A منصة ميكروفلويديك لتجهيز الدقة الصغيرة الحجم عينة واستخدامها لحجم الجسيمات البيولوجية منفصلة مع Microdevice الصوتية

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

والميزة الرئيسية لأجهزة ميكروفلويديك هو القدرة على التعامل مع أحجام عينة صغيرة، وبالتالي تقليل النفايات كاشف والحفاظ على عينة الثمينة. ومع ذلك، من أجل تحقيق القوي التلاعب عينة من الضروري معالجة التكامل الجهاز مع البيئة macroscale. لتحقيق للتكرار، حساسة الجسيمات الفصل مع أجهزة ميكروفلويديك، ويعرض هذا البروتوكول منصة ميكروفلويديك الآلي ومتكاملة الكاملة التي تمكن معالجة الدقيق لل،15-1،5 مل العينات باستخدام أجهزة ميكروفلويديك. وتشمل جوانب مهمة من هذا النظام تخطيط وحدات الجهاز ومواعيد المباريات القوية الناتجة في العالم موثوقة ومرنة لرقاقة الاتصالات، والتعامل مع السائل مؤتمتة بالكامل والتي تنجز حلقة مغلقة جمع العينات، وتنظيف النظام وفتيلة خطوات لضمان عملية قابلة للتكرار. أجهزة ميكروفلويديك مختلفة يمكن استخدامها بالتبادل مع هذه العمارة. نحن هنا دمج جهاز acoustofluidic، التفاصيل characteriz لهاأوجه، وتحسين الأداء، وإثبات استخدامه لحجم-فصل العينات البيولوجية. باستخدام التغذية المرتدة في الوقت الحقيقي خلال التجارب الانفصال، هو الأمثل جمع العينات لحفظ وتركيز العينة. على الرغم من أن تتطلب دمج قطع متعددة من المعدات، ومزايا هذه العمارة وتشمل القدرة على معالجة العينات المجهولة مع أي التحسين الإضافي النظام، وسهولة استبدال الجهاز، ودقيقة وقوية تجهيز العينات.

Introduction

فصل العينة والتجزئة هي واحدة من أكثر المناطق الواعدة للتطبيق لتقنيات الموائع الدقيقة. مثل هذه الخطوات معالجة العينة هي جزء لا يتجزأ لتشخيص فعالة السريرية، وتطوير العلاجات، وجهود biosurveillance، والتقدم في بحوث علوم الحياة والتكنولوجيا. وقد أظهر عدد لا يحصى من الاستراتيجيات فصل الموائع الدقيقة للجسيمات والغرويات مع وقف التنفيذ السائل، فضلا عن الأنواع الكيميائية والبيولوجية؛ العديد من الاستعراضات توفر لمحات عامة عن التقدم والتطورات الأخيرة في هذه المجالات 1-9. على الرغم من أن العديد من هذه التقنيات فصل الموائع الدقيقة (يشار إليها فيما يلي باسم "أجهزة كور") قد تميزت على نطاق واسع، وقد اعتبرت تقارير قليلة مشكلة فصل العينة على مستوى النظام. الأجهزة الأساسية عادة ما تكون فردية رقائق سنتيمتر النطاق، ربطه إلى أنابيب الفلورو، مع السائل بايدي النزوح أو ضغط المضخة.ومع ذلك، وإذا وعد على microfluidics - بما في ذلك زيادة التشغيل الآلي، والموثوقية، وانخفاض حجم العينة - هو أن تصبح حقيقة واقعة، على الأقل يجب أن تكرس جهدا مساويا لتصميم نظام الفصل التام الذي يتم دمج جهاز كور .

بالإضافة إلى ذلك، يشكل تحديا كبيرا للنهج ميكروفلويديك لbiodetection هو الماكرو إلى واجهة الصغيرة. هذا لا يشير فقط إلى الصلات المادية "العالم إلى رقاقة" من جهاز ميكروفلويديك لمكونات macroscale، وإلى عدم التوافق بين أحجام نموذجية عينة السريرية أو التحليلية (~ 0،1 حتي 10 مل)، وحجم الداخلي للرقائق ميكروفلويديك (~ ،01-10 ميكرولتر)، ولكن أيضا إلى القيود أخذ العينات الإحصائية الناتجة عن سد هذه المقاييس الحجم. وتساهم هذه القضايا إلى الاعتقاد بأن ما قبل تجهيز وإعداد نموذج هي "الحلقة الضعيفة" من ​​biodetection 10 منصة وصفها في هذا العمل تاKES خطوات كبيرة نحو التصدي لهذه التحديات.

إلقاء نظرة على مستوى النظام، هذا البروتوكول تفاصيل تجهيز موثوقة من وحدات التخزين على نطاق والتحليلية على وجه التحديد-المقننة (تتراوح ،15-1،5 مل) على ~ الجداول الزمنية 10 دقيقة. هذا هو "واحدة على زر" العملية: مرة واحدة يتم وضع قارورة تحتوي على مصدر العينة وجهة قارورة لجمع جزء في النظام، يبدأ الأمر "تشغيل" الإجراء، وجميع الخطوات والكمبيوتر التي تسيطر عليها. في نهاية المدى، يمكن إزالة قارورة جمع من نظام لتحليل المصب من الكسور فصل.

الجهاز الأساسية في هذا النظام هو رقاقة acoustophoresis التي تستخرج الثدييات (5-20 ميكرون) جزيئات الخلية الحجم من العينة. يتم اختيار الانفصال Acoustophoretic هنا في المقام الأول لأنها عالية الإنتاجية (إلى 100s من ميكرولتر / دقيقة)، خالية من التسمية، وعدم الاتصال، وبهذا توفر ميزات في فصل فيرو قابلة للحياةإس إي إس من الخلايا التي بعض التقنيات ميكروفلويديك أخرى يمكن أن المباراة. فيزياء الجسيمات الصوتية التركيز، وقد وصفت على نطاق واسع، 11-13، وهي ليست محور هذا البروتوكول، ولكن ملخص موجز للمفاهيم الأساسية يتبع للمساعدة في فهم تطبيق لفصل ميكروفلويديك.

موجات دائمة الموجات فوق الصوتية صدى في microchannels مملوءة بسائل تنتج حقول الضغوط التي تؤدي إلى ظهور قوى التي تدفع الجسيمات نحو عقد من الضغط المنخفض. حجم قوة يعتمد على حجم الجسيمات، وعلى النقيض عامل الصوتية المستمدة من الكثافة وcompressibilities من الجسيمات النسبية والسوائل تعليق. 14 وعلى هذا النحو، ومناسبة بشكل مثالي الصوتية التركيز على فصل الخلايا الحجم (~ 7-15 ميكرون) من (~ 50-200 نانومتر) جزيئات الفيروسات الحجم. الجسيمات أكبر تهاجر نحو عقدة الضغط؛ ومع ذلك، منذ أن حجم قوة صغيرة جدا لجسيمات أصغر من 2-3 ميكرون، هذه الجزيئات الصغيرة أو الأنواع الذائبة بالكاد تتحرك على الإطلاق. لدينا محددة للتنفيذ الانفصال الصوتية، كما هو موضح سابقا، 15 يشتمل على جدار رقيق لتقسيم القناة السوائل ويسمح الانضباطي، والتنسيب غير المتماثلة من موقف التركيز. وهذا يضيف مرونة في تصميم الجهاز، والفوائد، بما في ذلك أداء زيادة جودة الانفصال والسرعة موصوفة بشكل كامل في أي مكان آخر. 16،17

ومع ذلك، فإن الميزة الرئيسية لهذا النهج التصميم على مستوى النظام المذكور في هذا العمل هو أنه قابل للتكيف مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأجهزة الأساسية ميكروفلويديك. على سبيل المثال، معظم وسائط فصل الدفق المستمر أخرى، بما في ذلك بالقصور الذاتي، تجزئة حقل التدفق، والنزوح الأفقي القطعية (DLD)، وأنواع مختلفة من الأجهزة حركي كهربي يمكن إدراجها بسهولة، مع إدخال التعديلات المناسبة لمراعاة التغيرات في مدخل / تكوين منفذ ، معدلات التدفق،وأحجام العينة. الأجهزة مع أنواع مختلفة من المجالات على رقاقة (الكهربائية، والمغناطيسية) أو التدرجات (الحرارية والكيميائية) قد تتطلب اتصالات إضافية إلى شرائح، أو دمج أجهزة إضافية، والتي تتسع هذه المنصة.

يوفر هذا البروتوكول الخطوات المطلوبة لتصميم جهاز فصل ميكروفلويديك، وافتعال رقائق السيليكون والزجاج التي كتبها العميق الحفر أيون رد الفعل (DRIE، وهي عملية البلازما حفر متوفرة في العديد من مرافق التصنيع الدقيق، والذي يستخدم بالتناوب دورات الحفر والتخميل لتحقيق عميق الميزات مع الجوانب الرأسية 18). المقبل، وصفنا توصيف الجهاز acoustofluidic لتحديد معايير التشغيل المثلى للانفصال، وأخيرا بالتفصيل نظام الفصل متكاملة وإجراءات تجهيز العينات البيولوجية. ثم يتم عرض النتائج النموذجية توصيف الجهاز والبيانات تجهيز العينات ومناقشتها، والمزايا الرئيسية لهذا APPROوأبرزت منظمة العمل ضد الجوع، بما في ذلك نمطية، متانة، والدقة والأتمتة.

Protocol

1. Acoustophoretic تصميم الأجهزة وتخطيط الضوئية الرئيسية

ملاحظة: اعتبارات عامة وإرشادات لتصميم عملية التصنيع الدقيق وتخطيط قناع يمكن العثور عليها في النصوص على التصنيع الدقيق ودروس التصميم الضوئية الرئيسية 19-21.

  1. وضع قناع 1، وطبقة فلويديك (الجانب الأمامي)، وذلك باستخدام برمجيات CAD المناسب. اختيار الهندسة التي تسمح حقن العينة وفصل ملائم للتطبيق المطلوب.
    1. لالصوتية تركز، تعيين عرض قناة فلويديك ث لتوفير تردد الرنين و ن أكثر من 1 ميغا هرتز وفقا للمعادلة و ن = NC / 2W، حيث c هي سرعة الصوت في السوائل ذات الصلة و n هو عدد العقد الأمد موجة (على سبيل المثال، للقناة 900 ميكرون واسعة، واثنين ومن المتوقع في f 2 = 1.65 ميغاهيرتز) عقدة الرنين.
      ملاحظة: الجسيماتق يشغلن مناصب الجانبية متميزة بالقرب من نهاية قناة الانفصال يجب الخروج من منافذ مختلفة. في هذا البروتوكول، ويتم فصل جزيئات من حيث الحجم، لذلك تصنف وسائل مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO، للمشاريع الصغيرة الجسيمات ومخرج كبير الجسيمات، على التوالي، كما هو مبين في الشكل 1.
    2. تعيين طول قناة السوائل للسيطرة يتعرض طول جزيئات الوقت لمجال فصل بمعدل تدفق معين. تعد على رقاقة الوقت الإقامة للجسيمات إلى الهجرة بسبب فصل القوات يجب أن يتم تداولها في مقابل أكبر بصمة الشريحة المطلوبة.
      ملاحظة: في الأجهزة الصوتية التركيز لدينا، قناة تدفق يجعل ثلاثة يمر أسفل الشريحة لزيادة وقت الإقامة (الشكل 2A). في إجمالي معدل تدفق نموذجي من 200 ميكرولتر / دقيقة، والجسيمات التي تتدفق من خلال 300 × 200 ميكرون المقطع العرضي، 117 ملم قناة فصل طويل تنفق في المتوسط ​​2.1 ثانية في مجال الصوتية.
  2. تشمل الموانئ الموائعية في ايو قناعحزب التحرير للاتصالات لأنابيب القياسية ترتيبها على الشبكة الموحدة (5 ملم الملعب). تشمل علامات إيمانية مناسبة لمحاذاة أقنعة لبعضها البعض خلال تصنيع وتقطيع الأجهزة الفردية.
  3. وضع قناع 2، طبقة فيا (الجانب الخلفي)، والذي يتضمن فقط الموانئ الموائعية. تشمل علامات إيمانية لمحاذاة إلى قناع 1.

الشكل 1
الشكل 1. جهاز Acoustofluidic. اسكتشات تخطيطي العمارة جهاز acoustophoretic. (أ) أعلى عرض، والتي تبين التكوين العام H-فلتر (لا لتوسيع نطاق). (ب) رسم تخطيطي للقناة المقطع العرضي في الموقع والتي تمثلت في أسود متقطع سطر في (أ)، والتي تبين مجال الضغط (أزرق منقط خطوط)، والشعور قوات الصوتية الأولية الإشعاع (PRF) التي تدفع الجسيمات نحو طائرات العقدية (الأسهم الحمراء). قناة المقطع العرضي900 × 200 ميكرون مع جدار حوالي 10 ميكرون سميكة فصل الرئيسي (300 ميكرون واسع) وقنوات الالتفافية. (ج) تمثيل 3D فصل الجسيمات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. غرف الأبحاث تصنيع الرقائق الميكروية لAcoustophoresis

  1. نمط الموانئ السوائل الجانب الخلفي باستخدام قناع 2 على جانب مزدوج مصقول 0.5 مم، 100 مم <100> رقاقة السيليكون عن طريق معيار ضوئيه الإيجابية مقاومة. حفر هذه الهندسة التي كتبها العميق رد الفعل ايون النقش (DRIE) على عمق 350-400 ميكرون.
  2. تحويل رقاقة أكثر، والهندسة قناة السائل نمط للالجانب الأمامي باستخدام قناع 1 وفق المعايير الإيجابي مقاومة ضوئيه على الجانب الآخر من السيليكون. ثم، تركيب رقاقة الجهاز إلى الثاني (السيليكون فارغ) الناقل الرقاقة باستخدام مقاومة للضوء.
  3. حفر القنوات، أيضا DRIE، على عمق 200 ميكرون، من خلال الحفر السيليكون في المواقع ميناء (رقاقة الناقل يحمي سطح أداة DRIE). دي جبل الرقاقة الجهاز من سي رقاقة فارغ عن طريق نقع في مقاومة تجريد الحل.
  4. تنظيف رقاقة جهاز وملامح ورقاقة الزجاج البورسليكات 0.5 مم سميكة باستخدام سمكة البيرانا حل (حامض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين في 3: نسبة 1).
  5. اغلاق قنوات السوائل عن طريق ربطها anodically الزجاج والسيليكون رقائق باستخدام المعلمات التالية: ضغط الغرفة في 3 mTorr، ضغط المكبس في 1000 N، درجة الحرارة 350 درجة مئوية، وتطبيق 750 V حتى قطرات الحالية أقل من 0.2 مللي أمبير.
  6. قطع رقائق الفردية بعيدا بشفرة الماس على منشار تقطيع.

3. جهاز النهائي الجمعية

  1. بيزو محول مرفق
    ملاحظة: يتم إنشاء الموجات فوق الصوتية في رقاقة ميكروفلويديك بواسطة محول piezoceramic تعلق على الجانب السيليكون.
    1. من فيالتعليم الجامعي مكون المنخفضة اللزوجة عدة الايبوكسي، تزن من نسبة الموصى بها من كل من المكونات ومزجها جيدا.
    2. الاستغناء عن خليط الايبوكسي مع ماصة وموزعة بالتساوي عبر الرائدة zirconate تيتانات (PZT) piezoceramic لخلق رقيقة، حتى طبقة (حوالي 10 ميكرولتر من مزيج الايبوكسي لبيزو بأبعاد 37.5 × 10 × 0.5 مم).
    3. باستخدام رقصة مناسبة أو لاعبا اساسيا، محاذاة الجانب الايبوكسي من piezoceramic مع رقاقة ميكروفلويديك، وتوفير مساحة يخيم على جانب واحد لسلك مرفق لاحق (انظر الشكل 2A)، وتقديم عنصرين في اتصال. المشبك التجميع في الرذيلة، مع الحرص على عدم كسر أي من المكونات، وعلاج في درجة الحرارة ومدة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة الايبوكسي.
    4. بعد الشفاء من الايبوكسي، ونعلق غرامة عيار الأسلاك يؤدي إلى كل جانب من piezoceramic، عن طريق لحام مع حام الحديد غرامة طرف، مما يجعل من أقصر اتصال ممكن مع بيزو لتجنب رذلك استقطاب دي hermally. بدلا من ذلك، استخدام لاصق موصل للالغراء الأسلاك إلى بيزو.

الرقم 2
الشكل 2. فلويديك اللوح، رقاقة تصاعد، والعالم إلى رقاقة واجهة. صور من (أ) رقاقة ميكروفلويديك الصوتية (الأبعاد الخارجية من 70 × 9 × 1 مم) مع المرفقة محول بيزو يؤدي الأسلاك، والتي تبين ثلاث مسارات لفصل قناة أسفل الشريحة، (ب) التجهيزات المسمار الموائعية العرف ومكونات أنابيب تشكيله للواجهة رقاقة إلى العالم، (ج) الشريحة التي شنت على الجانب السفلي من اللوح فلويديك باستخدام تركيبات تحامل، والتي تمتد فتحة في اللوح للسماح لل مروحة التبريد، (د) وجهة نظر العلوي من اللوح مع وصلات أنابيب المرفقة ومروحة التبريد، و (ه) التخطيطي مستعرضة من التجهيزات المسمار الذي واجهة TUBIنانوغرام مع رقاقة ميكروفلويديك شنت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. جهاز تركيب والعالم إلى رقاقة التواصل
    1. إرفاق رقاقة إلى "اللوح فلويديك" (لوحة مع شبكة من متباعدة بصورة منتظمة مترابطة من خلال الثقوب) باستخدام تركيبات تحامل. إرفاق مروحة التبريد إلى اللوح لتنظيم درجة الحرارة خلال التجارب الصوتية (انظر الشكل 2).
      ملاحظة: تعمل بدون مروحة التبريد في الفولتية حملة نموذجية تثير درجة حرارة الجهاز إلى 70-80 درجة مئوية. هذه التحولات بشكل كبير من تردد الرنين بسبب تغير سرعة الصوت في السائل، ويمكن أن تؤثر سلبا على سلامة أي الجزيئات البيولوجية التي يتم معالجتها.
    2. المسمار في رقاقة إلى العالم الموصلات، وصفت سابقا في أماكن أخرى 22 و هو مبين في الشكل (2). تاريخ هذه طأنابيب nterface لأنابيب إضافية في المداخل والمخارج باستخدام معيار ¼ "-28 النقابات ل1/16" الأنابيب.

4. توصيف الصوتية التركيز الأداء

يتم تجميع مكونات النظام اللازمة لالصوتية التركيز توصيف معا في قائمة المواد: ملاحظة. خطوات 4.1 و 4.2 تطبيق أدناه لأي جهاز كور استخدامها مع هذه المنصة، في حين تصف الخطوات اللاحقة عمليات محددة إلى الجهاز acoustofluidic مناقشتها هنا.

  1. تكوين النظام
    1. تجميع رقاقة ميكروفلويديك باستخدام العالم إلى رقاقة الاتصالات على اللوح فلويديك، كما هو موضح في القسم 3. الاتصالات تجعل من استخدام أنابيب (مثل 1/16 "القطر الخارجي الفلورو بوليمر أنابيب) لمضخة وجمع السوائل قارورة. جبل الجمعية اللوح على مسرح المجهر قادرة على التصوير مضان مجهزة بكاميرا CCD.
    2. الاتصال أطوال diamete الداخلي صغيرص (ID) أنابيب (0.006 "يوصى) على الفور بعد رقاقة (انظر الشكل 4) لتكون بمثابة مقيد التدفق، التي استقرار النظام والسيطرة على تدفق تقسيم بين وسائل رقاقة. استخدام أنابيب ID أكبر، مثل 0.01 "أو 0.03"، لكافة الاتصالات الأخرى.
      1. تقدير الهيدروديناميكية مقاومة تدفق R ساعة من كل قطعة من أنابيب بطول L والقطر الداخلي D باستخدام المعادلة R ح = 128 ميكرولتر / πD حيث μ هي اللزوجة الديناميكية المائع. ونظرا لانخفاض الضغط Δ P بسبب طول كل من أنابيب بمعدل تدفق نظرا Q كتبها Δ P = QR ساعة.
      2. اختيار نسبة أطوال مقيد لتقسيم تدفق بين وسائل بما يتناسب مع طريقة الفصل المستخدمة. الفصل الأمثل مع رقائق الصوتية في هذا البروتوكول يتطلب SPO: نسبة تدفق أمر الشراء المحلي من approximately 65: 35٪.
      3. اختيار طول مقيد تدفق منفذ بحيث مقاومتهم الموائعية هي 3-4 مرات على الأقل أكبر من المقاومة الكلية في بقية نظام (لخص بشكل مناسب في سلسلة أو موازية). للجهاز acoustophoresis المستخدمة في هذا العمل، أطوال الأنابيب بين 35 و 65 سم للLPO ومكتب التخطيط الاستراتيجي هي مناسبة.
        ملاحظة: يجب النظر بعناية إلى R ساعة من أي كور جهاز ميكروفلويديك. لالصوتية لدينا تركز رقاقة في هذا العمل، R ح منخفضة نظرا لأبعادها قناة كبيرة نسبيا، وبالتالي فإن المقاومة أنابيب متصلة تتجاوز بسهولة. بالنسبة للأجهزة ذات أبعاد قناة أصغر، ومقاومة رقاقة قد تهيمن على بقية أنابيب النظام، الذي التصميم القضية والسيطرة على رقاقة قناة R ح هو اعتبار إضافي خلال الخطوة 1 من هذا البروتوكول. تتوفر مبادئ التصميم التفصيلية والمبادئ التوجيهية في الأدب. 23،24
  2. التأكيد النظام
    1. تحقق من وجود تسرب للتحقق من أن الجهاز ميكروفلويديك لا يوجد لديه عيوب ويتم اغلاق كافة الاتصالات الأنابيب. الاستغناء عن الماء من خلال الأنابيب مدخل حسب الحاجة مع حقنة ومراقبة أي تسرب السوائل في القناة الرئيسية.
    2. الاستغناء عن حجم معروفة من خلال رقاقة، وقياس الكميات التي تم جمعها من المنافذ للتأكد من أن نسبة تدفق كما هو متوقع. قد يشير الانحرافات عن نسبة الحجم المتوقع انسداد في أحد منافذ أو اتصالات تسريب.
      1. للحفاظ على نظافة النظام ومنع انسداد تدفق النظام بأكمله (أنابيب فلويديك ورقاقة) مع حلول التنظيف المناسبة (على سبيل المثال، التبييض، والايثانول والمياه) قبل وبعد تشغيل أي التجارب.
      2. في حال انسداد أو انسداد في أحد المنافذ، تدفق النظام أثناء توصيل مخرج واضح لمسح انسداد. إذا كان هذا غير ناجحة، عكس اتجاه تدفق أثناء التنظيف،تطبيق اختياريا نبضات سريعة من التدفق العكسي (باستخدام حقنة دفعتها يدويا). وأخيرا، إذا كان انسداد لا يزال لا يمكن إزالتها، واستبدال أنابيب أو رقاقة، حسب الاقتضاء.
  3. تردد المسح الضوئي الإعداد لصوتي التركيز
    1. ملء قناة الالتفافية (انظر الشكل 1) مع السوائل مثل الماء منزوع الأيونات، والإيثانول، أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عن طريق الحقن اليدوي مع حقنة. لاحظ أن هذا السائل لا يأتي في اتصال مع العينة التي يجري تجهيزها. ووصف تفاصيل ضبط الموقف عقدة باستخدام سوائل الالتفافية مختلفة في أماكن أخرى 16،17. باختصار، إذا كانت العقدة يجب أن تكون أقرب إلى الجدار الفاصل، واستخدام الكثافة أقل السائل الالتفافية، مثل الإيثانول. لعقدة موضع أقرب إلى تيار عينة المدخلات، واختيار السائل أكثر كثافة، مثل حل الجلسرين.
    2. جعل حل حبة من حوالي 0.01٪ (ث / ت) 5-8 ميكرومتر الخرز البوليمر الفلورسنت علقت في منطقة عازلة مثل PBS مع0.05٪ توين-20 وملء حقنة مدخل عينة مع الحل حبة. ملء الحقنة عازلة مدخل مع المخزن نفسه (وهذا لا يحتاج إلى أن يكون نفس السائل كما في قناة الالتفافية). لاحظ أنه في عام، يتم اختيار عازلة لتتناسب مع الطلب (انظر الخطوة 5.1).
    3. مع اللوح فلويديك على المسرح المجهر، والتركيز في منتصف المسافة تقريبا في عمق القناة في منطقة قناة مستقيمة قبل مخرج مع كل القنوات (فصل والتفافية) في مجال الرؤية. قد تكون هناك حاجة لالمائلة الزاوية مصدر ضوء خارجي إضافي لجعل جدران قناة مرئية، لمرحلة ما بعد المعالجة الناجحة لبيانات الصورة.
  4. التردد الآلي المسح الضوئي والتقاط الصور
    1. جعل التوصيلات الكهربائية باستخدام كابلات محمية (على سبيل المثال، RG-58 مجهزة مع موصلات BNC) إلى مولد وظيفة مع تردد الراديو (RF) مكبر للصوت لإيصال إشارة الإثارة إلى محول بيزو. اختياريا، قم بتوصيل الذبذبات لالناتج من مولد وظيفة لرصد الجهد الفعلي تطبيقها على محول.
    2. تشغيل مروحة التبريد، وتعيين مولد وظيفة مثل أن الإخراج من مكبر للصوت RF إلى محول بيزو هو في حدود 12-25 فولت الذروة إلى الذروة، (V ص).
    3. تعيين كل من الحقن لنفس معدل التدفق يتراوح بين 50 و 200 ميكرولتر / دقيقة. باستخدام ضخ حقنة واحدة لدفع كل من المحاقن مع نفس المحرك ويوصى للحد من الاضطرابات في التدفق.
    4. تنفيذ إجراء تردد المسح لتحديد بداية ونهاية الترددات، وحجم خطوة بين القيم تردد، والجهد محرك بيزو باستخدام أدوات الأتمتة المختبرية مثل الصكوك الوطنية ابفيف.
    5. في كل خطوة التردد، وتطبيق الجهد لمدة 15 ثانية للسماح للنظام لكي تتوازن، ثم التقاط 10 صور من الخرز التي تتدفق من خلال رقاقة لتحليلها لاحقا (مرات التعرض ما بين 10 و 100 ميللي ثانية ينصح).
    6. بين همنظمة العمل ضد الجوع تطبيقها خطوة التردد، إيقاف التيار الكهربائي لحوالي 20 ثانية للسماح للالخرز تعيد توزيع موحد عبر القناة وإزالة التحيز في التركيز من الخطوة تردد المطبقة سابقا.
  5. تحليل الصور لتحديد ما تردد الرنين والتركيز الوظيفة
    1. تشغيل برنامج نصي تحليل الصور (مثل النصي AF_freqScanPlotter.m MATLAB المقدمة لهذا البروتوكول) وإدخال المعلومات المطلوبة في المطالبات: اختيار قائمة ملفات الصور التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.4، أدخل بدء المسح الضوئي ووقف الترددات وحجم الخطوة، العرض الكامل القناة، وموقع الجدار، وأخيرا اختيار المنطقة صورة لتحليل، بما في ذلك فصل وقنوات الالتفافية.
    2. مراقبة المتوسط ​​التحليل النصي مجموعة من الصور التي تم التقاطها في كل خطوة التردد، ومتوسط ​​قيم الكثافة على طول اتجاه التدفق. وينتج عن ذلك المقطع العرضي خط فحص كثافة مضان.
      ملاحظة: تردد المقابلة لhighe وتعرف كثافة الحادي كما تردد الرنين (الشكل 3، الصف الأوسط)، والموقف في القناة حيث تحدث أعلى كثافة هو موقف التركيز (الشكل 3، الصف السفلي).

الشكل (3)
الشكل (3). الممثل مسح التردد. مثال على البيانات تردد المسح الضوئي للجانب جيدا (A) وسيئة إلى جانب (B) بيزو ورقاقة. الصف العلوي: كثافة الفلورسنت من الخرز (الأحمر يمثل عالية، والأزرق يمثل كثافة منخفضة). الصف الأوسط: الحد الأقصى لكثافة في كل تردد. الصف السفلي: موقع الكثافة القصوى، حيث يشير إلى توقع خط متقطع أحمر التركيز الموقف، والماس الحمراء تشير إلى تردد الرنين على النحو الذي يحدده الحد الأقصى للكثافة.ز "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. الفصل الآلي

ملاحظة: يتم تشغيل التجربة الفصل الآلي لفصل الجزيئات الكبيرة من الجزيئات الصغيرة نظرا لالصوتية تركز القوات تعتمد على حجم المطبقة في رقاقة ميكروفلويديك. يتم تجميع مكونات النظام المطلوبة معا في قائمة المواد.

  1. نظام التكوين وإعداد العينات
    1. ربط رقاقة ميكروفلويديك إلى ضخ حقنة، متعددة المنافذ صمامات اختيار الكمبيوتر التي تسيطر عليها،-PC ربطه تدفق متر، والأنابيب، كما هو مبين في الشكل (4). هذا التكوين تمكن الآلي تجهيز العينات من خلال رقاقة فصل ميكروفلويديك، فضلا الآلي تنظيف الخطوات بين التجارب لإزالة التلوث المتبادل وعينة المرحل.
    2. استخدام عينة العازلة مناسبة للخلايا أو جزيئات يمكن فصلها، أو على النحو المطلوب في فحص تحليل لاستخدامها بعد الانفصال. كما في الخطوة 4.3.2، المخزن المؤقت الانتعاش (ولكن ليس بالضرورة السائل الالتفافية) يجب أن تتطابق السائل العينة.
      ملاحظة: أي المخازن المائية التي تستخدم عادة مع العينات البيولوجية (على سبيل المثال، PBS) لها خصائص مشابهة الصوتية على المياه ولن تتغير بشكل ملحوظ على أداء الجهاز الصوتي. استخدام السوائل عينة مع الكثافة واللزوجة مختلفة إلى حد كبير من المياه ممكن، ولكن ينصح فقط لمشغلي مع خبرة كبيرة acoustophoresis.


الرقم 4
الرقم 4. الصوتية لتكوين النظام لتجارب الفصل الآلي. خطوط زرقاء تتبع مسار تدفق الرئيسي من خلال النظام. كل الخطوط الخضراء والسوداء هي 0.03 "القطر الداخلي (ID) أنابيب، وجميع خطوط زرقاء ورمادية بلون هي 0.01" أنابيب ID، مع هxception من لفائف القابضة، التي هي 0.03 "ID، ومقيد التدفق، والتي هي 0.006" ID. تمتلئ المحاقن مع العازلة، وملفات عقد يكون حجم كاف (550 ميكرولتر) لمنع امتصاص أي عينات أو الكواشف التنظيف في الحقن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إجراءات الانفصال
    1. حالة ما قبل التشغيل. قبل تشغيل الانفصال، والتأكد من أن خزانات تنظيف كاشف (التبييض، والإيثانول، عازلة) لديها ما يكفي من السوائل، وخزانات النفايات ليست كاملة، وكانت سببا في خطوط السوائل (أي مملوءة بمحلول). إذا كان الشرط الأخير غير مؤكدة، أو إذا كان يتم تشغيل النظام للمرة الأولى بعد تسكع (على سبيل المثال، وهي المرة الأولى في يوم معين)، تشغيل إجراء التنظيف الآلي (انظر الخطوة 5.3 أدناه). ضبط صمامات 3 و 4 في وسائل رقاقة في التدفق إلى إضاعة عزاءrvoirs في البداية.
    2. تشغيل مروحة التبريد، وتعيين مولد وظيفة في تردد الرنين لرقاقة الصوتية المستخدمة، كما هو محدد في الخطوة 4.5. ضبط نقطة التحديد الجهد على مولد وظيفة بحيث مخرجات مكبر للصوت RF بين 12 و 25 V ص، بما يتناسب مع فصل المرجوة.
    3. ربط مدخلات عينة فيال، مخزن الإدخال المؤقت فيال، وقارورة جمع المناسبة لهذا النظام. فقط قبل إرفاق نموذج فيال الإدخال إلى أنابيب صغيرة لها، دوامة لفترة وجيزة قنينة للعودة لوقف أي الجزيئات التي قد استقر. ثم، ونعلق القارورة والبدء في روتين الفصل دون تأخير.
      تنبيه: إذا كانت العينة التي سيتم تجهيزها تحتوي على عوامل قد تكون معدية، وينبغي أن تكون قارورة من نوع المسمار أعلى، للحفاظ على النظام مختومة ومنع عينة هباء. بالإضافة إلى ذلك، عند العمل مع المواد biohazardous، والتعامل مع كل قارورة وأنابيب حين يرتدي معدات الوقاية اللازمة واستخدام مساضوابط المخاطر uired والإجراءات لمجموعة المخاطر البيولوجية والسلامة الأحيائية المستوى المناسب لهذه المادة. مراجعة سياسات وبروتوكولات المؤسسية في حال وجود أي عدم اليقين.
    4. استخدام برنامج في مجموعة أدوات الأتمتة مختبر للسيطرة على الصمامات، وتدفق أجهزة الاستشعار ومضخة لتنفيذ روتين الفصل التلقائي بالكامل.
      ملاحظة: روتين تبديل الصمامات، ويشغلان حقنة مضخة سحب والتسريب، وترصد تدفق بيانات الاستشعار عن توقيت جمع الكسور عينة الإخراج بشكل صحيح. وفيما يلي ملخص للخطوات كبيرة في طريق 5.2.4.1 5.2.4.3، كما لو نفذت يدويا.
      1. رئيس أنابيب صغيرة. سحب ما يقرب من 15 ميكرولتر من إدخال عينة فيال لملء تماما أنبوب توصيله إلى صمام 1. وفي الوقت نفسه، رئيس الأنبوب الذي يربط بين الواق فيال مساهمة في صمام 2. على نحو مماثل، رئيس مدخل الهواء صمام 1 للتأكد من أنه لا تحتوي على السائل. وأخيرا، تبديل صمامات 1 و 2 لطرد لنضيعالسوائل الزائدة أو الهواء التي دخلت لفائف التحميل.
      2. تحميل لفائف العينة، كما هو مبين في الشكل 5A. تسلسل تحميل نموذجي لتجهيز العينة 250 ميكرولتر هو سحب 25 ميكرولتر من الهواء في 50 ميكرولتر / دقيقة، ثم 250 ميكرولتر من العينة على 200 ميكرولتر / دقيقة، تليها 35 ميكرولتر من العازلة الرائدة في 200 ميكرولتر / دقيقة، وأخيرا 25 ميكرولتر آخر من الهواء في 50 ميكرولتر / دقيقة.
        ملاحظة: كافة وحدات التخزين ومعدلات تدفق هي للمستخدم اختيار. لاحظ أن هذا التسلسل التحميل هو في ترتيب عكسي لكيفية المقابس السوائل سوف تتدفق من خلال الجهاز الانفصال.
      3. بدء ضخ عينة. تعيين مضخات حقنة للبث المقابس السوائل المحملة بالمعدل المطلوب (عادة 100 ميكرولتر / دقيقة). رصد معدلات التدفق في مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO مع أجهزة استشعار تدفق لضمان تدفق ثابت وعلى نسبة تحديدها في الخطوة 4.1 و لم يحدث أن انسداد.
      4. جمع الكسور منفصلة. عندما تكتشف مجسات تدفق ارتفاعا في معدل التدفق، مشيرا سنوياssage من فجوة الهواء الأولى، تبديل صمام الناتج المقابلة من النفايات (حيث أنها بدأت في الخطوة 5.2.1) إلى قارورة جمع العينات.
      5. بعد مرور عينة من رقاقة، ومراقبة تدفق الاستشعار للكشف عن فجوة الهواء الثانية. عند هذه النقطة، تبديل الصمامات العودة الى الانتاج سدى. بعد الاستغناء عن حجم كامل تحميل من الخطوة 5.2.4.2، والتوقف عن ضخ ضخ حقنة وإنهاء الروتين الأتمتة عندما يصل معدل التدفق صفر.
    5. بعد تجربة الانفصال كاملة، افصل مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO قارورة جمع العينات وتخزينها بشكل مناسب لتحليلها لاحقا.
  2. التنظيف الآلي وإزالة التلوث
    ملاحظة: قبل تجهيز كل عينة، الاحمرار وتطهير النظام فلويديك كله باستخدام الروتين الآلي التالية.
    1. تأمين مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO أنابيب جمع قارورة، وكذلك أنبوب عينة صغيرة في قوارير فارغة لجمع حلول التنظيف الزائدة التي سيتم مسح throuGH الأنابيب.
    2. بدء تشغيل الآلية تنظيف نظام الروتين. كما هو الحال مع إجراءات الفصل الآلي في الخطوة 5.2، البرنامج يجب أن يسيطر على الصمامات والمضخات حقنة لبالتتابع تحميل لفائف عقد مع الكواشف التنظيف، وطرد منهم من خلال النظام.
    3. أداء روتين التنظيف التالية: الاحمرار مع التبييض 10٪، ثم مع الايثانول 70٪، وتنتهي مع الماء أو وجود مخزن مؤقت المالحة المناسب (على سبيل المثال، برنامج تلفزيوني 1X أو المخزن المؤقت المستخدم لتجهيز العينات). استخدام كميات تدفق التالي: 450 ميكرولتر لتبييض والإيثانول، و 1،000 ميكرولتر للمياه / العازلة.
    4. خلال خطوات التنظيف، وطرد كل كاشف في مكتب التخطيط الاستراتيجي في حين تم تعيين صمام مأخذ LPO إلى منفذ التي يتم حظرها، ثم العكس بالعكس، لإزالة أي انسداد المحتملة في تدفق مقيد منفذ. الحفاظ على الانسحاب وتدفق ضخ معدلات 300-500 ميكرولتر / دقيقة لتقليل توليد فقاعة في الأنابيب واحداهما تراكم عندما يتم حظر إما SPO أو LPO.
    5. DISCAطريق الحلول التنظيف الزائدة وقارورة التي تم جمعها من خلال اتباع الإجراءات المناسبة للتعامل مع النفايات البيولوجية أو الكيميائية.

Representative Results

ويسلط الضوء على الملامح الرئيسية لتصميم الجهاز السمعي-ميكروفلويديك في الشكل وصفا كاملا في مكان آخر. 15 وباختصار، جنبا إلى جنب تدفق تيارين السوائل في قناة الانفصال، وفصلها عن قناة الالتفافية موازية بجدار رقيقة السيليكون. منذ حجم قوة الإشعاع الأساسي موازين مع حجم الجسيمات، الجزيئات الكبيرة تهاجر من تدفق الدخل المختلط العينة نحو العقدة الضغط الصوتية الموجودة في المجاور تيار السائل الانتعاش، في حين لا تزال جسيمات صغيرة في مجرى الأصلي (الشكل 1B، C). وتنقسم الهندسة المعمارية ثنائي القناة يحسن الجسيمات الفصل 17 ويسمح تعديل موقف عقدة باستخدام مختلف السوائل قناة تجاوز 16 في اللوح فلويديك والتركيبات يوفر منصة قوية للعالم لرقاقة الاتصالات، وتصميم وحدات يمكن تغيير سريع بين رقائق الموائعية (الشكل 2). هذا جonfiguration يسمح أيضا اتصالات السوائل عكسها، الذي ختم تصل إلى 1000 رطل لكل بوصة مربعة، ليتم بسرعة وبشكل موثوق (الشكل 2B، E).

ويمكن تقدير الدقة التردد و الرنانة من شريحة باستخدام الحسابات التحليلية 1D بسيطة (راجع الخطوة 1.1.1). من أكثر اكتمالا نموذج 2D محدود عنصر لدينا جهاز المقطع العرضي، 16 موقف مع التركيز المتوقع ل2-عقدة الرنين هو 225 ميكرون من الجدار والتردد المتوقع هو 1.68 ميغاهيرتز. ومع ذلك، يمكن الدقة و الأجهزة الحقيقية تختلف من ± 100 كيلو هرتز، اعتمادا على درجة حرارة التشغيل واقتران الأصداء الطولية والعرضية. ولذلك، بعد تجميع الجهاز، الدقة و يجب التحقق منها تجريبيا في معدلات تدفق ذات الصلة والفولتية محرك بيزو، كما هو موضح في الخطوة 4 من البروتوكول. ويبين الشكل 3 بالاشعة تردد التمثيلي الذي اتخذ في 200 ميكرولتر / دقيقة، مع المياه في القنوات الرئيسية والالتفافية، و 20 V ص الموردة إلى بيزو. عندما اقتران بين بيزو وجهاز ميكروفلويديك أمر جيد، وسوف تركز الجسيمات بإحكام على تردد الرنين، مما أدى إلى الذروة واضحة في كثافة الفلورسنت والهجرة إلى موضع التركيز المتوقع (الشكل 3A). في المقابل، عندما يكون هناك سوء اقتران، والجسيمات لن تركز بشكل جيد وستكون النتائج تردد المسح تكون مشابهة إلى الشكل 3B. في مثل هذه الأجهزة، قد تحتاج محول بيزو إلى إعادة تركيبه، إذا تم استخدام مادة لاصقة عكسها. خلاف ذلك، وهذا الجهاز غير مناسب عندما عالية الجودة مع التركيز أو تدفق سريع حاسمة لتطبيق المطلوب. البيانات في الشكل (3) تبلغ اختيار تردد التشغيل لتجارب لاحقة، والجهد وتدفق نطاق سعر متاح للجسيمات كفاءة الانفصال.

الملفات / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
الرقم 5. المعالجة الآلية للعينة. (A) رسم تخطيطي للعينة التي تم تحميلها في ملف عينة. (B) لمحة تدفق ممثلا لتجربة فصل ناجحة. (C) التدفق الجانبي من الفصل تشغيل خلالها منفذ SPO انسداد في حوالي 220 ثانية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد تحديد الرقائق التي هي فصل فعالة، وإدماجها في النظام هو مبين في الشكل (4). يتم التقليل من مجموع النظام اجتاحت حجم باستخدام أنابيب مع 0.01 "القطر الداخلي على طول مسار التدفق الرئيسي (خطوط زرقاء). ويوضح الشكل 5A الماكياج من المكونات عينة نموذجية أكسب من خلال النظام. مطلوب كمية صغيرة من "عازلة الرائدة" (~ 35 ميكرولتر) إلى preceدي العينة في تدفق للقضاء على تقلبات تدفق بينما العينة يتحرك من خلال رقاقة الانفصال. ويبين الشكل 5B تدفق البيانات الناتجة من التجربة الآلي الفصل الصوتية الناجحة. الملامح الرئيسية مسيرته الناجحة ما يلي: (1) زيادة عابرة في معدل التدفق في كل من LPO ومكتب التخطيط الاستراتيجي تراكم الضغوط ويبدأ السائل في التدفق من خلال النظام، (2) ارتفاع حاد مما يدل على مرور فقاعة الهواء (ل أقحم يظهر ملف تعريف الموسع للفقاعة واحدة)، والتي ينبغي أن تصل إلى مكتب التخطيط الاستراتيجي قبل LPO بسبب تدفق غير المتكافئ من وسائل اثنين، (3) تدفق ثابت من خلال كل وسائل بين فقاعات الهواء اثنين كما العينة التحركات من خلال النظام، و (4) يتم تسليم انخفاض تدريجي في معدل التدفق في كل المنافذ بعد حجم العينة الكامل للنظام. يدير إشكالية واضحة على الفور من ملامح تدفق مشابهة الشكل 5C، حيث يبدو أن مكتب التخطيط الاستراتيجي أصبح انسداد بعد حوالي 220 ثانية. في ثي يجب تشغيل الصورة الحالة، إجراء تنظيف مماثلة لتلك التي وصفها في الخطوة 5.3 لتنشيط القناة.

الشكل (6)
الرقم 6. جهاز Tunability: حجم الجسيمات والجهد الأثر. في المئة من المجهرية البوليسترين المستخرج في LPO يعتمد على حجم الجسيمات والجهد الموردة إلى piezoceramic. كل سطر يتوافق مع الجهد تشغيل مختلف على تردد الرنين، تحدد كما هو موضح في الخطوة 4. مجموع معدل التدفق من خلال الجهاز هو 200 ميكرولتر / دقيقة، مع ترددات محرك التطبيقية بين 1.62 و 1.64 ميغاهيرتز. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري لا تقل عن ثلاثة تجارب منفصلة. مستنسخة وتعديلها بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء من http://pubs.rsc.org / EN / المحتوى / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6 يبين جمعت نتائج الفصل باستخدام مختلف الأحجام البوليسترين الجسيمات وبيزو القيادة الفولتية التي تبرهن على معايير التشغيل اللازمة لفصل كفاءة. بشكل عام، يطلب من ارتفاع الفولتية (أي أكبر قوات الصوتية) لاستخراج جزيئات أصغر، كما هو متوقع. الفولتية حملة لا يمكن زيادة إلى أجل غير مسمى، ولكن نظرا إلى مزيد من تبديد الحرارة وتفاقم الآثار الناجمة عن تدفق الصوتية. تخدم 13 المؤامرة بمثابة دليل عام لالجسيمات أحجام فصل الجسيمات التي تظهر انتعاش اختلافا كبيرا في محرك أقراص معينة الجهد (على سبيل المثال، 10- والجسيمات 2 ميكرومتر في 8.8 V ص) سيفصل أيضا. عموما، السكان الجسيمات مع فرق كبيرة الحجم، مثل الفيروسات (~ 100 نانومتر) والخلايا (~ 10 ميكرون) يمكن فصلها بسرعة وكفاءة، كما يمكن الخلايا من مهرجان دبي السينمائي الدوليالأحجام erent (على سبيل المثال، 6-8 ميكرون الكريات الحمراء قرصي و8-15 ميكرون الكريات البيض). الشروط المحددة المطلوبة للعمل مع أنواع الخلايا الأخرى يجب أن يكون مصمما تجريبيا، كما شكل الخلية وكثافة والانضغاطية تؤثر على النقيض لها الصوتية، بالإضافة إلى حجم الخلية. تحقيقا لهذه الغاية، والإجراءات في الخطوة 4 هي مفيدة لتحديد شروط الفصل قابلة للاستخدام أي خلية أو الجسيمات نوع جديد، وليس فقط لتقييم نوعية جهاز acoustophoresis معين.

الرقم 7
الرقم 7. كفاءة فصل خلية للفيروسات عينات ارتفعت. نتائج الفصل من (A) خلايا راجي ارتفعت مع فيروس حمى الضنك (DENV) و (ب) الخلايا راجي وخلايا الكلى بوا ارتفعت مع جولدن جيت الفيروسات (GGV). يتم تحديد النسب المئوية التي تم جمعها باعتبارها جزء من الفيروسات أو الخلايا تخرج من معينمنفذ بالمقارنة مع المبلغ الإجمالي الخروج من رقاقة. أشرطة الخطأ (A) هي الانحراف المعياري من 3 محاكمات، في حين تم تجهيز العينات في (B) مرة واحدة فقط نظرا لانخفاض الكميات المتاحة. تم استخدام برنامج تلفزيوني 1X باعتبارها منطقة عازلة عينة والانتعاش السائل، مع الماء في القناة الالتفافية لجميع التجارب. وتراوحت ترددات التشغيل رقاقة بين 1.60 و 1.64 ميغاهيرتز، مع الفولتية محرك تتراوح أعمارهم بين 16 و 20 V ص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

للتدليل على فائدة من هذا المنبر للانفصال الجسيمات البيولوجي، ونحن استخدم لأول مرة لمعالجة العينات البيولوجية تتميز جيدا: خلايا الإنسان راجي (10 5 خلية / مل، متوسط ​​قطرها 8-10 ميكرون 25) ارتفعت مع فيروس حمى الضنك (DENV، 10 5 PFU / مل، قطر تقريبي 50 نانومتر 26). الشكل 7ويبين النسبة المئوية للخلايا راجي وDENV التي تم جمعها في كل من مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO (الذي يعرف بأنه جزء من كل نوع الجسيمات التي تم جمعها من كل منفذ مقارنة مع المبلغ الإجمالي للكل الجسيمات التي تم جمعها من رقاقة). وتكررت التجربة في ثلاث نسخ، وكان كميا الخلايا راجي باستخدام عداد كولتر، في حين كان كميا DENV باستخدام العكسية النسخ البلمرة الكمي سلسلة من ردود الفعل (RT-QPCR).

بعد ذلك، تم اختبار أداء النظام في السيناريو الذي هو أكثر واقعية لمعالجة العينات السريرية، التي الخصائص الفيزيائية الدقيقة للجسيمات قد يكون غير معروف، وكميات عينة المتاحة أقل. هنا، قمنا بتقييم فصل البوابة الذهبية التي تم تحديدها مؤخرا للفيروسات (GGV)، ثعبان الممرض اصابة خلايا الكلى الأصلة العاصرة 27 حجم جسيمات الفيروس GGV لم يتم قياسها، ولكن منذ GGV ينتمي إلى عائلة الفيروسات الرملية، فإنه ومن المرجح لحجم مماثل، ما بين 100 و 150 نانومتر. 28 ومعالجة العينات مع GGV ارتفعت (10 4 PFU / مل) إلى خلايا راجي الإنسان (وليس هدفا العدوى للفيروس)، والخلايا أفعى الكلى (الهدف العدوى لGGV، الحجم التقريبي 10 ميكرون 27)، مع كل أنواع الخلايا في 10 4 خلية / مل. كما كانت هذه العينات متوفرة بكميات منخفضة، وقد سجلت نتائج الانفصال عن واحد فقط تشغيل تجريبي في هذا العمل. ويبين الشكل 7B النسبة المئوية للخلايا راجي، خلايا بوا، وGGV التي تم جمعها من مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO. وتم قياس كمية الخلايا في هذه التجارب التي تعول على عدادة الكريات وكانت كمية الفيروسات التي RT-QPCR.

Discussion

يعرض هذا البروتوكول التكامل على مستوى النظام من أجهزة ميكروفلويديك لمعدات macroscale لأداء الآلي تجهيز العينات البيولوجية. ونمطية من هذا المنبر يسمح لها أن تكون قابلة للتكيف مع أي جهاز التدفق المستمر، وكمثال على ذلك، يركز على بروتوكول المعروضة على تميز وتحسين أداء جهاز فصل الجسيمات acoustofluidic. ويسلط الضوء على ثلاث مزايا رئيسية من هذا البروتوكول: (ط) نمطية ورقاقة إلى عالم التواصل، (ب) توصيف قوية من أداء الجهاز، و (ج) المعالجة الآلية من وحدات التخزين عينة المقننة على وجه التحديد لفصل الجسيمات.

أنا. نمطية ورقاقة إلى عالم التواصل

كما هو مبين في الشكل هي التي شنت على رقاقة ميكروفلويديك على اللوح المخصص لتناسب بسهولة على مرحلة المجهر للمراقبة المباشرة. اللوح يحتوي # 6-40 الثقوب مؤسسة الأمم المتحدة الخيوط على 5 مم الشبكة الملعب، ENAبلينغ رقاقة لتأمينها، والاتصالات السوائل في هذا الشأن. ونظرة خاطفة الاتصالات السوائل أنابيب مع نهايات تشكيله، والذي ختم ضد رقاقة فلويديك مع المطاط ختم وجه حشية وطوق الفولاذ المقاوم للصدأ. هذا المخطط واجهة يجعل لاستبدال سهلة رقاقة وإعادة تصميم الجهاز السريع، مما يتطلب قليل أو أي تغييرات على مكونات النظام الأخرى، وآثار أقدام رقاقة المقدمة مطابقة لشكل شبكة. على سبيل المثال، وقد استخدمنا هذه المنصة مع رقائق ميكروفلويديك لالكهربائي الدفق المستمر، تحلل الخلايا الحرارية، 29 خلط السريع من الكواشف لتخليق المواد الكيميائية، والقبض على خلية واحدة والاستجواب.

ثانيا. توصيف قوية من أداء الجهاز

من أجل تحسين أداء أي جهاز فصل ميكروفلويديك، يجب أولا أن تتسم عملياتها بدقة. النظام هو موضح هنا يدعم وضع بروتوكولات السريع والآلي للقيام بذلك. لأمثل محددلو لالصوتية التركيز الأجهزة، ونوعية التركيز، تردد التشغيل، والموقف من الجسيمات التي تركز في قناة ميكروفلويديك يجب أن تقاس لكل جهاز على حدة. هذه القياسات تتطلب تجتاح من خلال مجموعة من الترددات محرك piezoceramic، الفولتية ومعدلات التدفق، لتحديد مجموعات المعلمة المثلى للانفصال ذات جودة عالية. بروتوكول المعروضة تختلف تلقائيا هذه المعلمات الانضباطي ويلتقط ذات الصلة data- أي والصور الفلورسنت من الجزيئات المتدفقة في القناة التي هي في مرحلة ما بعد معالجتها لتوليد القياسات المطلوبة من الجسيمات التي تركز الجودة، والتردد، وموقف (الشكل 3).

توصيف كامل للأداء الجهاز السمعي يتطلب تكرار الخطوات 4.4 و 4.5 حسب الحاجة في ظل ظروف تجريبية مختلفة. على سبيل المثال، تم العثور على موقف التركيز المطلق للشريحة عن طريق تشغيل التفحص تردد في معدلات تدفق منخفضة نسبيا والجهد العاليالصورة لضمان الهجرة كاملة إلى الموقع عقدة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه بالاشعة تردد تقييم جودة التجمع الجهاز (عند تشغيل مع الخرز البوليسترين من حجم معروفة)، أو لتحديد كيف يمكن لنوع الجسيمات سابقا مجهول سوف تتصرف في نظام (بعد اتسم رقاقة مع الخرز). وهناك رقاقة مع نقل الطاقة جيدة من piezoceramic إلى القناة ميكروفلويديك يؤدي إلى التركيز ضيق في معدلات تدفق عالية (> 1 مل / دقيقة) والفولتية المنخفضة (12-15 V ص)، في حين أن تلك مع نقل الطاقة الفقراء لا يركز حتى في انخفاض معدلات تدفق (<100 ميكرولتر / دقيقة) والفولتية العالية (> 20 V ص). لقد وجدنا أن اتصال حميم بين رقاقة ميكروفلويديك وpiezoceramic أمر بالغ الأهمية لنقل الطاقة كفاءة في السائل. مزيد من التحقيق في الطريقة الأمثل للالترابط رقاقة ميكروفلويديك وpiezoceramic سيمكن إنتاج موثوق للأجهزة عالية الأداء.

وأخيرا، كاملةصورة لعملية عبوة acoustophoretic ويمكن الحصول عليها من خلال الجمع بين القياسات تردد مسح الصورة القائمة في الخطوة 4 (والشكل 3) مع التهم الجسيمات التي تم جمعها من مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO وظائف المعلمات التشغيل ذات الصلة، من تجارب الانفصال التي أجريت مع المجهرية كما هو موضح في الخطوة 5. كما هو مبين في الشكل (6)، مثل سلسلة من التجارب الآلي يمكن أن تميز بسرعة أداء جهاز الفردية وtunability، إعلام المستخدم من الفضاء المعلمة الأمثل لتشغيل الجهاز لفصل الجسيمات.

ثالثا. المعالجة الآلية عينة صغيرة لفصل الجسيمات

لميكروفلويديك القائم على رقاقة معالجة عينة ناجحة ودقيقة، فمن الأهمية بمكان أن يعتمد عليه وعلى وجه التحديد متر، والحمل، وتقديم، وجمع كميات من السوائل لأنها تمر من خلال. هذه الدقة هي أهمية خاصة عندما يكون حجم العينة صغير(~ 0،1-1 مل)، وهو أمر شائع في بيئة معملية السريرية أو البحثية. 30 دقيقة التعامل مع العينة يمثل تحديا في التجارب ميكروفلويديك التقليدية التي تستخدم انسحاب اليدوي من العينة في حقنة والتسريب في جهاز مع عدم وجود ردود فعل من عند العينة وقد تم فصل ومتى ينبغي جمعها. بروتوكول المعروضة توظف الآلي عينة لفائف التحميل والاستغناء يقترن مع ردود الفعل في الوقت الحقيقي من أجهزة الاستشعار تدفق لتمكين فصل استنساخه من وحدات التخزين عينة صغيرة.

ويبين الشكل 5 لمحات تدفق قياس في مكتب التخطيط الاستراتيجي وLPO من تجربة الفصل نموذجية. أولا، يتم تحميل المخزن الرئيسي لللا يقل عن 35 ميكرولتر لضمان تدفق مستقر قبل أن تصل عينة الشريحة الصوتية. لا ينصح عينة كميات أقل من 100 ميكرولتر لهذا التكوين النظام، لأن عينة التخفيف نظرا إلى المخزن المؤقت الرائدة يصبح المفرط. ويتم استخدام المكونات من الهواء في بداية الالبريد الحقن قبل المخزن المؤقت مما يؤدي إلى فصل المكونات عينة من السائل الذي يلي، ومنع الاختلاط والتخفيف من العينة، والتي تخدم كمؤشر على أجهزة استشعار التدفق. بعد عابرة الأولي كسائل يبدأ تتحرك من خلال النظام، وإشارات ارتفاع حاد في كل وسائل تشير إلى مرور الهواء فقاعة الأولى. يتم اتباع هذه العابرين قبل فترة طويلة من تدفق مستقر كما تدفقات العينة من خلال النظام، ثم موجة أخرى عندما يمر الهواء فقاعة الثانية، وأخيرا انخفاض في نهاية المطاف في معدل التدفق إلى الصفر بعد توقف ضخ حقنة.

يتم استخدام مرور المقابس الهواء من خلال أجهزة استشعار تدفق كنقاط الزناد لتبديل صمامات لتشغيل وإيقاف جمع العينات، وبالتالي التقليل من عينة المفقودة والتخفيف كتبها كميات السوائل غير العينة. حلقة مغلقة قياس أحجام العينة المجهزة يلغي الحاجة إلى إعادة برمجة هذه القيم قبل بدء التجربة في كل مرة يتم تغيير نموذج الإدخال. هذه الميزةأهمية خاصة عندما يكون حجم عينة محدودة، على سبيل المثال في حالة العديد من العينات السريرية. يساعد في الوقت الحقيقي رصد تدفق أيضا في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. تشغيل الفقراء (على سبيل المثال، تسد تشكل في واحدة من وسائل) هو واضح على الفور من التشكيلات الجانبية الناتجة عن تدفق، كما في الشكل 5B.

للتدليل على المرونة والفعالية في فصل acoustofluidic باستخدام بنية النظام قدم، DENV تنقيته ومخزونات فيروس GGV وقد ارتفعت في الأسهم الخلية ومفصولة معالجة من خلال رقاقة ميكروفلويديك. ويبين الشكل 7A أن الخلايا راجي تم فصل جيدا من الفيروسات، و97 تم العثور٪ من الخلايا راجي الخروج من رقاقة أن يكون في أمر الشراء المحلي، وبالتالي يترك عينة عالي التخصيب من DENV في مكتب التخطيط الاستراتيجي. في المقابل، كانت كفاءة DENV فصل أقل، مع 70٪ من DENV الخروج من رقاقة وجدت في مكتب التخطيط الاستراتيجي. ويمكن أن يعزى هذا إلى طفيفا خلط الحمل الحراري الناجمة عن يتحول من separatiعلى القناة، ولكن من المرجح أن بعض الجسيمات DENV المهاجرة جنبا إلى جنب مع الخلايا راجي في LPO. الخلايا المهاجرة أفقيا عبر يبسط جر بعض السوائل معهم، حتى في انخفاض عدد رينولدز. من خلال هذه الآلية، وكذلك امتصاص السطح غير محدد، نقل الجزيئات الفيروسية في LPO. ومع ذلك، فإن العينة عالي التخصيب من DENV في مكتب التخطيط الاستراتيجي هي فائدة كبيرة، على سبيل المثال عندما يستخدم دي نوفو تسلسل لكشف وتحديد الفيروسات.

ويبين الشكل 7B أنه في إحدى التجارب، تم العثور فقط حوالي 70٪ من خلايا بوا الخروج من رقاقة في LPO، مقارنة مع ما يقرب من 100٪ كفاءة فصل الخلايا راجي. الفرق في الأداء الفصل بين أنواع الخلايا اثنين قد يعزى إلى متوسط ​​حجم أصغر أو أقل كثافة الخلايا بوا بالمقارنة مع الخلايا راجي، وبالتالي يؤدي إلى القوات الصوتية أصغر. لتأكيد أو دحض هذه الافتراضات، وحجم وكثافة ومورفولوجية بواالخلايا في تعليق (التي تنمو عادة ملتصقة) من الخلايا بوا يجب أن تقاس بدقة، محاولة لمزيد من التحقيق. في نفس التجارب، على غرار التجارب مع DENV، الجزء الأكبر من GGV تعافى خرجت من مكتب التخطيط الاستراتيجي، مما يشير إلى إثراء جزء الفيروسي.

البيانات المقدمة تسلط الضوء على التحديات الكامنة في الهندسة منصات على نطاق واسع المطبقة لمعالجة مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. الأهم من ذلك، يمكن للتفاعلات البيولوجية تبدأ للعب كبير كدور إلى التأثيرات الفيزيائية والميكانيكية. ومع ذلك، تظهر أيضا هذه التجارب الأولية للقوة ووعد باستخدام هذا بنية النظام لتجهيز العينات في التطبيقات السريرية والبحوث. ونتيجة ل، جيدا اتسم نظام المهندسة قوي، وتوفر هذه المنصة القدرة على البحث عن إجابات على أسئلة علمية جديدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats