Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroakışkan cihazların en büyük avantajı, böylece reaktif atık azaltılması ve değerli örneği koruyarak, küçük bir örnek hacimleri işlemek için yeteneğidir. Bununla birlikte, dayanıklı örnek düzenlemesi elde etmek için bu makro ölçekli bir ortamda cihaz entegre gidermek için gereklidir. Mikroakışkan cihazlar ile tekrarlanabilir, hassas partikül ayrımı gerçekleştirmek için, bu protokol mikroakışkan cihazlar kullanarak 0,15-1,5 ml numune hassas işlenmesini sağlayan tam otomatik ve entegre bir platform mikroakışkan sunar. Bu sistemin önemli yönleri kapalı döngü örnek toplama, sistem temizliği ve tekrarlanabilir şekilde çalışmasını sağlamak için gerekli adımları emişli gerçekleştirir modüler cihaz düzeni ve bağlantıları çip, güvenilir ve esnek dünyada sonuçlanan sağlam fikstür ve tam otomasyonlu sıvı taşıma içerir. Farklı mikroakışkan cihazları bu mimari ile birbirlerinin yerine kullanılabilir. Burada bir acoustofluidic cihazı dahil, detay onun characteriztirme, performans optimizasyonu ve biyolojik numunelerin boyut ayrılması için kullanımını göstermektedir. Ayırma deneyler sırasında gerçek zamanlı geri bildirim kullanarak, numune toplama korumak ve örnek konsantre optimize edilmiştir. Ekipmanın çoklu parçalar entegrasyonu gerektiren rağmen, bu mimarinin avantajları hiçbir ek sistem optimizasyonu, cihaz değiştirme kolaylığı ve hassas, sağlam numune işleme ile bilinmeyen örnekleri işlemek için yeteneği vardır.

Introduction

Örnek ayırma ve fraksiyonlara mikrosıvı teknolojiler için uygulamanın en umut verici alanlarından biridir. Böyle bir numune alma basamaklar etkili klinik teşhis, tedavi geliştirme, Biyodenetleme çabaları ve yaşam bilimleri araştırma ve teknolojinin ilerlemesi için ayrılmaz bir parçasıdır. Bir sayısız mikroakışkan ayırma stratejileri yanı sıra kimyasal ve biyolojik türler için sıvı askıya partikül ve kolloidler için ortaya konulmuştur; 9 - Birkaç yorum bu alanlarda 1 son ilerleme ve gelişmeler genel değerlendirme. (Bundan sonra "Çekirdek Cihazlar" olarak anılacaktır), bu mikroakışkan ayırma teknolojilerin çok yoğun, özelliği olmakla birlikte, çok az sayıda rapor bir sistem seviyesinde örneği ayırma problemi üzerinde durmuştur. Çekirdek Cihazları tipik bir deplasman veya basınç pompası tarafından teslim sıvıyla florpolimer boru arabirim bireysel santimetre ölçekli cips, vardır.Numune hacimlerindeki otomasyonu, güvenilirlik ve azalma artmış dahil - - Mikroakiskan vaadi varsa Ancak, en azından denk bir çaba Çekirdek Cihaz entegre edilmiş olan tam bir ayrılık sisteminin tasarımına adamış olmalıdır, gerçeklik olmaktır .

Buna ek olarak, biodetection için mikroakışkan yaklaşımlar için büyük bir sorun mikro arayüzü makro. Bu ~ macroscale bileşenleri bir mikroakışkan cihazın fiziksel "dünya-to-çip" bağlantıları ve tipik klinik veya analitik numune hacimleri (~ 0.1-10 ml) ve mikroakışkan cips iç hacmi arasındaki uyumsuzluğu (değil sadece anlamına gelir 0,01-10 ul), aynı zamanda bu büyüklük ölçekleri köprü kaynaklanan istatistiksel örnekleme sınırlamaları. Bu konular örnek ön-işleme ve hazırlama biodetection "zayıf halka" olduğu algısının katkıda bulunur. 10 Bu çalışmada ta açıklanan platformuBu zorlukların ele yönünde kes önemli adımlar.

Bir sistem düzeyinde görünümünü alarak, bu protokol ~ 10 dakika timescales üzerinde (0.15 ila 1.5 ml arasında değişen) hassas ölçülü analitik ölçekli hacimlerinin güvenilir işleme ayrıntıları. Bu "tek tuşla" operasyonu: fraksiyon koleksiyonu için örnek ve hedef şişeleri içeren kaynak flakon sistemi içine yerleştirilir kez "run" komutu işlemini başlatır ve tüm adımlar bilgisayar kontrollü vardır. Bir Uygulamanın sonunda, toplama şişeler ayrılan fraksiyonların alt analizi için sistemden çıkarılabilir.

Bu sistemde Çekirdek Cihaz örnekten memeli hücre büyüklüğünde (5-20 mikron) partikülleri ayıklayan bir acoustophoresis çip. Acoustophoretic ayrılması o yüksek verimli olmasından dolayı burada seçilir, etiket içermeyen ve temassız, böylece canlı Viru ayıran avantajları sunan (ul / dk 100'ler kadar)Birkaç diğer mikroakışkan teknikler maç hücrelerden ses. 13 ve bu protokolün odak değil, altında yatan kavramların kısa bir özetini mikroakışkan ayrılık uygulamayı anlamakta yardımcı olmak için aşağıda - akustik parçacığın fiziği yaygın, 11 tarif edilmiştir odaklama.

Sıvı dolu Mikrokanallarda rezonansa Ultrason duran dalgalar alçak basınç düğümler doğru parçacıkları sürücü kuvvetlerin doğuran basınç alanları üretmek. Kuvveti büyüklüğü odaklama akustik ideal ölçekli hücre (~ 7-15 ayrılması için uygundur, parçacığın hacmine bağlıdır ve bu gibi, göreli yoğunluklar ve parçacığın sıkıştınlabilme türetilen akustik kontrast faktörü ve süspansiyon sıvısı. 14 Virüs boyutlu (~ 50-200 nm) parçacıklardan um). Daha büyük parçacıklar bir basınç düğüm doğru göç; Ancak, kuvvet büyüklüğü beri için çok küçükdaha küçük 2-3 mikron, bu küçük parçacıklar veya çözünmüş türlerin neredeyse hiç hareket parçacıklar. Akustik ayırma Bizim özel uygulama, daha önce tarif edildiği gibi, 15 kanalının alt bölümlere ayırmak için sıvı ince bir duvar içerir ve ayarlanabilir, odaklama pozisyonda asimetrik yerleşimi sağlar. Bu cihaz tasarımında esneklik katar ve performans avantajları da dahil artmış ayırma kalitesi ve hızı-olan tam başka nitelendirdi. 16,17

Ancak, bu çalışmada açıklanan sistem düzeyindeki tasarım yaklaşımı önemli bir avantajı mikroakışkan Çekirdek Cihazları büyük bir çeşitliliği adapte olmasıdır. Uygun düzenlemeler giriş / çıkış konfigürasyonu değişiklikleri hesaba yapılan, örneğin, atalet, akış alanı ayırma, deterministik yanal olarak yer değiştirmesine (DLD) ve elektrokinetik cihazın farklı türleri dahil olmak üzere diğer pek çok sürekli akış ayırma modu, hali hazırda, dahil edilebilir , akış hızları,ve numune hacimleri. Çeşitli on-chip alanlarının türleri (elektrik, manyetik) veya degradeler (termal, kimyasal) olan cihazlar bu platform barındırmaktadır çip ya da ek donanım entegrasyonu, ek bağlantı gerektirebilir.

Bu protokol, mikroakışkan ayırma cihazı tasarımı ve gravür ve pasivasyon döngüleri alternatif derin ulaşmak için kullandığı birçok mikroimalat tesislerinde (derin reaktif iyon dağlama ulaşabilirsiniz Drie, plazma oyma işlemi silikon cam yongaları üretmek için gerekli adımları sağlar Dikey yan duvarları 18) ile özellik. Sonra, acoustofluidic cihazın karakterizasyonu ayrılması için optimum çalışma parametrelerini belirlemek için, ve nihayet detay tam entegre ayrıştırma sistemi ve biyolojik numunelerin işlenmesi için prosedürü açıklar. Tipik cihaz karakterizasyon sonuçları ve örnek işleme verileri daha sonra sunulmuş ve tartışılmıştır ve bu beğenme önemli avantajları vardırach modülerlik, sağlamlık, hassasiyet ve otomasyon dahil vurgulanır.

Protocol

1. Acoustophoretic Cihaz Tasarımı ve photomask Düzen

NOT: Genel hususlar ve mikroimalat proses tasarımı ve maske düzeni için rehberlik photomask tasarım mikrofabrikasyon metinler ve öğreticiler bulunabilir 19 - 21.

  1. Uygun CAD yazılımı kullanarak, Maske 1, akışkan Katmanı (ön taraf) yatıyordu. İstenilen uygulama için uygun numune enjeksiyonu ve ayrılık izin veren bir geometri seçin.
    1. Akustik odaklama için bir rezonans frekansı f n sağlamak için w, akışkan kanal genişliğini ayarlayın Bir 900-mikron genişliğinde bir kanal için c, ilgili akışkan içinde ses hızıdır ve n, duran dalga düğüm (örneğin sayısıdır denklemi f n = nc / 2w, 1 'e göre MHz daha büyük, iki düğüm rezonans f 2 = 1.65 MHz) bekleniyor.
      NOT: Parçacıkfarklı çıkışlarından çıkmalısınız ayırma kanalının sonuna yakın farklı yanal pozisyonları işgal s. Bu protokol, parçacıkların büyüklüklerine göre ayrılırlar, bu nedenle, Şekil 1 'de gösterildiği gibi yerleri sırasıyla küçük ve büyük parçacık-parçacık çıkış için DPT ve LPO, belirlenir.
    2. Zaman parçacıklarının uzunluk belirli bir akış hızında ayırma alanına maruz kalan kontrol etmek için sıvı kanal uzunluğu ayarlayın. Uzun parçacıklar ayırma kuvvetler nedeniyle göç etmek için on-chip kalma süresi daha gerekli çip ayak izi değmelidir gerekir.
      Not: akustik odaklama cihazları, akış kanalı sisteminde artan kalış süresine (Şekil 2a) çip aşağı üç kez geçer. 300 x 200 um kesiti, 117 mm uzunluğunda ayırma kanalından akan 200 ul / dakika, partiküllerin, tipik bir toplam akış hızında akustik alan ortalama 2,1 saniye geçirirler.
  2. Maske Layo içinde akışkan bağlantı noktalarını ekleyinstandardize ızgara (5 mm sahada) üzerinde düzenlenmiş standart boru bağlantıları için ut. Imalat ve bireysel cihazların dicing sırasında birbirlerine maske uyum için uygun fiducial işaretleri ekleyin.
  3. Maske 2, yalnızca akışkan bağlantı noktalarını içeren Via Katmanı (arka taraf), yatıyordu. Hizalama 1 Maske için referans işaretleri ekleyin.

figür 1
Şekil 1. Acoustofluidic cihaz. Acoustophoretic cihaz mimarisinin şematik skeçler. (A) genel H-filtre konfigürasyonunu gösteren Üstten görünüm, (ölçeksiz). (B) siyah ile işaretlenmiş yerde kanal kesitinin şematik olarak kesikli çizgi (a), basınç alanı (mavi çizgiler noktalı), ve doğru parçacıkları sürücü akustik birincil radyasyon güçleri (PRF) duygusu gösteren düğüm düzlemleri (kırmızı oklar). Kanal kesitiYaklaşık 10 mikron kalınlığında ana (300 mikron genişliğinde) ve baypas kanalları ayıran bir duvar ile 900 × 200 mikron olduğunu. (C) partikül ayırma 3D gösterimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Acoustophoresis için mikroakışkan Chips 2. Temiz oda imalatı

  1. Desen çift tarafta Mask 2 kullanarak arka tarafı sıvı portlar standart pozitif karşı fotolitografiyle 0.5 mm kalınlığında, 100 mm çap <100> silikon gofret cilalı. 350-400 um derinliğe kadar derin bir tepkisel iyonla hakketme (DRIE) bu geometriyi Etch.
  2. Gofret ters çevirin ve desen ön tarafı sıvı kanal geometrisi, standart tarafından Maske 1 kullanılarak silikon diğer yüzüne fotolitografi pozitif direnmek. Ardından, ışığa kullanarak ikinci bir (boş silikon) taşıyıcı gofret cihaz gofret monte edin.
  3. Aracılığıyla-etching port yerlerine (taşıyıcı gofret DRIE takım yüzeyi koruyan) olarak silikon, 200 um'lik bir derinliğe kadar, DRIE göre, aynı zamanda, kanal Etch. Iliklerine çözümü karşı-sıyırma ile boş Si gofret cihaz gofret De-monte edin.
  4. Cihaz kez gofret ve (: 1 oranında bir 3 sülfürik asit ve hidrojen peroksit) Piranha çözeltisi kullanılarak sıradan bir 0,5 mm kalınlıkta bir borosilikat cam levhanın temizleyin.
  5. Anotsal aşağıdaki parametreleri kullanarak cam ve silikon gofret bağlanmasıyla sıvı kanalları Seal: 350 ° C'de 1000 N, sıcaklığı 3 mTor, piston basıncı odası basıncı ve 0.2 mA şimdiki damla kadar 750 V uygulayın.
  6. Bir dicing testereye bir elmas bıçak ile bireysel cips ayrı kesin.

3. Final Cihaz Meclisi

  1. Piezo Transducer Eklenti
    NOT: Ultrason silikon tarafına bağlı bir piezoseramik dönüştürücü tarafından mikroakışkan çip oluşturulur.
    1. At Gönderenwo-bileşenli düşük viskoziteli epoksi kit, her iki bileşen için tavsiye edilen oranı tartılır ve iyice karıştırın.
    2. Bir pipet ile epoksi karışımı dağıtın ve ince, hatta katman (37.5 × 10 × 0,5 mm boyutlarında piezo epoksi karışımı yaklaşık 10 ul) oluşturmak için bir kurşun zirkonat titanat (PZT) piezo seramiği boyunca yayılır.
    3. Uygun bir jig veya fikstür kullanarak, daha sonraki tel eki (Şekil 2a) için bir tarafta bir taşkın alanı sağlayan, mikroakışkan çip ile Piezo seramik epoksi tarafını hizalayın ve temas iki bileşenden getir. Bileşenlerden herhangi çatlamak özen mengenede derleme Kelepçe ve epoksi üreticisi tarafından tavsiye edilen sıcaklık ve sürede tedavi.
    4. Epoksi kürünü sonra, tel t önlemek için piezo ile kısacık olası teması, bir ucu ince havya ile lehim yaparak, piezoseramikli her tarafında yol açar ince ölçü takmakhermally de-polarize onu. Alternatif olarak, piezo teller yapıştırmak için iletken bir yapışkan kullanın.

Şekil 2,
Şekil 2. Akışkan Breadboard, Chip Montaj ve Dünya to-Chip Arayüz. (A) akustik mikroakışkan çip Fotoğraflar ekli piezo transdüser tel uçları ile (70 × 9 × 1 mm dış boyutları), ayrılığın üç geçer gösteren çip aşağı kanal, (b) çip-to-dünya arayüzü, (c) sıkma fikstür kullanarak akışkan breadboard alt monte çip, için özel akışkan vida parçaları ve işlenmiş boru parçaları breadboard bir açılış kapsayan izin Tubi arabirim soğutma fanı (d) bağlanmış boru bağlantılarının ve soğutma fanı ile breadboard üstten görünüşüdür, ve (e) vidalı bağlantı parçaları bir enine kesit şematikmonte mikroakışkan çip ile ng. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Cihaz Montaj ve Dünya-To-Chip arabirim
    1. "Akışkan breadboard" sıkıştırma fikstür kullanarak (geçiş delikleri dişli düzenli aralıklı bir ızgara ile bir tabak) çipi takın. Akustik deneyler sırasında sıcaklık düzenleyen breadboard bir soğutma fanı takın (Şekil 2).
      NOT: Tipik sürücü gerilimlerde soğutma fanı olmadan çalışma 70-80 ° C'ye cihaz sıcaklığını yükseltir. Bu önemli ölçüde bağlı sıvıda değişmiş ses hızına rezonans frekansı kaydırır ve olumsuz işleniyor herhangi bir biyolojik parçacıkların canlılığı etkileyebilir.
    2. Daha önce başka bir yerde 22 açıklandığı ve Şekil 2'de gösterilen, chip-to-Dünyada konnektörleri vidalayın. Bu i katılınstandart kullanarak giriş ve çıkışları ek boru ile nterface tüpleri ¼ "-28 1/16 için sendikalar" tüp.

Akustik Odaklama Performansının 4. Karakterizasyonu

NOT: Akustik odaklama karakterizasyonu için gerekli Sistem bileşenleri Malzeme Listesinde gruplandırılmıştır. 4.1 Adımları ve sonraki adımlar Burada tartışılan acoustofluidic cihaza özgü işlemleri tarif ise 4.2 aşağıda, bu platform ile kullanılan herhangi Çekirdek Aygıt için geçerlidir.

  1. Sistem konfigürasyonu
    1. Bir sıvı pompası ve tahsilat şişeleri hortumu (örneğin 1/16 "dış çap florpolimer boru) kullanarak Bölüm 3. Make bağlantıları açıklandığı gibi, akışkan breadboard dünya talaşa bağlantılarını kullanarak mikroakışkan çip takılacak. CCD kamera ile donatılmış floresan görüntüleme yeteneğine sahip bir mikroskop sahnede breadboard tertibatını monte edin.
    2. Küçük iç Diamete uzunlukları bağlayınr (ID) boru derhal sistemi istikrara kavuşturmak ve yonga çıkışları arasındaki akış bölme kontrol akış kısıtlayıcılarla olarak hizmet etmek çip (Şekil 4) sonra (0.006 "tavsiye edilir). Diğer tüm bağlantılar için, örneğin 0.01 "ya da 0.03" gibi büyük kimlik tüpleri kullanın.
      1. Μ sıvının dinamik viskozite olup uzunluğu L ve denklem R h kullanılarak iç çapı D = 128 uL / πD 4, ile boru her parçasının hidrodinamik akış direnci R h tahmin edilmesi. Nedeniyle, belirli bir akış oranında Q, boru donanımı, her uzunluğuna basınç düşüşü Δ P Δ p = QR h ile verilir.
      2. Ayırma yöntemi kullanıldığı için uygun çıkışları arasındaki akışını bölmek sınırlama uzunlukları oranı seçin. Bu protokol akustik çipleri ile Optimum ayırma bir DPT gerektirir: approxima ve LPO akış oranıtely 65:% 35.
      3. Çıkış akış kısıtlayıcılarla uzunluğunu seç şekilde onların akışkan direnç sistemine (uygun seri veya paralel olarak özetlenebilir) geri kalan toplam direncin en az 3-4 kat daha büyüktür. Bu çalışmada kullanılan acoustophoresis cihazı için boru 35 uzunlukları ve LPO ve DPT 65 cm uygundur.
        NOT: Dikkatli göz herhangi bir mikroakışkan Çekirdek Aygıt R h verilmelidir. Bizim akustik Bu çalışmada çipi odaklama için, Rh nedeniyle nispeten büyük kanal boyutları düşük, bu nedenle bağlı boru dirençleri kolayca aşar. Daha küçük kanal boyutları ile cihazlar için çipin direnç kasa tasarımı ve on-chip kanal R h kontrolü Bu protokolün 1. Adım sırasında ek bir bedel olduğu sistem tüp kalan, hakim olabilir. Detaylı tasarım ilkeleri ve kuralları literatürde mevcuttur. 23,24
  2. Sistem Teyidi
    1. Sızıntı mikroakışkan cihaz için bir tutku var ve tüm boru bağlantılarının sızdırmaz olduğundan emin olmak için kontrol edin. Bir şırınga ile gerektiği gibi giriş boruları yoluyla su koyun ve ana kanal herhangi bir sıvı sızıntısı izlemek.
    2. Çip sayesinde bilinen bir hacmi koyun ve akış oranı beklendiği gibi emin olmak için çıkışları toplanan hacimleri ölçmek. Beklenen hacim oranı sapmalar çıkışları ya da sızdıran bağlantılarından birinde tıkanıklıkları gösterebilir.
      1. Sistem temizliği korumak ve daha önce herhangi bir deney çalıştırdıktan sonra uygun temizlik çözümleri (örneğin, çamaşır suyu, etanol, su) ile tüm sistemi (akışkan boru ve chip) floş tıkanma önlemek için.
      2. Tıkanıklığı gidermek için net bir çıkış takmayı ise çıkışları birinde takunya veya tıkanmalar durumunda, sistem yıkayın. Bu başarısız olursa, yıkama sırasında akış yönünü tersine,isteğe bağlı olarak (elle çalıştırılan şırınga kullanarak) ters akımın hızlı darbeleri uygulayarak. Hala tıkanıklık kaldırılamaz Son olarak, gerektiği gibi boru veya yonga değiştirin.
  3. Akustik Odaklama Frekans Tarama Kurulum
    1. Deionize su, etanol ya da bir şırınga ile, manuel enjeksiyon ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) gibi sıvı ile bypass kanalı (Şekil 1 e bakınız) doldurun. Numune işlenen bu sıvı temas etmediğini unutmayın. Farklı baypas sıvıları kullanarak düğüm konumunu ayarlarken ayrıntıları başka bir yerde 16,17 açıklanmıştır. Düğümü ayıran duvara daha yakın olması gerekir, eğer Kısaca, etanol gibi bir düşük yoğunluklu bypass sıvısı kullanır; daha yakın, giriş örnek akışının düğüm yerleştirilmesi için, örneğin, bir gliserol çözeltisi olarak, daha yoğun bir akışkan seçin.
    2. (Ağırlık / hacim) 5-8 mikron floresan polimer taneleri gibi olan PBS gibi bir tampon içinde süspansiyon haline yaklaşık% 0.01 arasında bir kordon çözeltisi oluşturunuz% 0.05 Tween-20 ve boncuk çözeltisi ile numune giriş şırınga doldurun. (Bu bypass kanalı ile aynı akışkan olması gerekmez) aynı tampon ile tampon girişi şırınga doldurun. Genel olarak, tampon uygulaması (Adım 5.1) uygun bir şekilde seçilebilir unutmayın.
    3. Mikroskop sahnede akışkan breadboard ile, sadece görüş alanında iki kanal (ayırma ve bypass) ile çıkışa önce düz bir kanal bölgede kanalın derinliği içine yaklaşık yarım odaklanın. Ek eğik açılı dış ışık kaynağı görüntü verilerinin başarılı post-processing için, kanal duvarları görünür kılmak için gerekli olabilir.
  4. Otomatik Frekans Tarama ve Görüntü Yakalama
    1. Piezo transdüktöre uyarma sinyali sağlamak için radyo frekansı (RF) amplifikatör ile bir fonksiyon jeneratörü (örneğin, RG-58 BNC konnektörleri ile donatılmış) Korumalı kabloların kullanarak elektrik bağlantılarını yapın. İsteğe bağlı olarak, bir osiloskop bağlamakGerçek gerilimi izlenmesi için fonksiyon üretecinin çıkış transdüser başvurdu.
    2. Soğutma fanı açın ve tepeden-tepe (V pp) volt piezo transdüser RF amplifikatör çıkışı 12-25 aralığında olacak şekilde işlev üreteci ayarlayın.
    3. 50 ve 200 ul / dakika arasında, aynı akış hızına iki şırınga ayarlayın. Aynı motor ile iki şırınga sürücü tek bir şırınga pompası kullanılarak akış düzensizlikler en aza indirmek için tavsiye edilir.
    4. Başlangıç ​​ve bitiş frekansları, frekans değerleri arasındaki adım büyüklüğü ve bu National Instruments LabVIEW gibi laboratuvar otomasyon araçlarını kullanarak piezo sürücü gerilimi belirterek frekans tarama işlemini gerçekleştirin.
    5. Her frekans adımında, sistem dengeye, ardından (önerilir 10 ile 100 milisaniye arasında pozlama süreleri) 10 sonraki analiz için çip akan boncuk görüntü yakalamak izin 15 sn gerilim uygulamak.
    6. E arasındaach boncuk kanal boyunca homojen dağıtabilir ve önceden uygulanan frekans adımından odaklanarak önyargı kaldırmak izin yaklaşık 20 saniye boyunca gerilim kapatın, frekans adımı uygulandı.
  5. Görüntü Analizi Rezonans Frekans ve Odaklama Konumunu belirlemek için
    1. (Örneğin, bu Protokol ile sağlanan AF_freqScanPlotter.m MATLAB komut dosyası gibi) bir görüntü analizi komut dosyasını çalıştırın ve istemleri de gerekli bilgileri girin: Adım 4.4 oluşturulan görüntü dosyalarının listesini seçmek, tarama başlangıç ​​girin ve frekansları ve step boyutu durdurmak, Tam kanal genişliği, duvar konumu ve nihayet ayrılması ve baypas kanalları hem de dahil olmak üzere, analiz etmek görüntü bölgeyi seçin.
    2. Analiz komut ortalama her frekans adımda çekilen görüntülerin setini gözlemleyin ve akış yönü boyunca yoğunluk değerlerinin ortalamasını alın. Bu floresans yoğunluğunu enine kesit çizgisi-tarama ile sonuçlanır.
      NOT: highe karşılık gelen frekans st yoğunluğu rezonans frekansı (Şekil 3, orta sıra) ve en yüksek yoğunluk odaklama konumu (Şekil 3, alt sıra) olduğu için oluşur kanal pozisyon olarak tayin edilir.

Şekil 3,
Iyi bağlanmış, (A) için frekans tarama verileri ve kötü bağlanmış (B) piezo ve yonga Şekil 3. Temsili Frekans Tarama. Örnek. Üst sıra: boncuk floresan yoğunluğu (kırmızı yüksek temsil ve mavi düşük yoğunluklu gösterir). Orta sıra: Her frekansta maksimum yoğunluğu. Alt satır: Maksimum yoğunluk tarafından belirlenen kırmızı kesik çizgi konumunu odaklanarak tahmin gösterir maksimum yoğunluk, yeri ve kırmızı elmas rezonans frekansı göstermektedir.g "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5. Otomatik Ayırma

NOT: Otomatik ayırma deneyi nedeniyle mikroakışkan çip uygulanan boyut bağımlı akustik odaklama kuvvetleri küçük parçacıklardan büyük partiküllerin ayrılması için çalıştırılır. Gerekli sistem bileşenleri Malzeme Listesinde gruplandırılmıştır.

  1. Sistem Yapılandırma ve Numune Hazırlama
    1. Şekil 4'te gösterildiği gibi şırınga pompası mikroakışkan çip takın, bilgisayar kontrollü çoklu port seçimi vanalar, PC arayüz debimetre ve boru. Bu yapılandırma mikroakışkan ayırma çip sayesinde numunelerin işleme otomatik yanı sıra otomatik sağlayan deneyler arasındaki adımları temizlik çapraz kontaminasyonu ve numune taşıma-over kaldırın.
    2. Analiz yöntemi ile gerektiği gibi hücreler ya da parçacıklar için uygun örnek bir tampon kullanarak ayrılır veya edilmesiayrılıktan sonra kullanılmalıdır. Aşama 4.3.2 olduğu gibi, geri tamponu (zorunlu olmamakla birlikte bypass sıvısı) numune sıvı ile aynı olmalıdır.
      Not: tipik haliyle biyolojik örnekler (ör PBS) ile kullanılan herhangi bir sulu tamponlar suya benzer akustik özelliklere sahiptir ve kayda değer bir akustik cihazın performansını değiştirmeyecektir. Yoğunluk ve sudan önemli ölçüde farklı viskoziteye sahip örnek sıvıların kullanılması mümkün olmakla birlikte, tek önemli acoustophoresis deneyime sahip operatörler için önerilir.


Şekil 4,
Otomatik Ayırma Deneyleri Şekil 4. Akustik Sistem Yapılandırması. Mavi çizgiler sistemi aracılığıyla ana akış yolu iz. Tüm yeşil ve siyah çizgiler 0.03 "iç çapı (ID) boru ve tüm mavi ve gri renkli çizgiler 0,01 olan" dir e, kimlik boruKimliği "0.006 olan kimlik ve akış kısıtlayıcılarla," 0.03 olduğunu tutma bobinleri, bir xception. Şırıngalar tamponu ile doldurulur ve tutma bobinleri şırınga içine herhangi bir numune veya temizlik reaktiflerin alımını önlemek için yeterli hacmi (550 ul) vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Ayırma Prosedür
    1. Ön çalışma durumu. Ayrılık çalıştırmadan önce temizlik reaktif rezervuarlar (çamaşır suyu, etanol, tampon) yeterli sıvıyı sahip olmasını sağlamak, atık depoları dolu değil, ve akışkan hatları prime (yani, çözüm ile dolu). İkinci koşul belirsiz, ya da sistem boşta sonra ilk kez çalıştırılıyor ise (örneğin, belirli bir günde ilk kez), otomatik temizleme yordamını çalıştırmak (aşağıdaki Adım 5.3). Rese atık akmasına çip çıkışları Vanalar 3 ve 4 ayarlayınBaşlangıçta rvoirs.
    2. Soğutma fanı açın ve adım 4.5 belirlenen, kullanılan akustik çip için rezonans frekansında fonksiyon jeneratörü ayarlayın. Fonksiyon jeneratörü gerilim ayar noktasını ayarlayın, böylece istenen ayrılması için uygun olarak 12 ve 25 V pp arasındaki RF amplifikatör çıkışları.
    3. Sisteme örnek Giriş Flakon, Tampon Giriş Flakon ve uygun toplama şişeleri bağlayın. Sadece kendi pikap tüp Numune Giriş Flakon takmadan önce, girdap flakon kısaca yerleşmiş olabilecek parçacıkları yeniden askıya. Ardından, şişeyi takın ve gecikmeden ayırma rutin başlatmak.
      DİKKAT: işlenecek Örnek potansiyel olarak bulaşıcı maddeler içeriyorsa, vialler sızdırmaz şekilde kapalı bir sistemi korumak ve örnek aerosol haline önlemek için, vidalı kapaklı türde olmalıdır. Biyolojik tehlikesi olan materyallerle çalışırken gerekli koruyucu ekipman giyen ve req kullanırken ek olarak, tüm şişeleri ve boru koluBiyolojik Risk Grubu ve Biyogüvenlik Seviye için edinilmiş tehlike kontrolleri ve prosedürleri malzeme mülk. Herhangi bir belirsizlik durumunda kurumsal politika ve protokolleri danışın.
    4. , Vanaları kontrol sensörleri akış ve tam otomatik ayırma rutin yürütmek için pompalamak için bir laboratuvar otomasyon araç bir program kullanın.
      NOT: Rutin, vanalar anahtarları şırınga pompası çekilmesi ve infüzyon harekete ve monitörler doğru çıktı örnek fraksiyonların toplanması zamanlama sensörü verileri akar. Elle yürütülen sanki önemli adımlar, 5.2.4.3 ile 5.2.4.1 aşağıda özetlenmiştir.
      1. Başbakan pikap hortumu. Tamamen Aynı anda Valve 1. bağlamadan tüp doldurmak için örnek Giriş Flakon yaklaşık 15 ul çekiniz, Benzer bir şekilde 2. Valf Tampon Giriş Flakon bağlayan tüp başbakan, Vana 1 asal hava girişi buna emin olmak için herhangi bir sıvıyı içerir. Son olarak, herhangi bir atık sınırdışı Vanalar 1 ve 2 anahtarYükleme bobin girmiştir aşırı sıvı veya hava.
      2. Şekil 5a'da gösterildiği gibi, örnek bobin yerleştirin. 250 ul numune için tipik bir yükleme sırasının 50 ul / dakika, 200 ul / dk'da gelen tampon 35 ul ve ardından 200 ul / dakika, önceki numune daha sonra 250 ul, ve son olarak hava ile 25 ul geri etmektir 50 ul / dak havada bir diğer 25 ul.
        NOT: Tüm birimler ve akım hızları kullanıcı tarafından seçilebilir. Bu yükleme sırası sıvı fişler ayırma cihazının akacaktır nasıl tersten olduğunu unutmayın.
      3. Örnek infüzyon başlayın. Istenilen oranda (tipik olarak 100 ul / dk) yüklü sıvı fişler demlenmeye şırınga pompaları ayarlayın. Bu akış istikrarlı ve Adım 4.1 belirlenen oranda ve bu tıkanma oluştu değil emin olmak için akış sensörleri ile DPT ve LPO akış oranlarını izleyin.
      4. Ayrılmış kesirler toplayın. Akış sensörleri akış hızının ani bir artış tespit zaman pa belirtenİlk hava boşluğu ssage, bir örnek toplama şişesine (o adım 5.2.1 başladı) atık karşılık gelen çıkış vanasını açın.
      5. Çip numunenin geçişten sonra, akış sensörü ikinci hava boşluğu tespit gözlemliyoruz. Bu noktada, atık geri çıkış vanalarını açın. Adım 5.2.4.2 yüklenen tam birim dağıtılır sonra, şırınga pompası infüzyonu durdurun ve akış hızı sıfıra ulaştığında otomasyon rutin sonlandırın.
    5. Ayırma Deney tamamlandıktan sonra, DPT ve LPO örnek toplama şişeleri kesmek ve sonraki analiz için uygun bir şekilde saklayın.
  2. Otomatik Temizleme ve Dezenfekte
    NOT: Her bir numune, floş işlemeden önce aşağıdaki otomatik rutin kullanarak tüm akışkan sistemini decontaminate.
    1. Throu atılır fazla temizleme solüsyonları toplamak DPT ve LPO toplama viyal tüpleri, hem de boş şişeler örnek alma tüpü elde edintüpleri gh.
    2. Otomatik sistem temizleme rutin başlayın. Adım 5.2 Otomatik Ayırma işlemde olduğu gibi, vana ve şırınga pompası kontrol etmelidir programı temizleme reaktifleri ile tutma bobini yük sırayla için, ve sistem üzerinden yıkayın.
    3. % 70 etanol ile, daha sonra% 10 çamaşır suyu ile aynı hizada, ve su ya da uygun bir tuz tamponu ile sona (örneğin, 1 x PBS veya numune için kullanılan tampon): Aşağıdaki temizleme düzeni gerçekleştirin. Çamaşır suyu ve etanol için 450 ul ve su / tamponu için 1000 ul: Aşağıdaki floş hacimleri kullanın.
    4. LPO çıkış valfı bloke bir bağlantı noktasına ayarlanmış ise yıkama aşamaları sırasında, çıkış akış kısıtlayıcılarla herhangi bir potansiyel takunya kaldırmak için, tam tersi daha sonra, DPT içine her reaktifi yıkayın. DPT veya LPO ya bloke edildiğinde tüp ve backpressure biriken kabarcık oluşumunu en aza indirmek için 300-500 ul / dk çekilmesi ve infüzyon akış oranlarını korumak.
    5. DiscaFazla yıkama çözümleri ve biyolojik ya da kimyasal atık taşıma için uygun prosedürler izlenerek toplanan hangi şişeleri rd.

Representative Results

Akustik-mikroakışkan cihaz tasarımının temel özellikleri Şekil 1'de belirtilen ve başka bir yerde tam tarif edilmiştir. 15 Kısaca, iki sıvı akımının, akış yan yana bir ayrıştırma kanalına olarak, ince bir silikon duvarla paralel bir by-pass kanalı ayrılır. Primer ışın kuvveti büyüklüğü parçacık hacmi ile terazi yana küçük parçacıkların orijinal akışı (Şekil 1B, C) ​​devam ederken, büyük partiküller, bitişik geri sıvı akımı bulunan akustik basınç düğüm doğru karma örnek girdi akımından göç ederler. Bölünmüş iki kanallı mimarisi parçacık ayrımı 17 artırır ve farklı baypas kanalı sıvıları kullanılarak düğüm pozisyonu ayarlanmasını sağlar. Dünya bağlantılarını çip için 16 akışkan breadboard ve demirbaşlar sağlam bir platform sağlar ve modüler tasarımı akışkan cips arasında hızlı değişen sağlar (Şekil 2). Bu cKULLANICI TARAFINDAN YAPILANDIRILABİLİR benzer şekilde kapatan 1000 psi'ye kadar, hızlı ve güvenilir bir (Şekil 2B, E) yapılacak, geri dönüşümlü akışkan bağlantılarını sağlar.

Bir çip rezonans frekansı f res basit 1D analitik hesaplamalar kullanılarak tahmin edilebilir (1.1.1 Adım bakınız). Bizim cihaz kesitinin, 16 daha tam 2B sonlu elemanlar modelinden 2 düğümlü rezonans beklenen odaklama pozisyon duvardan 225 mikron olan ve beklenen frekans 1.68 MHz olduğunu. Ancak, gerçek cihazların f res çalışma sıcaklığı ve uzunlamasına ve yanal rezonansların bağlantı bağlı ± 100 kHz göre değişebilir. Protokol Aşama 4'te tarif edildiği gibi Dolayısıyla bu cihaz, montajdan sonra, f res ampirik, ilgili akış hızlarına ve piezo tahrik gerilimlerinde doğrulanması gerekir. Şekil 3, 200 ul / dak alındığı temsili frekans taramaları Ana ve baypas kanalları su ve 20 V pp ile birlikte piezo verilen. Piezo ve mikroakışkan cihaz arasındaki bağlanması iyi olduğu zaman, parçacıkların beklenen odaklama konumuna (Şekil 3A) floresan yoğunluğu ve göç açık bir tepe ile sonuçlanan, rezonans frekansında sıkı odaklanacaktır. Düşük birleştirme olduğunda tersine, Partiküller odak olmaz ve frekans tarama sonuçları 3B Şekil benzer olacaktır. Bu tür cihazlarda, piezo dönüştürücü bir tersinir yapışkan kullanılmış ise, yeniden monte edilmesi gerekebilir; odaklama, yüksek kaliteli veya hızlı akış gerekli uygulama için kritik, aksi takdirde, bu cihaz için uygun değildir. Şekil 3'te veriler daha sonraki deneyler için çalışma frekansı seçimi ve gerilim bilgilendirmek ve verimli parçacıklar ayrılması için mevcut oran aralığını akış.

Dosyaları / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
Şekil 5. Örnek İşleme Otomatik. Numune bobin yüklenen numunenin (A) şematik. (B), başarılı bir ayırma deneyi Örnek akış profili. (C) DPT çıkış yaklaşık 220 sn tıkanmış sırasında çalışacak bir ayrılık profili akış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Etkili ayırıcılar olan fiş belirlendikten sonra, bunlar Şekil 4'te gösterilen sisteme dahil edilmiştir. Toplam sistem süpürme hacmi ana akış yolu boyunca 0,01 "iç çapı ile borunun kullanılarak en aza düşürülmektedir (mavi çizgi). Şekil 5A, makyaj görüntülemektedir sistem üzerinden infüzyon tipik bir örnek fiş. "Öncü tamponu" (~ 35 ul) bir miktar přece için gereklidirde örnek ayırma çip sayesinde hareket ederken akış dalgalanmaları ortadan kaldırmak için akışında örnek. Şekil 5B başarılı otomatik akustik ayırma deney kaynaklanan akış verileri gösterir. Başarılı bir çalışma temel özellikleri şunlardır: LPO ve DPT hem debi (1) geçici bir artış basınç oluşturur ve sıvının sistemi üzerinden akmaya başlar, (2) bir hava kabarcığı geçişini gösteren bir keskin başak ( ilave nedeniyle iki çıkıştan eşitsiz akışına LPO önce DPT ulaşması gereken tek kabarcık), genişletilmiş bir profilini gösterir, sistem üzerinden örnek hamle olarak iki hava kabarcıkları arasında her iki çıkışları aracılığıyla (3) stabil akım, ve (4) tam bir numune hacmi sonrasında çıkış akış oranında bir aşamalı bir düşüş sistemine iletilir. Problemli çalışır o DPT yaklaşık 220 saniye sonra tıkanır anlaşılmaktadır 5C, Şekil benzer akış profilleri hemen belirgindir. Thi içinde s durumda, Aşama 5.3 'de tarif edilene benzer bir temizleme prosedürü, kanal unclog çalıştırılmalıdır.

Şekil 6,
Şekil 6. Cihaz Ayarlanabilirliğin: Tane Boyutu ve Gerilim Etkileri. LPO çıkarılan polistiren mikroküreler Yüzde piezo seramiği verilen parçacık boyutu ve gerilimine bağlıdır. Her bir çizgi bir aygıt aracılığıyla Adım 4. Toplam akış hızı tarif edildiği gibi belirlenen rezonans frekansı farklı bir çalışma gerilimi, karşılık gelen 200 ul / dakika, 1.62 ve 1.64 MHz arasında uygulanan tahrik frekansları. Hata çubukları en az üç ayrı deneyde standart sapmasını temsil eder. Çoğaltılabilir ve http://pubs.rsc.org / tr / İçerik / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j Kimya Royal Society izniyle güncellenmiştir.target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6, çeşitli polistiren partikül boyutlarını ve verimli ayrılması için gerekli çalışma parametrelerini gösteren Piezo sürüş voltajlar kullanılarak ayırma sonuçlarını derledi. Beklendiği gibi, genel olarak, daha yüksek gerilimler (yani, daha yüksek akustik güçler), daha küçük parçacıklar elde etmek için gereklidir. Sürücü gerilimleri süresiz nedeniyle yüksek ısı dağılımı ve akustik akışı artan etkileri, ancak artan edilemez. 13 arsa belirli bir sürücü geriliminde önemli ölçüde farklı iyileşme (örneğin, 10- gösteren partikül ayırma-partikül büyüklükleri için genel bir kılavuz olarak hizmet vermektedir ve 8.8 V pp 2 mikron partiküller) iyi ayıracak. Genel olarak, bu virüsler (~ 100 nm) ve hücreleri (~ 10 mm) fark hücreleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde ve etkili bir şekilde ayrılabilir olan büyük bir fark ile partikül popülasyonları,erent boyutları (örneğin, 6-8 mikron diskoid eritrosit ve 8-15 mikron lökositler). Diğer hücre türleri çalışmak için gerekli olan belirli koşullar hücre şekli, yoğunluğu ve sıkıştırılabilirlik gibi hücre boyutuna ek olarak, akustik bir kontrast etkiler, ampirik olarak tespit edilmelidir. Bu amaçla, Adım 4 prosedürler Herhangi bir yeni hücre veya parçacık türü için kullanılabilir ayırma koşullarını belirlemek için faydalı değil, sadece belirli bir acoustophoresis cihazının kalitesinin değerlendirilmesi için bulunmaktadır.

Şekil 7,
Hücre-Virus Spiked Numuneler Şekil 7. Ayırma verim. Altın Kapı Virüsü (GGV) ile tutturuldu Dengue virüsü (NV) ve (B) Raji hücreleri Boa böbrek hücreleri ile çivili (A) Raji hücreleri ayrılma sonuçları. Toplanan Yüzdeler, belirli bir çıkan virüs ya da hücreler fraksiyonu olarak tanımlandığı gibidirçip çıkan toplam miktara göre çıkış. (B) örnekleri sadece nedeniyle, mevcut düşük miktarlarda bir kez işlendi ise için hata çubukları (A), 3 deneme standart sapmadır. 1x PBS Tüm deneyler için bypass kanalındaki su ile, örnek tamponu ve geri sıvısı olarak kullanılmıştır. Chip çalışma frekansları 16 ve 20 V pp arası sürücü gerilimleri, 1.60 ve 1.64 MHz arasında değişmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

İnsan Raji hücrelerini (10 5 hücre / ml, ortalama çapı 8-10 mikron 25) dang virüsü (DENV, 10 ile çivili: Biyolojik partikül ayrılması için bu platformun programı göstermek için, öncelikle iyi karakterize biyolojik örnekleri işlemek için kullanılan 5 pfu / ml, yaklaşık çapı 50 nm 26). Şekil 7A (çip toplanan her parçacığın toplam miktarı ile kıyaslandığında, her çıkışında toplanan her bir parçacık türü fraksiyonu olarak tanımlanır) DPT ve LPO hem de toplanan Raji hücreleri ve DENV yüzdesini gösterir. Deney üç kez tekrarlanmıştır ve NV, bir ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) kullanılarak değerlendirilmiştir ise Raji hücreleri, bir Coulter sayacı kullanılarak sayıldı.

Daha sonra, sistem performansı parçacıkların tam olarak fiziksel özellikleri bilinmeyen olabilecek olan klinik numuneler, işleme için daha gerçekçi bir senaryo içinde test edilmiştir ve mevcut örnek miktarları daha düşüktür. Burada, biz henüz ölçülen olmamıştır yakın zamanda tanımlanmış golden gate virüsü (GGV), bir yılan patojen bulaşmasını boğa yılanı böbrek hücreleri. 27 GGV virüs parçacığın boyutu ayrılması değerlendirildi, ancak GGV Arenaviridae ailesine ait olduğundan, bu Bir olası olduğuBenzer büyüklük, 100 nm ile 150. 28 Biz GGV ile örnekler işlenmiş Raji insan hücrelerinden (değil virüs için bir enfeksiyon hedef) ve boa böbrek hücreleri (GGV için enfeksiyon hedefinin, yaklaşık büyüklüğü 10 içine (10 4 pfu / ml) çivili 10 4 hücre / ml her iki hücre tipleri ile um 27). Bu örnekler, düşük miktarlarda kullanılabilir olarak, tek bir deneysel çalışma ayrılma sonuçları Şekil 7B, Raji hücreleri, Boa hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. Bu çalışmada rapor edilen ve GGV DPT ve LPO toplanır. Hücreler bir hemasitometre üzerinde sayılarak bu deneylerde ölçülmüştür ve virüsler RT-qPCR ölçüldü.

Discussion

Bu protokol otomatik biyolojik numune işlem gerçekleştirmek için macroscale ekipman mikroakışkan cihazların sistem düzeyinde entegrasyonu sunuyor. Bu platformun modülerliği bir örnek olarak, sunulan protokol karakterize bir acoustofluidic partikül ayırma cihazın performansını optimize odaklanmaktadır, herhangi bir sürekli akış cihaza adapte olmasını sağlar ve. Bu protokolün üç önemli avantajları vurgulanır: (i) modülerlik ve chip-to-dünyanın cihaz performansında (ii) sağlam karakterizasyonu ve partikül ayrılması için hassas olarak ölçülmüş numune hacimleri (iii) otomatik işleme, arabirim.

ben. Modülerlik ve chip-için-dünya arabirim

Şekil 2 de gösterildiği gibi, mikroakışkan çip kolayca doğrudan gözlem için bir mikroskop sahneye uygun özel bir delikli tahta üzerine monte edilir. Breadboard 5 mm-pitch ızgara, ena üzerinde # 6-40 UNF dişli delikler içeriyorçip bling güvenli olması için, ve sıvı bağlantıları yapılacaktır. Sıvı bağlantıları işlenmiş uçları ile tüpler PEEK olan bir lastik yüz sızdırmazlık conta ve paslanmaz çelik bilezikli akışkan çip karşı hangi mühür. Bu arayüz düzeni kolay çip değişimi ve hızlı cihaz yeniden tasarımı, az gerektiren veya diğer sistem bileşenlerine hiçbir değişiklik sağlanan çip ayak izleri ızgara biçimine uygun hale getirir. Örneğin, sürekli akış elektroforezi, termal hücre erimesi, kimyasal sentezi için reaktif 29 hızlı karıştırma ve tek hücreli yakalama ve sorgulama için mikroakışkan çipleri ile bu platformu kullandık.

ii. Cihaz performansı Sağlam karakterizasyonu

Herhangi bir mikroakışkan ayırma cihazının performansını optimize etmek amacıyla, operasyon ilk olarak iyice karakterize edilmelidir. Burada anlatılan sistem bunu yapmak için hızlı ve otomatik protokollerin gelişimini destekler. Belirli examp içinakustik odaklama cihazları, odaklama kalite, çalışma frekansı ve mikroakışkan kanal odaklı partiküllerin pozisyon le, her bir cihaz için ölçülmelidir. Bu ölçümler, piezoseramik sürücü frekansları, gerilim ve akım oranları aralığı boyunca süpürme gerektiren yüksek kaliteli ayrılması için en uygun parametre kombinasyonları belirlemek için. Sunulan protokol otomatik olarak bu ayarlanabilir parametreleri değişir ve veri-alakalı yakalar, yani post-işlenmiş kalite, sıklığını ve pozisyon (Şekil 3) odaklama parçacığın gerekli ölçümleri oluşturmak için vardır kanalda akan parçacıkların floresan görüntüler.

Akustik cihaz performansı tam karakterizasyonu tekrarlayan Adımlar 4.4 ve farklı deneysel koşullar altında gerektiği gibi 4.5 gerektirir. Örneğin, bir çip mutlak odaklama pozisyonu nispeten düşük debiler ve yüksek gerilim frekans tarama çalıştırarak bulunurs düğümü yere tam göçü sağlamak. Ayrıca, bu tür frekans taramaları (bilinen boyutta polistiren boncuklar ile çalışacak) cihazı montaj kalitesini değerlendirmek, ya da (bir çip boncuklar ile karakterize edilmiştir sonra) önceden bilinmeyen parçacık tipi sisteminde nasıl davranacağını belirler. Kötü enerji transferi olanlar bile odak olmaz ise mikroakışkan kanala piezo seramiği iyi bir enerji transferi ile bir çip, dar yüksek debilerde (> 1 ml / dak) ve düşük gerilim (12-15 V pp) de odaklama neden olacaktır Düşük debilerde (<100 ul / dak) ve yüksek gerilim (> 20 V pp) de. Biz mikroakışkan yonga ve piezo seramiği arasında yakın temas sıvısı içine enerji transfer verimi için kritik olduğunu bulduk. Yüksek performanslı cihazların güvenilir üretim sağlayacak mikroakışkan çip ve Piezo seramik yapıştırma optimal yöntemi daha fazla araştırma.

Son olarak, tam birBir acoustophoretic aygıtın operasyon resmi mikro-küreleri ile yapılan ayırma deneyler, Aşama 4 (Şekil 3), ilgili çalışma parametrelerinin bir fonksiyonu olarak DPT ve LPO toplanan parçacık sayısı ile görüntü-bazlı frekans tarama ölçümlerinin bir araya getirilmesiyle elde edilebilir Şekil 6'da gösterildiği gibi, Aşama 5'de olduğu gibi, otomatik deney gibi bir dizi hızlı bir şekilde partikül ayrılması için bir cihazı çalıştırmak için uygun bir parametre alanı kullanıcıya bildiren tek bir aygıtın performansı ve ayarlanabilirliği, karakterize edilebilir.

iii. Parçacık ayrılması için otomatik küçük örnek işleme

Başarılı ve doğru mikroakışkan çipli örnek işleme için, güvenilir ve hassas ölçüm, yük, teslim ve onlar geçerken sıvı hacimleri toplamak için kritik öneme sahiptir. Örnek hacmi küçük olduğu zaman bu hassasiyet özellikle önemlidirKlinik veya araştırma laboratuvar ortamlarında yaygındır (~ 0.1-1 ml). 30 Hassas numune alma sırasında numunenin hiç geribildirim ile bir cihazın içine şırınga ve infüzyon içine numune elle çekilmesi istihdam geleneksel mikroakışkan deneylerde zorlu ayrılmış vardır ve toplanan edilmelidir zaman. Sunulan protokol örneği bobin yükleme otomatik bünyesinde bulundurmaktadır ve küçük örnek hacimlerinin tekrarlanabilir ayrımlarını sağlamak için akış sensörleri gerçek zamanlı geribildirim ile birleştiğinde dağıtma.

Şekil 5, tipik bir ayırma deneyi ile ilgili DPT ve LPO ölçülen akış profillerini göstermektedir. İlk olarak, en az 35 ul lider tampon numunesi akustik çip ulaşmadan önce istikrarlı akışını sağlamak için yüklenir. Nedeniyle önde gelen tampon örnek seyreltme aşırı olur çünkü 100 ul daha az örnek hacimleri, bu sistem yapılandırması için tavsiye edilmez. Bir hava fişi th başında kullanılanönde gelen tamponu önce e enjeksiyon karıştırma ve numune seyreltme ve akış sensörleri bir göstergesi olarak hizmet önlenmesi, aşağıda sıvıdan örnek fişi ayırmak için. Akışkan olarak ilk geçici sistemi ile hareket başlar sonra, her iki satış keskin başak sinyalleri ilk hava kabarcığı geçişini gösterir. Numune, sistem üzerinden ikinci hava kabarcığı geçer sonra başka başak ve şırınga pompası durduktan sonra sıfıra akış hızında nihayet nihai bir azalma akarken bu geçici kararlı akış uzun bir süre tarafından takip edilmektedir.

Akış sensörleri ile hava fişler geçişi dolayısıyla olmayan numune sıvı hacimleri ile kayıp numune ve seyreltme minimize başlangıç ​​ve örnek toplama durdurmak için vanaları geçmek için tetik noktalar olarak kullanılır. Işlenmiş örnek hacimlerinin Kapalı döngü ölçüm öncesinde deney girdi örnek değiştiğinde her zaman başlamasından bu değerleri yeniden programı gereksinimini ortadan kaldırır. Bu özelliközellikle önemli numune hacmi çok klinik örnekleri için, örneğin, sınırlı olduğunda. Gerçek zamanlı akış izleme de sorun giderme yardımcı olur; (örneğin, bir yapışmasına neden çıkışları birinde oluşturan) fakir bir çalışma Şekil 5b gibi, elde edilen akım profillerinden derhal açıktır.

Esneklik ve acoustofluidic ayırma etkinliğini sunulan sistem mimarisi ile arıtılmış, NV ve GGV virüs stokları göstermek için mikroakışkan çip yoluyla hücre stokları çivili ve işleme ile ayrılmıştır. Şekil 7a, Raji hücreleri 97 gibi virüslerden iyi ayrılmış olduğunu göstermektedir çip çıkan Raji hücrelerin% 'si ve böylece DPT DENV bir zenginleştirilmiş örnek bırakarak LPO olduğu tespit edilmiştir. Buna karşılık, NV ayırma verimliliği DENV% 70 DPT bulunan çip çıkarken ile düşüktü. Bu separati sarım tarafından uyarılan küçük bir konvektif karıştırma atfedilebilirkanalda, ancak LPO içine Raji hücreleri ile birlikte göç bazı NV parçacıkların daha yatkın. Akıcılık arasında yanal göç Hücreler bile düşük Reynolds sayısı az, onlarla bazı sıvıyı sürükleyin. Bu mekanizma, aynı zamanda spesifik olmayan yüzey adsorpsiyonunun, viral partiküller LPO içine aktarın. Baştan sıralama tespit etmek ve virüsleri tanımlamak için kullanılır Bununla beraber, DPT DENV oldukça zenginleştirilmiş örneği, örneğin, önemli bir avantajdır.

Şekil 7b, bir deney vadede, çip çıkan Boa hücrelerin sadece yaklaşık% 70 Raji hücreleri için yaklaşık% 100 ayırma verimliliği ile karşılaştırıldığında, LPO bulundu göstermektedir. Bu nedenle daha küçük bir akustik kuvvetlerinde ortaya çıkan, Raji hücreleri ile karşılaştırıldığında, iki hücre tipleri arasında ayrım performans farkı daha küçük bir ortalama boyutu ya da boa hücre düşük yoğunluğuna atfedilebilir. Bu varsayımları, Boa büyüklüğü, yoğunluğu ve morfolojisi onaylamak veya reddedeceksüspansiyon halindeki hücreler (normal olarak yapışık büyüdüğü) Boa hücrelerinin doğru bir ileri araştırmalar için bir çaba ölçülmelidir. Aynı deneylerde, benzer DENV ile deneyler, kurtarıldı GGV toplu viral fraksiyonun bir zenginleşme gösteren DPT çıktı.

Sunulan veriler biyolojik örneklerin çeşitli işlemek için mühendislik geniş uygulanamaz platformların doğal zorlukları vurgulayın. Önemlisi, biyolojik etkileşimler, fiziksel ve mekanik etkilere gibi büyük bir rol oynamaya başlayabilirsiniz. Ancak, bu ön deneyler de güç ve klinik ve araştırma uygulamalarında örnek işleme için bu sistem mimarisini kullanan sözünü göstermektedir. Sağlam, iyi karakterize mühendislik sistemi olarak bu platform yeni bilimsel sorulara cevap aramaya yeteneği sağlar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats