एक microfluidic प्रेसिजन छोटे मात्रा नमूना प्रसंस्करण के लिए प्लेटफार्म और एक ध्वनिक microdevice से अलग जैविक कणों का आकार के लिए इसके उपयोग

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
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Bioengineering
 

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Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

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Abstract

Microfluidic उपकरणों का एक प्रमुख लाभ इस प्रकार अभिकर्मक कचरे को कम करने और कीमती नमूना संरक्षण, छोटा सा नमूना मात्रा में हेरफेर करने की क्षमता है। हालांकि, मजबूत नमूना हेरफेर प्राप्त करने के लिए यह macroscale पर्यावरण के साथ डिवाइस एकीकरण को संबोधित करने के लिए आवश्यक है। Microfluidic उपकरणों के साथ repeatable, संवेदनशील कण जुदाई का एहसास करने के लिए, इस प्रोटोकॉल microfluidic उपकरणों का उपयोग कर 0.15-1.5 मिलीलीटर नमूनों की सटीक प्रसंस्करण के लिए सक्षम बनाता है कि एक पूर्ण स्वचालित और एकीकृत microfluidic मंच प्रस्तुत करता है। इस प्रणाली के महत्वपूर्ण पहलुओं को बंद लूप नमूना संग्रह, सफाई व्यवस्था और repeatable संचालन को सुनिश्चित करने के लिए कदम भड़काना accomplishes जो मॉड्यूलर उपकरण लेआउट और कनेक्शन चिप के लिए विश्वसनीय और लचीला दुनिया में जिसके परिणामस्वरूप मजबूत फिक्सचर, और पूरी तरह से स्वचालित तरल पदार्थ से निपटने में शामिल हैं। विभिन्न microfluidic उपकरणों इस वास्तुकला के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम एक acoustofluidic डिवाइस शामिल करने, विस्तार इसकी characterizसमझना, प्रदर्शन अनुकूलन, और जैविक नमूने का आकार-अलग होने के लिए इसके उपयोग प्रदर्शित करता है। जुदाई प्रयोगों के दौरान वास्तविक समय प्रतिक्रिया का उपयोग करके, नमूना संग्रह के संरक्षण और नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए अनुकूलित है। उपकरणों के कई टुकड़े के एकीकरण की आवश्यकता होती है, यह वास्तुकला के फायदे के लिए कोई अतिरिक्त प्रणाली अनुकूलन, डिवाइस प्रतिस्थापन में आसानी, और सटीक, मजबूत नमूना प्रसंस्करण के साथ अज्ञात नमूनों को संसाधित करने की क्षमता शामिल है।

Introduction

नमूना जुदाई और विभाजन microfluidic प्रौद्योगिकी के लिए आवेदन की सबसे आशाजनक क्षेत्रों में से एक है। ऐसे नमूने से निपटने के कदम प्रभावी नैदानिक ​​निदान, चिकित्सा विज्ञान के विकास, biosurveillance प्रयासों, और जीवन विज्ञान अनुसंधान और प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के लिए अभिन्न अंग हैं। असंख्य microfluidic जुदाई रणनीतियों के साथ-साथ रासायनिक और जैविक प्रजातियों के लिए तरल पदार्थ से निलंबित विविक्त और कोलाइड, के लिए प्रदर्शन किया गया है; 9 - कई समीक्षाएँ इन क्षेत्रों 1 में हाल की प्रगति और विकास की रूपरेखा प्रदान करते हैं। (इसके बाद "कोर उपकरणों" के रूप में करने के लिए कहा गया है) इन microfluidic जुदाई प्रौद्योगिकियों के कई बड़े पैमाने पर किया गया विशेषता है हालांकि, कुछ रिपोर्टों एक प्रणाली के स्तर पर नमूना जुदाई समस्या पर विचार किया है। कोर उपकरणों आम तौर पर एक विस्थापन या दबाव पंप द्वारा दिया तरल पदार्थ के साथ, फ्लोरो ट्यूबिंग को interfaced व्यक्ति सेंटीमीटर पैमाने पर चिप्स, कर रहे हैं।नमूना संस्करणों में स्वचालन, विश्वसनीयता, और कमी वृद्धि हुई सहित - - microfluidics का वादा करता है, तो फिर भी, कम से कम एक बराबर प्रयास कोर डिवाइस एकीकृत है जो में एक पूरा जुदाई प्रणाली के डिजाइन के लिए समर्पित किया जाना चाहिए, वास्तविकता बन गया है ।

इसके अलावा, biodetection को microfluidic दृष्टिकोण के लिए एक बड़ी चुनौती सूक्ष्म इंटरफ़ेस करने के लिए मैक्रो है। यह ~ macroscale घटकों के लिए एक microfluidic डिवाइस के भौतिक "दुनिया करने वाली चिप" कनेक्शन करने के लिए, और ठेठ नैदानिक ​​या विश्लेषणात्मक नमूना संस्करणों (~ 0.1-10 एमएल) और microfluidic चिप्स के आंतरिक मात्रा के बीच बेमेल (करने के लिए न केवल संदर्भित करता है 0.01-10 μl), लेकिन यह भी इन आकार तराजू ब्रिजिंग से उत्पन्न होने वाली सांख्यिकीय नमूना सीमाओं के। इन मुद्दों नमूना पूर्व प्रसंस्करण और तैयारी biodetection के 'कमजोर कड़ी' हैं कि धारणा के लिए योगदान करते हैं। 10 इस काम टा में वर्णित मंचइन चुनौतियों के समाधान की ओर केन्याई प्रमुख कदम।

एक प्रणाली स्तर लेने को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल ~ 10 मिनट पर timescales (0.15 से 1.5 मिलीग्राम से लेकर) ठीक-मीटर के जरिए विश्लेषणात्मक पैमाने संस्करणों के विश्वसनीय प्रसंस्करण विवरण। यह एक "एक बटन" ऑपरेशन है: अंश संग्रह के लिए नमूना और गंतव्य शीशियों युक्त स्रोत शीशी प्रणाली में रखा जाता है एक बार, "रन" आदेश प्रक्रिया शुरू की है, और सभी कदम कंप्यूटर नियंत्रित कर रहे हैं। एक रन के अंत में, संग्रह शीशियों अलग अंशों के बहाव के विश्लेषण के लिए सिस्टम से हटाया जा सकता है।

इस प्रणाली में कोर डिवाइस नमूना से स्तनधारी सेल आकार (5-20 माइक्रोन) कणों निकालता है जो एक acoustophoresis चिप है। Acoustophoretic जुदाई यह उच्च throughput है इसका मुख्य कारण यहां चुना जाता है, लेबल मुक्त, और गैर संपर्क, इस प्रकार व्यवहार्य वीरू को अलग करने में लाभ की पेशकश (μl / मिनट के 100s तक)कुछ अन्य microfluidic तकनीक मेल कर सकते हैं कि कोशिकाओं से एसईएस। 13 और इस प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित नहीं कर रहे हैं, लेकिन अंतर्निहित अवधारणाओं का एक संक्षिप्त सारांश microfluidic जुदाई के लिए आवेदन को समझने में सहायता करने के लिए इस प्रकार है - ध्वनिक कण के भौतिकी बड़े पैमाने पर, 11 में वर्णित किया गया है केंद्रित थी।

तरल पदार्थ से भरे microchannels में गूंजती अल्ट्रासाउंड खड़े तरंगों कम दबाव के नोड्स की ओर कणों कि ड्राइव बलों को जन्म दे जो दबाव के खेतों, उत्पादन। बल परिमाण ध्यान केंद्रित ध्वनिक आदर्श आकार सेल (~ 7-15 की जुदाई के लिए अनुकूल है, कण की मात्रा पर निर्भर करता है, और इस तरह के रूप में सापेक्षिक घनत्व और कण की compressibilities से निकाली गई एक ध्वनिक विपरीत कारक और निलंबित तरल पदार्थ पर। 14 वायरस आकार (~ 50-200 एनएम) कणों से माइक्रोन)। बड़े कणों एक दबाव नोड ओर पलायन; हालांकि, बल परिमाण के बाद के लिए बहुत छोटा हैछोटे से 2-3 माइक्रोन, इन छोटे कणों या भंग प्रजातियों शायद ही सब पर कदम कण। ध्वनिक जुदाई की हमारी विशिष्ट कार्यान्वयन, पहले से वर्णित के रूप में, 15 द्रव चैनल प्रतिभाग करने के लिए एक पतली दीवार को शामिल किया गया और ट्यून करने योग्य, ध्यान केंद्रित कर स्थिति की असममित नियुक्ति की अनुमति देता। इस उपकरण के डिजाइन में लचीलापन कहते हैं, और प्रदर्शन लाभ सहित वृद्धि की जुदाई गुणवत्ता और गति-कर रहे हैं पूरी तरह से कहीं वर्णित। 16,17

हालांकि, इस काम में वर्णित प्रणाली स्तर डिजाइन दृष्टिकोण का एक बड़ा लाभ यह microfluidic कोर उपकरणों की एक महान विविधता के लिए अनुकूल है। उचित समायोजन इनलेट / आउटलेट विन्यास में परिवर्तन के लिए खाते में बनाया के साथ उदाहरण के लिए, जड़त्वीय, प्रवाह क्षेत्र विभाजन, नियतात्मक पार्श्व विस्थापन (DLD), और electrokinetic उपकरणों के विभिन्न प्रकार सहित अधिकांश अन्य निरंतर प्रवाह जुदाई मोड, आसानी से शामिल किया जा सकता , प्रवाह की दरें,और नमूना संस्करणों। विभिन्न पर चिप क्षेत्रों के प्रकार (बिजली, चुंबकीय) या ढ़ाल (थर्मल, रसायन) के साथ उपकरणों इस मंच accommodates जो चिप, या अतिरिक्त हार्डवेयर के एकीकरण, के लिए अतिरिक्त कनेक्शन की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल एक microfluidic जुदाई डिवाइस डिजाइन करने के लिए, और नक़्क़ाशी और passivation के चक्र बारी गहरी हासिल करने के लिए उपयोग करता है, जो कई microfabrication सुविधाओं में (गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी द्वारा उपलब्ध DRIE, एक प्लाज्मा खोदना प्रक्रिया सिलिकॉन कांच चिप्स के निर्माण के लिए आवश्यक कदम प्रदान करता है खड़ी sidewalls 18) के साथ सुविधाएँ। अगला, हम acoustofluidic डिवाइस के लक्षण वर्णन के अलग होने के लिए इष्टतम ऑपरेटिंग मानकों का निर्धारण करने के लिए, और अंत में विस्तार से पूरी तरह से एकीकृत जुदाई प्रणाली और जैविक नमूने प्रसंस्करण के लिए प्रक्रिया का वर्णन है। ठेठ युक्ति लक्षण परिणाम और नमूना प्रसंस्करण डेटा तब प्रस्तुत किया और चर्चा है, और इस appro के प्रमुख लाभ कर रहे हैंACH प्रतिरूपकता, मजबूती, सटीक और स्वचालन सहित डाला जाता है।

Protocol

1. Acoustophoretic डिवाइस डिजाइन और photomask लेआउट

नोट: जनरल विचार और microfabrication प्रक्रिया डिजाइन और मुखौटा लेआउट के लिए मार्गदर्शन photomask डिजाइन की microfabrication पर ग्रंथों और ट्यूटोरियल में पाया जा सकता है 19-21।

  1. उचित सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, मास्क 1, fluidic परत (सामने की ओर) बाहर करना। वांछित आवेदन के लिए उचित नमूना इंजेक्शन और जुदाई परमिट एक ज्यामिति चुनें।
    1. ध्वनिक ध्यान केंद्रित के लिए एक गुंजयमान आवृत्ति n प्रदान करने के लिए डब्ल्यू, fluidic चैनल चौड़ाई सेट एक 900 माइक्रोन विस्तृत चैनल के लिए प्रासंगिक तरल पदार्थ में ध्वनि की गति है और n खड़ी-लहर नोड्स (जैसे की संख्या है, जहां समीकरण एफ एन = नेकां / 2W, के अनुसार 1 मेगाहर्ट्ज से अधिक से अधिक, दो नोड गूंज एफ 2 = 1.65 मेगाहर्ट्ज) पर उम्मीद है।
      नोट: कणअलग दुकानों से बाहर निकलना चाहिए जुदाई चैनल के अंत के पास अलग पार्श्व पदों पर बैठे है। इस प्रोटोकॉल में, कण आकार से अलग हो रहे हैं, तो चित्र 1 में दिखाया के रूप में दुकानों, क्रमशः छोटे कण और बड़े कण आउटलेट, के लिए एसपीओ और LPO, नामित कर रहे हैं।
    2. समय कणों की लंबाई एक विशिष्ट प्रवाह दर पर जुदाई क्षेत्र को उजागर कर रहे नियंत्रित करने के लिए तरल पदार्थ चैनल लंबाई निर्धारित करें। लंबे समय तक कणों जुदाई बलों के कारण विस्थापित करने के लिए पर चिप निवास समय बड़ा आवश्यक चिप पदचिह्न के खिलाफ बंद का कारोबार किया जाना चाहिए।
      नोट: हमारी ध्वनिक ध्यान केंद्रित उपकरणों में, प्रवाह चैनल वृद्धि हुई निवास समय (चित्रा 2) के लिए चिप नीचे तीन गुजरता बनाता है। 300 x 200 माइक्रोन पार अनुभाग, 117 मिमी लंबी जुदाई चैनल के माध्यम से बह 200 μl / मिनट, कण का एक विशिष्ट कुल प्रवाह दर पर ध्वनिक क्षेत्र में औसत 2.1 सेकंड पर खर्च करते हैं।
  2. मुखौटा Layo में fluidic बंदरगाहों में शामिलएक मानकीकृत ग्रिड (5 मिमी पिच) पर व्यवस्था मानक ट्यूबिंग के लिए कनेक्शन के लिए संघ राज्य क्षेत्र। निर्माण और व्यक्तिगत उपकरणों के dicing के दौरान एक दूसरे के लिए मास्क के संरेखण के लिए उपयुक्त विश्वस्त चिह्न शामिल करें।
  3. मास्क 2, केवल fluidic बंदरगाहों में शामिल हैं जो के माध्यम लेयर (पीछे की ओर), बाहर करना। संरेखण एक मुखौटा करने के लिए विश्वस्त चिह्न शामिल करें।

चित्र 1
चित्रा 1. Acoustofluidic डिवाइस। Acoustophoretic डिवाइस वास्तुकला के योजनाबद्ध रेखाचित्र। (क) कुल मिलाकर एच फिल्टर विन्यास दिखा शीर्ष दृश्य, (पैमाने पर नहीं)। (ख) काले द्वारा चिह्नित स्थान पर चैनल पार अनुभाग के योजनाबद्ध में लाइन धराशायी (क), दबाव क्षेत्र (नीली लाइनों बिंदीदार), और की ओर कणों कि ड्राइव ध्वनिक प्राथमिक विकिरण बलों (पीआरएफ) की भावना दिखा नोडल विमानों (लाल तीर)। चैनल पार अनुभागलगभग 10 माइक्रोन मोटी मुख्य (300 माइक्रोन चौड़ा) और बाईपास चैनलों को अलग करने के लिए एक दीवार के साथ 900 × 200 माइक्रोन है। (ग) कण जुदाई की 3 डी प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Acoustophoresis के लिए microfluidic चिप्स 2. Cleanroom निर्माण

  1. पैटर्न एक डबल साइड पर नकाब 2 का उपयोग कर वापस साइड द्रव बंदरगाहों मानक सकारात्मक विरोध फोटोलिथोग्राफी द्वारा 0.5 मिमी मोटी, 100 मिमी व्यास <100> सिलिकॉन वेफर पॉलिश। 350-400 माइक्रोन की गहराई तक गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (DRIE) द्वारा इस ज्यामिति खोदना।
  2. वेफर पर बारी और पैटर्न सामने साइड तरल पदार्थ चैनल ज्यामिति मानक द्वारा मास्क 1 का उपयोग सिलिकॉन के दूसरे पक्ष पर फोटोलिथोग्राफी सकारात्मक-विरोध। फिर, photoresist का उपयोग कर एक दूसरे (खाली सिलिकॉन) वाहक वेफर के लिए डिवाइस वेफर माउंट।
  3. के माध्यम से नक़्क़ाशी बंदरगाह स्थानों (वाहक वेफर DRIE उपकरण सतह की रक्षा करता है) में सिलिकॉन, 200 माइक्रोन की गहराई तक, DRIE द्वारा भी, चैनल खोदना। में भिगोने के समाधान का विरोध-अलग करना द्वारा खाली सी वफ़र से डिवाइस वेफर डी-माउंट।
  4. डिवाइस वेफर और (: 1 के अनुपात में एक 3 में सल्फ्यूरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड) पिरान्हा समाधान का उपयोग कर एक कुरूप 0.5 मिमी मोटी borosilicate ग्लास वेफर साफ करें।
  5. Anodically निम्नलिखित मानकों का उपयोग गिलास और सिलिकॉन वेफर्स से संबंध द्रव चैनलों सील: 350 डिग्री सेल्सियस पर 1000 एन, तापमान पर 3 mTorr, पिस्टन दबाव में चैम्बर दबाव है, और 0.2 मा नीचे वर्तमान बूंदों तक 750 वी लागू होते हैं।
  6. एक dicing देखा पर एक हीरा ब्लेड के साथ व्यक्तिगत चिप्स के अलावा कट।

3. अंतिम विधानसभा डिवाइस

  1. पीजो ट्रांन्सड्यूसर अनुलग्नक
    नोट: अल्ट्रासाउंड सिलिकॉन तरफ से जुड़ी एक piezoceramic ट्रांसड्यूसर द्वारा microfluidic चिप में उत्पन्न होता है।
    1. से तकWO-घटक कम चिपचिपापन epoxy किट, दोनों घटकों की सिफारिश अनुपात वजन और उन्हें अच्छी तरह से मिला लें।
    2. एक विंदुक के साथ epoxy मिश्रण बांटना और एक पतली, यहां तक ​​कि परत (37.5 × 10 × 0.5 मिमी के आयाम के साथ एक पीजो के लिए epoxy मिश्रण के लगभग 10 μl) बनाने के लिए एक titanate नेतृत्व zirconate (PZT) piezoceramic भर में समान रूप से फैला।
    3. एक उपयुक्त जिग या स्थिरता का उपयोग करना, बाद में तार लगाव (चित्रा 2 देखें) के लिए एक तरफ एक के ऊपर क्षेत्र प्रदान करने, microfluidic चिप के साथ piezoceramic की epoxy ओर संरेखित, और संपर्क में दो घटक लाने के लिए। घटकों में से किसी को दरार नहीं ख्याल रख रही है, एक उप में विधानसभा दबाना, और epoxy निर्माता से सिफारिश तापमान और अवधि पर इलाज।
    4. Epoxy के ठीक हो जाने के बाद, तार टी से बचने के लिए पीजो साथ छोटा संभव संपर्क, एक ठीक-टिप टांका लोहे के साथ टांका बनाकर, piezoceramic के प्रत्येक पक्ष की ओर जाता है ठीक गेज देते हैंhermally डी-ध्रुवीकरण यह। वैकल्पिक रूप से, पीजो के लिए तारों गोंद के लिए एक प्रवाहकीय चिपकने का उपयोग करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Fluidic breadboard, चिप बढ़ती है, और विश्व के लिए चिप इंटरफ़ेस। (क) ध्वनिक microfluidic चिप की तस्वीरें संलग्न पीजो ट्रांसड्यूसर तार नेतृत्व के साथ (70 × 9 × 1 मिमी बाहरी आयाम), जुदाई की तीन गुजरता दिखा चिप नीचे चैनल, (ख) चिप करने वाली दुनिया इंटरफेस, (ग) clamping जुड़नार का उपयोग कर fluidic breadboard के नीचे करने के लिए मुहिम शुरू की चिप, के लिए कस्टम fluidic पेंच फिटिंग और मशीनीकृत ट्यूबिंग घटकों breadboard में एक खोलने फैले अनुमति देने के लिए TUBI इंटरफेस है कि प्रशंसक ठंडा, (घ) संलग्न ट्यूबिंग कनेक्शन और शीतलन प्रशंसक के साथ breadboard के एक शीर्ष दृश्य, और (ङ) पेंच फिटिंग की एक पार के अनुभागीय योजनाबद्धघुड़सवार microfluidic चिप के साथ एनजी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. डिवाइस बढ़ते और विश्व करने वाली चिप Interfacing
    1. "Fluidic breadboard" clamping जुड़नार का उपयोग कर (के माध्यम से छेद पिरोया नियमित रूप से स्थान दिया गया का एक ग्रिड के साथ एक प्लेट) करने के लिए चिप देते हैं। ध्वनिक प्रयोगों के दौरान तापमान को विनियमित करने के लिए breadboard के एक शीतलन प्रशंसक संलग्न (चित्र 2 देखें)।
      नोट: विशिष्ट ड्राइव वोल्टेज पर ठंडा प्रशंसक बिना ऑपरेटिंग 70-80 डिग्री सेल्सियस के लिए डिवाइस तापमान उठाती है। यह काफी होने के कारण तरल पदार्थ में बदल ध्वनि के वेग को गुंजयमान आवृत्ति बदलाव, और नकारात्मक कार्रवाई की जा रही है कि किसी भी जैविक कणों की व्यवहार्यता पर असर पड़ सकता है।
    2. पहले से कहीं और 22 में वर्णित है और चित्रा 2 में दिखाया गया है, चिप करने वाली दुनिया कनेक्टर्स में भाड़ में। ये मैं शामिलमानक का उपयोग inlets और दुकानों पर अतिरिक्त ट्यूबिंग को nterface नलियों ¼ "-28 1/16 के लिए यूनियनों" ट्यूबिंग।

ध्वनिक ध्यान केंद्रित प्रदर्शन 4. विशेषता

नोट: ध्वनिक ध्यान केंद्रित लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक सिस्टम घटक सामग्री सूची में एक साथ बांटा जाता है। 4.1 कदम और बाद के चरणों यहाँ पर चर्चा acoustofluidic डिवाइस के लिए विशिष्ट कार्यों का वर्णन है, जबकि 4.2 से नीचे है, इस मंच के साथ इस्तेमाल किसी भी कोर डिवाइस के लिए लागू होते हैं।

  1. प्रणाली विन्यास
    1. एक तरल पदार्थ पंप और संग्रह शीशियों के लिए ट्यूबिंग (जैसे 1/16 "बाहरी व्यास फ्लोरो ट्यूबिंग) का उपयोग कर धारा 3. कनेक्शन में वर्णित है, fluidic breadboard पर दुनिया करने वाली चिप कनेक्शन का उपयोग microfluidic चिप इकट्ठा। एक सीसीडी कैमरा से लैस प्रतिदीप्ति इमेजिंग में सक्षम एक खुर्दबीन के मंच पर breadboard विधानसभा माउंट।
    2. छोटे भीतरी diamete की लंबाई कनेक्टआर (आईडी) ट्यूबिंग तुरंत प्रणाली को स्थिर और चिप दुकानों के बीच प्रवाह बंटवारे जो नियंत्रण प्रवाह restrictors, के रूप में काम करने के लिए चिप (देखें चित्रा 4) के बाद (0.006 "सिफारिश की है)। अन्य सभी कनेक्शन के लिए, इस तरह के 0.01 "या 0.03" के रूप में बड़ा आईडी ट्यूब का प्रयोग करें।
      1. Μ तरल पदार्थ के गतिशील चिपचिपापन है जहां लंबाई एल और समीकरण आर का उपयोग कर भीतरी व्यास डी = 128 μL / πD 4, साथ ट्यूबिंग के एक टुकड़े की हाइड्रोडायनामिक प्रवाह प्रतिरोध आर का अनुमान है। कारण एक दिया प्रवाह दर क्यू पर ट्यूबिंग के प्रत्येक लंबाई करने के लिए दबाव ड्रॉप Δ पी Δ पी = क्यूआर द्वारा दिया जाता है।
      2. जुदाई विधि का इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए उचित रूप में दुकानों के बीच प्रवाह को विभाजित करने की restrictor लंबाई के अनुपात चुनें। इस प्रोटोकॉल में ध्वनिक चिप्स के साथ इष्टतम जुदाई एक एसपीओ की आवश्यकता है: approxima के LPO प्रवाह अनुपातtely 65: 35%।
      3. आउटलेट प्रवाह restrictors की लंबाई चुनें ऐसी है कि उनकी fluidic प्रतिरोध प्रणाली (उचित रूप से श्रृंखला या समानांतर में अभिव्यक्त किया है) के बाकी हिस्सों में कुल प्रतिरोध की तुलना में कम से कम 3-4 गुना बड़ा है। इस काम में इस्तेमाल acoustophoresis डिवाइस के लिए, ट्यूबिंग 35 की लंबाई और LPO और एसपीओ के लिए 65 सेमी उपयुक्त हैं।
        नोट: सावधानी से विचार किसी भी microfluidic कोर डिवाइस के आर एच के लिए दिया जाना चाहिए। हमारे ध्वनिक इस काम में चिप ध्यान केंद्रित के लिए, आर एच इसकी वजह से अपेक्षाकृत बड़े चैनल आयामों को कम है, तो जुड़ा ट्यूबिंग प्रतिरोध आसानी से यह अधिक है। छोटे चैनल आयामों के साथ उपकरणों के लिए, चिप की प्रतिरोधक मामले डिजाइन और पर चिप चैनल आर का नियंत्रण इस प्रोटोकॉल के चरण 1 के दौरान एक अतिरिक्त विचार है जिसमें सिस्टम ट्यूबिंग के बाकी है, पर हावी हो सकते हैं। विस्तृत डिजाइन सिद्धांतों और दिशा निर्देशों के साहित्य में उपलब्ध हैं। 23,24
  2. सिस्टम जांच
    1. लीक microfluidic युक्ति कोई दोष है और सभी ट्यूबिंग कनेक्शन सील कर रहे हैं कि यह पुष्टि करने के लिए जाँच करें। एक सिरिंज के साथ जरूरत के रूप में इनलेट ट्यूब के माध्यम से पानी बांटना और मुख्य चैनल में किसी भी तरल पदार्थ लीक करने के लिए निगरानी।
    2. चिप के माध्यम से एक ज्ञात मात्रा बांटना, और प्रवाह अनुपात उम्मीद है कि यह सुनिश्चित करने के आउटलेट से एकत्र की मात्रा को मापने। उम्मीद की मात्रा अनुपात से विचलन के आउटलेट या लीक कनेक्शनों में से एक में रुकावटों का संकेत हो सकता।
      1. सिस्टम सफाई बनाए रखने और पहले और किसी भी प्रयोगों चलाने के बाद उचित सफाई समाधान (जैसे, ब्लीच, इथेनॉल, पानी) के साथ पूरे सिस्टम (fluidic ट्यूबिंग और चिप) फ्लश clogging रोकने के लिए।
      2. रुकावट स्पष्ट करने के लिए स्पष्ट आउटलेट plugging जबकि दुकानों में से एक में मोज़री या रुकावटों की घटना में, सिस्टम फ्लश। इस असफल होता है, निस्तब्धता दौरान प्रवाह की दिशा रिवर्सवैकल्पिक रूप से (एक स्वयं-actuated सिरिंज का उपयोग) रिवर्स प्रवाह की तेजी से दालों को लागू करने। अभी भी रुकावट नहीं हटाया जा सकता है, तो अंत में, आवश्यक के रूप में ट्यूबिंग या चिप, जगह।
  3. ध्वनिक ध्यान केंद्रित के लिए फ्रीक्वेंसी स्कैन सेटअप
    1. ऐसे विआयनीकृत पानी, इथेनॉल, या एक सिरिंज के साथ मैनुअल इंजेक्शन द्वारा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के रूप में तरल पदार्थ के साथ बाईपास चैनल (चित्रा 1 देखें) भरें। नमूना कार्रवाई की जा रही के साथ इस तरल पदार्थ के संपर्क में नहीं आता है कि ध्यान दें। अलग बाईपास तरल पदार्थ का उपयोग नोड स्थिति का समायोजन का ब्यौरा कहीं और 16,17 वर्णित हैं। नोड विभाजन की दीवार के करीब होने की जरूरत है कि अगर संक्षेप में, इथेनॉल जैसे, एक कम-घनत्व बाईपास तरल पदार्थ का उपयोग करें; करीब इनपुट नमूना स्ट्रीम करने के लिए नोड प्लेसमेंट के लिए, इस तरह के एक ग्लिसरॉल समाधान के रूप में, एक सघन तरल पदार्थ चुनें।
    2. (V / डब्ल्यू) 5-8 माइक्रोन फ्लोरोसेंट बहुलक मोती के साथ पीबीएस के रूप में एक बफर में निलंबित लगभग 0.01% का मनका समाधान करें0.05% बीच 20 और मनका समाधान के साथ नमूना इनलेट सिरिंज भरें। (इस बाईपास चैनल के रूप में ही तरल पदार्थ होने की जरूरत नहीं है) ही बफर के साथ बफर इनलेट सिरिंज भरें। सामान्य रूप में, बफर आवेदन (5.1 कदम देखें) सूट करने के लिए चुना जाता है कि ध्यान दें।
    3. खुर्दबीन मंच पर fluidic breadboard के साथ, बस देखने के क्षेत्र में दोनों चैनलों (जुदाई और बाईपास) के साथ दुकान से पहले एक सीधे चैनल क्षेत्र में चैनल की गहराई में लगभग आधे रास्ते में ध्यान केंद्रित। एक अतिरिक्त परोक्ष कोण बाहरी प्रकाश स्रोत छवि डेटा की सफल बाद के प्रसंस्करण के लिए, चैनल दीवारों दिखाई बनाने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  4. स्वचालित आवृत्ति स्कैन और छवि पर कब्जा
    1. पीजो ट्रांसड्यूसर को उत्तेजना संकेत देने के लिए रेडियो फ्रीक्वेंसी (आरएफ) एम्पलीफायर के साथ एक समारोह में जनरेटर के लिए (जैसे, आरजी -58 BNC connectors के साथ सुसज्जित) परिरक्षित केबल का उपयोग कर बिजली के कनेक्शन बनाओ। वैकल्पिक रूप से, करने के लिए एक आस्टसीलस्कप कनेक्टवास्तविक वोल्टेज की निगरानी के लिए समारोह जनरेटर के उत्पादन में ट्रांसड्यूसर के लिए आवेदन किया।
    2. ठंडा प्रशंसक पर बारी, और चोटी से पीक (वी पीपी) वोल्ट पीजो ट्रांसड्यूसर के लिए आरएफ एम्पलीफायर के उत्पादन 12-25 की रेंज में है कि इस तरह के समारोह जनरेटर सेट।
    3. 50 और 200 μl / मिनट के बीच एक ही प्रवाह की दर से दोनों सीरिंज सेट करें। एक ही मोटर के साथ दोनों सीरिंज ड्राइव करने के लिए एक एकल सिरिंज पंप का प्रयोग प्रवाह करने के लिए अव्यवस्थाएं कम से कम करने की सिफारिश की है।
    4. आरंभ और अंत आवृत्तियों, आवृत्ति मूल्यों के बीच कदम आकार, और इस तरह नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स LabVIEW के रूप में एक प्रयोगशाला स्वचालन टूलकिट का उपयोग पीजो ड्राइव वोल्टेज निर्दिष्ट द्वारा एक आवृत्ति स्कैन प्रक्रिया करते हैं।
    5. प्रत्येक आवृत्ति कदम पर, इस प्रणाली को संतुलित करने के लिए, तो (सिफारिश कर रहे हैं 10 और 100 मिसे के बीच जोखिम बार) 10 के बाद के विश्लेषण के लिए चिप के माध्यम से बह मोतियों की छवियों पर कब्जा अनुमति देने के लिए 15 सेकंड के लिए वोल्टेज लागू होते हैं।
    6. ई के बीचACH मोती चैनल भर में समान रूप से विभाजित करना और पहले से लागू किया आवृत्ति कदम से ध्यान केंद्रित करने में पूर्वाग्रह को दूर जाने के लिए लगभग 20 सेकंड के लिए वोल्टेज बंद कर देते हैं, आवृत्ति कदम लागू होता है।
  5. छवि विश्लेषण गुंजयमान आवृत्ति और ध्यान केंद्रित स्थिति का निर्धारण करने के लिए
    1. (जैसे कि इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदान की AF_freqScanPlotter.m MATLAB स्क्रिप्ट के रूप में) एक छवि विश्लेषण स्क्रिप्ट चलाने के लिए और संकेतों का पर आवश्यक जानकारी दर्ज करें: चरण 4.4 में उत्पन्न छवि फाइलों की सूची का चयन करें, स्कैन शुरू दर्ज करें और आवृत्तियों और कदम आकार को रोकने, पूर्ण चैनल चौड़ाई, दीवार स्थान, और अंत में जुदाई और बाईपास चैनलों सहित दोनों का विश्लेषण करने के लिए छवि क्षेत्र का चयन करें।
    2. विश्लेषण स्क्रिप्ट औसत प्रत्येक आवृत्ति कदम पर कब्जा कर लिया छवियों के सेट पर गौर करें, और प्रवाह दिशा के साथ तीव्रता मूल्यों औसत। इस प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक पार अनुभाग लाइन-स्कैन में यह परिणाम है।
      नोट: highe के लिए इसी आवृत्ति सेंट तीव्रता गुंजयमान आवृत्ति (चित्रा 3, मध्य पंक्ति), और उच्चतम तीव्रता ध्यान केंद्रित कर स्थिति (चित्रा 3, नीचे पंक्ति) है तब होता है जहां चैनल में स्थिति के रूप में परिभाषित किया गया है।

चित्र तीन
अच्छी तरह से युग्मित (ए) के लिए आवृत्ति स्कैन डेटा और खराब युग्मित (बी) पीजो और चिप की चित्रा 3। प्रतिनिधि आवृत्ति स्कैन। उदाहरण। शीर्ष पंक्ति: मोतियों की फ्लोरोसेंट तीव्रता (लाल उच्च प्रतिनिधित्व करता है, और नीले रंग के कम तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है)। मध्य पंक्ति: प्रत्येक आवृत्ति पर अधिकतम तीव्रता। नीचे पंक्ति: अधिकतम तीव्रता द्वारा निर्धारित रूप में लाल धराशायी लाइन स्थिति ध्यान केंद्रित भविष्यवाणी इंगित करता है जहां अधिकतम तीव्रता के स्थान, और लाल हीरे गुंजयमान आवृत्ति संकेत मिलता है।जी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. स्वचालित पृथक्करण

नोट: स्वचालित जुदाई प्रयोग की वजह से microfluidic चिप में लागू आकार पर निर्भर ध्वनिक ध्यान केंद्रित बलों को छोटे कणों से बड़े कण अलग करने के लिए चलाया जाता है। आवश्यक सिस्टम घटक सामग्री सूची में एक साथ बांटा जाता है।

  1. सिस्टम विन्यास और नमूना तैयार
    1. चित्रा 4 में दिखाया गया है सिरिंज पंप करने के लिए microfluidic चिप कनेक्ट, कंप्यूटर नियंत्रित बहु बंदरगाह चयन वाल्व, पीसी-interfaced प्रवाह मीटर, और ट्यूबिंग,। यह विन्यास microfluidic जुदाई चिप के माध्यम से नमूने के प्रसंस्करण स्वचालित है, के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित सक्षम बनाता है प्रयोगों के बीच कदम सफाई पार संदूषण और नमूना ले जाने वाला दूर करने के लिए।
    2. करने के लिए विश्लेषण परख द्वारा अपेक्षित के रूप में कोशिकाओं या कणों के लिए उपयुक्त एक नमूना बफर का प्रयोग अलग कर दिया, या किया जाना हैजुदाई के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है। चरण 4.3.2 के रूप में, वसूली बफर (लेकिन जरूरी नहीं कि बाईपास द्रव) नमूना तरल पदार्थ से मेल खाना चाहिए।
      नोट: आम तौर पर जैविक नमूने (जैसे, पीबीएस) के साथ प्रयुक्त कोई जलीय बफ़र्स पानी के समान ध्वनिक गुण होते हैं और appreciably ध्वनिक डिवाइस के प्रदर्शन को नहीं बदलेगा। घनत्व और पानी से काफी अलग चिपचिपाहट के साथ नमूना तरल पदार्थ का उपयोग संभव है, लेकिन केवल महत्वपूर्ण acoustophoresis अनुभव के साथ ऑपरेटरों के लिए सिफारिश की है।


चित्रा 4
स्वचालित पृथक्करण प्रयोगों के लिए चित्रा 4. ध्वनिक प्रणाली विन्यास। ब्लू लाइन प्रणाली के माध्यम से मुख्य प्रवाह पथ का पता लगा। सभी हरे और काले लाइनों 0.03 "भीतरी व्यास (आईडी) ट्यूबिंग, और सभी नीले और ग्रे रंग की लाइनों 0.01 कर रहे हैं कर रहे हैं" ई के साथ, आईडी ट्यूबिंगआईडी "0.006 हैं जो आईडी, और प्रवाह restrictors," 0.03 रहे हैं, जो पकड़े कॉयल, की xception। सीरिंज बफर के साथ भरा है, और पकड़े कॉयल सीरिंज में किसी भी नमूने या सफाई अभिकर्मकों के तेज रोकने के लिए पर्याप्त मात्रा (550 μl) कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पृथक्करण प्रक्रिया
    1. पूर्व रन राज्य। जुदाई चल रहा से पहले, सफाई अभिकर्मक जलाशयों (ब्लीच, इथेनॉल, बफर) पर्याप्त तरल पदार्थ है कि यह सुनिश्चित, अपशिष्ट जलाशयों पूरा नहीं कर रहे हैं, और द्रव लाइनों primed हैं (यानी, समाधान के साथ भरा)। उत्तरार्द्ध हालत अनिश्चित है, या सिस्टम सुस्ती के बाद पहली बार के लिए चलाया जा रहा है, तो (उदाहरण के लिए, एक भी दिन पर पहली बार), एक स्वचालित प्रक्रिया सफाई चलाते हैं (नीचे 5.3 चरण देखें)। अनुसंधान कौशल बर्बाद करने के लिए प्रवाह करने के लिए चिप दुकानों पर वाल्व 3 और 4 सेटशुरू में rvoirs।
    2. ठंडा प्रशंसक पर बारी, और 4.5 कदम में निर्धारित के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा ध्वनिक चिप के लिए गुंजयमान आवृत्ति पर समारोह जनरेटर सेट। समारोह जनरेटर पर वोल्टेज सेट बिंदु समायोजित इतना है कि वांछित अलग होने के लिए उचित रूप में 12 और 25 वी पीपी बीच आरएफ एम्पलीफायर आउटपुट।
    3. इस प्रणाली के लिए नमूना इनपुट शीशी, बफर इनपुट शीशी, और उचित संग्रह शीशियों कनेक्ट करें। बस अपनी पिक ट्यूबिंग के लिए नमूना इनपुट शीशी संलग्न करने से पहले, भंवर शीशी संक्षेप में बसे हो सकता है कि किसी भी कणों फिर से निलंबित करने के लिए। फिर, शीशी देते हैं और बिना किसी देरी के जुदाई दिनचर्या आरंभ करें।
      चेतावनी: संसाधित करने के लिए नमूना संभावित संक्रामक एजेंट होता है, तो शीशियों एक मोहरबंद प्रणाली को बनाए रखने और नमूना aerosolization को रोकने के लिए, एक पेंच शीर्ष प्रकार का होना चाहिए। Biohazardous सामग्री के साथ काम कर रहे हैं जब आवश्यक सुरक्षा उपकरण पहनने और अनुरोध का उपयोग करते समय इसके अलावा, सभी शीशियों और ट्यूबिंग संभालजैविक जोखिम समूह और जैव सुरक्षा स्तर के लिए uired खतरा नियंत्रण और प्रक्रियाओं सामग्री के लिए उपयुक्त। किसी भी अनिश्चितता के मामले में संस्थागत नीतियों और प्रोटोकॉल से परामर्श करें।
    4. , वाल्व नियंत्रण सेंसर प्रवाह और पूरी तरह से स्वचालित जुदाई दिनचर्या से बाहर ले जाने के लिए पंप करने के लिए एक प्रयोगशाला स्वचालन टूलकिट में एक कार्यक्रम का प्रयोग करें।
      नोट: सामान्य, वाल्व स्विच सिरिंज पंप वापसी और अर्क को सक्रिय करता है, और मॉनिटर सही ढंग से उत्पादन नमूना अंशों का संग्रह समय के लिए सेंसर डाटा प्रवाह। मैन्युअल से बाहर किया जाता है, तो के रूप में प्रमुख कदम है, 5.2.4.3 के माध्यम से 5.2.4.1 में नीचे संक्षेप हैं।
      1. प्रधानमंत्री पिक ट्यूबिंग। पूरी तरह से इसके साथ ही वाल्व 1. करने के लिए इसे जोड़ने ट्यूब को भरने के लिए नमूना इनपुट शीशी से लगभग 15 μl वापस ले लें, इसी तरह फैशन में 2. वाल्व को बफर इनपुट शीशी जोड़ने ट्यूब प्रधानमंत्री, वाल्व 1 के प्रधानमंत्री हवा प्रवेश यह सुनिश्चित करना है कि कोई तरल पदार्थ होता है। अंत में, किसी भी बर्बाद करने के लिए निष्कासित करने के लिए वाल्व 1 और 2 के लिए स्विचलोड हो रहा है कुंडली में प्रवेश किया है कि अतिरिक्त तरल पदार्थ या हवा।
      2. चित्रा 5 ए में दिखाया गया है, नमूना तार लोड करें। एक 250 μl नमूना प्रसंस्करण के लिए एक ठेठ लोड हो रहा है अनुक्रम 50 μl / मिनट, 200 μl / मिनट पर प्रमुख बफर के 35 μl के द्वारा पीछा 200 μl / मिनट, पर नमूने की तो 250 μl, और अंत में हवा के 25 μl वापस लेने के लिए है 50 μl / मिनट में हवा का एक और 25 μl।
        नोट: सभी संस्करणों और प्रवाह दरों उपयोगकर्ता के चयन कर रहे हैं। इस लोडिंग अनुक्रम द्रव प्लग जुदाई डिवाइस के माध्यम से प्रवाह होगा कैसे की रिवर्स क्रम में है कि ध्यान दें।
      3. नमूना जान फूंकना शुरू करो। वांछित दर (आमतौर पर 100 μl / मिनट) पर लोड द्रव प्लग तर करने के लिए सिरिंज पंप सेट करें। कि प्रवाह स्थिर है और 4.1 चरण में निर्धारित अनुपात में है, और उस clogging नहीं हुआ है सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह सेंसर के साथ एसपीओ और LPO में प्रवाह की दर की निगरानी करें।
      4. अलग अंशों लीजिए। प्रवाह सेंसर प्रवाह की दर में एक कील का पता लगाने, देहात का संकेतपहले हवा खाई की ssage, एक नमूना संग्रह शीशी (यह कदम 5.2.1 में शुरू कर दिया है) कचरे से इसी उत्पादन वाल्व स्विच।
      5. चिप से नमूना के पारित होने के बाद, प्रवाह सेंसर दूसरी हवा खाई का पता लगाने के निरीक्षण करते हैं। इस बिंदु पर, बर्बाद करने के लिए वापस उत्पादन वाल्व स्विच। चरण 5.2.4.2 से भरी हुई पूरी मात्रा तिरस्कृत होने के बाद, सिरिंज पंप अर्क को रोकने और प्रवाह की दर शून्य तक पहुँच जाता है जब स्वचालन दिनचर्या समाप्त।
    5. जुदाई प्रयोग पूरा होने के बाद, एसपीओ और LPO नमूना संग्रह शीशियों काटना और बाद के विश्लेषण के लिए उचित रूप से उन्हें दुकान।
  2. स्वचालित सफाई और परिशोधन
    नोट: प्रत्येक नमूना, फ्लश प्रक्रिया से पहले और निम्न स्वचालित दिनचर्या का उपयोग कर पूरे fluidic सिस्टम शुद्ध करना।
    1. Throu प्लावित हो जाएगा कि अतिरिक्त सफाई समाधान इकट्ठा करने के लिए एसपीओ और LPO संग्रह शीशी नलियों, साथ ही खाली शीशियों में नमूना पिक ट्यूब सुरक्षितनलियों gh।
    2. स्वचालित प्रणाली सफाई दिनचर्या शुरू करें। कदम 5.2 में स्वचालित पृथक्करण की प्रक्रिया के साथ के रूप में, वाल्व और सिरिंज पंप पर नियंत्रण करना चाहिए कार्यक्रम सफाई अभिकर्मकों के साथ पकड़े तार लोड क्रमिक करने के लिए, और इस प्रणाली के माध्यम से उन्हें फ्लश।
    3. 70% इथेनॉल के साथ तो, 10% ब्लीच से भरा है, और पानी या एक उपयुक्त खारा बफर के साथ खत्म होता है (उदाहरण के लिए, 1x पीबीएस या नमूना प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल बफर): निम्न सफाई नियमित प्रदर्शन। ब्लीच और इथेनॉल के लिए 450 μl, और पानी / बफर के लिए 1,000 μl: निम्नलिखित फ्लश की मात्रा का प्रयोग करें।
    4. LPO आउटलेट वाल्व अवरुद्ध है कि एक बंदरगाह के लिए सेट कर दिया जाता है, जबकि निस्तब्धता चरणों के दौरान, आउटलेट प्रवाह restrictors में किसी भी संभावित मोज़री दूर करने के लिए, ठीक इसके विपरीत है तो, एसपीओ में प्रत्येक अभिकर्मक फ्लश। एसपीओ या LPO या तो अवरुद्ध है जब ट्यूबिंग और backpressure buildup में बुलबुला पीढ़ी को कम से कम करने के लिए 300-500 μl / मिनट की वापसी और अर्क प्रवाह की दर को बनाए रखें।
    5. Discaअतिरिक्त निस्तब्धता समाधान और वे जैविक या रासायनिक कचरे से निपटने के लिए उचित प्रक्रिया का पालन करके एकत्र जिसमें शीशियों RD।

Representative Results

ध्वनिक-microfluidic युक्ति डिजाइन की मुख्य विशेषताएं चित्रा 1 में प्रकाश डाला, और पूरी तरह से कहीं वर्णित हैं। 15 संक्षिप्त, दो द्रव धाराओं के प्रवाह पक्ष द्वारा साइड एक अलग चैनल में में, एक पतली सिलिकॉन दीवार से एक समानांतर बाईपास चैनल से अलग कर दिया। प्राथमिक विकिरण बल परिमाण कण की मात्रा के साथ तराजू के बाद से छोटे कणों मूल धारा (चित्रा 1 बी, सी) में रहते हैं, जबकि बड़े कण, आसन्न वसूली द्रव धारा में स्थित ध्वनिक दबाव नोड की ओर मिश्रित नमूना इनपुट स्ट्रीम से बाहर आ जाते हैं। उप-विभाजित दो चैनल वास्तुकला कण जुदाई 17 में सुधार और विभिन्न बाईपास चैनल तरल पदार्थ का उपयोग करके नोड स्थिति के समायोजन की अनुमति देता है। दुनिया कनेक्शन चिप के लिए के लिए 16 fluidic breadboard और फिक्सचर एक मजबूत मंच प्रदान करता है, और मॉड्यूलर डिजाइन fluidic चिप्स के बीच तेजी से बदलते सक्षम बनाता है (चित्रा 2)। इसे देखेंonfiguration वैसे ही जो मुहर 1,000 साई तक, जल्दी और मज़बूती (चित्रा 2 बी, ई) बना दिया जाए, प्रतिवर्ती द्रव कनेक्शन की अनुमति देता है।

एक चिप के गुंजयमान आवृत्ति रिस सरल -1 डी विश्लेषणात्मक गणना का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है (1.1.1 कदम को देखें)। हमारे डिवाइस पार अनुभाग, 16 की एक और पूरी 2D परिमित तत्व मॉडल से 2 नोड गूंज के लिए उम्मीद ध्यान केंद्रित कर स्थिति की दीवार से 225 माइक्रोन है और उम्मीद की आवृत्ति 1.68 मेगाहर्ट्ज है। हालांकि, वास्तविक उपकरणों की रिस ऑपरेटिंग तापमान और अनुदैर्ध्य और पार्श्व अनुनादों के युग्मन पर निर्भर करता है, ± 100 किलोहर्ट्ज़ से भिन्न हो सकते हैं। प्रोटोकॉल के चरण 4 में वर्णित के रूप में इसलिए, डिवाइस विधानसभा के बाद, रिस अनुभव से, प्रासंगिक प्रवाह दरों और पीजो ड्राइव वोल्टेज पर सत्यापित किया जाना चाहिए। चित्रा 3, 200 μl / मिनट पर लिया प्रतिनिधि आवृत्ति स्कैन से पता चलता है मुख्य और बाईपास चैनलों में पानी, और 20 वी पीपी के साथ पीजो करने के लिए आपूर्ति की। पीजो और microfluidic युक्ति के बीच युग्मन अच्छा हो गया है, कणों की उम्मीद ध्यान केंद्रित कर स्थिति (चित्रा 3) के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता और प्रवास में एक स्पष्ट चोटी है, जिसके परिणामस्वरूप गुंजयमान आवृत्ति पर कसकर ध्यान दिया जाएगा। गरीब युग्मन है जब वहाँ इसके विपरीत, कणों में अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित नहीं होगी और आवृत्ति स्कैन के परिणाम 3 बी चित्रा के समान हो जाएगा। इस तरह के उपकरणों में, पीजो ट्रांसड्यूसर एक प्रतिवर्ती चिपकने वाला इस्तेमाल किया गया है, तो फिर से मुहिम शुरू करने की आवश्यकता हो सकती है; ध्यान केंद्रित कर उच्च गुणवत्ता वाले या तेजी से प्रवाह आवश्यक आवेदन के लिए महत्वपूर्ण हैं जब अन्यथा, इस डिवाइस अनुपयुक्त है। चित्रा 3 में डेटा बाद के प्रयोगों के लिए ऑपरेटिंग आवृत्ति की पसंद है, और वोल्टेज सूचित और कुशल कणों जुदाई के लिए उपलब्ध दर सीमा प्रवाह।

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चित्रा 5. नमूना प्रसंस्करण स्वचालित। नमूना कुंडली में भरी हुई नमूना (ए) योजनाबद्ध। (बी) के एक सफल जुदाई प्रयोग के प्रतिनिधि प्रवाह प्रोफ़ाइल। (सी) एसपीओ आउटलेट लगभग 220 सेकंड में भरा हुआ है, जिसके दौरान चलाए जा रहे एक जुदाई से प्रोफ़ाइल प्रवाह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रभावी विभाजक हैं कि चिप्स की पहचान करने के बाद, वे चित्रा 4 में दिखाया गया है प्रणाली में शामिल कर रहे हैं। कुल सिस्टम में बह मात्रा मुख्य प्रवाह मार्ग के किनारे 0.01 "भीतरी व्यास के साथ ट्यूबिंग का उपयोग करके कम से कम है (नीली लाइनों)। चित्रा 5 ए मेकअप दिखाता है प्रणाली के माध्यम से संचार एक ठेठ नमूना प्लग की। "अग्रणी बफर" (~ 35 μl) की एक छोटी राशि prece करने की आवश्यकता हैडी नमूना जुदाई चिप के माध्यम से आगे बढ़ रहा है, जबकि प्रवाह में उतार-चढ़ाव को खत्म करने के प्रवाह में नमूना। चित्रा 5 ब एक सफल स्वचालित ध्वनिक जुदाई प्रयोग से उत्पन्न प्रवाह डेटा से पता चलता है। एक सफल चलाने की मुख्य विशेषताएं शामिल हैं: LPO और एसपीओ दोनों में प्रवाह की दर में (1) एक क्षणिक वृद्धि दबाव बनाता है और तरल पदार्थ प्रणाली के माध्यम से प्रवाह करने के लिए शुरू होता है, (2) एक हवाई बुलबुले के पारित होने का संकेत एक तेज कील ( इनसेट कारण दो दुकानों से असमान प्रवाह को LPO पहले एसपीओ तक पहुंच जाना चाहिए जो एक बुलबुला), की एक विस्तारित प्रोफ़ाइल से पता चलता है, इस प्रणाली के माध्यम से नमूना कदम के रूप में दो हवा के बुलबुले के बीच दोनों दुकानों के माध्यम से (3) स्थिर प्रवाह, और (4) पूर्ण नमूना मात्रा के बाद दोनों दुकानों में प्रवाह की दर में एक क्रमिक कमी प्रणाली के लिए दिया जाता है। समस्याग्रस्त रन यह एसपीओ लगभग 220 सेकंड के बाद भरा हो गया प्रतीत होता है कि जहां 5C, चित्रा के समान प्रवाह प्रोफाइल से तुरंत स्पष्ट कर रहे हैं। में यह मामला है, 5.3 चरण में वर्णित है कि इसी तरह एक सफाई प्रक्रिया चैनल unclog करने के लिए चलाया जाना चाहिए।

चित्रा 6
चित्रा 6 डिवाइस tunability: कण आकार और वोल्टेज प्रभाव। LPO में निकाले polystyrene microspheres का प्रतिशत piezoceramic के लिए आपूर्ति कण आकार और वोल्टेज पर निर्भर करता है। प्रत्येक पंक्ति है डिवाइस के माध्यम से चरण 4. कुल प्रवाह की दर में वर्णित के रूप में चुना गया गुंजयमान आवृत्ति पर एक अलग ऑपरेटिंग वोल्टेज, से मेल खाती 200 μl / मिनट, 1.62 और 1.64 मेगाहर्ट्ज के बीच लागू ड्राइव आवृत्तियों के साथ। त्रुटि सलाखों में कम से कम तीन अलग-अलग प्रयोगों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। Reproduced और http://pubs.rsc.org / एन / सामग्री / ArticleLanding / 2014 / एएन / c4an00034j से रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी की अनुमति के द्वारा संशोधित किया।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6 से पता चलता विभिन्न पॉलीस्टीरिन कण आकार और कुशल जुदाई के लिए आवश्यक संचालन मानकों दिखाना है कि पीजो ड्राइविंग voltages का उपयोग कर जुदाई परिणामों को संकलित। उम्मीद के रूप में सामान्य में, उच्च वोल्टेज (यानी, अधिक से अधिक ध्वनिक बलों), छोटे कणों को निकालने के लिए आवश्यक हैं। ड्राइव voltages अनिश्चित काल के कारण अधिक से अधिक गर्मी लंपटता और ध्वनिक स्ट्रीमिंग के बढ़ते प्रभाव के लिए, तथापि, नहीं बढ़ाई जा सकती। 13 भूखंड एक विशिष्ट ड्राइव वोल्टेज पर काफी अलग वसूली (जैसे, 10 चलता है कि कण जुदाई-कण आकार के लिए एक सामान्य गाइड के रूप में कार्य करता है और 8.8 वी पीपी पर 2-माइक्रोन कण) अच्छी तरह से अलग कर देगा। आम तौर पर, इस तरह के वायरस (~ 100 एनएम) और सेल (~ 10 माइक्रोन) रचनाकार की कोशिकाओं कर सकते हैं, तेजी से और कुशलता से अलग किया जा सकता के रूप में एक बड़े आकार के अंतर के साथ कण आबादी,erent आकार (जैसे, 6-8 माइक्रोन चक्रिकाभ एरिथ्रोसाइट्स और 8-15 माइक्रोन ल्यूकोसाइट्स)। अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए आवश्यक विशिष्ट परिस्थितियों सेल आकार, घनत्व और दबाव के रूप में सेल आकार के अलावा, अपने ध्वनिक विपरीत प्रभावित करते हैं, अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। यह अंत करने के लिए, चरण 4 में प्रक्रियाओं किसी भी नए सेल या कण प्रकार के लिए प्रयोग करने योग्य जुदाई की स्थिति का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है, और न केवल एक विशेष acoustophoresis डिवाइस की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए कर रहे हैं।

चित्रा 7
सेल-वायरस बालीदार नमूनों की 7 चित्रा जुदाई दक्षता। गोल्डन गेट वायरस (GGV) के साथ नुकीला डेंगू वायरस (DENV) और (बी) के राजी कोशिकाओं और बोआ गुर्दे की कोशिकाओं के साथ नुकीला (ए) राजी कोशिकाओं से पृथक्करण का परिणाम है। एकत्र प्रतिशत एक विशिष्ट से बाहर निकलने वायरस या कोशिकाओं के अंश के रूप में परिभाषित कर रहे हैंचिप बाहर निकलने की कुल राशि की तुलना में आउटलेट। (बी) में नमूने केवल उपलब्ध होने के कारण कम मात्रा में करने के लिए एक बार प्रोसेस किया गया, जबकि के लिए त्रुटि सलाखों (ए), 3 परीक्षण के मानक विचलन कर रहे हैं। 1x पीबीएस सभी प्रयोगों के लिए बाईपास चैनल में पानी के साथ, नमूना बफर और वसूली के तरल पदार्थ के रूप में इस्तेमाल किया गया था। चिप ऑपरेटिंग आवृत्तियों 16 और 20 वी पी पी के बीच ड्राइव voltages के साथ, 1.60 और 1.64 मेगाहर्ट्ज के बीच थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मानव राजी कोशिकाओं (10 5 कोशिकाओं / एमएल, औसत व्यास 8-10 माइक्रोन 25) डेंगू वायरस (DENV, 10 के साथ नुकीला: जैविक कण अलग होने के लिए इस मंच की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, हम पहले अच्छी तरह से विशेषता जैविक नमूने पर कार्रवाई करने के लिए इसका इस्तेमाल किया 5 pfu / एमएल, अनुमानित व्यास 50 एनएम 26)। 7 चित्राएक (चिप से एकत्र प्रत्येक कण की कुल राशि के साथ तुलना में प्रत्येक आउटलेट से एकत्र प्रत्येक कण प्रकार के अंश के रूप में परिभाषित) एसपीओ और LPO दोनों में एकत्र राजी कोशिकाओं और DENV का प्रतिशत दिखाता है। प्रयोग के तीन प्रतियों में दोहराया गया था, और DENV एक रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-qPCR) का उपयोग मात्रा थी, जबकि राजी कोशिकाओं, एक कल्टर काउंटर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया।

इसके बाद, सिस्टम के प्रदर्शन के कणों की सटीक शारीरिक विशेषताओं अज्ञात हो सकता है जिसमें नैदानिक ​​नमूने, प्रसंस्करण के लिए और अधिक यथार्थवादी है कि एक परिदृश्य में परीक्षण किया गया था, और उपलब्ध नमूना मात्रा कम कर रहे हैं। यहाँ, हम अभी तक मापा नहीं किया गया है हाल ही में पहचान गोल्डन गेट वायरस (GGV), एक साँप रोगज़नक़ को संक्रमित बोआ कंस्ट्रिकटर गुर्दे की कोशिकाओं। 27 GGV वायरस कण के आकार की जुदाई का आकलन किया है, लेकिन GGV Arenaviridae परिवार के अंतर्गत आता है, के बाद से यह एक की संभावना हैइसी तरह के आकार, एनएम 100 और 150 के बीच। 28 हम GGV साथ नमूने संसाधित राजी मानव कोशिकाओं (नहीं वायरस के लिए एक संक्रमण लक्ष्य), और बोआ गुर्दे की कोशिकाओं (GGV के लिए संक्रमण लक्ष्य अनुमानित आकार 10 में (10 4 pfu / एमएल) नुकीला 10 4 कोशिकाओं / एमएल में दोनों प्रकार की कोशिकाओं के साथ माइक्रोन 27),। इन नमूनों कम मात्रा में उपलब्ध थे, केवल एक प्रायोगिक रन से जुदाई परिणाम चित्रा 7B राजी कोशिकाओं, बोआ कोशिकाओं का प्रतिशत से पता चलता है। इस काम में सूचना दी, और GGV एसपीओ और LPO से एकत्र कर रहे हैं। प्रकोष्ठों एक hemacytometer पर भरोसा करके इन प्रयोगों में मात्रा निर्धारित किया गया है और वायरस RT-qPCR द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया।

Discussion

इस प्रोटोकॉल स्वचालित जैविक नमूने प्रसंस्करण प्रदर्शन करने macroscale उपकरणों के लिए microfluidic उपकरणों की प्रणाली स्तर एकीकरण प्रस्तुत करता है। इस मंच के प्रतिरूपकता एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया प्रोटोकॉल निस्र्पक और एक acoustofluidic कण जुदाई डिवाइस के प्रदर्शन के अनुकूलन पर केंद्रित है, यह किसी भी सतत प्रवाह डिवाइस के लिए अनुकूल होने की अनुमति देता है, और। इस प्रोटोकॉल के तीन प्रमुख लाभ पर प्रकाश डाला जाता है: (i) प्रतिरूपकता और चिप करने वाली दुनिया डिवाइस प्रदर्शन (ii) मजबूत लक्षण, और कण अलग होने के लिए ठीक मीटर के जरिए नमूना संस्करणों (iii) स्वचालित प्रसंस्करण, interfacing।

मैं। प्रतिरूपकता और चिप करने वाली दुनिया interfacing

चित्रा 2 में दिखाया गया है, microfluidic चिप आसानी से प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए एक खुर्दबीन मंच पर फिट करने के लिए एक कस्टम breadboard पर मुहिम शुरू की है। breadboard एक 5 मिमी पिच ग्रिड, Ena पर # 6-40 यूएनएफ पिरोया छेद होता हैचिप bling सुरक्षित होने की, और तरल पदार्थ कनेक्शन किए जाने के लिए। तरल पदार्थ कनेक्शन मशीनीकृत समाप्त होता है, साथ ट्यूबों तिरछी कर रहे हैं एक रबर का सामना सील गैस्केट और एक स्टेनलेस स्टील के कॉलर के साथ fluidic चिप के खिलाफ जो मुहर। इस इंटरफ़ेस योजना आसान चिप प्रतिस्थापन और तेजी से डिवाइस को नया स्वरूप, कुछ की आवश्यकता होती है या अन्य प्रणाली घटकों में कोई परिवर्तन नहीं है, बशर्ते चिप पैरों के निशान ग्रिड प्रारूप के अनुरूप के लिए बनाता है। उदाहरण के लिए, हम निरंतर प्रवाह वैद्युतकणसंचलन, थर्मल सेल, रासायनिक संश्लेषण के लिए अभिकर्मकों के 29 तेजी से मिश्रण, और एकल कक्ष पर कब्जा है और पूछताछ के लिए microfluidic चिप्स के साथ इस मंच का इस्तेमाल किया है।

द्वितीय। डिवाइस प्रदर्शन के मजबूत लक्षण वर्णन

किसी भी microfluidic जुदाई डिवाइस के प्रदर्शन का अनुकूलन करने के लिए, अपने ऑपरेशन पहले अच्छी तरह से विशेषता किया जाना चाहिए। यहाँ वर्णित व्यवस्था यह करने के लिए तेजी से और स्वचालित प्रोटोकॉल के विकास का समर्थन करता है। विशिष्ट examp के लिएध्वनिक ध्यान केंद्रित उपकरणों, ध्यान केंद्रित गुणवत्ता, ऑपरेटिंग आवृत्ति, और microfluidic चैनल में ध्यान केंद्रित कणों की स्थिति की Le प्रत्येक अलग-अलग डिवाइस के लिए मापा जाना चाहिए। इन मापों, piezoceramic ड्राइव आवृत्तियों, वोल्टेज और प्रवाह दरों की एक सीमा के माध्यम से व्यापक आवश्यकता होती है उच्च गुणवत्ता वाले अलग होने के लिए इष्टतम पैरामीटर संयोजन की पहचान करने के लिए। प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्वचालित रूप से इन ट्यून करने योग्य मानकों को बदलता है और data- प्रासंगिक कब्जा यानी, बाद संसाधित गुणवत्ता, आवृत्ति, और स्थिति (चित्रा 3) ध्यान केंद्रित कण की आवश्यक मापन उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं कि चैनल में बहने कणों की फ्लोरोसेंट छवियों।

ध्वनिक डिवाइस प्रदर्शन का पूरा लक्षण वर्णन दोहरा कदम 4.4 और विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में जरूरत के रूप में 4.5 की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, एक चिप का पूर्ण ध्यान केंद्रित स्थिति अपेक्षाकृत कम प्रवाह दर और उच्च वोल्टेज में आवृत्ति स्कैन चलाकर पाया जाता हैएस नोड स्थान पर पूरा प्रवास सुनिश्चित करने के लिए। इसके अतिरिक्त, ऐसे आवृत्ति स्कैन (जब से जाना जाता है आकार की polystyrene मोती के साथ चलाने के लिए) डिवाइस विधानसभा की गुणवत्ता का आकलन कर सकते हैं, या (एक चिप मोतियों के साथ बताया गया है के बाद) एक पहले से अज्ञात कण प्रकार की प्रणाली में व्यवहार करेंगे कैसे निर्धारित करने के लिए। गरीब ऊर्जा हस्तांतरण के साथ उन लोगों के भी ध्यान नहीं देंगे, जबकि microfluidic चैनल को piezoceramic से अच्छी ऊर्जा हस्तांतरण के साथ एक चिप, तंग उच्च प्रवाह दर (> 1 मिलीग्राम / मिनट) और कम वोल्टेज (12-15 वी पीपी) पर ध्यान केंद्रित करने में परिणाम होगा कम प्रवाह दर (<100 μl / मिनट) और उच्च वोल्टेज (> 20 वी पीपी) पर। हम microfluidic चिप और piezoceramic के बीच घनिष्ठ संपर्क द्रव में कुशल ऊर्जा हस्तांतरण के लिए महत्वपूर्ण है कि मिल गया है। उच्च प्रदर्शन उपकरणों की विश्वसनीय उत्पादन सक्षम हो जाएगा microfluidic चिप और piezoceramic संबंध का इष्टतम विधि की आगे की जांच।

अंत में, एक पूराएक acoustophoretic डिवाइस के ऑपरेशन की तस्वीर microspheres के साथ किए गए प्रयोगों से जुदाई, चरण 4 (और चित्रा 3) प्रासंगिक संचालन मानकों के कार्यों के रूप में एसपीओ और LPO से एकत्र कण की गिनती के साथ की छवि के आधार पर आवृत्ति स्कैन माप के संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता चित्रा 6 में दिखाया गया है चरण 5 में वर्णित के रूप में, स्वचालित प्रयोगों की एक ऐसी श्रृंखला तेजी से कण अलग होने के लिए उपकरण को संचालित करने के लिए इष्टतम पैरामीटर अंतरिक्ष के उपयोगकर्ता बताए, एक व्यक्ति डिवाइस के प्रदर्शन और tunability चिह्नित कर सकते हैं।

तृतीय। कण अलग होने के लिए स्वचालित छोटे नमूना प्रसंस्करण

सफल और सटीक microfluidic चिप आधारित नमूना प्रसंस्करण के लिए, यह मज़बूती और ठीक मीटर, भार, देने, और वे के माध्यम से पास के रूप में तरल पदार्थ की मात्रा को इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है। नमूना मात्रा छोटा है जब इस सटीक विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैनैदानिक ​​या अनुसंधान प्रयोगशाला सेटिंग्स में आम है, जो (~ 0.1-1 एमएल),। 30 सटीक नमूना हैंडलिंग जब नमूने की कोई राय के साथ एक डिवाइस में एक सिरिंज और संचार में नमूना के मैनुअल वापसी रोजगार है कि पारंपरिक microfluidic प्रयोगों में चुनौती दे रहा है अलग कर दिया गया है और इसे एकत्र किया जाना चाहिए जब। प्रस्तुत प्रोटोकॉल नमूना तार लोड हो रहा है स्वचालित रोजगार और छोटा सा नमूना संस्करणों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विभाजन सक्षम करने के लिए प्रवाह सेंसर से वास्तविक समय प्रतिक्रिया के साथ युग्मित वितरण।

चित्रा 5 एक ठेठ जुदाई प्रयोग से एसपीओ और LPO पर मापा प्रवाह प्रोफाइल से पता चलता है। सबसे पहले, कम से कम 35 μl के अग्रणी बफर नमूना ध्वनिक चिप तक पहुंचने से पहले स्थिर प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए भरी हुई है। कारण प्रमुख बफर करने के लिए नमूना कमजोर पड़ने अत्यधिक हो जाता है क्योंकि 100 μl से कम नमूना संस्करणों, इस प्रणाली के विन्यास के लिए सिफारिश नहीं कर रहे। हवा का एक प्लग वीं की शुरुआत में प्रयोग किया जाता हैप्रमुख बफर से पहले ई इंजेक्शन मिश्रण और नमूने के कमजोर पड़ने और प्रवाह सेंसर करने के लिए एक संकेतक के रूप में सेवारत रोकने, कि इस प्रकार के तरल पदार्थ से नमूना प्लग अलग करने के लिए। तरल पदार्थ के रूप में एक प्रारंभिक क्षणिक प्रणाली के माध्यम से आगे बढ़ बाद शुरू होती है, दोनों दुकानों में तेज कील संकेतों पहले एयर बबल के पारित होने का संकेत मिलता है। नमूना प्रणाली के माध्यम से दूसरे एयर बबल गुजरता है जब फिर एक और कील, और सिरिंज पंप बंद हो जाता है के बाद शून्य करने के लिए प्रवाह की दर में अंत में एक अंतिम कमी प्रवाह के रूप में इन यात्रियों स्थिर प्रवाह की एक लंबी अवधि के द्वारा पीछा कर रहे हैं।

प्रवाह सेंसर के माध्यम से हवा प्लग के पारित होने के इस तरह गैर नमूना तरल पदार्थ की मात्रा से खो नमूना और कमजोर पड़ने को कम करने, शुरू करने और नमूना संग्रह को रोकने के लिए वाल्व स्विच करने के लिए ट्रिगर अंक के रूप में प्रयोग किया जाता है। प्रसंस्कृत नमूना संस्करणों के बंद लूप पैमाइश से पहले प्रयोग इनपुट नमूना बदल जाता है हर बार की शुरुआत करने के लिए इन मूल्यों को फिर से कार्यक्रम के लिए की आवश्यकता समाप्त। यह सुविधा हैविशेष रूप से महत्वपूर्ण नमूना मात्रा कई चिकित्सीय नमूनों के मामले में, उदाहरण के लिए सीमित है। वास्तविक समय के प्रवाह की निगरानी भी समस्या निवारण में सहायता करता है; (उदाहरण के लिए, एक रोकना दुकानों में से एक में बनाने) एक गरीब रन चित्रा 5 ब के रूप में, परिणामी प्रवाह प्रोफाइल से तुरंत स्पष्ट है।

लचीलापन और acoustofluidic जुदाई की प्रभावशीलता प्रस्तुत प्रणाली वास्तुकला का उपयोग कर, शुद्ध DENV और GGV वायरस शेयरों का प्रदर्शन करने के microfluidic चिप के माध्यम से सेल के शेयरों में नुकीला और प्रसंस्करण से अलग हो गए थे। चित्रा 7A राजी कोशिकाओं 97 के रूप में, वायरस से अच्छी तरह से अलग हो गए थे कि पता चलता है चिप बाहर निकलने राजी कोशिकाओं की% जिससे एसपीओ में DENV के एक बेहद समृद्ध नमूना छोड़ने LPO में होना पाया गया है। इसकी तुलना में, DENV जुदाई की दक्षता DENV के 70% एसपीओ में पाया चिप बाहर निकलने के साथ कम था। इस separati के बदल जाता है से प्रेरित मामूली संवहनी मिश्रण करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकताचैनल पर, लेकिन LPO में राजी कोशिकाओं के साथ-साथ पलायन कर कुछ DENV कणों के लिए और अधिक होने की संभावना है। सुव्यवस्थित भर laterally पलायन कोशिकाओं भी कम रेनॉल्ड्स नंबर पर, उनके साथ कुछ तरल पदार्थ खींचें। इस तंत्र, साथ ही अविशिष्ट सतह सोखना करके, वायरल कणों LPO में हस्तांतरण। डी नोवो अनुक्रमण का पता लगाने और वायरस की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है फिर भी, जब एसपीओ में DENV की अत्यधिक समृद्ध नमूना उदाहरण के लिए, एक महत्वपूर्ण लाभ है।

चित्रा 7b एक प्रयोगात्मक समय में, चिप बाहर निकलने बोआ कोशिकाओं के बारे में केवल 70% राजी कोशिकाओं के लिए लगभग 100% जुदाई दक्षता के साथ तुलना में, LPO में पाया गया है कि पता चलता है। इसलिए छोटे ध्वनिक बलों, जिसके परिणामस्वरूप राजी कोशिकाओं की तुलना में दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच अलगाव के प्रदर्शन में अंतर एक छोटे औसत आकार या बोआ कोशिकाओं की एक कम घनत्व के कारण हो सकता है। इन suppositions, बोआ के आकार, घनत्व और आकृति विज्ञान की पुष्टि या खंडन करने के लिएनिलंबन में कोशिकाओं (सामान्य रूप से पक्षपाती हो जाना है) बोआ कोशिकाओं की सही, आगे की जांच के लिए एक प्रयास मापा जाना चाहिए। एक ही प्रयोगों में, इसी प्रकार DENV के साथ प्रयोग करने के लिए, बरामद GGV के थोक वायरल अंश की एक संवर्धन का संकेत है, एसपीओ से बाहर निकल गया।

प्रस्तुत डाटा जैविक नमूने की एक किस्म के प्रसंस्करण के लिए इंजीनियरिंग मोटे तौर पर लागू प्लेटफार्मों के निहित चुनौतियों पर प्रकाश डाला। महत्वपूर्ण बात है, जैविक बातचीत शारीरिक और यांत्रिक प्रभाव के रूप में के रूप में महान एक भूमिका निभाने के लिए शुरू कर सकते हैं। हालांकि, इन प्रारंभिक प्रयोगों भी सत्ता और नैदानिक ​​और अनुसंधान अनुप्रयोगों में नमूना प्रसंस्करण के लिए इस प्रणाली वास्तुकला का उपयोग करने का वादा प्रदर्शित करता है। एक मजबूत, अच्छी तरह से विशेषता इंजीनियर प्रणाली के रूप में, इस मंच नई वैज्ञानिक सवालों के जवाब तलाश करने के लिए क्षमता प्रदान करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

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References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

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