एंजाइमी biosensors के उपयोग अंतर्जात एटीपी या एच यों
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

Biology

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Palygin, O., Levchenko, V., Evans, L. C., Blass, G., Cowley Jr., A. W., Staruschenko, A. Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney. J. Vis. Exp. (104), e53059, doi:10.3791/53059 (2015).

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Abstract

एंजाइमी microelectrode biosensors व्यापक रूप से वास्तविक समय में बाह्य सिगनल को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उनके उपयोग के अधिकांश मस्तिष्क के स्लाइस और neuronal सेल संस्कृतियों के लिए सीमित कर दिया गया है। हाल ही में, इस तकनीक के पूरे अंगों के लिए लागू किया गया है। सेंसर डिजाइन के क्षेत्र में अग्रिम रक्त-भरकर रखा विवो गुर्दे में में सेल सिगनल की मापने संभव बना दिया है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहा गुर्दा interstitium में एटीपी और एच 22 सिगनल को मापने के लिए आवश्यक कदम की सूची। दो अलग-अलग सेंसर डिजाइन पूर्व vivo के लिए और इन विवो प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कर रहे हैं। सेंसर के दोनों प्रकार के तेजी से जवाब, संवेदनशील और चयनात्मक biosensors देने के लिए एक permselectivity परत के शीर्ष पर एक पतली एंजाइमी biolayer साथ लेपित हैं। permselectivity परत जैविक ऊतक में interferents से संकेत रक्षा करता है, और enzymatic परत ग्लिसरॉल काइनेज और ग्लिसरॉल-3-फॉसफोरस की अनुक्रमिक उत्प्रेरक प्रतिक्रिया का इस्तेमालएटीपी की उपस्थिति में phate ओक्सीडेस एच 22 उत्पादन करने के लिए। पूर्व vivo अध्ययन के लिए इस्तेमाल सेंसर के सेट आगे एक प्लैटिनम / इरीडियम (पं आईआर) तार इलेक्ट्रोड पर एच 22 के ऑक्सीकरण द्वारा विश्लेष्य का पता चला। इन विवो अध्ययन के लिए सेंसर के बजाय खून से भरकर रखा ऊतक के लिए बनाया गया एक मध्यस्थ लेपित सोने इलेक्ट्रोड पर एच 22 की कमी के आधार पर कर रहे हैं। अंतिम एकाग्रता परिवर्तन विश्लेष्य के ज्ञात सांद्रता के लिए अंशांकन द्वारा पीछा वास्तविक समय amperometry से पता चला रहे हैं। इसके अतिरिक्त, amperometric संकेत की विशिष्टता ओ 2 और एटीपी तदनुसार एच 2 टूट कि इस तरह के catalase के रूप में एंजाइमों और apyrase के अलावा द्वारा की पुष्टि की जा सकती है। ये सेंसर भी पहले और एक प्रयोग के बाद सटीक calibrations पर काफी भरोसा है। निम्नलिखित दो प्रोटोकॉल एटीपी और एच 2 के वास्तविक समय का पता लगाने के अध्ययन की स्थापनागुर्दे के ऊतकों में 2 हे, और आगे अन्य जैविक तैयारी या पूरे अंगों में उपयोग के लिए वर्णित विधि का विस्तार करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Introduction

(यह भी उपस्थित पांडुलिपि में सेंसर के रूप में संदर्भित) एंजाइमी microelectrode biosensors कोशिकाओं और ऊतकों में रहने वाले गतिशील संकेतन प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण किया गया है। सेंसर जैविक रूप से प्रासंगिक सांद्रता में सेल संकेतन अणुओं के अस्थायी और स्थानिक संकल्प में वृद्धि हुई प्रदान करते हैं। इसके बजाय नमूने लिए और समय की लंबी अवधि में अंतराल पर लिया बाह्य तरल पदार्थ का विश्लेषण करने के अपने एंजाइमों विश्लेष्य पर प्रतिक्रिया के रूप में, इन सेंसरों जिससे वास्तविक समय माप 1,2 उत्पादन, के रूप में तेजी से प्रतिक्रिया। Purines या हाइड्रोजन पेरोक्साइड, और उनकी रिहाई की गतिशीलता की तरह ऑटोक्राइन और पैराक्राइन कारकों की मध्य सांद्रता के फास्ट पता लगाने सामान्य और रोग की स्थिति में 3 दवाओं के प्रभाव के लिए एक प्रोफ़ाइल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्तमान में, सेंसर का उपयोग अनुप्रयोगों के बहुमत के मस्तिष्क के ऊतकों स्लाइस और सेल संस्कृतियों 4-10 में किया गया है। यह पांडुलिपि उद्देश्य में विस्तृत प्रोटोकॉलसही रूप में पूरे गुर्दे में analytes की वास्तविक समय सांद्रता को मापने के लिए साधन की स्थापना।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल मध्य एटीपी और एच गुर्दे में 2 2 हे संकेतन अध्ययन करने के लिए विकसित किए गए। गुर्दे की देशी वातावरण में, बाह्य एटीपी तेजी से उसके डेरिवेटिव (ADP, एएमपी और एडेनोसाइन) में अंतर्जात ectonucleotidases द्वारा catabolized है। यहां इस्तेमाल सेंसर अन्य purines या एटीपी गिरावट उत्पादों 11 से अधिक एटीपी के लिए अत्यधिक चयनात्मक हैं। यह एटीपी जारी है और इसकी संकेतन समारोह के निरंतर और गतिशील सांद्रता की सटीक निगरानी की अनुमति देता है के रूप में यह एक महान लाभ प्रदान करता है। मध्यवर्ती एटीपी एकाग्रता दो microelectrodes के संयोजन, एक एटीपी सेंसर और एक अशक्त सेंसर का उपयोग मापा जाता है। Catalase अनुप्रयोगों के साथ संयोजन में अशक्त सेंसर मध्य एच 22 सांद्रता 12 का पता लगाने में सक्षम है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल Senso के दो अलग अलग डिजाइनों का उपयोगया तो पूर्व vivo के लिए या विवो अनुप्रयोगों में इष्टतम विशेषताओं है कि रुपये।

दोनों डिजाइन एक सेंसर एंजाइमी परत में निहित ग्लिसरॉल काइनेज और ग्लिसरॉल-3-फास्फेट oxidase की अनुक्रमिक उत्प्रेरक प्रतिक्रिया के आधार पर कर रहे हैं और एटीपी की उपस्थिति से प्रेरित है। पूर्व vivo अध्ययन में इस्तेमाल किया सेंसर के सेट, एच 22, अंतिम enzymatic प्रतिक्रिया उत्पाद में, एक प्लैटिनम / इरीडियम (पं आईआर) तार इलेक्ट्रोड पर ऑक्सीकरण से पता चला है। इन विवो अध्ययन के लिए सेंसर के बजाय खून से भरकर रखा ऊतक के लिए बनाया गया एक मध्यस्थ लेपित सोने इलेक्ट्रोड पर 2 2 हे कमी एच के आधार पर कर रहे हैं। इस पांडुलिपि में वर्णित दोनों प्रोटोकॉल की एक योजना चित्र 1 में दिखाया गया है। यह बाध्य एंजाइमों का अभाव छोड़कर अशक्त सेंसर अपनी इसी एटीपी सेंसर करने के लिए समान है। इसलिए, catalase एंजाइम के साथ एच 22 का पता लगाने के अलावा, अशक्त सेंसर विदेश मंत्रालयउपायों अविशिष्ट हस्तक्षेप। एटीपी सांद्रता अशक्त अविशिष्ट हस्तक्षेप और एटीपी सेंसर संकेत से पृष्ठभूमि एच 22 का पता चला घटाकर की गणना कर रहे हैं। कई सेंसर भी इसी बातिल के साथ रखा जब इन विवो के लिए एडेनोसाइन, ionosine, hypoxanthine, acetylcholine कोलीन, ग्लूटामेट, ग्लूकोज, लैक्टेट, पूर्व vivo आवेदन या एडेनोसाइन, ionosine के लिए D-सेरीन, और hypoxanthine सहित अन्य analytes पता लगाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं सेंसर।

सही रूप में analytes पता लगाने के लिए सेंसर की क्षमता उचित पूर्व और बाद calibrations 13 पर निर्भर करता है। इस विश्लेषण जैविक ऊतकों में उपयोग के दौरान होता है कि सेंसर संवेदनशीलता में बहाव के लिए खातों है। सेंसर सेंसर एंजाइमी प्रतिक्रियाओं में एक अभिकर्मक के रूप में प्रयोग किया जाता है कि ग्लिसरॉल के एक डिपो रखती है। सेंसर ग्लिसरॉल युक्त स्नान समाधान में उपयोग नहीं किया जाता है, यह समय के साथ बाहर धोना होगा। छोटे आरecording बार तो सेंसर बहाव को कम करने के लिए जरूरी हैं। इसके अतिरिक्त बहुत सेंसर 14 की संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं अंतर्जात प्रोटिएजों और प्रोटीन टुकड़े से दूषण संवेदक।

वर्तमान पांडुलिपि पूर्व vivo के लिए और इन विवो गुर्दे की तैयारी में एंजाइमी microelectrode biosensors के उपयोग स्थापित करता है। वास्तविक समय विश्लेष्य मात्रा का ठहराव गुर्दे की बीमारियों और औषधीय एजेंटों के तंत्र में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकता है कि सेलुलर संकेत का अभूतपूर्व विस्तार प्रदान करता है।

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Protocol

प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड का पालन निम्नलिखित पशु प्रक्रियाओं। पूर्व अनुमोदन संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) से प्राप्त हुई थी।
नोट: सेंसर निर्माता के निर्देशों की समीक्षा प्रयोग डिजाइन और पूर्व अपने प्रयोग के दौरान किया जाना चाहिए। सेंसर का उपयोग करते समय इन निर्देशों का पालन इष्टतम परिणामों का उत्पादन होगा।

1. सेंसर कैलिब्रेशन

  1. प्रयोग की शुरुआत से पहले ताजा स्टॉक समाधान तैयार करें।
  2. 10 मिमी Napi बफर, 100 मिमी NaCl, 1 मिमी 2 MgCl, और 2 मिमी ग्लिसरॉल युक्त बफर बनाएँ। NaOH का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित करें। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत एक शेयर एटीपी एकाग्रता (100 मिमी) का उपयोग करना, बफर ए के 90 μl के लिए 10 μl शेयर जोड़कर एक ताजा 10 मिमी एटीपी अंशांकन समाधान बनाने
  4. टी में अपनी टिप (चित्रा 2) रखकर एटीपी सेंसर rehydrate2-8 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट के लिए बफर युक्त वह पुनर्जलीकरण चैम्बर।
    नोट: पुनर्जलीकरण के बाद, सेंसर अधिक से अधिक 20 सेकंड के लिए हवा के संपर्क में नहीं किया जाना चाहिए या सेंसर संवेदनशीलता को कम किया जा सकता है। हवा के लिए लंबे निवेश प्रत्याशित रहे हैं, ग्लिसरॉल का एक समाधान में संक्षेप में सेंसर डुबकी। सेंसर कई प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इन सेंसर पुनर्जलीकरण के रूप में एक ही दिन में हो जाना चाहिए। सेंसर अप करने के लिए 24 घंटे के लिए बफर के साथ पुनर्जलीकरण कक्ष में संग्रहित किया जा सकता है।
  5. दोहरी चैनल potentiostat (चित्रा 3) को चालू करें और रिकॉर्डिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं।
  6. बफर ए प्लेस के 3 मिलीलीटर अंशांकन कक्ष में संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ एक अंशांकन कक्ष तैयार। तो, पुनर्जलीकरण कक्ष से प्रत्येक संवेदक लो जोड़तोड़ को देते हैं और अंशांकन चैम्बर समाधान में डालें।
    नोट: एक अंशांकन कक्ष के रूप में एक मानक सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश का प्रयोग करें। सभी calibrations और सेंट बाहर ले जाने केएक उच्च प्रदर्शन प्रयोगशाला हवा की मेज पर एक फैराडे पिंजरे में udies amperometry रिकॉर्डिंग (चित्रा 4) के दौरान संकेत शोर को कम करने के लिए। Calibrations सर्वोत्तम संभव के रूप में डेटा संग्रह की शुरुआत करने के लिए करीब के रूप में किया जाता है। इन विवो अनुप्रयोगों के लिए जांच के लिए इष्टतम समय पशु के बाद सर्जरी वसूली की अवधि के दौरान होता है।
  7. पूर्व vivo अंशांकन
    1. 10 चक्र के लिए 100 एम वी / सेकंड की दर से 500 एम वी -500 एम वी से सेंसर साइकिल द्वारा अंशांकन कक्ष में चक्रीय voltammetry प्रदर्शन करते हैं। यह बहुत सेंसर की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है। 10 चक्र से मनाया निशान के लिए 5 चित्रा देखें।
    2. अंतिम चक्र के बाद 600 एम वी करने के लिए सेंसर फूट डालना। सेंसर मौजूदा एक asymptote को क्षय होगा। एक स्थिर पढ़ने 5 मिनट की एक न्यूनतम के बाद हासिल की है। शून्य पढ़ने रिकॉर्ड।
  8. विवो सेंसर अंशांकन में
    1. इन विवो Senso पर चक्रीय voltammetry प्रदर्शन नहीं करतेआर एस। इसके बजाय, एम वी 500 करने के लिए 30 सेकंड के लिए अंशांकन कक्ष में सेंसर फूट डालना। तब 0 एम वी potentiostat सेट और सेंसर मौजूदा एक asymptote करने के लिए वृद्धि करने के लिए अनुमति देते हैं। सेंसर वर्तमान अनंतस्पर्शी करने के लिए कम से कम 2 मिनट का समय लगेगा। शून्य पढ़ने रिकॉर्ड।
  9. लगातार एक वांछित पता लगाने रेंज शामिल एक अंशांकन लाइन का निर्माण करने के चेंबर में एटीपी समाधान की निर्धारित मात्रा जोड़ें। एटीपी चैम्बर भर में समान रूप diffuses के रूप में एटीपी समाधान के लिए एक क्षय द्वारा पीछा शुरू में सेंसर संकेत में तेजी से शिखर, पैदा करता है। रिकार्ड संकेत मूल्यों संकेत स्तर एक बार। प्रत्येक एटीपी इसके बाद आंकड़े 6A और 7 शो निशान स्थिर है और क्रमश: vivo अध्ययन दोनों पूर्व vivo के लिए और में एटीपी सांद्रता का सुझाव दिया है।
    नोट: यह analytes की मैला ढोने वालों का उपयोग करके इलेक्ट्रोड के चयनात्मकता पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान प्रोटोकॉल एच <के लिए एटीपी सेंसर और Catalase की विशिष्टता का परीक्षण करने के apyrase इस्तेमाल कियाउप> 2 ओ 2 संकेत (आंकड़े 6B)। दवाओं प्रशासित किया जा रहे हैं, तो सेंसर के साथ उनकी जेट के मापन के अध्ययन से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए।
  10. एटीपी सेंसर (शून्य स्तर (चित्रा 7) को कम करना चाहिए एटीपी आवेदन द्वारा उत्पादित वर्तमान की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल (89 संयुक्त राष्ट्र / मिलीग्राम) के एक शेयर से apyrase के 3 μl जोड़ें।
  11. (22 आवेदन शून्य पढ़ने को कम करना चाहिए एच द्वारा उत्पादित वर्तमान) अशक्त सेंसर की विशिष्टता का परीक्षण करने के 2mg / एमएल के एक शेयर (100 संयुक्त राष्ट्र / मिलीग्राम) से catalase के 3 μl जोड़ें।

सेंसर अध्ययन के लिए 2. पशु शल्य चिकित्सा

  1. पूर्व vivo के लिए सर्जरी
    1. Isoflurane (5% प्रेरण, 1.5% से 2.5 रखरखाव) / चिकित्सा ग्रेड हे 2 या किसी अन्य रूप में मंजूरी दे दी विधि के साथ प्रयोगात्मक पशु anesthetize। 12 पशु लगातार संज्ञाहरण की एक पर्याप्त स्तर सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जानी चाहिए 15 '। सेंटसक्षम श्वसन दर और पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया उचित संज्ञाहरण पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
      अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार पशु euthanize: ध्यान दें। सभी गैर-जीवन रक्षा प्रक्रियाओं के पूरा होने पर पशु 12 की मानवीय निधन सुनिश्चित करने के लिए वातिलवक्ष उत्प्रेरण थोरैकोटॉमी से गहरा anaesthetized जानवरों euthanize।
    2. एक लापरवाह स्थिति में एक तापमान नियंत्रित शल्य चिकित्सा की मेज पर चूहे रखें। एक उचित संवेदनाहारी गहराई को बनाए रखते हुए, बायां गुर्दा के साथ लाइन में लगभग 5 सेमी की एक midline चीरा बनाने के लिए और बाहर का उदर महाधमनी का पर्दाफाश।
    3. सीलिएक और बेहतर mesenteric धमनियों, और इन धमनियों ऊपर उदर महाधमनी के चारों ओर एक संयुक्ताक्षर लपेटें लेकिन ligate नहीं है। गुर्दे की धमनियों के नीचे उदर महाधमनी के आसपास दो संयुक्ताक्षर लपेटें।
    4. संयुक्ताक्षर ऊपर उदर महाधमनी दबाना। कम संयुक्ताक्षर बाँधो। पॉलीथीन टयूबिंग (PE50) के साथ उदर महाधमनी कैथीटेराइज़। दूसरी महाधमनी संयुक्ताक्षर के साथ कैथेटर सुरक्षित।
    5. क्लैंप हटाने और mesenteric और सीलिएक धमनियों ligate। गुर्दे पूरी तरह से blanched है जब तक 2-3 मिनट के लिए आरटी पर हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान के साथ 6 मिलीग्राम / मिनट पर गुर्दा छिड़कना।
    6. महाधमनी के हिस्से से जुड़ा गुर्दे और कैथेटर, आबकारी। स्नान समाधान के साथ भरा एक 3 मिलीलीटर पेट्री डिश में गुर्दे रखें।
      नोट: प्रयोग प्रोटोकॉल आरटी पर किया जा सकता है। 145 सोडियम क्लोराइड, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 1 2 CaCl, 10 HEPES, NaOH के साथ समायोजित पीएच 7.35: स्नान समाधान मिमी में शामिल हैं।
  2. इन विवो के लिए सर्जरी
    1. अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल का उपयोग चूहे anesthetize। इन विवो विश्लेषण के लिए ketamine के साथ चूहों (20 मिलीग्राम / किग्रा आईएम) और inactin (50 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) anesthetize। पशु लगातार संज्ञाहरण की एक पर्याप्त स्तर सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जानी चाहिए। एक स्थिर सांस की दर और पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया उचित संज्ञाहरण पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
    2. उचित संज्ञाहरण गहराई प्राप्त होने के बादएड, हवा की मेज पर स्थित एक तापमान नियंत्रित जमीन की सतह पर एक लापरवाह स्थिति में चूहे जगह है। सतह छोड़ देते हैं और 36 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
    3. उचित संवेदनाहारी गहराई को बनाए रखते हुए, गुर्दे के साथ लाइन में एक midline चीरा लगभग 5 सेमी बनाते हैं।
    4. ध्यान हटाने और पूरे गुर्दे दिखाई दे रहा है तो यह है कि त्वचा संबंधी और चमड़े के नीचे ऊतक लंगर के लिए एक सिवनी का प्रयोग करें। किसी भी आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए एक गुर्दा कप में गुर्दे रखें।
    5. रक्त की मात्रा बनाए रखने के लिए गले की नस के माध्यम से 1 मिलीग्राम / 100 ग्राम / घंटा पर 0.9% सोडियम क्लोराइड: 2% BSA के एक चतुर्थ अर्क का प्रयोग करें। मूत्र संग्रह के लिए दोनों मूत्रवाहिनी cannulate। प्लेस बेहतर mesenteric और सीलिएक धमनियों के आसपास के संबंधों को और गुर्दे छिड़काव दबाव (आंकड़े 10A) के हेरफेर के लिए बाहर का aortal।
    6. औषधीय एजेंटों के आवेदन में विवो प्रयोगों के दौरान की आवश्यकता है, एक मध्य कैथेटर की प्रविष्टि (आंकड़े 10 बी की सिफारिश की है

3. डाटा अधिग्रहण सेटअप

  1. डाटा अधिग्रहण कार्यक्रम खोलें और दोनों पूर्व vivo के लिए और एनोडिक सकारात्मक को विवो प्रयोगों में अपनी polarity निर्धारित किया है। आस्की कोड के रूप में डेटा को बचाने के लिए कार्यक्रम निर्धारित किया है।
  2. गुर्दे में सेंसर के त्वरित प्रविष्टि के लिए micromanipulators स्थिति।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सेंसर के वांछित स्थान प्राप्त करने में मदद करने के लिए micromanipulator से जुड़ी एक डमी जांच का उपयोग करें।
  3. पूर्व vivo डाटा अधिग्रहण
    1. / मिनट 650 μl की एक स्थिर दर पर cannulated महाधमनी के माध्यम से (2.1.6) से स्नान समाधान के साथ गुर्दे छिड़कना। शल्य कैंची का प्रयोग, ध्यान सेंसर प्रविष्टि के लिए आवश्यक है, जो गुर्दे कैप्सूल, हटा दें।
    2. रबर बैंड गुर्दे से अधिक तंगी और पिन के साथ सिलिकॉन लेपित पकवान से जुड़ी के साथ गुर्दे सुरक्षित।
    3. इसकी टिप में डूबे साथ पेट्री डिश में गुर्दे के करीब संदर्भ इलेक्ट्रोड रखेंबफर समाधान।
  4. विवो डाटा अधिग्रहण में
    1. एक गुर्दा कप में गुर्दे रखें। जानवर के तनाव और उम्र पर निर्भर करता है। शिथिल गुर्दे रखती है कि कप के एक आकार का उपयोग 8 शो गुर्दे कप के दो आकारों चित्रा। इसी कप ऐसी micropuncture आदि के रूप में 16 गुर्दे समारोह के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित विभिन्न शारीरिक दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
      गुर्दे कप की स्थिति जानवर श्वास द्वारा उत्पादित यांत्रिक शोर को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन साथ हस्तक्षेप या गुर्दे छिड़काव या मूत्र के प्रवाह को ब्लॉक नहीं होना चाहिए: ध्यान दें।
    2. डेटा संग्रह के प्रदर्शन से पहले वसूली समय के 45 मिनट की अनुमति दें।
    3. एक 26-30G सुई का प्रयोग, गुर्दे में सेंसर की इच्छित स्थान पर और गहराई में एक पंचर छेद करना। जताया रक्त को दूर करने के लिए सतह छेद दाग। गुर्दे की सतह के लिए ग्लिसरॉल समाधान जोड़ें। इस प्रयोग के दौरान बाहर सुखाने से गुर्दे की सतह को रोकने जाएगा। पुनर्जलीकरण चैम्बर से पहले सेंसर निकालें और यह micromanipulator के लिए देते हैं। जल्दी, 20 सेकंड के भीतर, गुर्दे में हौसले से बनाई गई छेद में इलेक्ट्रोड डालें। दोहराएँ अशक्त संवेदक के लिए 3.5-3.9 कदम।
    4. सेंसर से से, गुर्दे में लगभग 1 सेमी संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें।
  5. Potentiostat पर मुड़ें और कंप्यूटर पर रिकॉर्डिंग कार्यक्रम को सक्रिय करें। 9 पूर्व vivo गुर्दे डाटा अधिग्रहण के अंतिम सेटअप पता चलता है। 10 एक सम्मिलित कैथेटर के साथ इन विवो गुर्दे डाटा अधिग्रहण के अंतिम सेटअप पता चलता है।

4. डेटा विश्लेषण

  1. उत्पत्ति या किसी अन्य इसी तरह के सॉफ्टवेयर में ASCII डेटा फ़ाइल आयात करें।
  2. एकाग्रता मौजूदा संबंध
    1. वर्तमान के लिए एक रेखीय एकाग्रता (एक्स अक्ष) का निर्माण करने के लिए एटीपी या एच 2 के लिए (वाई अक्ष) संबंध रेखीय फिट / एक्सट्रपलेशन समारोह का प्रयोग करें 2 अंशांकन अंक (आंकड़े 6 और 7)।
      रेखीय फिट पंक्ति: y = mx + बी
  3. एकाग्रता के लिए वर्तमान समकक्ष रखना
  4. इंट्रासेल्युलर एटीपी द्वारा उत्पादित वास्तविक वर्तमान प्राप्त करने के लिए एटीपी सेंसर के उन लोगों से अशक्त सेंसर की मापा निशान घटाना।
  5. 4.2.1 में विस्तृत अंशांकन समीकरण का उपयोग एनएम को amperometry द्वारा प्राप्त देहात में एटीपी मूल्यों को बदलने। "एक्स" मूल्य में प्रत्येक समायोजित वर्तमान आयात और वाई (विश्लेष्य की एकाग्रता) के लिए हल करके एटीपी सेंसर की घटाया डेटा का पता लगाने की एकाग्रता का निर्धारण।
  6. यदि आवश्यक हो तो इसी तरह, अपने अंशांकन समीकरण से एच 22 एकाग्रता की गणना।

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Representative Results

एंजाइमी microelectrode biosensor का डिजाइन पूरी गुर्दे में analytes की वास्तविक समय का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। या तो पूर्व vivo के लिए या vivo अध्ययन में सामान्य प्रयोग के डिजाइन का इस्तेमाल किया चित्रा 1 व्याप्ति सेंसर में सचित्र है और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के अध्ययन पर कि क्या आधार पर अलग पूर्व vivo या विवो में है।

प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सही, पूर्व और बाद calibrations प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। चित्रा 6A calibrations दौरान पूर्व vivo एटीपी सेंसर से देखा संकेत के एक प्रतिनिधि का पता लगाने से पता चलता है। जल्दी कि apyrase नोट एटीपी संकेत सफाया कर दिया। Catalase एटीपी संकेत पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा और यह बनाता है एच 22 (चित्रा 6B) को अपनी विशिष्टता को दर्शाता है। अंशांकन प्रक्रिया छठी में। एटीपी के गतिशील परिवर्तन (चित्रा 6A, सही पैनल) की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक रेखीय फिट का उत्पादनVO सेंसर अंशांकन पूर्व vivo सेंसर की है कि एक समान ट्रेस पैदा करता है। हालांकि, इस सेंसर के बजाय ऑक्सीडेटिव धाराओं के reductive पता लगाता है और उत्पादन में इस तरह के रूप में वर्तमान नकारात्मक है। इन सेंसरों की कैलिब्रेशन भी एक 0.3-80 माइक्रोन के रेंज में एक रेखीय फिट (चित्रा 7A सही पैनल) पैदा करता है। अन्य प्यूरीन उत्पादों पर एटीपी को इन विवो सेंसर की विशिष्टता चित्रा 7 बी में दिखाया गया है।

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण हमें दवा आसव 12 के जवाब में अंतर्जात पदार्थों और तीव्र परिवर्तन के दोनों बेसल स्तर को मापने के लिए अनुमति देता है। आंग चित्रा 11 में दिखाया गया नमक प्रतिरोधी और नमक के प्रति संवेदनशील चूहों में एच 22 के मध्य अंतर्जात एकाग्रता के परिवर्तन द्वितीय प्रेरित। इन प्रयोगों के लिए, Sprague Dawley (एसडी) या डाहल नमक के प्रति संवेदनशील (एसएस) चूहों से हौसले से पृथक गुर्दे निरंतर लामिना का प्रवाह (650 μl / मिनट) के तहत 1 माइक्रोन आंग द्वितीय के साथ भरकर रखा गया था। थानेदार के रूप मेंWN चित्रा 11 में, आंग द्वितीय एसडी और एस एस चूहों दोनों से गुर्दे में एच 22 की तीव्र रिहाई लाती है। हालांकि, प्रत्येक प्रतिक्रिया का अधिकतम आयाम काफी जानवरों के एक उच्च नमक आहार 12 से तंग आ चुके थे, खासकर जब एसएस चूहों में उठाया गया था। विवो में biosensors के एक प्रतिनिधि के आवेदन चित्रा 12 में दिखाया गया है। Catalase (5 माइक्रोग्राम / एमएल) biosensor के द्वारा पता लगाया पूरी तरह से ब्लॉक एच 22 संकेत के अर्क। इन प्रयोगों औषधीय हस्तक्षेप के जवाब में अंतर्जात पदार्थों और उनकी रिहाई के वास्तविक समय माप के बेसल स्तर का पता लगाने के लिए amperometric तकनीक के साथ संयुक्त विशिष्ट एंजाइमी biosensors के उपयोग का वर्णन। इस दृष्टिकोण के आगे अनुप्रयोगों नमक के प्रति संवेदनशील उच्च रक्तचाप जैसी गुर्दे की विकृतियों के हमारे ज्ञान और समझ में सुधार होगा purinergic संकेतन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, गुर्दे बैलidative तनाव और क्रोनिक किडनी रोग।

चित्र 1
प्रोटोकॉल के चित्रा 1. योजनाबद्ध। हित के विश्लेष्य और इसकी विशिष्टता के परीक्षण के साथ कैलिब्रेशन प्रयोगों के शुरू करने के तुरंत पहले किया जाता है। इन विवो प्रोटोकॉल जटिल शारीरिक प्रयोगों और औषधीय अनुप्रयोगों के लिए पूर्व vivo के लिए पीछा किया जाना चाहिए। पोस्ट प्रयोग अंशांकन किया और डेटा विश्लेषण के दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2। एंजाइमी Microelectrode सेंसर। दोपूर्व vivo अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल संवेदक आकार, 50 माइक्रोन और 125 माइक्रोन व्यास दिखाए जाते हैं। प्रत्येक सेंसर तार एक सोने का अंत कनेक्टर से कनेक्ट करने के लिए एक केशिका ट्यूब में फैली हुई है () नहीं दिखाया। इनसेट एटीपी का पता लगाने के लिए एंजाइमों के साथ लिपटे एक सेंसर टिप से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3। दोहरी चैनल potentiostat। CH1 और CH2 लेबल potentiostat चैनल। 1) CH1 एटीपी सेंसर कनेक्शन और 2) CH2 विद्युत संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए मिलकर कर रहे हैं कि अशक्त सेंसर कनेक्शन 3) कनेक्शन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4। सेंसर सेटअप। डाटा अधिग्रहण बिजली के शोर को कम करने के लिए एक फैराडे पिंजरे में और एक कंपन से मुक्त काम की सतह के लिए एक उच्च प्रदर्शन प्रयोगशाला मेज पर किया जाता है। 1) एक तापमान नियंत्रित शल्य चिकित्सा की मेज micromanipulators एक प्रकाश स्रोत शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और सेंसर प्रविष्टि 4 के लिए आवश्यक है प्रयोग 3) के दौरान सेंसर का लचीला स्थिति के लिए चुंबकीय बढ़ते एडेप्टर से जुड़े होते हैं) शारीरिक प्रयोगों 2 के दौरान पशुओं के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है ) दोहरी चैनल potentiostat 5) सेंसरों के लिए धारक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5। चक्रीय Voltammetry। पूर्व vivo अध्ययन के लिए, सेंसर चक्रीय voltammetry -0.5 और पूर्व अंशांकन प्रोटोकॉल के लिए 0.5 वी के बीच 10 चक्र के लिए आयोजित किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6। पूर्व Vivo के लिए amperometry कैलिब्रेशन। (ए) कैलिब्रेशन स्नान समाधान के लिए जाना जाता एटीपी सांद्रता के अलावा उपयोग करता है। अनंतस्पर्शी स्तर (काला ट्रेस) में दर्ज की गई amperometric मूल्यों इसी। प्राप्त धाराओं एक अंशांकन समीकरण पैदा करते हैं। एक उदाहरण सही पैनल पर दिखाया गया है। लाल निशान वर्तमान मुद्दों हैएच 22 के ही इसके लिए जवाब है जो अशक्त सेंसर की NT। (बी) अशक्त सेंसर स्नान समाधान और amperometric मूल्यों दर्ज कर रहे हैं asymptotes (पतली काला तीर) के लिए जाना जाता एच 22 सांद्रता (लाल तीर) के अलावा के साथ calibrated है। स्नान समाधान (मोटी काला तीर) के लिए Catalase के अलावा तेजी से वर्तमान क्षय में यह परिणाम है। सही पैनल अशक्त सेंसर अंशांकन समीकरण से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7। के लिए amperometry कैलिब्रेशन;। इन विवो इलेक्ट्रोड के vivo में अंशांकन कमी प्रतिक्रियाओं को छोड़कर पूर्व vivo अध्ययन में विस्तृत करने के लिए एक समान फैशन में एक रिवर्स वर्तमान (polarity) पैदा किया जाता है। (ए) में जाना जाता एटीपी सांद्रता के अलावा एटीपी सेंसर (काला ट्रेस) पर एक amperometric मौजूदा उत्पादन लेकिन अशक्त सेंसर (लाल ट्रेस) पर कोई प्रभाव नहीं है। Apyrase के अलावा एटीपी सेंसर की वर्तमान extinguishes। (बी) एटीपी सेंसर की विशिष्टता अलग purinergic एजेंट (UTP, यूडीपी और एडेनोसाइन) के 10 माइक्रोन के अलावा द्वारा की पुष्टि की है। एटीपी के आगे अनुप्रयोगों के लिए एक स्थिर पहचाने जाने amperometric वर्तमान प्रदान करते हैं। एक मध्यस्थ लेपित सोने इलेक्ट्रोड के आधार पर इन विवो सेंसर (सी) माइक्रो। इस figu का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंफिर से।

आंकड़ा 8
8 चित्रा। किडनी कप। Vivo अध्ययन में, गुर्दे अभी भी दिखाया स्टेनलेस स्टील गुर्दे कप का उपयोग कर आयोजित कर रहे हैं। कप के दो आकारों गुर्दे आकार भिन्नता को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। ये कप जानवर के श्वसन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं, जो आंदोलन कलाकृतियों को कम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा 9. पूर्व Vivo पृथक और perfused गुर्दे की। पृथक गुर्दे की एक मोटी सी के साथ लेपित 1) पेट्री डिश में रखा गया हैपिन प्रविष्टि 2) वृक्क धमनी प्रयोग 3) एटीपी सेंसर के दौरान लगातार छिड़काव के लिए एक सिरिंज पंप करने के लिए cannulated और जुड़ा हुआ है के लिए licone नीचे, 4) और अशक्त सेंसर गुर्दे 5) संदर्भ इलेक्ट्रोड जलमग्न गुर्दे के पास रखा जाता है में डाला जाता है नहाने के समाधान में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
विवो रक्त भरकर रखा गुर्दे में चित्रा 10। बायां गुर्दा संपर्क में है और एक गुर्दा कप में रखा गया है (ए), सही गुर्दे पशु अंदर बरकरार है। दोनों सेंसर गुर्दे में डाला जाता है। बीएसए: सोडियम क्लोराइड द्रव नुकसान ख का कारण प्रतिक्रिया करने के लिए catheterized गले नस के माध्यम से संचार होता हैY 1) गुर्दे की एक गुर्दा कप 2) एटीपी सेंसर 3) अशक्त सेंसर और 4) संदर्भ इलेक्ट्रोड द्वारा आयोजित किया जाता है प्रत्यक्ष औषधीय अनुप्रयोगों के लिए एक प्रत्यारोपित मध्य कैथेटर के साथ इन विवो प्रयोग की बड़ी मध्य लाइन चीरा (बी) उदाहरण डाला जाता है लामिना औषधीय सुई लेनी के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से गुर्दे में प्रत्यारोपित और संलग्न गुर्दे 5) कैथेटर के उदर सतह में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 11
एच 2 चित्रा 11. पूर्व Vivo विश्लेषण उप> गुर्दे में ओ 2। आंग द्वितीय छिड़काव एच चूहा गुर्दा कोर्टेक्स में 22 रिलीज का कारण बनता है। (ए) मतलब की वास्तविक समय में परिवर्तन एन = 8 आवेदनों की कुल से एच 22 एकाग्रता (ग्रे सलाखों के मानक त्रुटि दिखाने) (4 अलग चूहों से 4 गुर्दे)। शीर्ष पर सलाखों आंग द्वितीय आवेदन प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) के अधिक से अधिक एच Sprague Dawley (एसडी) और डाहल नमक के प्रति संवेदनशील (एसएस) चूहों के लिए आंग द्वितीय छिड़काव के दौरान 22 एकाग्रता आयाम मूल्यों में क्रमश: एक निम्न और उच्च नमक आहार खिलाया। * - पी <एसडी चूहों बनाम 0.05। आंकड़ा अनुमति के साथ संदर्भ में 12 से अनुकूलित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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(चित्रा 10B में दिखाया गया है) एच के vivo विश्लेषण मध्य एच के vivo मूल्यांकन के 2 2 हे। उदाहरण में यह आंकड़ा 12. एक एसएस चूहे की मज्जा में 22 एकाग्रता एक कम नमक आहार खिलाया। 5 मिनट के अंतराल के लिए एक प्रत्यारोपित कैथेटर के माध्यम से catalase के मध्य आवेदन गुर्दे मज्जा में एच 22 संकेत की एक पूरी नाकाबंदी का उत्पादन किया। गुर्दे रक्त प्रवाह से वार्शआउट से Catalase की कमी, एक अतिरिक्त Catalase आवेदन (10 मिनट) द्वारा फिर से अवरुद्ध किया गया था जो संकेत, के एक आंशिक वसूली में हुई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल एटीपी की बढ़ी अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करने के लिए विकसित किया गया और पूर्व vivo भरकर रखा, पृथक और इन विवो में खून-भरकर रखा गुर्दे के लिए एच 22 संकेतन। प्रोटोकॉल और यहां इस्तेमाल किया सेंसर के बीच मतभेद औषधीय एजेंटों या शारीरिक अध्ययन के लिए या तो इष्टतम डाटा अधिग्रहण प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल 1) सेंसर अंशांकन, 2) शल्य प्रक्रिया, 3) डाटा अधिग्रहण सेटअप, और 4) के आंकड़ों के विश्लेषण से मिलकर बनता है। वे कई प्रयोगात्मक शर्तों के लिए analytes की वास्तविक समय माप सक्षम। यह अधिक से अधिक गुर्दे की बीमारियों में अंतर्दृष्टि और अधिक प्रभावी औषधीय उपचार के विकास को बढ़ावा मिलेगा। यहाँ हम एटीपी और एच 22 का विश्लेषण करने के लिए सेंसर का इस्तेमाल किया। हालांकि, अन्य पदार्थों के लिए सेंसर भी उपलब्ध हैं और इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल चूहे गुर्दे में एटीपी और एच 22 अध्ययन करने के लिए आवेदन किया है, लेकिन एक ही metho थेघ आसानी से चूहों में आवेदन के लिए समायोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, इस दृष्टिकोण आनुवंशिक कृंतक मॉडल की बहुतायत पर विचार के लिए एक महान क्षमता है।

एंजाइमी microelectrode biosensors के मूल डिजाइन क्लार्क और लियोन्स 2 द्वारा 1960 में विकसित किया गया था। Biosensors के प्रारंभिक विकास के बाद, अग्रिमों दोनों डिजाइन 17-19 और अनुप्रयोगों के 20 में किया गया है। Llaudet एट अल। 21,22 एंजाइम कोटिंग के लिए Cosneir एट अल। 23 से तरीकों का उपयोग करते हुए वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एटीपी सेंसर के सिद्धांत डिजाइन विकसित की है। ये सेंसर मस्तिष्क astrocytes 8 से एटीपी रिहाई, 4,24 साँस लेने के विनियमन, और कंकाल की मांसपेशी धमनिका विनियमन 25 सहित शारीरिक प्रक्रियाओं की संख्या में एटीपी संकेतन का पता चला है। हाल ही में पूर्व vivo प्रोटोकॉल गुर्दे 12 में एटीपी सिगनल को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस पांडुलिपि मैं का लक्ष्यइस तरह के गुर्दे में एटीपी के रूप में अंतर्जात पदार्थों का पता लगाने के लिए प्रभावी दिशाओं और अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए।

एंजाइमी microelectrode biosensors विवो में analytes मापने के मौजूदा साधन पर कई फायदे हैं। हालांकि, विशेष सावधानियों किसी अन्य नई विधि के लिए के रूप में इस दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। एक स्थापित दृष्टिकोण के साथ मान्यता के प्राप्त आंकड़ों में आत्मविश्वास प्रदान करता है। पहले से 26,27 वर्णित के रूप में उदाहरण के लिए, microdialysis मापन किया गया था। कोई महत्वपूर्ण अंतर सेंसरों और डायलिसिस के नमूने 12 से प्राप्त उन लोगों के द्वारा निर्धारित शिखर सांद्रता के बीच मनाया गया। microdialysis की सीमा है कि यह केवल विश्लेष्य की स्थिर राज्य स्तरों कि उपायों है। जैसे, सेल संकेतन में गतिशील परिवर्तन का आकलन केवल एंजाइमी microelectrode biosensors के उपयोग के साथ प्राप्त किया जा सकता है। सेंसर प्रतिक्रिया समय का कारख़ाना विनिर्देशों संवेदक के बीच अलगप्रकार के। पूर्व vivo सेंसर 5-10 सेकंड के और 90% से 10 से संकेत वृद्धि के लिए 30-35 सेकंड के विवो सेंसर में एक प्रतिक्रिया समय है। अंशांकन निशान (आंकड़े 6 और 7) विश्लेष्य अलावा / हटाने के समय संकल्प प्रदर्शित करता है। सेंसर और microdialysis दृष्टिकोण दोनों के लिए, analytes द्वारा उत्पादित संकेत ब्लॉक करने के लिए विशिष्ट एंजाइमों का उपयोग विशिष्टता को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।

वर्णित प्रोटोकॉल कई चुनौतियों का सामना किया। ऊतक में किसी भी सेंसर प्रविष्टि के रूप में, ऊतकों को नुकसान होती है। यह माप 28 प्रभावित कर सकते हैं, जो संकेत दे रास्ते सक्रिय कर सकता है। सेल नुकसान को कम करने के लिए, पतली सेंसर की जरूरत होगी। हालांकि, यह सुइयों के एक छोटे से प्रवेश छेद बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं तो सेंसर के साथ गुर्दे कैप्सूल घुसना मुश्किल है। पतला सेंसर मोड़ करने के लिए और अधिक होने की संभावना है और प्रविष्टि पर अपने कोटिंग बाधित। बड़ा व्यास सेंसर अधिक प्रतिरोधी झुकने और resulta हैंउनकी कोटिंग। चित्रा 3 के लिए एनटी क्षति एक पतली और मोटी सेंसर से पता चलता है। झुकने के लिए मोटी सेंसर का प्रतिरोध करने के लिए इसके अलावा, वे एंजाइमी परत के लिए वृद्धि की सुरक्षा प्रदान करने, कोटिंग का एक मोटा परत होते हैं। मोटी सेंसर का उपयोग के कारण ऊतकों को नुकसान की चिंता का विषय यह मस्तिष्क के ऊतकों में होगा की तुलना में गुर्दे में काफी कम था। प्रविष्टि गहराई अनुमानित है और गुर्दे पर माप पूरा कर रहे हैं के बाद फाइनल प्लेसमेंट सत्यापित किया जाना चाहिए। सेंसर टिप 0.5 मिमी है और गुर्दे कोर्टेक्स 2-3 मिमी मोटी है के रूप में एक प्रविष्टि गाइड के रूप में सेंसर टिप लंबाई का उपयोग छाल तथा मज्जा परतों और बीच आकलन के लिए पर्याप्त है। सेंसर के दूषण भी इस प्रकार एक प्रयोग करने के लिए इन विवो प्रोटोकॉल में लंबे समय में सेंसर उपयोग को सीमित करने, रक्त में अधिक से अधिक दर पर होता है। 1 आधा घंटा 1 के रिकॉर्डिंग बार केवल एक छोटा सा सेंसर बहाव में हुई। मुख्य मानदंड को कम सेंसर प्रदर्शन का आकलन कम संवेदनशीलता है जबअंशांकन प्रक्रिया के दौरान विश्लेष्य करने के लिए। बढ़ी हुई बिजली के शोर और आधारभूत वर्तमान की अस्थिरता भी सेंसर टिप क्षतिग्रस्त संकेत मिलता है कि कर सकते हैं। एटीपी की सटीक मापन के लिए, दोनों सेंसर (एटीपी और अशक्त) संकेत के आगे घटाव के लिए इसी तरह के शोर और स्थिरता विशेषताएं होनी चाहिए। अन्यथा, सेंसरों की एक प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। कम शोर और विश्लेष्य के छोटे सांद्रता का पता लगाने के लिए, प्रत्येक जानवर के लिए नया सेंसर के इस्तेमाल का सुझाव दिया है।

कई कदम सफल प्रायोगिक परिणामों के लिए महत्वपूर्ण हैं। सेंसर बहुत कमजोर हैं और सेंसर टिप हानिकारक से बचने के लिए सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, पुनर्जलीकरण के बाद, सेंसर अधिक से अधिक 20 सेकंड के लिए हवा के संपर्क में नहीं किया जाना चाहिए। कम शोर रिकॉर्डिंग ऊतकों में जैविक संकेतों के सफल पता लगाने के लिए आवश्यक हैं। उस प्रयोजन के लिए, एक उच्च प्रदर्शन प्रयोगशाला हवा मेज और समुचित बिजली ग्राउंडिंग की आवश्यकता है। विश्लेष्य dur की सही मात्रा के अलावाअंशांकन कदम आईएनजी प्रयोगों में सटीक एकाग्रता निर्धारण के लिए आवश्यक है। पूर्व vivo गुर्दे की सर्जरी में गुर्दे की भलाई के समाशोधन हासिल करने सफल रिकॉर्डिंग में परिणाम होगा। एंजाइमों का उपयोग apyrase और calibrations में Catalase और प्रयोगों में सेंसर अविशिष्ट संवेदनशीलता के आकलन के लिए अनुमति देता है और माप की पुष्टि करता है।

इन प्रोटोकॉल बहुत गुर्दे में बाह्य संकेतन का विस्तार बढ़ाया प्रदान। सेंसर द्वारा सकती सुधार संवेदनशीलता और अस्थायी समाधान हमें रोग राज्यों में संकेत है और पहले से undetectable थे कि औषधीय हेरफेर निम्नलिखित एटीपी में परिवर्तन को हल करने के लिए अनुमति दे सकता है। पूर्व vivo गुर्दे पर औषधीय अनुप्रयोगों के अध्ययन के लिए इष्टतम है, जबकि इन विवो प्रोटोकॉल जटिल शारीरिक अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। यहां इस्तेमाल में विवो सेंसर का डिजाइन बीएल में हस्तक्षेप के खिलाफ अभूतपूर्व विरोध में सक्षम बनाताऊतक बाढ़-भरकर रखा। साथ में ले ली, इन सेंसरों मौजूदा प्रोटोकॉल और तकनीकों के साथ पहले संभव नहीं थे कि आवेदनों की एक बड़ी राशि प्रदान करते हैं।

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Disclosures

इस पांडुलिपि की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए सेंसर Sarissa बायोमेडिकल लिमिटेड (कोवेन्ट्रीय, यूके) द्वारा प्रदान किया गया।

Acknowledgements

हम वर्तमान पांडुलिपि में इस्तेमाल किया सेंसर के विकास में उनके काम के लिए Sarissa बायोमेडिकल सराहना करते हैं। इस शोध राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े द्वारा समर्थित किया गया है, और रक्त संस्थान HL108880 (ए Staruschenko) अनुदान, एच एल 116,264 (ए काउली) और एच एल 122,662 (ए Staruschenko और ए काउली), के मेडिकल कॉलेज द्वारा वित्त पोषित परियोजना विस्कॉन्सिन अनुसंधान मामलों की समिति # 9306830 (ओ Palygin) और एक स्वस्थ विस्कॉन्सिन अनुसंधान और शिक्षा कार्यक्रम # 9,520,217 आगे बढ़ाने, और नेशनल किडनी फाउंडेशन के युवा अन्वेषक अनुदान (ओ Palygin)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sensor Kit Sarissa Biomedical SBK-ATP-05-125 The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm Sarissa Biomedical SBS-ATP-05-125 store at 2-8 oC before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm Sarissa Biomedical SGS-ATP-10-50 store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe null sensor 125 μm Sarissa Biomedical SBS-NUL-20-125 store at 2-8 oC before use
Sarissagold null sensor 50 μm Sarissa Biomedical SGS-NUL-10-50 store at 2-8 oC before use
Sarissaprobe ATP Manual Sarissa Biomedical http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage  TMC
Dual channel potentiostat Digi-Ivy DY2021 Type II Faraday cage
Data acquisition program Digi-Ivy DY2000
Perfusion pump Razel Scientific Instruments Model R99E
Fiber optic illuminator Schott ACE 1
micromanipulator Narishige MM-3
micromanipulator magnetic stand Narishige GJ-8
air table TMC 63-500
isoflurane ventilator LEI Medical M2000
3 ml petri dish Fisher Scientific S3358OA
needle Santa Cruz 26-30 G
pins Standard dissection pins
catheter Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue Vetbond 1469SB
suture Look SP117
rubber bands any 2-4 mm wide rubber bands
silicone Momentive RTV-615 Clear 1#
clamp Fine Science Tools 18052-03
standard dissection kit Kit should include scalpel and dissection sissors 
Kidney Cup Of own design
standard chemicals Sigma-Aldrich
ATP Sigma-Aldrich A6559-25UMO 100 mM ATP solution
hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 216763
glycerol Sigma-Aldrich G9012
Apyrase Sigma-Aldrich A7646
Catalase Sigma-Aldrich C40
isoflurane Clipper 10250
inactin Sigma-Aldrich T133
ketamine Clipper 2010012
Hanks Balanced Salt Solution  Gibco 14025092

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References

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