Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een groot voordeel van microfluïdische apparaten is de mogelijkheid om kleine steekproef volumes manipuleren, waardoor reagens afval verminderen en het behoud van kostbare monster. Echter, robuuste sample manipulatie bereiken is het noodzakelijk device integratie richten de macroschaal omgeving. Om herhaalbare, gevoelige deeltje scheiding met microfluïdische apparaten te realiseren, dit protocol presenteert een compleet geautomatiseerde en geïntegreerde microfluïdische platform dat precieze verwerking van 0,15-1,5 ml monsters met behulp van microfluïdische apparaten mogelijk maakt. Belangrijke aspecten van dit systeem zijn onder modulaire apparaat lay-out en robuuste armaturen resulteert in betrouwbare en flexibele wereld om verbindingen chip, en volledig geautomatiseerde materiaalbehandeling die closed-loop monstername, systeem schoonmaken en priming stappen om herhaalbare werking volbrengt. Verschillende microfluïdische inrichtingen kunnen uitwisselbaar worden gebruikt met deze architectuur. Een acoustofluidic apparaat Hier nemen we, detail zijn characterizatie, performance optimalisatie, en demonstreren het gebruik ervan voor de grootte-scheiding van biologische monsters. Door het gebruik van real-time feedback tijdens de scheiding experimenten wordt monstername geoptimaliseerd om te besparen en zich te concentreren monster. Hoewel die de integratie van meerdere apparaten, voordeel van deze architectuur zijn de mogelijkheid om onbekende monsters te verwerken zonder extra systeemoptimalisatie, gemakkelijke vervangingsapparaat en nauwkeurige en robuuste monster verwerking.

Introduction

Sample scheiding en fractionering is een van de meest veelbelovende toepassingsgebieden van microfluïdische technologie. Dergelijke sample handling stappen zijn integraal voor een effectieve klinische diagnostiek, therapeutische ontwikkeling, biosurveillance inspanningen, en de vooruitgang in het leven wetenschappelijk onderzoek en technologie. Talloze microfluïdische scheidingsstrategieën aangetoond voor vloeistof zwevende deeltjes en colloïden, alsmede voor chemische en biologische species; verschillende reviews bieden overzicht van de recente vorderingen en de ontwikkelingen op deze gebieden 1-9. Hoewel veel van deze microfluïdische scheidingstechnieken (hierna "Core Devices") zijn uitgebreid gekarakteriseerd, zijn enkele rapporten als het monster scheiding probleem op systeemniveau. De Core apparaten zijn meestal individuele centimeter schaal chips, gekoppeld aan fluorpolymeren buizen, met vloeistof door een verplaatsing of druk pomp geleverd.Toch, als de belofte van microfluidics - waaronder meer automatisering, betrouwbaarheid en vermindering van monstervolumes - is werkelijkheid te laten worden, ten minste een gelijkwaardige inspanning moet worden besteed aan het ontwerp van een volledige scheiding systeem waarin de Core Device is geïntegreerd .

Daarnaast is een grote uitdaging voor microfluïdische benaderingen BioDetection is de macro micro-interface. Dit betreft niet alleen de fysieke "wereld naar chip" verbindingen van een microfluïdische inrichting macroschaal componenten en de mismatch tussen typische klinische en analytische monstervolumes (~ 0,1-10 ml) en het inwendige volume van microfluïdische chips (~ 0,01-10 ui), maar ook voor de statistische steekproef beperkingen die voortvloeien uit het overbruggen van deze formaataanduidingen. Deze kwesties dragen bij aan de perceptie dat monster pre-processing en voorbereiding zijn de 'zwakke schakel' van BioDetection. 10 De in dit werk ta beschreven platformkes belangrijke stappen in de richting van het aanpakken van deze uitdagingen.

Het nemen van een system-level view, dit protocol worden de betrouwbare verwerking van nauwkeurig gedoseerde analytische schaal volumes (variërend 0,15-1,5 ml) op ~ 10 min tijdschalen. Dit is een "one-button" bediening: zodra de bron flacon met het monster en bestemming flesjes voor fractie collectie in het systeem worden geplaatst, de "run" commando initieert de procedure, en alle stappen zijn computergestuurd. Aan het einde van een run, kan de collectie flacons worden verwijderd uit het systeem voor de downstream-analyse van de gescheiden fracties.

De Core-apparaat in dit systeem is een acoustophoresis chip die zoogdiercellen-formaat (5-20 pm) deeltjes uittreksels uit de steekproef. Acoustophoretic scheiding wordt hier gekozen voornamelijk omdat het high-throughput (tot 100s van pl / min), label-free en non-contact, en biedt dus voordelen bij het scheiden van levensvatbare viruses uit cellen die weinig andere microfluïdische technieken kan evenaren. De fysica van de akoestische deeltjes scherpstellen zijn uitvoerig beschreven, 11-13 en zijn niet de focus van dit protocol, maar een korte samenvatting van de onderliggende concepten volgt om te helpen bij het ​​begrijpen van de applicatie om microfluïdische scheiding.

Ultrasone staande golven resoneert in met vloeistof gevulde microkanalen produceren drukvelden, die tot krachten die deeltjes drijven richting knopen van lagedruk geven. De kracht magnitude afhankelijk van het volume van het deeltje, en een akoestisch contrast factor afgeleid van de relatieve dichtheden en compressibilities van het deeltje en het suspenderende vloeistof. 14 Als zodanig akoestische gericht is ideaal voor het scheiden van cellen-sized (~ 7-15 pm) van virus-en kleinbedrijf (~ 50-200 nm) deeltjes. De grotere deeltjes migreren naar een druk knooppunt; Aangezien de kracht magnitude is zeer klein voordeeltjes kleiner dan 2-3 urn, deze kleine deeltjes of opgeloste species nauwelijks bewegen helemaal. De specifieke implementatie van dempingwaarde, zoals eerder beschreven, 15 bevat een dunne wand voor het vloeistofkanaal verdelen en maakt afstembare, asymmetrische plaatsing van de scherpstelpositie. Dit voegt flexibiliteit in het apparaat design en de prestaties voordelen, waaronder verhoogde afscheiding kwaliteit en snelheid zijn volledig elders beschreven. 16,17

Echter, een belangrijk voordeel van de in dit werk beschreven systeemniveau ontwerpbenadering is dat het kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van microfluïdische apparaten Core. Zo kunnen bijvoorbeeld de meeste andere doorstroom scheiding modes, waaronder inertie, stroom-veld fractionering, deterministische laterale verplaatsing (DLD), en diverse soorten elektrokinetische apparaten gemakkelijk worden opgenomen, met de nodige aanpassingen om rekening te houden met veranderingen in de inlaat / uitlaat configuratie , stroomsnelheden,en sample volumes. Apparaten met verschillende soorten on-chip velden (elektrisch, magnetisch) of gradiënten (thermisch, chemisch) kunnen aanvullende verbindingen met de chip of de integratie van extra hardware, waarbij dit platform herbergt nodig.

Dit protocol voorziet in de stappen die nodig zijn om een ​​microfluïdische scheiding apparaat te ontwerpen, en silicium-glazen chips te fabriceren door diepe reactief ionen etsen (DRIE, een plasma-etsproces verkrijgbaar in vele microfabricage faciliteiten, die gebruik maakt van afwisselende cycli van etsen en passiveren tot diep te bereiken eigenschappen met verticale zijwanden 18). Vervolgens beschrijven we de karakterisering van het acoustofluidic apparaat om de optimale bedrijfsparameters voor de scheiding vast, en tenslotte detail de volledig geïntegreerde scheidingssysteem en de procedure voor het verwerken van biologische monsters. Typische apparaat karakterisering resultaten en monster verwerking van gegevens worden vervolgens gepresenteerd en besproken, en de belangrijkste voordelen van deze voorkomendach zijn gemarkeerd, zoals modulariteit, robuustheid, precisie en automatisering.

Protocol

1. Acoustophoretic Device Design en fotomasker Layout

OPMERKING: Algemene overwegingen en begeleiding voor microfabricage procesontwerp en masker lay-out kan worden gevonden in teksten over microfabricage en tutorials van fotomasker ontwerp 19-21.

  1. Indeling Mask 1, de Fluidic Layer (voorkant), met behulp van geschikte CAD-software. Kies een geometrie die monsterinjectie en scheiding die geschikt is voor de gewenste toepassing toelaat.
    1. Voor akoestische scherpstellen, stelt u de vloeibare kanaalbreedte w om een resonantiefrequentie f n bieden groter dan 1 MHz volgens de vergelijking f n = nc / 2w, waarbij c de geluidssnelheid in de desbetreffende vloeistof en n het aantal staande golf knooppunten (bijvoorbeeld voor een 900-um breed kanaal, de twee- knooppunt resonantie wordt verwacht op f 2 = 1,65 MHz).
      OPMERKING: Particles bezetten verschillende laterale posities aan het einde van de scheiding kanaal moet verlaten verschillende verkooppunten. In dit protocol worden deeltjes op grootte gescheiden, zodat de uitlaten zijn aangeduid SPO LPO, van kleine deeltjes en grote deeltjes outlet, respectievelijk, zoals getoond in figuur 1.
    2. Stel het vloeistofkanaal lengte regelen hoe lang deeltjes worden blootgesteld aan het veld scheiding bij een bepaalde stroomsnelheid. Langere on-chip verblijftijd voor deeltjes te migreren als gevolg van de scheiding krachten moeten worden afgewogen tegen de grotere vereiste chip voetafdruk.
      LET OP: In onze akoestische gericht apparaten, de stroom kanaal maakt drie passen beneden de chip voor verhoogde verblijftijd (Figuur 2a). Bij een typische totale stroomsnelheid van 200 pl / min, deeltjes die door de 300 x 200 urn doorsnede, 117 mm lang scheidingskanaal besteden gemiddeld 2,1 seconde op het akoestische veld.
  2. Omvatten vloeibare havens in het masker Layout voor verbindingen met standaard slangen aangebracht op een gestandaardiseerde rooster (5-mm pitch). Omvatten geschikte vaste merktekens voor uitlijning van maskers met elkaar tijdens de fabricage en in blokjes snijden van de afzonderlijke apparaten.
  3. Indeling Mask 2, de Via Layer (achterzijde), die alleen bestaat uit vloeibare poorten. Omvatten vaste merktekens voor aanpassing aan Mask 1.

Figuur 1
Figuur 1. Acoustofluidic Device. Schematische schetsen van acoustophoretic apparaat architectuur. (A) bovenaanzicht, waarin de totale configuratie H-filter (niet op schaal). (B) Schematische voorstelling van het kanaal dwarsdoorsnede op de plaats gekenmerkt door de zwarte stippellijn in (a), die het veld druk (blauwe gestippelde lijnen), en het gevoel van de akoestische primaire straling krachten (PRF) dat deeltjes rijden in de richting knoopvlakken (rode pijlen). Het kanaal doorsnedeis 900 × 200 micrometer met een muur van ongeveer 10 micrometer dik het scheiden van de belangrijkste (300 micrometer breed) en bypass-kanalen. (C) 3D-weergave van de deeltjesfysica scheiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Cleanroom Fabricage van microfluïdische chips voor Acoustophoresis

  1. Patroon van de back-side vloeistofpoorten behulp Mask 2 op een dubbel-side 0,5 mm dik, met een diameter van 100 mm <100> silicium wafer gepolijst door standaard positief weerstaan ​​fotolithografie. Etch deze geometrie diepe reactief ionen etsen (DRIE) tot een diepte van 350-400 urn.
  2. Draai de wafer over, en het patroon van de front-side vloeistofkanaal geometrie met behulp Mask 1 door standaard positieve resist fotolithografie op de andere kant van het silicium. Vervolgens monteer het apparaat wafer om een ​​tweede (lege silicium) carrier wafer met fotolak.
  3. Etsen kanalen, ook met DRIE, tot een diepte van 200 pm, doorgaande etsen van het silicium in de haven locaties (de drager beschermt de wafer DRIE gereedschap oppervlak). De-mount het apparaat wafer van de lege Si wafer door het weken in weerstaan-stripoplossing.
  4. Reinig het inrichtingsplak en eentonig 0,5 mm dik borosilicaatglas wafer via Piranha-oplossing (zwavelzuur en waterstofperoxide in een 3: 1 verhouding).
  5. Verzegel de vloeistofkanalen door anodisch binden van het glas en silicium wafers met de volgende parameters: kamerdruk bij 3 mTorr, de zuiger druk op 1000 N, temperatuur 350 ° C en toepassen 750 V totdat de stroom minder dan 0,2 mA.
  6. Snijd de individuele chips uit elkaar met een diamant mes op een dicing zaag.

3. Definitieve inrichtingsamenstel

  1. Pezouitstraler Attachment
    OPMERKING: Ultrasound wordt gegenereerd in de microfluïdische chip met een piezoceramic transducer die aan het siliciumatoom kant.
    1. Uit bijwo-component lage viscositeit epoxy kit, wegen uit de aanbevolen verhouding van beide componenten en meng ze grondig.
    2. Verdeel de epoxy mengsel met een pipet en gelijkmatig verdeeld over een loodzirconaattitanaat (PZT) piëzokeramisch een dunne, egale laag (ongeveer 10 pl epoxymengsel een piezo met afmetingen van 37,5 x 10 x 0,5 mm) te maken.
    3. Met behulp van een geschikte mal of fitting, lijn de epoxy van het piëzokeramische de microfluïdische chip, waardoor een overhangende gebied aan de ene kant voor latere bevestiging draad (zie figuur 2a), en de twee componenten in contact te brengen. Klem de assemblage in een bankschroef, zorg ervoor dat u een van de componenten te kraken, en genezing bij de temperatuur en de duur aanbevolen door de epoxy fabrikant.
    4. Nadat de epoxy is uitgehard, hechten fijne gauge aders aan elke zijde van de piëzokeramische door solderen met een fijne punt soldeerbout, waardoor de kortst mogelijke contact met de piëzo om t voorkomenhermally de-polariserende het. U kunt ook gebruik maken van een geleidende lijm om draden lijm aan de piëzo.

Figuur 2
Figuur 2. Fluidic Breadboard, Chip Montage, en World-to-Chip Interface. Foto's van (a) de akoestische microfluïdische chip (uitwendige afmetingen van 70 × 9 × 1 mm) met aangebouwde piëzo transducer draad leads, met drie doorgangen van de scheiding kanaal langs de chip, (b) aangepaste fluïdische schroefverbindingen en bewerkte buizen onderdelen voor de chip-to-wereld-interface, (c) de chip gemonteerd aan de onderzijde van de vloeibare broodplank met spaninrichtingen, verspreid over een opening in het breadboard te staan ventilator koeling, (d) een bovenaanzicht van de breadboard met aangehechte buisverbindingen en ventilator, en (e) een schematische dwarsdoorsnede van de schroefverbindingen de tubi communicerenng met gemonteerde microfluïdische chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Apparaat Montage en World-To-Chip Interfacing
    1. Bevestig de chip naar de "vloeibare breadboard" (een plaat met een raster van regelmatige afstand staande threaded doorgaande gaten) met behulp spaninrichtingen. Bevestig een koelventilator de breadboard temperatuur gedurende akoestische experimenten reguleren (zie figuur 2).
      OPMERKING: Bediening zonder de koelventilator op typische rijden spanningen verhoogt het apparaat de temperatuur tot 70-80 ° C. Dit significant verschuift de resonantiefrequentie als gevolg van veranderde geluidssnelheid in de vloeistof, en kunnen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van elke biologische deeltjes die worden verwerkt.
    2. Schroef chip-to-wereld connectors eerder elders beschreven 22 en getoond in figuur 2. Doe deze interface buizen om extra buizen aan de in- en uitgangen met behulp van standaard ¼ "-28 vakbonden voor 1/16" slang.

4. Karakterisering van Acoustic scherpstelling

LET OP: Systeem componenten die nodig zijn voor akoestische focussen karakterisering zijn gegroepeerd in de Materials List. Stappen 4.1 en 4.2 hieronder van toepassing op alle Core-apparaat gebruikt met dit platform, dat volgende stappen beschrijven handelingen die specifiek zijn voor de acoustofluidic apparaat hier besproken.

  1. Systeem configuratie
    1. Monteer de microfluïdische chip met behulp wereld naar chipverbindingen de vloeibare breadboard, zoals beschreven in sectie 3. De verbindingen maken gebruik van buizen (bijvoorbeeld 1/16 "buitendiameter fluorpolymeer buis) een vloeistofpomp en verzamelen flesjes. Monteer het breadboard samenstel op het podium van een microscoop die fluorescentiebeeldvorming uitgerust met een CCD camera.
    2. Sluit lengtes van kleine innerlijke diameter (ID) buis (0,006 "aanbevolen) onmiddellijk na de chip (zie figuur 4) fungeren als stroomrestrictoren, waardoor het systeem te stabiliseren en de stroom splitsing tussen de chip outlets. Met grotere ID buizen, zoals 0,01 "en 0,03" voor alle aansluitingen.
      1. Schat de hydrodynamische stromingsweerstand Rh elk buisstuk met een lengte L en de inwendige diameter D met de formule R h = 128 gl / πD 4, waarin μ het fluïdum dynamische viscositeit. Het drukverschil Δ P aan elk leidingstuk bij een gegeven debiet Q wordt gegeven door P = Δ QR h.
      2. Kies een verhouding van lengte restrictor om de stroom tussen de uitlaten splitsen afhankelijk van de scheidingswerkwijze worden toegepast. Optimale scheiding met de akoestische chips in dit protocol vereist een SPO: LPO stroom verhouding van approximately 65: 35%.
      3. Kies de lengte van de uitlaat stroomrestrictoren zodanig dat de fluïde resistentie ten minste 3-4 maal groter zijn dan de totale weerstand in de rest van het systeem (adequaat samengevat in serie of parallel). Voor de acoustophoresis apparaat dat wordt gebruikt in dit werk, slangen lengtes van 35 en 65 cm voor de LPO en SPO zijn geschikt.
        LET OP: Een zorgvuldige afweging moet worden besteed aan R h van elke microfluïdische Core Device. Voor onze akoestische concentreren chip in dit werk, R h is laag vanwege de relatief grote kanaal afmetingen, zodat de aangesloten slangen weerstanden gemakkelijk overtreffen. Voor apparaten met kleinere afmetingen kanaal, kan de weerstand van de chip van de rest van het systeem buis, waarbij het ​​ontwerp en de controle van de on-chip kanaal R h is een bijkomende overweging bij stap 1 van dit protocol domineren. Gedetailleerd ontwerp principes en richtlijnen zijn beschikbaar in de literatuur. 23,24
  2. System Verification
    1. Controleer op lekkage te controleren of de microfluïdische apparaat heeft geen gebreken en alle slangaansluitingen worden afgesloten. Verdeel water door de inlaat buizen als nodig is met een spuit en te letten op elke vloeistof lekken in het hoofdkanaal.
    2. Verdeel een bekend volume door de chip, en meet de vanuit de uitlaten volumes opdat de stroming verhouding zoals verwacht. Afwijkingen van de verwachte volumeverhouding kunnen verstoppingen in een van de uitlaten of lekkende verbindingen geven.
      1. Om het systeem schoon te houden en te voorkomen dat verstopping flush het hele systeem (vloeibare buizen en chip) met geschikte reinigingsmiddelen (bijvoorbeeld bleekmiddel, ethanol, water) voor en na het uitvoeren van elke experimenten.
      2. In het geval van klompen of blokkades in een van de verkooppunten, spoel het systeem, terwijl de stekker van de duidelijke stopcontact om de blokkade te wissen. Als dit niet lukt, omkeren van de stroomrichting tijdens het spoelen,eventueel aanbrengen snelle pulsen van terugstroom (met een handmatig bediende spuit). Tenslotte, als de blokkering nog niet kan worden verwijderd, plaatst de slang of chip, indien nodig.
  3. Frequentie Scan Setup voor akoestische Scherpstellen
    1. Vul het omloopkanaal (zie figuur 1) met vloeistof zoals gedeïoniseerd water, ethanol, of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door handmatige injectie met een spuit. Merk op dat deze vloeistof niet in contact komt met het monster wordt verwerkt. De data van het aanpassen knooppuntpositie bypass met verschillende vloeistoffen worden elders beschreven 16,17. Kortom, wanneer de node moet dichter bij de scheidingswand zijn, gebruik een lagere dichtheid bypass fluïdum, zoals ethanol; voor knooppunt plaatsing dichter bij de ingang monsterstroom Kies een dichter medium, zoals een glycerol oplossing.
    2. Wordt kraal oplossing van ongeveer 0,01% (w / v) 5-8 micrometer fluorescerende polymeerpareltjes gesuspendeerd in een buffer, zoals PBS met0,05% Tween-20 en vul het monster inlaat spuit met de kraal oplossing. Vul de buffer inlaat spuit met dezelfde buffer (dit hoeft niet hetzelfde fluïdum als in de bypass-kanaal). Merk op dat in het algemeen wordt de buffer gekozen om de applicatie (zie stap 5,1) passen.
    3. Met vloeibare breadboard op de microscooptafel richten ongeveer halverwege de diepte van het kanaal in een rechte kanaalgebied vlak voor de uitlaat met beide kanalen (scheiding en bypass) in het gezichtsveld. Een extra schuine hoek externe lichtbron kan nodig zijn het kanaal muren zichtbaar, voor een succesvolle post-processing van de beeldgegevens te maken.
  4. Geautomatiseerde Frequency Scan en Fotolader
    1. Voeg elektrische verbindingen met afgeschermde kabels (bijvoorbeeld RG-58 voorzien van BNC-connectoren) een functiegenerator met radiofrequentie (RF) versterker het excitatiesignaal aan de piëzo transducer te leveren. Optioneel, sluit een oscilloscoop aande uitgang van de functiegenerator voor het bewaken van het werkelijke spanning op de transducer.
    2. Zet de koelventilator, en stel de functiegenerator zodanig dat de uitgang van de RF-versterker aan de piëzo transducer in het bereik van 12-25 volt piek-tot-piek (Vpp).
    3. Zet beide spuiten met dezelfde stroomsnelheid tussen 50 en 200 ul / min. Met behulp van een spuitpomp beide spuiten aandrijving met dezelfde motor wordt aanbevolen om verstoringen aan de stroming te minimaliseren.
    4. Voer een procedure frequentie scan onder vermelding van het begin en einde frequenties, de grootte stap tussen de frequentie waarden en piëzobekrachtiging spanning met behulp van een laboratorium automatisering toolkit zoals National Instruments LabVIEW.
    5. Bij elke frequentiestap, gelden de spanning voor 15 seconden om het systeem in evenwicht, dan vastleggen 10 afbeeldingen parels die door de chip voor verdere analyse (belichtingstijden tussen 10 en 100 msec wordt aanbevolen).
    6. Tussen each toegepast frequentie stap, zet de spanning voor ongeveer 20 seconden te laten de parels gelijkmatig te verdelen over het kanaal en verwijder bias in focus van de eerder toegepaste frequentie stap.
  5. Image Analysis om resonantiefrequentie en Focussen positie te bepalen
    1. Uitvoeren van een beeldanalyse script (zoals de AF_freqScanPlotter.m MATLAB script voorzien van dit protocol) en voer de vereiste informatie op de aanwijzingen: selecteer de lijst met afbeeldingsbestanden gegenereerd in stap 4.4, voert u de scan start en stop frequenties en stap grootte, de volledige kanaal breedte, de muur locatie, en ten slotte selecteert u de afbeelding gebied te analyseren, met inbegrip van zowel de scheiding en bypass-kanalen.
    2. Let op de analyse script gemiddelde van de reeks van beelden vastgelegd op elke frequentie stap, en het gemiddelde van de intensiteit waarden langs de stroomrichting. Dit resulteert in een doorsnede linescan fluorescentie-intensiteit.
      NB: De frequentie die overeenkomt met de highe st intensiteit wordt gedefinieerd als de resonantiefrequentie (figuur 3, middelste rij), en de positie in het kanaal waar de hoogste intensiteit optreedt is de focus positie (figuur 3, onderste rij).

Figuur 3
Figuur 3. Vertegenwoordiger Frequency Scan. Voorbeeld van een frequentie scan gegevens voor zowel gekoppeld (A) en slecht gekoppelde (B) piëzo en chip. Bovenste rij: fluorescerende intensiteit van kralen (rood staat hoog en blauw staat voor lage intensiteit). Middelste rij: maximale intensiteit bij elke frequentie. Onderste rij: locatie van de maximale intensiteit, waar de rode gestippelde lijn geeft voorspeld focus positie, en rode diamanten geven resonantiefrequentie zoals bepaald door de maximale intensiteit.g "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Geautomatiseerde Scheiding

Opmerking: De geautomatiseerde scheiding experiment wordt uitgevoerd om grote deeltjes uit kleine deeltjes te scheiden vanwege de in het microfluïdische chip grootte-afhankelijke akoestische focus krachten. De benodigde onderdelen zijn gegroepeerd in de Materials List.

  1. System Configuration en Monstervoorbereiding
    1. Sluit de microfluïdische chip naar de spuitpomp, computergestuurde multi-poort stuurkleppen, PC-interface stroommeter, leidingen, zoals weergegeven in figuur 4. Deze configuratie maakt geautomatiseerde verwerking van monsters via microfluidic scheiding chip, maar ook geautomatiseerde schoonmaken stappen tussen experimenten om kruisbesmetting en sample overdracht verwijderen.
    2. Gebruik een monsterbuffer geschikt is voor de cellen of deeltjes te scheiden, of zoals vereist door de analyse assayworden gebruikt na scheiding. Zoals in stap 4.3.2, moet de recovery buffer (maar niet noodzakelijk de bypass fluïdum) het fluïdummonster passen.
      OPMERKING: waterige buffers typisch gebruikt met biologische monsters (bijvoorbeeld PBS) wat de akoestische eigenschappen vergelijkbaar met water en zal niet merkbaar verandert de werking van het akoestische inrichting. Het gebruik van vloeistofmonsters met een dichtheid en viscositeit significant verschillend van water mogelijk, maar alleen aanbevolen voor exploitanten met aanzienlijke acoustophoresis ervaring.


Figuur 4
Figuur 4. Acoustic System Configuration voor Automated Scheiding Experimenten. De blauwe lijnen op te sporen de hoofdstroom pad door het systeem. Alle groene en zwarte lijnen zijn 0,03 "binnendiameter (ID) slangen, en al blauw en grijs-gekleurde lijnen zijn 0.01" ID slang, met de eXception van het bedrijf spoelen, die 0,03 'ID, en de stroom begrenzers, die 0,006 "ID. De spuiten zijn gevuld met buffer, en het bedrijf spoelen voldoende volume (550 pl) om opname van eventuele monsters of reiniging reagentia in de spuiten te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Scheiding Procedure
    1. Pre-run staat. Voorafgaand aan het uitvoeren van de scheiding, ervoor te zorgen dat de schoonmaak reagentiareservoirs (bleekmiddel, ethanol, buffer) over voldoende vocht, het afval reservoirs zijn niet vol, en de vloeiende lijnen zijn gevuld (dat wil zeggen, gevuld met oplossing). Als de laatste voorwaarde is onzeker is, of wanneer het systeem wordt voor de eerste keer na stationair draaien (bijvoorbeeld de eerste keer op een bepaalde dag), voert een automatische reiniging (zie stap 5.3 hieronder). Kleppen set 3 en 4 op de chip verkooppunten te stromen naar Rese verspillenrvoirs aanvankelijk.
    2. Zet de koelventilator, en stel de functiegenerator de resonantiefrequentie van de akoestische chip wordt gebruikt, zoals bepaald in stap 4,5. Pas de spanning set punt op de functie generator zodat de RF-versterker uitgangen tussen de 12 en 25 V pp, afhankelijk van de gewenste scheiding.
    3. Sluit de Sample Input Vial, Buffer Input Vial, en passende collectie flesjes aan het systeem. Net voordat u de Sample Input Vial zijn pick-up buizen, vortex de flacon kort om opnieuw op te schorten alle deeltjes die mogelijk hebben gevestigd. Maak dan de flacon en de inleiding van de scheiding routine zonder vertraging.
      LET OP: Als het monster te verwerken bevat mogelijk besmettelijke stoffen, moet de flesjes van een schroef-top te zijn, om een ​​gesloten systeem te handhaven en te voorkomen dat het monster aërosolvorming. Bovendien, als het werken met biologisch gevaarlijke materialen, behandelen alle flesjes en slangen, terwijl het dragen van de vereiste beschermende uitrusting en het gebruik van de required gevaar controles en procedures voor de biologische Risk Group en Biosafety Level eigenen om het materiaal. Raadplegen institutionele beleid en protocollen in geval van onzekerheid.
    4. Gebruik van een programma in een laboratoriumautomatisering toolkit voor de ventielen, volumestroom sensoren en pomp het uitvoeren van de volautomatische scheiding routine.
      LET OP: De routine schakelt de kleppen, bedient spuit terugtrekken en infuuspomp en monitoren stroom sensor data voor het verzamelen van de output monster fracties juiste timing. De belangrijkste stappen zijn hieronder samengevat 5.2.4.1 tot 5.2.4.3, alsof handmatig.
      1. Prime de pick-up buis. Trek ongeveer 15 gl van het volgende in- Vial aan de buis te sluiten op Valve 1. Tegelijkertijd volledig vullen, vul de buis die de Input Buffer Vial Valve 2. Op soortgelijke wijze, vul de luchtinlaat van de klep 1 te zorgen dat het bevat geen vloeistof. Tenslotte schakelt Afsluiters 1 en 2 te verdrijven om eventuele verliezenovertollig vocht of lucht dat het laden spoel heeft ingevoerd.
      2. Laad het monster spoel, zoals getoond in figuur 5a. Een typische laad- sequentie voor het verwerken van een 250-ul monster wordt 25 gl lucht trekken op 50 pl / min, vervolgens 250 gl monster bij 200 pl / min, gevolgd door 35 pl leidende buffer bij 200 pl / min, en tenslotte een 25 pl lucht bij 50 ul / min.
        LET OP: Alle volumes en debieten zijn de gebruiker te selecteren. Merk op dat deze belasting sequentie in omgekeerde volgorde waarin de vloeistof pluggen door de scheidingsinrichting stroomt.
      3. Begin monster infusie. Stel de spuitpompen het geladen fluïdum pluggen dien met de gewenste snelheid (meestal 100 pl / min). Toezien op de debieten van de SPO en LPO met flow sensoren om ervoor te zorgen dat de stroom is stabiel en in de verhouding bepaald in stap 4.1, en dat verstopping niet heeft plaatsgevonden.
      4. Verzamel gescheiden fracties. Wanneer de stroom sensoren detecteren een piek in de stroomsnelheid, met vermelding van paSsage van de eerste luchtspleet, schakelt de betreffende uitgang ventiel uit afval (waar het begon in stap 5.2.1) om een ​​monster collectie flacon.
      5. Na passage van het monster van de chip, observeert de stroom sensor detecteert de tweede luchtspleet. Op dit punt, schakelt de output kleppen terug te verspillen. Na de volledige volume geladen vanaf stap 5.2.4.2 wordt afgegeven, stoppen met de spuit pomp infusie en de automatisering routine te beëindigen wanneer het debiet op nul.
    5. Na de scheiding experiment is voltooid, koppelt u de SPO LPO monstername flesjes en bewaar ze op de juiste wijze voor verdere analyse.
  2. Geautomatiseerde Reiniging en Ontsmetting
    LET OP: Voor de verwerking van elk monster, flush en ontsmetten het gehele vloeibare systeem met behulp van de volgende geautomatiseerde routine.
    1. Zet de SPO LPO collectie flesje buizen, evenals het monster pick-up buis in de lege flesjes om overtollig schoonmaakmiddelen die worden doorgespoeld throu verzamelengh de buizen.
    2. Start het automatische systeem reiniging routine. Net als bij de geautomatiseerde scheiding procedure in stap 5.2, het programma moeten de kleppen en injectiepomp controleren om achtereenvolgens laden van de houdspoel met het schoonmaken reagentia, en spoel ze door het systeem.
    3. Voer de volgende reiniging routine: gelijk met 10% bleekmiddel, daarna met 70% ethanol, en eindigen met water of een geschikte buffer zoutoplossing (bijvoorbeeld 1x PBS of buffer gebruikt voor monster verwerking). Gebruik de volgende flush volumes: 450 ul voor bleekmiddel en ethanol en 1000 ul water / buffer.
    4. Tijdens het spoelen stappen, spoelen elk reagens in de SPO, terwijl de LPO uitlaatklep is ingesteld op een poort die geblokkeerd is, dan vice versa, om eventuele verstoppingen in het stopcontact stroom restrictors verwijderen. Onderhouden terugtrekking en infusie debiet van 300-500 pl / min tot bubble generatie minimaliseren in de slang en de tegendruk opbouw wanneer ofwel de SPO of de LPO is geblokkeerd.
    5. Discard de overtollige spoelen oplossingen en de flesjes waarin ze verzameld door het volgen van de juiste procedures voor het omgaan met biologische of chemische afval.

Representative Results

Belangrijkste kenmerken van de akoestische-microfluïdische apparaat ontwerp zijn aangegeven in figuur 1, en ​​volledig elders beschreven. 15 In het kort, twee vloeistofstromen stroming side-by-side in een scheidingskanaal, gescheiden van een parallelle omloopkanaal een dunne silicium wand. Aangezien de primaire stralingskracht magnitudeschalen met deeltjesvolume, grote deeltjes migreren uit het gemengde monster invoerstroom naar de akoestische druk knooppunt in het aangrenzende stroom terugwinning vloeistof, terwijl kleine deeltjes blijven in de oorspronkelijke stroom (Figuur 1B, C). De onderverdeeld tweekanaals architectuur verbetert deeltjesscheiding 17 en maakt aanpassing van het knooppunt positie met behulp van verschillende bypass kanaal vloeistoffen. 16 van de vloeibare broodplank en armaturen levert een robuust platform voor de wereld om verbindingen chip, en het modulaire ontwerp maakt een snelle wisseling tussen vloeibare chips (Figuur 2). Deze configuration eveneens laat omkeerbaar vloeistofaansluitingen, welke afdichting tot 1000 psi, snel en betrouwbaar (figuur 2B, E) worden gemaakt.

De resonantiefrequentie f res van een chip kan worden geschat met behulp van eenvoudige 1D analytische berekeningen (zie stap 1.1.1). Uit uitgebreider 2D eindige elementen model van ons apparaat dwarsdoorsnede 16 de verwachte focus positie 2-node resonantie 225 urn van de wand en de verwachte frequentie 1,68 MHz. Echter, kunnen f res van echte apparaten variëren met ± 100 kHz, afhankelijk van de temperatuur en de koppeling van longitudinale en laterale resonanties. Dus na inrichtingssamenstel, f res moeten empirisch geverifieerd relevant stroomsnelheden en piëzo-aanstuurspanningen, zoals beschreven in stap 4 van het protocol. Figuur 3 toont representatieve frequentie scans op 200 pl / min, met water in de hoofd- en bypass-kanalen en 20 V pp geleverd aan de piëzo. Bij koppeling tussen de piezo en microfluïdische inrichting goed, zal deeltjes stevig gericht op de resonantiefrequentie, waardoor een duidelijke piek in de fluorescentie-intensiteit en migratie naar de verwachte focus positie (figuur 3A). Daarentegen, als er slechte koppeling deeltjes niet goed gericht en de resultaten frequentie scan overeenkomstig figuur 3B zijn. In dergelijke inrichtingen nodig de piezo transducer opnieuw worden gemonteerd als een reversibele lijm is gebruikt; anders is dit apparaat niet geschikt wanneer hoge kwaliteit scherpstellen of snelle doorstroming cruciaal zijn voor de gewenste toepassing. De gegevens in figuur 3 op de hoogte van de keuze van de operationele frequentie voor de volgende experimenten, en de spanning en debiet assortiment beschikbaar voor een efficiënte deeltjes scheiding.

Bestanden / ftp_upload / 53.051 / 53051fig5.jpg "/>
Figuur 5. Geautomatiseerde monster verwerking. (A) Schematische weergave van het monster in de steekproef spoel geladen. (B) Vertegenwoordiger stroom profiel van een succesvolle scheiding experiment. (C) Flow profiel van een scheiding te voeren waarin de SPO afvoer verstopt op circa 220 sec. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na het identificeren van chips die effectief afscheiders, worden deze opgenomen in het systeem weergegeven in figuur 4. Totale systeem slagvolume wordt geminimaliseerd door slangen met een 0,01 "binnendiameter langs de hoofdstroom pad (blauwe lijnen). Figuur 5A toont de make-up van een typisch monster plug toegediend via het systeem. Een kleine hoeveelheid "leading buffer" (~ 35 pi) moet Precede het monster in de stroom naar debietschommelingen elimineren terwijl het monster beweegt door de scheidingsinrichting chip. Figuur 5B toont stroom data verkregen door succesvolle geautomatiseerde dempingwaarde experiment. Belangrijkste kenmerken van een succesvolle run omvatten: (1) een tijdelijke verhoging van de stroomsnelheid in zowel de LPO en SPO als de druk bouwt en vloeistof begint te stromen door het systeem, (2) een scherpe piek met vermelding van de passage van een luchtbel (de bijvoegsel toont een geëxpandeerd profiel van een enkele bel), waarbij de SPO vóór de LPO zal bereiken als gevolg van de ongelijke stroming van de beide uitlaten (3) stabiele stroom door beide uitstroomopeningen tussen de twee luchtbellen wanneer het monster beweegt door het systeem, en (4) een geleidelijke afname van de stromingssnelheid in beide uitlaten nadat het volledige monstervolume wordt geleverd aan het systeem. Problematisch runs vallen direct uit stromingsprofielen vergelijkbaar met figuur 5C, wanneer blijkt dat de SPO raakte verstopt na ongeveer 220 seconden. In thi s geval een schoonmaak werkwijze gelijk aan die beschreven in stap 5.3 beschreven worden uitgevoerd om het kanaal ontstoppen.

Figuur 6
Figuur 6. Device tunability: deeltjesgrootte en Voltage Effects. Percentage polystyreen microbolletjes in het LPO gewonnen is afhankelijk van de deeltjesgrootte en spanning aan de piëzokeramische geleverd. Elke lijn correspondeert met een andere werkspanning bij de resonantiefrequentie bepaald zoals beschreven in stap 4. Totaal stroomsnelheid door de inrichting 200 pl / min, met toegepaste aandrijving frequenties tussen 1,62 en 1,64 MHz. Foutbalken geven de standaardafwijking van ten minste drie afzonderlijke experimenten. Gereproduceerd en gewijzigd met toestemming van de Royal Society of Chemistry van http://pubs.rsc.org / nl / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6 toont opgesteld scheidingsresultaten behulp van polystyreen verschillende deeltjesgrootten en piezo stuurspanningen die de bedrijfsparameters die nodig zijn voor efficiënte scheiding te tonen. In het algemeen worden hogere spanningen (dwz meer akoestische krachten) nodig om kleinere deeltjes te extraheren, zoals verwacht. Stuurspanningen kan niet onbeperkt worden verhoogd, echter, vanwege een grotere warmteafvoer en toenemende effecten van akoestische streaming. 13 De plot dient als een algemene richtlijn voor deeltjesscheiding-deeltjesgrootte die significant verschillend herstel in een bepaalde stuurspanning (bijvoorbeeld 10- tonen en 2-um-deeltjes bij 8,8 V pp) zal goed scheiden. In het algemeen deeltjesgroepen met een groot verschil in grootte, zoals virussen (~ 100 nm) en cellen (~ 10 urn) kunnen snel en efficiënt worden gescheiden, evenals cellen van diffErent maten (bv 6-8 um schijfvormige erytrocyten en 8-15 um leukocyten). De specifieke omstandigheden moeten werken met andere celtypen moeten empirisch worden bepaald, zoals celvorm, dichtheid en samendrukbaarheid invloed op de akoestische contrast, naast celgrootte. Daartoe de procedures in stap 4 zijn nuttig voor het bepalen bruikbaar scheidingsomstandigheden voor nieuwe cel of deeltje soort, en niet alleen om de kwaliteit van een bepaald acoustophoresis inrichting.

Figuur 7
Figuur 7. Scheiding Efficiency van Cell-Virus Spiked monsters. Scheiding resultaten van (A) Raji cellen die verrijkt met Dengue virus (DENV) en (B) Raji cellen en Boa niercellen verrijkt met Golden Gate Virus (GGV). Percentages verzameld worden gedefinieerd als de fractie van virussen of cellen verlaten van een specifiekeoutlet vergeleken met het totaal verlaten van de chip. De foutbalken voor (A) is de standaardafwijking van 3 proeven, terwijl de monsters in (B) slechts eenmaal verwerkt wegens de lage beschikbare hoeveelheden. 1x PBS werd gebruikt als het monsterbuffer en nuttige vloeistof, met water in het omloopkanaal voor alle experimenten. Chip operationele frequenties varieerden tussen 1,60 en 1,64 MHz, met drive spanningen tussen 16 en 20 V pp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om het nut van dit platform voor biologisch deeltje scheiding aan te tonen, hebben we eerst gebruikt om goed gekarakteriseerd biologische monsters te verwerken: de menselijke Raji cellen (10 5 cellen / ml, de gemiddelde diameter van 8-10 um 25) verrijkt met dengue virus (DENV, 10 5 pfu / ml, ongeveer een diameter van 50 nm 26). Figuur 7A toont het percentage Raji cellen en DENV in zowel de SPO LPO verzameld (gedefinieerd als de fractie van elk deeltje vanuit elke uitlaat ten opzichte van de totale hoeveelheid van elk verzameld uit de chip deeltje). Het experiment werd herhaald in drievoud en Raji cellen werden gekwantificeerd onder toepassing van een Coulter teller, terwijl DENV werd gekwantificeerd met behulp van een reverse-transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR).

Vervolgens wordt de prestatie van het systeem werd getest in een scenario die realistischer voor het verwerken van klinische monsters, waarbij de exacte eigenschappen van de deeltjes bekend kan zijn en de beschikbare monsterhoeveelheden lager. Hier onderzochten we scheiding van de recent geïdentificeerde golden gate virus (GGV), een slang pathogeen infecteren boaconstrictor niercellen. 27 het formaat van GGV virusdeeltje nog niet gemeten, maar omdat GGV behoort tot de familie Arenaviridae het waarschijnlijk van eenvergelijkbare grootte, tussen 100 en 150 nm. 28 We verwerkte monsters met GGV spiked (10 4 pfu / ml) in de Raji menselijke cellen (niet een infectie doelstelling voor het virus), en boa niercellen (infectie doelwit voor GGV, geschatte grootte 10 pm 27), beide celtypen bij 10 4 cellen / ml. Als deze monsters beschikbaar waren in kleine hoeveelheden, zijn scheiding voortvloeit uit slechts één experimentele run gemeld in dit werk. Figuur 7B toont het percentage van Raji cellen, Boa cellen en GGV verzameld uit de SPO en de LPO. De cellen werden in deze experimenten gekwantificeerd door telling op een hemacytometer en virussen werden gekwantificeerd door RT-qPCR.

Discussion

Dit protocol geeft de system-level integratie van microfluïdische apparaten op macroschaal apparatuur om geautomatiseerde verwerking van biologisch monster uit te voeren. De modulariteit van dit platform maakt het mogelijk om aanpasbaar aan elke continue stroom apparaat, en, als voorbeeld, de gepresenteerde protocol is gericht op het karakteriseren en optimaliseren van de prestaties van een acoustofluidic deeltjes- scheidingsinrichting. Drie grote voordelen van dit protocol zijn gemarkeerd: (i) modulariteit en chip-to-wereld interfacing, (ii) uitgebreide karakterisering van de prestaties van het apparaat, en (iii) automatische verwerking van nauwkeurig gedoseerde monster volumes voor deeltjesfysica scheiding.

ik. Modulariteit en chip-to-wereld interfacing

Zoals getoond in figuur 2, wordt de microfluïdische chip gemonteerd op een aangepaste breadboard om gemakkelijk op een microscoop podium voor directe waarneming. De broodplank bevat # 6-40 UNF schroefgaten op een 5 mm-pitch raster, enabling de chip te beveiligen en fluïdumverbindingen worden gemaakt. De vloeistofaansluitingen worden PEEK buis met gedraaide einden, waarbij afdichting tegen vloeibare chip met een rubber-face pakking en een roestvrij stalen kraag. Deze interface regeling zorgt voor een gemakkelijke en snelle vervanging chip apparaat redesign, waarvoor weinig of geen wijzigingen in andere onderdelen van het systeem, mits chip voetafdrukken voldoen aan het raster formaat. Zo hebben we dit platform met microfluïdische chips voor de continue stroming elektroforese thermische cellysis, 29 snel mengen van reagentia voor chemische synthese en eencellige capture en ondervraging.

ik ik. Robuuste karakterisering van prestaties van het apparaat

Om de prestatie van elke microfluïdische scheidingsinrichting optimaliseren de werkzaamheden eerst grondig gekarakteriseerd. De hier beschreven systeem ondersteunt de ontwikkeling van snelle en geautomatiseerde protocollen om dit te doen. Voor de specifieke example akoestische focusseerinrichtingen, de focusserende kwaliteit, werkfrequentie en de positie van de gerichte deeltjes in de microfluïdische kanaal worden gemeten voor elk apparaat. Deze metingen vereisen vegen door een reeks van piezoceramic rijden frequenties, spanningen en debieten, om de optimale parameter combinaties voor hoogwaardige scheiding identificeren. Het gepresenteerde protocol verschilt automatisch deze instelbare parameters en vangt de betreffende data- dwz fluorescentiebeelden deeltjes stroomt in het kanaal dat nabewerkt tot de vereiste afmetingen van deeltjes concentreren, het aantal keren, en de positie (figuur 3) genereren.

Volledige karakterisering van akoestische prestaties van het apparaat moet herhalen van de stappen 4.4 en 4.5 als nodig is onder verschillende experimentele omstandigheden. Zo wordt de absolute scherpstelpositie van een chip gevonden door uitvoering van de frequentiescan relatief lage stroomsnelheden en hoogspannings volledige migratie naar de knooppuntlocatie waarborgen. Bovendien kunnen dergelijke frequentiescans de kwaliteit van inrichtingsamenstel (indien uitgevoerd met polystyreen kralen van bekende grootte) beoordelen of om te bepalen hoe een eerder onbekend soort deeltje gedragen in het systeem (nadat een chip is gekarakteriseerd met kralen). Een chip met goede energieoverdracht van de piezoceramic de microfluïdische kanaal resulteert in strakke focus bij hoge stroomsnelheden (> 1 ml / min) en de lage spanning (V pp 12-15), terwijl die met slechte energieoverdracht niet eens richten bij lage stroomsnelheden (<100 pl / min) en hoge spanningen (> 20 V pp). Wij hebben gevonden dat innig contact tussen de microfluïdische chip en de piëzokeramische is essentieel voor efficiënte energieoverdracht in de vloeistof. Verder onderzoek van de optimale methode van hechten van de microfluïdische chip en de piëzokeramische zal betrouwbare productie van hoogwaardige apparaten.

Tenslotte volledigbeeld van de werking van een acoustophoretic apparaat kan worden verkregen door het combineren van de beeldgebaseerde frequentie scanmetingen van Stap 4 (en figuur 3) met deeltjesaantallen vanuit het SPO LPO als functies van de relevante bedrijfsparameters vanuit scheidingsexperimenten met microbolletjes uitgevoerd zoals beschreven in Stap 5. Zoals getoond in figuur 6, kan een dergelijke reeks geautomatiseerde experimenten snel karakteriseren van de prestaties van een individu apparaat en tunability informeren van de gebruiker van de optimale parameter speelt de inrichting voor deeltjesscheiding bedienen.

iii. Geautomatiseerde kleine steekproef verwerking voor deeltjesscheiding

Voor een succesvolle en nauwkeurige microfluïdische chip-gebaseerde monster verwerking, is het essentieel om betrouwbaar en nauwkeurig meter, belasting, leveren, en het verzamelen van de hoeveelheden vloeistof als ze door. Deze nauwkeurigheid is vooral belangrijk wanneer het monster volume is klein(~ 0,1-1 ml), die gebruikelijk is in klinische of onderzoekslaboratorium instellingen. 30 Precise sample handling is een uitdaging in traditionele microfluïdische experimenten die manuele terugtrekking van het monster in een spuit en infusie in een apparaat gebruiken zonder feedback van wanneer het monster heeft gescheiden en wanneer deze moet worden verzameld. De gepresenteerde protocol wendt geautomatiseerde monster spoel het laden en het afgeven in combinatie met real-time feedback van stroom sensoren om reproduceerbare scheidingen van kleine steekproef volumes mogelijk te maken.

Figuur 5 toont de stroom profielen gemeten op de SPO LPO van een typische scheiding experiment. Ten eerste leidt buffer van ten minste 35 gl geladen in een stabiele stroom voordat het monster akoestische chip bereikt. Monstervolumes minder dan 100 gl worden niet aanbevolen voor deze systeemconfiguratie, omdat monsterverdunning vanwege de leidende buffer excessief. Een plug van lucht wordt gebruikt bij het begin van the injectie voordat de leidende buffer om het monster stekker scheiden van de vloeistof die volgt voorkomen menging en verdunning van monster en dient als indicator voor de flowsensoren. Na een voorbijgaande als vloeistof begint te bewegen door het systeem scherpe piek signalen in beide uitstroomopeningen geven de doorgang van de eerste luchtbel. Deze transiënten worden gevolgd door een langdurige stabiele stroom wanneer het monster stroomt door het systeem, een piek wanneer de tweede luchtbel passeert, en tenslotte een eventuele afname van de stroomsnelheid tot nul na de injectiepomp stopt.

De passage van de lucht door de pluggen flow sensoren wordt gebruikt als triggerpoints de ventielen schakelen starten en stoppen monstername, de gemaskeerde monster en verdunning minimaliseren van niet-monstervloeistof volumes. Closed-loop dosering van verwerkte monstervolumina hoeft te herprogrammeren deze waarden voor de aanvang van het experiment telkens de input sample veranderd. Deze functie isvooral belangrijk wanneer monstervolume beperkt is, bijvoorbeeld bij vele klinische monsters. Real-time stroom bewaking helpt ook bij het oplossen van problemen; een slechte run (bijvoorbeeld een belemmering vormen in een van de uitlaten) is onmiddellijk duidelijk uit de resultante stromingsprofielen, zoals in figuur 5b.

Om de flexibiliteit en doelmatigheid van acoustofluidic scheiding met gebruikmaking van de systeemarchitectuur, gezuiverd DENV en GGV virusvoorraden demonstreren werden ingespoten in cel voorraden en gescheiden door verwerking via de microfluïdische chip. Figuur 7a toont dat Raji-cellen werden goed gescheiden van virussen, zoals 97 % van Raji cellen verlaten de chip bleken in het LPO, waardoor een sterk verrijkt monster van DENV in de SPO verlaten. In vergelijking, de efficiëntie van DENV scheiding was lager, met 70% van DENV verlaten van de chip in de SPO. Dit kan worden toegeschreven aan de geringe convectieve menging geïnduceerd door de windingen van de separatiop kanaal, maar meer waarschijnlijk enige DENV deeltjes migreert samen met de Raji cellen in de LPO. Cellen migreren lateraal over stroomlijnt slepen wat vocht met hen, zelfs bij lage Reynolds getal. Door dit mechanisme, en niet-specifieke adsorptie oppervlak, virusdeeltjes over in het LPO. Toch is de sterk verrijkt monster DENV in het SPO is een belangrijk voordeel, bijvoorbeeld wanneer de novo sequentie wordt gebruikt voor het opsporen en virussen te identificeren.

Figuur 7b toont dat in een experimentele run, slechts ongeveer 70% van de cellen Boa verlaten de chip werden gevonden in het LPO, tegen bijna 100% scheidingsrendement van Raji-cellen. Het verschil in scheidingsprestatie tussen de twee celtypen kan worden toegeschreven aan een kleinere gemiddelde grootte of een lagere dichtheid van Boa cellen in vergelijking met Raji-cellen, dus resulteert in kleinere akoestische krachten. Om te bevestigen of weerleggen deze veronderstellingen, de grootte, dichtheid en morfologie van Boacellen in suspensie (die normaal hechtende kweken) van Boa cellen moeten nauwkeurig worden gemeten, een poging voor verder onderzoek. In dezelfde experimenten vergelijkbaar met de experimenten met DENV het grootste deel van het gewonnen GGV verlaten van de SPO, wijst op een verrijking van de virale fractie.

De gepresenteerde gegevens benadrukken de inherente problemen van techniek breed toepasbare platforms voor het verwerken van een verscheidenheid van biologische monsters. Belangrijk is, kan de biologische interacties gaan even grote rol spelen als de fysische en mechanische effecten. Echter, deze voorlopige experimenten de kracht en de belofte van het gebruik van dit systeem architectuur voor monster verwerking in de klinische en wetenschappelijke toepassingen tonen ook aan. Als een robuuste, goed gekarakteriseerd ontworpen systeem, dit platform biedt de mogelijkheid om antwoorden op nieuwe wetenschappelijke vragen te zoeken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats