttranslational proteinmodifiseringer, transport og degradering.

Det er derfor ikke overraskende at feil i den underliggende molekylære machineries og endrede protein uttrykk nivåer har vært assosiert med ulike sykdommer som kreft eller utviklingshemming. Faktisk, ser på utestående kompleksitet nevrale utvikling og pattedyr hjernens funksjon, den sensitivitet av disse avanserte systemer til endringer i proteinuttrykk manifesterer seg i flere kjente intellektuelle mangler blant annet Alzheimers og Parkinsons sykdom (AD og PD) samt autismespekterforstyrrelser (ASD) som Fragilt X-syndrom (FXS). Den sistnevnte sykdom er kjennetegnet ved en omfattende misexpression av en rekke proteiner, noe som skyldes tap av en enkelt oversettelse regulerende protein, FMRP (Svak X mental retardasjon Protein) 1-4. Videre kromosomale rearrangements påvirker Variabel kostnad x koblet protein A (VCXA), et protein, som forvalter mRNA stabilitet og oversettelse ved å endre mRNA capping 5, har nylig vært forbundet med intellektuell underskudd, mens punktmutasjoner ikke ble identifisert hos pasienter med kognitive funksjonshemninger som nå 6, 7, noe som tyder på at de observerte psykiske funksjonsnedsettelser stammer fra endrede VCXA uttrykk og feilregulert uttrykk for sitt mål beskyttins. I tråd med disse funnene, en studie undersøker om de novo kopitall varianter av gener assosiert med ASD etablert at nye genduplikasjon og slettinger er en betydelig risikofaktor for ASD 8, og dermed støtter ideen om at forhøyet eller redusert protein uttrykk nivåer kan forårsake intellektuell underskudd.

Bemerkelsesverdig, nyere forskning videre gitt bevis for at ekspresjonsnivået av et gitt protein er nøyaktig tilpasset for å hindre at den aggregasjon som en konsekvens av høye proteinmengder med nesten ingen sikkerhetsmarginer 9. Det har derfor blitt foreslått at selv små økninger er tilstrekkelig til å fremkalle sykdommer som AD og PD 9. Selv om forskjellige molekyl machineries som bidrar til protein ekspresjonskontrollsekvens foreslår en kompleks regulering som er i lys av disse funnene, en studie undersøkte ekspresjonsnivået av over 5000 pattedyrgener 10 viste atnaturen foretrukket en mer parsimonious ordning: Den cellulære overflod av proteiner ble vist å være hovedsakelig regulert på nivå med oversettelses 10, og dermed illustrerer at forvaltningen av RNA tilgjengelighet hovedsakelig tjener til å finjustere protein uttrykk.

Studerer dosen av proteiner av interesse (POI) er derfor ikke bare viktig for forståelsen av de endogene funksjon av et protein, men også for undersøkelse av mange sykdommer og utvikling av behandlingsformer. Dermed har siste tiårene sett forkant av flere strategier som bruker RNA-interferens å manipulere POI dosering. Selv om RNA-interferens blir mye brukt til å studere proteinfunksjon og er også blir brukt i kliniske forsøk for å behandle kreft eller okulære sykdommer, så vel som for å forfølge antiviral terapi i pasienter 11-13, kan det oppstå visse vanskeligheter som kan gjøre det umulig strategien. For eksempel frøet sekvens, som driver knockdown etter homologi er forholdbare kort, dermed fremme off-target effekter. Siden svært effektive sekvenser er sjeldne og må bli funnet blant tusenvis av alternativer (anmeldt i 14), identifisere riktig rekkefølge kan være tidkrevende og kostbart, men resultatene kan likevel være skuffende.

En alternativ strategi er å direkte målrette POI etter antistoffer. Her illustrerer vi bruk av proteinbærer Chariot (produsert av Active Motif) for å redusere cellular protein tilgjengelighet, og ansettelse av tredimensjonale rekonstruksjoner for å studere protein funksjon etter knock-down.

Den aktive motivet av vognen i seg selv et 2,8 kDa peptidet, blir brukt til skyt peptider, proteiner og antistoffer på tvers av membraner av pattedyrceller 15. Peptid forbinder med POI ved å danne ikke-kovalent bundet makromolekylære komplekser utnytte hydrofobe interaksjoner, hvorpå Chariot-POI-komplekser er internalisert inn i celler i en endosomet-independent måte. Viktigere Chariot ble indikert å påvirke hverken den intracellulære lokalisering av skytteltrafikk proteiner, og heller ikke å utøve cytotoksiske effekter eller for å påvirke den biologiske aktivitet av sin last 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stock Solutions

  1. Resuspender den lyofiliserte aktive motivet pulver i sterilt H2O til en endelig konsentrasjon på 2 ug / ul. Trykk forsiktig for å blande.
  2. Forbered små porsjoner (for eksempel 12 pl hver, 2 pl kreves per reaksjon) og lagre dem ved -20 ° C.

2. Fremstilling av Cells

  1. Seed pattedyrceller slik som HEK293-celler eller primære neuroner på en 24 brønners plate i 500 pl vekstmedium inkludert antibiotika.
    MERK: Når du bruker nevroner, frø cellene ved lav tetthet og bruker bare de to midterste radene i 24 brønners plate. Hver brønn vil dermed ha en tom motstykke til båtplass mediet under inkubasjon (trinn 4.2). Ved håndtering av nerveceller, alltid sørge for at cellene ikke blir holdt utenfor inkubatoren i mer enn noen få minutter.
  2. Culture cellene ved passende betingelser (fuktet, 5% CO2 og 37 ° C) inntil cellene er appen. 50%konfluent.
    MERK: Når du bruker nevroner, kultur cellene til ønsket utviklingsstadiet er nådd og endre programmet. 25-50% av det medium to ganger i uken. Medium: Neurobasal medium (som inneholder 1x B27, 5 mM L-glutamin og 1x penicillin og streptomycin, sammenligne med ref 16).

3. Chariot Complex Formation

  1. Per reaksjon, fortynnet 0,1-2 ug av POI eller det tilsvarende antistoff, så vel som kontrollprotein, eller kontroll-antistoff, henholdsvis i 50 ul PBS.
    MERK: teknikken fungerer også med makromolekylære komplekser bestående av pre-bundet primære og sekundære antistoffer (cp 'representative resultater', figur 1.). Bland og spinn.
  2. For hver prøve ble fortynnet 2 ul vogn lageroppløsning i 50 ul PBS ved hjelp av separate rør for å unngå selv-assosiasjon av vogn. Bland og spinn.
  3. Overfør den fortynnede POI eller antistoff (trinn 3.1) til Chariot fortynning av pipetteTing. Bland og spinn.
  4. Inkuber blandingen i 30 minutter ved romtemperatur (vogn-POI-komplekser vil danne).

4. Transfeksjon av celler

  1. Fortynne Chariot komplekser (trinn 3.4) i 100 pl forvarmet vekst medium (37 ° C, ingen tilsetningsstoffer). Fjern medium og vaske cellene gang ved hjelp forvarmes 1x PBS.
    MERK: Når du bruker nevroner, ikke kast mediet, vil det bli gjenbrukt. Hold det ved 37 ° C. For vasking, bruke PBS som inneholder 0,5 mM MgCl2 og CaCl 2.
    Forslag: holde mediet i tomme brønner mens inkubering av platen (trinn 4.5).
  2. Påfør Chariot kompleksoppløsningen (trinn 4.1) til cellene og rock cellene forsiktig for å sikre en jevn fordeling av oppløsningen. Dyrke cellene under standardbetingelser (trinn 2.2) for en time. Legg serum til en sluttkonsentrasjon på 10%. Ved bruk av nerveceller, legge mediet fra trinn 4.1. Dyrke cellene i 1 til 2 timer.
    MERK:optimal inkubasjonstid er avhengig av størrelsen og egenskapene av lasten, og kan måtte justeres empirisk. Følgende forslag kan tjene som en rettesnor: For peptider, er 1 time vanligvis tilstrekkelig, for proteiner 1-2 timer er anbefalt, for antistoffer to timer, og for transfeksjon av nevroner med antistoffer 4 timer.
  3. Prosess celler for analyse som vanlig. Vennligst merk: teknikken er kompatibel med eksperimenter ved hjelp av festeprotokollene samt levende avbildning.

5. Imaging

  1. Ved hjelp av en laser scanning mikroskop, kan z-stabler av celler og / eller cellekamre av interesse ved å bruke ca. 0,25-0,5 um avstand. Den nøyaktige lag avstand avhenger av størrelsen av den konstruksjon som skal rekonstrueres, og må bestemmes individuelt.

6. Reconstruction

  1. I de følgende trinnene, kan du bruke Esc bunnen for å veksle mellom å velge og navigere, Cntr å velge flere objekter ved å klikke on dem og shift-tasten for å kutte gjenstander (jfr. steg 6,10).
  2. Åpne LSM-filen i Imaris.
  3. Bruke skjermen Justering for hver kanal, kontrast i bildet før de lyseste strukturer nå metning. Vær oppmerksom på at denne justeringen vil ikke påvirke overflaten konstruksjon, den bare tjener til å bistå experimenter i terskel bildet.
  4. Klikk på Legg til nye Overflater ikonet. En veiviser vil åpnes.
  5. Velg: Segment bare et interesseområde. Gå videre til neste trinn.
  6. Juster kantene av valgboksen for å passe din gjenstand for interesse. Vær oppmerksom på at bildet har 3 dimensjoner, og at utvalget må justeres på z-planet også. Hvis den rektangulære formen på valgboksen ikke skal samsvare objektet av interesse ordentlig, slår objektet og / eller forstørre esken til alle nødvendige strukturer er innebygd. Uønskede gjenstander kan fjernes senere (jfr. Steg 6,10). Fortsette.
  7. Velg riktig lmAnnel. The Surface Area Detaljnivå eller sfære diameter bør settes til matche strukturene blir rekonstruert. Avhengig av signalegenskaper, kan enten Absolute Intensitet eller Local Contrast brukes. Vanligvis Local Contrast fungerer bedre for diffuse signaler. I alle fall innstillinger må justeres separat for hver enkelt signal eller strukturen av interesse, respektivt.
  8. Ved hjelp av terskelverdier verktøyet, rekonstruere strukturen av interesse.
  9. Fullfør rekonstruksjon ved å klikke på den grønne pilen nederst.
  10. Juster objektet ytterligere ved hjelp av blyant verktøyet til å kutte og fjerne flater etter behov. Det er kun mulig å kutte i nord-sør retning, derfor vippe bildet for å kutte det ønskede objektet.
  11. Skaff målinger av volum, areal og intensiteter for hver overflate ved å velge statistikk, avansert statistikk og gjennomsnittsverdier.
  12. (Valgfritt trinn) Å observere fargekodede statistikk (jf. Figur 2E F), velg kategorien fargen på den tilsvarende overflaten og merk 'statistikk Coded "i stedet for" base ". Flere alternativer vises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I de følgende avsnittene, eksemplarisk resultatene illustrerer en funksjonell knockdown av et interessepunkt (Simiate, for ytterligere informasjon vennligst se 16, 17) ved hjelp av Chariot reagent og antistoff forstyrrelser blir presentert. Funnene viser at redusert uttrykk for Simiate svekker transkripsjonen aktivitet, og, i en dose avhengig måte, induserer apoptose, som kulminerte i dødelighet på over 99% hvis høyere antistoff mengder (> 1 mg antistoff) brukes (disse funnene ble publisert tidligere i 16). Her har vi nå med de teknikker og protokoller som anvendes i detalj, og dessuten vise hvordan vogn reagens kan anvendes for å transfektere dissosierte hippocampale neuroner i primærkulturer.

For å undersøke hvorvidt Chariot peptider muliggjøre en effektiv skyt av antistoffer og, i særdeleshet, hvis disse antistoffene forblir funksjonell under prosedyren, uttrykte vi FLAG-Simiate I 24 timer i HEK293-celler, og senere transfekteres cellene som benytter vogn koplet rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler (figur 1). Den FLAG-Simiate konstruere er godt uttrykt av HEK293 celler og lokaliserer til somata samt kjernen av disse cellene (Figur 1a). Her FLAG-Simiate klynger betydelig (figur 1B), og dermed speiler den flekkete fordeling av endogent Simiate i kjernen.

Antistoffkomplekser skytteltrafikk over cellemembranen vises i sammenstillinger (figur 1A, i rødt, røde piler), men de frigitte antistoffer oppdage FLAG-Simiate spesifikt som vist ved en dyp colocalization av FLAG-Simiate og rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler (figur 1B , i gul, gul pil). Som av notatet, forsøket ikke bare viser at antistoffene forblir funksjonell under en Chariot-mediertmembran passasjen, men at de også er i stand til å gå inn i kjernen. Siden deres størrelse utelukker antistoffer fra fatt kjernen via diffusjon, er det sannsynlig at det nukleære lokaliseringssignal til stede i vogn selv letter translokasjon av rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler inn i kjernen. Faktisk er antistoff-sammenstillinger også observert ved eller i henholdsvis den nukleære rommet (figur 1B, røde piler).

Bruke rbαSimiate-Chariot komplekser til funksjonelt utarme endogene Simiate i HEK293 celler (figur 2), fant vi ut at vi var i stand til å målrette opp til 80% av de rbαSimiate bindingssteder, ved hjelp av 2,0 mikrogram av antistoffer 16. Interessant, mens skyt gtαrbAlexa568 antistoffer alene inn HEK 293 celler hadde ingen tydelig effekt på utseendet på atom flekker (Figur 2A-C), tap av funksjonelle Simiate avrundet atom flekker (figur 2D-F </ strong>, cp. 16) som vist med tredimensjonale rekonstruksjoner (figur 2B, C vs. E, F), og i en doseavhengig måte, apoptose (figur 3, jfr. 16).

Gitt at nervecellene er svært følsomme for toksiske effekter, også har vi brukt teknikken i grunnskolen hippocampus kulturer (figur 4). Ved hjelp av TUNEL assay og MAP2 farging for å analysere celleintegritet, fant vi ingen effekt på levedyktigheten av neuroner ved sammenligning av uekte eller ubehandlede og behandlede celler Chariot (app. 20-25% TUNEL-positive celler etter 1 + 4 timers behandling, jfr. 4.4 -4,6). Derfor testet vi Chariot mediert antistoff skyt i nevronale kulturer. Etter samme program ordningen ble gtαgpAlexa568 antistoff assemblages sett i varierende strekker seg i ca 83% av cellene, der de skjedde i somata samt kjerner (figur 5A). Disse observasjonene er videre støttet bya tre-dimensjonal analyse (figur 5B) og tett montere bilde sett i HEK293-celler, sammen således viser at den vogn teknikken kan brukes med hell for å transfektere dissosiert primære hippocampale neuroner i tillegg.

Figur 1
Figur 1. FLAG-Simiate blir oppdaget av Simiate spesifikke antistoffer i skytteltrafikk inn HEK293 celler ved hjelp av Chariot reagens. For antistoffinterferensforsøk, rbSimiate-gtrbAlexa568 antistoffer ble ferdig satt sammen før Chariot-antistoff-komplekset formasjon. A) HEK293 celler som uttrykker FLAG-merket Simiate. Simiate antistoff sammensetninger skrive inn soma samt kjernen etter søknad, hvor de colocalize spesielt med FLAG-Simiate. Runde prikker: Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 stillinger (røde piler). B) En høy effekt forstørrelse av eske regioni (A) illustrerer colocalization av FLAG-Simiate og Chariot mediert Simiate signal (gule piler). Vær oppmerksom på tilstedeværelsen av en Chariot antistoff samling i kjernen (rød pil). Skala: 10 mikrometer.

Figur 2
Figur 2. Simiate-spesifikke antistoffer skytteltrafikk inn i HEK293-celler forstyrrer cellulære funksjoner av endogen Simiate. A, B) HEK293-celler som ble behandlet med vogn-gtrbAlexa568 (1 pg) tjener som kontroll. I rødt blir endogent Simiate vist i falske farger, mens Chariot-gtrbAlexa568 assemblages ikke vises. Atom flekker ble merket med markørprotein SC35 (i grønt), mens apoptotiske celler ble identifisert ved TUNEL analysen (i blått). B) Rekonstruksjon av atom flekker fra eske regionen i A. C) Rekonstruksjon av samme region som illustrerer flekk volumer og flateri en fargekodet måte. D, E) HEK293-celler Følgende vogn-rbSimiate behandling (0,5 ug). Endogen Simiate samt Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 sammensetninger er vist i rødt, mens kjernefysiske flekker og apoptotiske celler vises i henhold til A og B. E) Kjernefysiske flekker rekonstruert fra eske regionen i D. F) Den samme region er vist som skissert for C. Vær oppmerksom på avrundede utseende og aggregering av flekker (alle rekonstruksjoner: Imaris programvare). Scale bar i C, F: 2 mikrometer. Alle andre skala barer: 10 mikrometer. 1) For tredimensjonal rekonstruksjon, ble bare ikke-apoptotiske celler brukes.

