Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg
Bioengineering

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Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

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Abstract

Una gestione rigorosa di espressione della proteina è essenziale non solo per ogni organismo vivo, ma anche una strategia importante per indagare le funzioni delle proteine ​​in modelli cellulari. Pertanto, una recente ricerca ha inventato diversi strumenti per indirizzare l'espressione della proteina in linee cellulari di mammifero o anche modelli animali, tra cui l'RNA e l'interferenza degli anticorpi. Mentre la prima strategia ha raccolto molta attenzione nel corso degli ultimi due decenni, i peptidi che mediano una traslocazione dei carichi di anticorpi attraverso le membrane cellulari e nelle cellule, ottenute molto meno interesse. In questa pubblicazione, fornendo un protocollo dettagliato come utilizzare un vettore peptide chiamato Chariot in cellule renali embrionali umane come in neuroni ippocampali primari eseguire esperimenti di interferenza anticorpale e illustrano ulteriormente l'applicazione di ricostruzioni tridimensionali per analizzare la funzione delle proteine. I nostri risultati suggeriscono che Chariot è, probabilmente a causa del suo segnale di localizzazione nucleare, particularly ben adatto a bersaglio le proteine ​​che risiedono nel soma e il nucleo. Sorprendentemente, quando si applica Chariot alle culture ippocampali primarie, il reagente si rivelò essere sorprendentemente ben accettato dai neuroni dissociati.

Introduction

Una stretto controllo dell'espressione della proteina è essenziale per ogni organismo vivente per comandare il proprio sviluppo e di reagire a segnali ambientali. Pertanto, un gran numero di meccanismi è stato inventato durante l'evoluzione di regolare con precisione il livello di espressione di ogni proteina codificata dal app. 20.000 geni esistenti in qualsiasi cellula eucariotica in un dato momento della sua vita. Che si svolgono in diverse fasi della produzione di proteine, meccanismi regolatori spaziano dalla gestione della struttura della cromatina, trascrizione e RNA movimentazione alla direzione di modificazioni post-traduzionali di proteine, trasporto e degradazione.

Non è quindi sorprendente che i disturbi del macchinari molecolari e livelli di espressione della proteina alterata sottostante sono stati associati con malattie diverse come il cancro o disabilità intellettiva. In effetti, guardando l'eccezionale complessità dello sviluppo neuronale e la funzione del cervello dei mammiferi, la Sensitività di questi sistemi sofisticati ad alterazioni nel espressione della proteina si manifesta in diversi deficit intellettuali ben noti, tra cui Alzheimer e morbo di Parkinson (AD e PD), così come disturbi dello spettro autistico (ASD) come la sindrome dell'X fragile (FXS). Quest'ultima malattia è caratterizzata da una vasta misexpression di una varietà di proteine, che è dovuto alla perdita di una singola definizione regolazione proteine, FMRP (fragile X ritardo mentale Protein) 1-4. Inoltre, riarrangiamenti cromosomici che interessano la carica variabile legata all'X proteina A (VCXA), una proteina, che gestisce la stabilità mRNA e la traduzione modificando mRNA tappatura 5, sono state recentemente associate a deficit intellettivi, mentre mutazioni puntiformi non sono state identificate nei pazienti con disabilità cognitive fin d'ora 6, 7, il che suggerisce che i disturbi mentali osservati provengono da espressione VCXA alterata e l'espressione disregolazione della sua prote bersaglioins. In linea con questi risultati, uno studio che ha valutato se de novo copia variazioni del numero di geni sono associati con ASD stabilito che duplicazioni di geni nuovi e delezioni sono un fattore di rischio significativo per ASD 8, sostenendo in tal modo l'idea che i livelli di espressione della proteina elevati o diminuiti possono causare deficit intellettuali.

Sorprendentemente, recenti ricerche hanno fornito ulteriore prova che il livello di espressione di una data proteina è regolata con precisione per prevenire l'aggregazione in conseguenza di elevate quantità della proteina con quasi senza margini di sicurezza 9. È stato quindi proposto che anche piccoli incrementi sono sufficienti ad indurre malattie come AD e PD 9. Sebbene la varietà di macchinari molecolari che contribuiscono al controllo espressione della proteina suggerisce uno schema regolazione complessa alla luce di questi risultati, uno studio che ha il livello di espressione di oltre 5.000 geni di mammifero 10 dimostrato chela natura ha preferito uno schema più parsimoniosa: L'abbondanza cellulare di proteine ​​ha dimostrato di essere in prevalenza regolato a livello della traduzione 10, illustrando in tal modo che la gestione della disponibilità di RNA serve soprattutto per mettere a punto l'espressione della proteina.

Studiando la dose di proteine ​​di interesse (POI) è quindi importante non solo per la comprensione delle funzioni endogene di una proteina, ma anche alla ricerca di molte malattie e lo sviluppo di terapie. Così, negli ultimi decenni hanno visto l'avanzata delle diverse strategie utilizzando RNA interferenza di manipolare dosaggio POI. Anche se l'interferenza dell'RNA è ampiamente usato per studiare la funzione delle proteine ​​e viene anche applicata in studi clinici per il trattamento di cancro o di malattie oculari, nonché a perseguire terapie antivirali nei pazienti 11-13, alcune difficoltà possono sorgere che potrebbero rendere la strategia di impossibile. Ad esempio, la sequenza seme, che spinge il colpo per omologia è comparabilitàeffetti a breve, quindi la promozione fuori bersaglio bile. Dal momento che le sequenze altamente efficienti sono rari e hanno bisogno di essere trovato tra migliaia di opzioni (rivisto nel 14), identificando la sequenza giusta può richiedere molto tempo e costoso, ma i risultati possono ancora essere deludente.

Una strategia alternativa è quello di colpire direttamente il POI da anticorpi. Qui, illustriamo l'uso del Carro proteina carrier (prodotto da Active Motif) per ridurre la disponibilità proteina cellulare, e l'impiego di ricostruzioni tridimensionali per studiare la funzione della proteina seguente knock-down.

Il motivo attivo di carro, per sé un 2,8 kDa peptide, viene utilizzato per peptidi navetta, proteine ​​e anticorpi attraverso le membrane delle cellule di mammifero 15. I soci peptide con POI formando non covalente accoppiato complessi macromolecolari che utilizzano interazioni idrofobiche, dopo complessi Chariot-POI vengono internalizzati nelle cellule in un endosome-indmaniera ependent. Importante, Chariot stato indicato per non pregiudicare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​spola, né di esercitare effetti citotossici o di influenzare l'attività biologica del suo carico 15.

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Protocol

1. Le soluzioni madre

  1. Risospendere la polvere motivo attiva liofilizzata in H 2 O sterile ad una concentrazione finale di 2 mg / mL. Toccare con attenzione per la miscelazione.
  2. Preparare piccole aliquote (ad esempio, 12 ml ciascuno, 2 ml sono necessari per reazione) e conservarli a -20 ° C.

2. Preparazione di cellule

  1. Seed cellule di mammiferi come le cellule HEK293 o neuroni primari su un terreno di coltura 24 pozzetti in 500 microlitri tra cui antibiotici.
    NOTA: quando si utilizza i neuroni, seminare le cellule a bassa densità e utilizzare solo le due file centro del piatto ben 24. Ogni pozzetto avrà quindi una controparte vuoto al porto del mezzo durante l'incubazione (passo 4.2). Quando si maneggiano i neuroni, assicurarsi sempre che le cellule non sono tenuti al di fuori dell'incubatore per più di qualche minuto.
  2. Coltivare le cellule in condizioni adeguate (umidificati, 5% di CO 2 e 37 ° C) fino a quando le cellule sono app. 50%confluente.
    NOTA: quando si utilizza i neuroni, la cultura delle cellule fino alla fase di sviluppo desiderata viene raggiunta e cambiare app. 25-50% del mezzo due volte a settimana. Media: media Neurobasal (contenente 1x B27, 5 mM L-glutammina e 1x penicillina e la streptomicina, confrontare con rif 16).

3. Carro formazione del complesso

  1. Per reazione, diluire 0,1-2 ug del POI o il corrispondente anticorpo, nonche la proteina di controllo, o anticorpo di controllo, rispettivamente, in 50 ml di PBS.
    NOTA: La tecnica funziona anche con complessi macromolecolari costituito da anticorpi primari e secondari pre-bound (cp 'Rappresentante Risultati', figura 1.). Mescolare ed effetti.
  2. Per ogni campione, diluire 2 ml soluzione madre Carro in 50 ml di PBS utilizzando tubi separati al fine di evitare l'auto-associazione di Carro. Mescolare ed effetti.
  3. Trasferire il POI o anticorpi (passo 3.1) diluito per la diluizione Chariot per pipettaTing. Mescolare ed effetti.
  4. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente (complessi Chariot-POI formeranno).

4. Trasfezione delle cellule

  1. Diluire i complessi Chariot (punto 3.4) in 100 ml terreno di crescita pre-riscaldato (37 ° C, senza additivi). Rimuovere il supporto e lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 1x PBS.
    NOTA: quando si utilizza neuroni, non gettare il medium, che sarà riutilizzato. Tenerlo a 37 ° C. Per il lavaggio, utilizzare PBS contenente 0,5 mM MgCl 2 e CaCl 2.
    Suggerimento: tenere il mezzo in pozzi vuoti, mentre incubando la piastra (passo 4.5).
  2. Applicare la soluzione complessa carro (passo 4.1) alle cellule e oscillare delicatamente le cellule per assicurare una distribuzione uniforme della soluzione. Far crescere le cellule in condizioni standard (passo 2,2) per 1 ora. Aggiungere siero a una concentrazione finale del 10%. Quando si utilizzano i neuroni, aggiungere il supporto dal punto 4.1. Crescere le cellule per 1 o 2 ore in più.
    NOTA: Iltempo di incubazione ottimale dipende dalle dimensioni e le proprietà del carico e può essere necessario regolare empiricamente. I seguenti suggerimenti possono servire come linea guida: Per peptidi, 1 ora di solito è sufficiente, per le proteine ​​sono raccomandati 1-2 ore, per gli anticorpi 2 ore, e per la trasfezione di neuroni con anticorpi 4 ore.
  3. celle di processo per l'analisi, come al solito. Si prega di notare: la tecnica è compatibile con gli esperimenti che utilizzano i protocolli di fissaggio così come l'imaging dal vivo.

5. Imaging

  1. Utilizzando un microscopio a scansione laser, prendere z-pile di cellule e / o compartimenti cellulari di interesse utilizzando circa 0,25-0,5 micron distanza. La distanza strato precisa dipende dalle dimensioni della struttura da ricostruire e deve essere determinato singolarmente.

6. ricostruzione

  1. Nei passaggi seguenti, utilizzare il fondo Esc per passare da selezionare e spostarsi, Cntr per selezionare più oggetti facendo clic su on loro e tasto shift per tagliare gli oggetti (cfr. punto 6.10).
  2. Aprire il LSM-file in Imaris.
  3. Utilizzando la regolazione di visualizzazione per ogni canale, contrastare l'immagine fino a quando le strutture più brillanti raggiungono la saturazione. Si prega di notare che questa regolazione non influenzerà la costruzione superficie, serve solo ad aiutare lo sperimentatore in thresholding l'immagine.
  4. Fare clic sull'icona Aggiungi nuove superfici. Si aprirà una procedura guidata.
  5. Selezionare: Segmento solo una regione di interesse. Procedere alla fase successiva.
  6. Regolare i margini della casella di selezione per misura il vostro oggetto di interesse. Si prega di tenere presente che l'immagine ha 3 dimensioni e che la selezione deve essere adeguato al piano z pure. Se la forma rettangolare della casella di selezione non deve corrispondere l'oggetto di interesse correttamente, girare l'oggetto e / o ingrandire la casella fino a quando tutte le strutture necessarie sono incorporati. oggetti indesiderati possono essere rimossi in seguito (cfr. punto 6.10). Procedere.
  7. Selezionare il ch appropriataAnnel. La superficie livello di dettaglio o diametro della sfera devono essere impostati in abbinamento alle strutture di essere ricostruito. A seconda delle caratteristiche del segnale, sia assoluta intensità o Contrasto locale possono essere utilizzati. In generale, il contrasto locale funziona meglio per i segnali diffusi. In ogni caso, le impostazioni devono essere regolate separatamente per ciascun segnale o struttura di interesse, rispettivamente.
  8. Utilizzando lo strumento Soglia, ricostruire la struttura di interesse.
  9. Completa la ricostruzione facendo clic sulla freccia verde in basso.
  10. Regolare l'oggetto ulteriormente utilizzando lo strumento matita per tagliare e rimuovere le superfici, come richiesto. È possibile solo tagliare in direzione nord-sud, quindi inclinare l'immagine per tagliare l'oggetto desiderato.
  11. Ottenere misurazioni di volume, area e intensità per ogni superficie da Statistics selezione, statistiche dettagliate, e valori medi.
  12. (Passo opzionale) Per osservare le statistiche color-coded (cfr. Figura 2E F), selezionare la scheda colore della superficie corrispondente e Mark 'Statistica Coded' invece di 'base'. verranno visualizzate diverse opzioni.

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Representative Results

Nei paragrafi che seguono, i risultati esemplari che illustrano un atterramento funzionale di un POI (Simiate, per ulteriori dettagli si rimanda 16, 17) utilizzando Chariot reagente e l'interferenza degli anticorpi sono presentati. I risultati dimostrano che l'espressione diminuita Simiate compromette l'attività trascrizionale, e, in un modo dipendente dosaggio, induce apoptosi, che si conclude con i tassi di mortalità di oltre il 99% se vengono applicati quantità di anticorpi più alti (> 1 mg di anticorpi) (queste scoperte sono state pubblicate in precedenza in 16). Qui, ora presentiamo le tecniche e protocolli impiegati in dettaglio e, inoltre, dimostra come Chariot reagente può essere utilizzato per trasfezione neuroni dell'ippocampo dissociate in colture primarie.

Per studiare se peptidi Chariot permettono una spola efficiente di anticorpi e, in particolare, se questi anticorpi rimangono funzionale durante la procedura, abbiamo espresso FLAG-Simiate Per 24 ore in cellule HEK293 e successivamente trasfettate le cellule utilizzando Chariot accoppiati rbαSimiate-gtαrbAlexa568 macromolecole (Figura 1). Il costrutto FLAG-Simiate è ben espressa da cellule HEK293 e localizza al somata così come i nuclei di queste cellule (Figura 1A). Qui, FLAG-Simiate cluster in modo significativo (Figura 1B), rispecchiando in tal modo la distribuzione punteggiato di endogena Simiate nel nucleo.

I complessi anticorpo spola attraverso la membrana cellulare, appaiono in assemblaggi (Figura 1A, a, frecce rosse rosse), ma gli anticorpi rilasciati rilevano FLAG-Simiate specificamente come mostrato da una profonda colocalizzazione di FLAG-Simiate e le macromolecole rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figura 1B , in giallo, freccia gialla). Come di nota, l'esperimento non solo dimostra che gli anticorpi rimangono funzionali nel corso di un carro-Mediatedpassaggio della membrana, ma che sono anche in grado di entrare nel nucleo. Poiché le loro dimensioni esclude anticorpi da intraprendere nucleo per diffusione, è probabile che il segnale di localizzazione nucleare presente nel carro stesso facilita la traslocazione di macromolecole rbαSimiate-gtαrbAlexa568 nel nucleo. Infatti, assemblaggi anticorpi sono anche osservati a o, rispettivamente, il compartimento nucleare (Figura 1B, frecce rosse).

Utilizzando rbαSimiate-Chariot complessi per esaurire funzionalmente Simiate endogena in cellule HEK293 (figura 2), abbiamo scoperto che siamo stati in grado di indirizzare fino al 80% dei siti di legame rbαSimiate, utilizzando 2,0 mg di anticorpi 16. È interessante notare che, mentre la spola anticorpi gtαrbAlexa568 solo in cellule HEK 293 non hanno avuto effetti evidenti sulla comparsa di macchie nucleari (Figura 2A-C), la perdita di Simiate funzionale raccordata chiazze nucleari (Figura 2D-F </ strong>, cp. 16) come illustrato dalle ricostruzioni tridimensionali (Figura 2B, C vs E, F) e, in modo dose-dipendente, indotta (Figura 3, cp. 16).

Dato che le cellule neuronali sono molto sensibili agli effetti tossici, abbiamo anche applicato la tecnica in colture primarie ippocampali (Figura 4). Utilizzando test TUNEL e MAP2 colorazione per analizzare l'integrità delle cellule, abbiamo riscontrato alcun effetto sulla vitalità dei neuroni quando si confrontano le cellule finte o non trattate e Chariot trattati (App. Cellule positive 20-25% TUNEL dopo 1 + 4 ore di trattamento, cp. 4.4 -4.6). Quindi, abbiamo testato Chariot anticorpo mediata spola in colture neuronali. Seguendo lo stesso schema di applicazione, gtαgpAlexa568 assemblaggi di anticorpi sono stati visti in varia estende in circa il 83% delle cellule, dove si sono verificati negli somata così come nuclei (Figura 5A). Queste osservazioni sono ulteriormente supportati bya analisi tridimensionale (Figura 5B) e strettamente rimontare l'immagine vista in cellule HEK293, insieme evidenziando così che la tecnica carro può essere utilizzato con successo per trasfettare dissociato neuroni ippocampali primari.

Figura 1
Figura 1. FLAG-Simiate viene rilevato da anticorpi specifici Simiate spola in cellule HEK293 utilizzando Chariot reagente. Per gli esperimenti di interferenza di anticorpi, anticorpi rbSimiate-gtrbAlexa568 sono stati premontati prima della formazione del complesso Chariot-anticorpo. A) HEK293 cellule che esprimono FLAG-tagged Simiate. Simiate assemblaggi anticorpi entrano soma nonché il nucleo seguente applicazione, dove colocalize specificamente FLAG-Simiate. puntini rotondi: assemblaggi Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 (frecce rosse). B) Un ingrandimento elevato potere della regione inscatolatoin (A) che illustra la colocalizzazione di FLAG-Simiate e Chariot mediata segnale Simiate (frecce gialle). Si prega di notare la presenza di un anticorpo assemblaggio carro nel nucleo (freccia rossa). barra della scala: 10 micron.

figura 2
Figura 2. anticorpi Simiate-specifici spola in cellule HEK293 interferiscono con le funzioni cellulari di endogena Simiate. A, B) HEK293 cellule trattate con carro-gtrbAlexa568 (1 mg) servono come controllo. In rosso, endogena Simiate è mostrato in falsi colori, mentre assemblaggi Chariot-gtrbAlexa568 non vengono visualizzati. macchioline nucleari sono stati etichettati con il SC35 proteina marcatore (in verde), mentre le cellule apoptotiche sono stati identificati mediante test TUNEL (in blu). B) Ricostruzione di macchie nucleari provenienti dalla regione in scatola in A. C) Ricostruzione della stessa regione che illustrano i volumi macchiolina e superficiin maniera codificata colore. D, E) HEK293 cellule in seguito al trattamento Chariot-rbSimiate (0,5 mg). Endogena Simiate così come Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblaggi sono mostrati in rosso, mentre macchioline nucleari e cellule apoptotiche sono visualizzati in base ad A e B. E) macchioline nucleari ricostruiti dalla regione in scatola in D. F) La stessa regione è mostrato come delineato per C. Si prega di notare l'aspetto raggiato e l'aggregazione di macchioline (tutte le ricostruzioni: software Imaris). barra della scala in C, F: 2 micron. Tutte le altre barre di scala: 10 micron. 1) Per la ricostruzione tridimensionale, sono stati utilizzati solo le cellule non apoptotiche.

Figura 3
Figura 3. Alte dosi di Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 inducono la morte delle cellule di massa. HEK293 cellule sono state trattate con 2 mg di rispettivamente Chariot-gtrbAlexa568 o Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568, (entrambi comp Lexes mostrati in verde e indicati dalle frecce e ingrandimenti). etichettatura TUNEL (in blu) è stato applicato per identificare le cellule apoptotiche. barra della scala: 10 micron.

Figura 4
Figura 4. Carro non è tossico per i neuroni dell'ippocampo primari. AB) DIV 7 neuroni erano o finto trattati (media, A) o sottoposti a reagente Chariot (B) come descritto nel protocollo per l'anticorpo spola (1 + 4 ore, cp. 4.4-4.6). Mentre SC-35, una proteina marker per macchioline nucleari, è servito a etichettare i macchinari trascrizione e splicing, TUNEL è stata applicata per identificare le cellule in apoptosi (frecce verdi). C) non trattati e trattati Chariot DIV 16/17 neuroni. MAP2 colorazione è stata applicata per visualizzare gli alberi dendritiche. Barre di scala: 10 micron.

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Figura 5. Chariot transfezione mediata è compatibile con colture neuronali. A) un rappresentante primario neurone dell'ippocampo da div 5. L'immagine mostra z-proiezioni di pile scattate utilizzando un microscopio a scansione laser (Laser Scanning Microscope 710, Zeiss). barra della scala: 10 micron. Si prega di notare la presenza di complessi Chariot-gtgpAlexa568 (rosso) nel nucleo e la soma della cellula. B) Ricostruzione tridimensionale (software Imaris) del nucleo, così come assemblaggi gtgpAlexa568 mostrato in A. Soma e dendriti del neurone sono indicate da punti grigi, che vengono distillati da etichettatura dei endogena Simiate. barra della scala: 10 micron. quantità di anticorpi trasfettate: 0,25 mg.

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Discussion

Qui, presentiamo un protocollo per studiare il significato dei livelli di espressione della proteina nel controllo funzioni cellulari in modo dose guidato. Il protocollo descritto consente una manipolazione perfezionato dell'espressione proteica in vari tipi di cellule di mammifero, inclusi neuroni dell'ippocampo, facilitando così studi dettagliati di funzione proteica a livello cellulare.

Anche se l'interferenza dell'RNA rappresenta una strategia ben noto a down-regolare POI, che ha i suoi svantaggi (cfr. 14). Non solo l'identificazione di una sequenza altamente specifico e efficiente può essere costoso e richiede tempo, ma anche biogenesi trascrizione all'interno della cella può causare risultati imprevedibili poiché l'accumulo dei costrutti RNA tossici, un sovraccarico della macchina di esportazione nucleare e una saturazione della RNAi endogena sistemi di elaborazione possono provocare effetti off-target o inefficienza. Inoltre, elevate quantità di vettori esogeni possono indurre RNAi unseffetti specifici applicabili pure, e perturbano l'omeostasi cellulare.

Anticorpi, d'altra parte, non richiedono ulteriore elaborazione mediante macchinari endogeni una volta entrati cellula, e sono efficaci immediatamente, sostenendo così non solo sperimentazione risparmiare tempo, ma anche ricerche di processi cellulari immediati. Anche se possono avere effetti non specifici fuori bersaglio, anche l'aumento del numero di anticorpi ben caratterizzati e altamente specifiche disponibili rende questa alternativa la pena di pensiero. Poiché la fornitura di complessi macromolecolari in cellule rappresenta un grande ostacolo, diverse tecniche di trasfezione sono state sviluppate nei ultimi anni, compresi i peptidi R8 e azoR8 18 nonché microsfere 19 spola mediata. Mentre R8 e azoR8 sono stati indicati a comportarsi in modo simile a Chariot 18, microsfere sono stati trovati a richiedere 24 ore per l'assorbimento 19, che è considerevolmente più lungo di mem Chariot-mediatapassaggi brane e possono causare difficoltà quando si studia la dose risposte cellulari dipendenti più veloce e.

Sorprendentemente, la tecnica di Carro si è rivelata applicabile alle culture dell'ippocampo primarie, che sono molto sensibili ai trattamenti e di difficile trasfezione. Finora, i vettori Chariot sono stati utilizzati per analizzare la funzione delle proteine ​​in colture primarie di osteoblasti 20 e nella linea cellulare di neuroblastoma-glioma NG108-15 21, radici dorsali pulcino culture gangli 21, o in cellule PC12 22, che provengono dalla neurale cresta, ma segnalazioni di qualsiasi applicazione in colture cellulari derivate dal sistema nervoso centrale sono ancora disponibili. Dal momento che i reagenti di trasfezione tradizionali come Lipofectamine sono inefficienti in queste cellule e trasfezioni virali intricate, Biga potrebbe rappresentare un'alternativa interessante.

In particolare, Chariot stesso è stato osservato per localizzare al nucleo 15, probabilmentegrazie al suo segnale PKKKRKV localizzazione nucleare (cfr. 23). In linea con queste osservazioni, abbiamo scoperto che Chariot mediata trasfezione delle macromolecole rbαSimiate-gtαrbAlexa568 ha determinato una chiara etichettatura dei compartimenti nucleari come chiazze nucleari. Infatti, sono stati rilevati anticorpi di controllo quali gtαgpAlexa568 nel nucleo di entrambi, HEK293 e cellule ippocampali primarie. Poiché gli anticorpi, in particolare in assemblaggi, sono troppo grandi per intraprendere il nucleo per diffusione e poiché Simiate sé non contiene alcun segnale di localizzazione nucleare noto, ma entra nel nucleo per diffusione, è probabile che il segnale carro è coinvolto nella localizzazione nucleare di anticorpi. In alternativa, un trasporto in assemblaggi di proteine ​​più grandi potrebbe anche essere possibile, anche se questo non spiegherebbe la presenza di gtαgpAlexa568 nel nucleo dei neuroni ippocampali di ratti, in quanto non vi è alcun obiettivo per questo anticorpo in queste cellule. Inoltre, siSNO Chariot è stato trovato per non interferire con la localizzazione fisica di peptidi e proteine ​​15 spola, queste osservazioni suggeriscono che gli anticorpi si comportano diversamente.

In effetti, quando la spola complessi anticorpo quali Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figura 1) o Chariot-gtαgpAlexa568 (Figura 5) attraverso le membrane cellulari, compaiono a grappoli, che si sciolgono solo, se del caso proteine ​​bersaglio, come endogena Simiate o FLAG-Simiate sono presenti (solo in Figura 1). Utilizzando Chariot anticorpo in osteoblasti, Selim e collegi hanno osservato lo stesso effetto 20. Dato che Chariot stato dimostrato non interferire con la localizzazione di peptidi e proteine ​​15, queste osservazioni indicano che carro montato anticorpi smontare solo se vi è un meccanismo molecolare come un'interazione anticorpo-bersaglio, che supera l'inter idrofobaazioni tra Carro e il suo carico di anticorpi e, quindi, incoraggia lo smontaggio. Poiché gli anticorpi sono più pesanti peptidi o la maggior parte delle altre proteine ​​e hanno, a causa della loro forma, una grande superficie, si può associare con più alto numero di molecole di carro e / o interagire più costante con peptidi Chariot, che sarebbe quindi promuovere una più Chariot-driven comportamento degli anticorpi. La mancanza di un meccanismo di smontaggio produrrebbe pertanto un aspetto raggruppato e una localizzazione nucleare del carico anticorpi (Figura 5).

Presi insieme, i dati mostrano che carro è particolarmente adatto per affrontare la funzione delle proteine ​​che risiedono nel nucleo e che è applicabile in una varietà di tipi di cellule di mammifero inclusi neuroni ippocampali primari.

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Acknowledgements

Il lavoro presentato è stato sostenuto in parte da un finanziamento dal Canadian Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation del programma di partnership Canada a RD, Jerome Lejeune Fondazione di RD, il Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung dell'Università di Erlangen-Norimberga di Rd e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft di RD e RE. Gli autori desiderano ringraziare Ingrid Zenger di assistenza tecnica con la manutenzione coltura delle cellule così come il Prof. M. Wegner per fare un vettore pCMV5-FLAG disponibili. Gli autori inoltre desiderano ringraziare particolarmente Nadja Schroeder per il supporto utile alla ripresa video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

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References

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