Figur 3
Figur 3. Høye doser av Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 indusere massiv celledød. HEK293 celler ble behandlet med 2 mikrogram av Chariot-gtrbAlexa568 eller Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 henholdsvis (begge komp lexes vist i grønt og indikert med piler samt forstørrelser). TUNEL merking (i blått) ble anvendt for å identifisere apoptotiske celler. Skala: 10 mikrometer.

Figur 4
Figur 4. Chariot er ikke giftig for primær hippocampus nevroner. AB) DIV 7 nevroner var enten uekte behandlet (medium, A) eller utsatt for Chariot reagens (B) som beskrevet i protokollen for antistoffskyt (1 + 4 timer, cp. 4,4-4,6). Mens SC-35, en markør protein for atom flekker, servert å merke transkripsjon og skjøting maskiner, ble TUNEL flekker brukes til å identifisere apoptotiske celler (grønne piler). C) Ubehandlet og Chariot behandlet DIV 16/17 nerveceller. MAP2 farging ble anvendt for å visualisere de dendrittiske trærne. Skala barer: 10 mikrometer.

pload / 53049 / 53049fig5highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 5. Chariot transfeksjon er kompatibel med nevronale kulturer. A) En representant primære hippocampus nevron fra div 5. Bildet viser z-projeksjoner av stabler tatt med en laser scanning mikroskop (Laser Scanning Microscope 710, Zeiss). Skala: 10 mikrometer. Vær oppmerksom på forekomsten av Chariot-gtgpAlexa568 komplekser (røde) i kjernen og soma av cellen. B) Tredimensjonal rekonstruksjon (Imaris programvare) av kjernen samt gtgpAlexa568 sammensetninger vist i A. Soma og dendritter av nervecellen er angitt med grå prikker, som er destillert fra merking av endogen Simiate. Skala: 10 mikrometer. Antistoff mengde transfektert: 0,25 mikrogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for å studere betydningen av protein ekspresjonsnivåer i å kontrollere cellulære funksjoner i en dose drevet måte. Protokollen er beskrevet gir en finjustert manipulering av protein uttrykk i ulike pattedyrcelletyper, inkludert hippocampus nevroner, dermed legge til rette for detaljerte studier av protein funksjon på cellenivå.

Selv om RNA interferens er en velkjent strategi for å ned-regulere POI, har det sine ulemper (cp. 14). Ikke bare identifisering av en svært spesifikk og effektiv sekvens kan være kostbart og tidkrevende, men også transkripsjon biogenese inne i cellen kan forårsake uventede resultater siden opphopning av giftige RNA-konstruksjoner, en overbelastning av det kjernefysiske eksport maskiner, så vel som et metnings av det endogene RNAi behandlingssystemer kan føre til off-target-effekter eller ineffektivitet. Dessuten kan store mengder av eksogene RNAi vektorer indusere unsPecific effekter også, og forurolige celle homeostase.

Antistoffer, på den annen side, krever ingen ytterligere behandling av endogene machineries når de har kommet inn i cellen, og er effektive straks, dermed støtter ikke bare tidsbesparende eksperimentering, men også undersøkelser av øyeblikkelige cellulære prosesser. Selv om de kan ha uspesifikke off-target effekter, også det økende antall godt karakterisert og svært spesifikke antistoffer tilgjengelig gjør dette alternativet verdt en tanke. Siden levering av makromolekylære komplekser i celler representerer et stort hinder, har ulike transfeksjon teknikker blitt utviklet i løpet av de siste årene, inkludert peptider R8 og azoR8 18 samt mikrosfære 19 mediert skytteltrafikk. Mens R8 og azoR8 ble angitt å oppføre seg på samme måte som Chariot 18, ble mikrosfærer funnet å kreve 24 timer for opptak 19, som er betydelig lengre enn vogn-mediert memBrane passasjer og kan forårsake problemer når studere raskere og doseavhengige cellulære responser.

Bemerkelsesverdig, Chariot teknikken viste seg å være gjeldende for primær hippocampus kulturer, som er svært følsomme for behandlinger og vanskelig å transfektere. Så langt har Chariot bærere blitt brukt til å analysere proteinet i funksjon primære osteoblastkulturer 20 så vel som i glioma neuroblastom-cellelinje NG108-15 21, brud dorsal root ganglia kulturer 21, eller i PC12-celler 22, som stammer fra det nevrale crest, men ikke meldt om noe program i cellekulturer avledet fra det sentrale nervesystemet er tilgjengelig ennå. Siden tradisjonelle transfeksjon reagenser så som Lipofectamine er ineffektive i disse celler og virus transfections intrikate, kan Vogn representerer et interessant alternativ.

Spesielt, vogn selv ble observert å lokalisere til kjernen 15, sannsynligvispå grunn av den nukleære lokaliseringssignal PKKKRKV (jfr. 23). I tråd med disse observasjonene, fant vi at Chariot transfeksjon av rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler resulterte i en tydelig merking av kjernefysiske avdelinger som atom flekker. Faktisk kontrollantistoffer som gtαgpAlexa568 ble også påvist i kjernen av begge, HEK293 og primære hippocampus celler. Siden antistoffer, spesielt i sammensetninger, er altfor stor til å ta fatt i kjernen ved diffusjon og siden Simiate i seg selv ikke inneholder noen kjent nukleære lokaliseringssignal, men snarere går inn i kjernen via diffusjon, er det sannsynlig at den vogn signal er involvert i nukleær lokalisering av antistoffer. Alternativt kan en transport i større protein sammensetninger også være mulig, selv om dette ikke ville forklare tilstedeværelsen av gtαgpAlexa568 i kjernen av dyrkede hippocampale neuroner fra rotter, som det ikke er noe mål for dette antistoff i disse celler. Videre siNCE Chariot ble funnet å ikke forstyrre den naturlige lokalisering av skytteltrafikk peptider og proteiner 15, disse observasjonene tyder på at antistoffer oppfører seg annerledes.

Faktisk, når skytantistoffkomplekser som Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (figur 1) eller Chariot-gtαgpAlexa568 (figur 5) over cellemembraner, vises de i klynger, som bare oppløses, når passende target proteiner som endogene Simiate eller FLAG-Simiate er tilstede (bare i figur 1). Ved hjelp av Chariot antistoffkomplekser i osteoblaster, Selim og høyskoler observert den samme effekten 20. Gitt at vogn ble vist ikke å interferere med lokalisering av peptider og proteiner 15 Disse observasjonene tyder på at sammenstilt vogn antistoffer demontere bare hvis det er en molekylær mekanisme slik som en antistoff-target-interaksjon, som overvinner den hydrofobe interhandlinger mellom Chariot og dens antistoff last, og dermed oppfordrer demontering. Fordi antistoffer er tyngre enn peptider eller de fleste andre proteiner, og har, på grunn av sin form, en stor overflate, kan de forbinder med høyere antall Chariot molekyler og / eller kommunisere mer fast med Chariot peptider, noe som ville derved fremme en mer Vogn-drevet virkemåten av antistoffer. Mangel på en demontering mekanisme vil derfor resultere i et gruppert utseende og en nukleær lokalisering av antistoffet last (figur 5).

Tatt sammen, viser dataene at vogn er spesielt godt egnet for å ta opp funksjon av proteiner som befinner seg i kjernen, og at den kan anvendes i en rekke forskjellige pattedyrcelletyper, inkludert primære hippocampus-neuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Den presenterte arbeidet ble støttet i deler av midler fra den kanadiske Institutes of Health Research / Fragilt X Foundation of Canada partnerskap til RD Instituttet, Jerome Lejeune Foundation til RD, den Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung ved University Erlangen-Nürnberg til RD og fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til RD og RE. Forfatterne ønsker å takke Ingrid Zenger for hjelp i forbindelse med cellekultur vedlikehold samt professor M. Wegner for å lage en pCMV5-FLAG vektor tilgjengelig. Forfatterne videre vil spesielt takke Nadja Schroeder for nyttig støtte ved videoopptak.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics