Generasjon og kvantitativ analyse av Pulsed Low Frequency Ultralyd å Bestem Sonic følsomhet Ubehandlet og behandlet neoplastiske celler

1Department of Biology, Syracuse University
Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Ultralyd refererer til en oscillerende lydtrykket bølge med en frekvens som er større enn den øvre grense av menneskelige hørselskapasitet (~ 20 kHz) 1. Lavfrekvente ultralyd i 20-60 kHz ble benyttet i laboratoriet som et middel til å generere emulsjoner, forbereder celleprøver for nukleinsyre-ekstraksjon, for vev avbrudd, og for en rekke andre tester. Nytten av lavfrekvente ultralyd har også blitt utvidet til industriell setting for sveising, rengjøring ulike materialer og materialbehandling. Kommersielt tilgjengelige ultralyd generatorer kommer i frekvenser som spenner 18-60 kHz, og fullskala wattstyrker fra 100-1,200 W.

Selv om ultralyd har lenge vært brukt i den kliniske setting for bildediagnostikk, har det blitt brukt som et terapeutisk modalitet bare nylig. Ultralyd ≥1 MHz er i stand til å trygt forstyrrende nyrestein (nyrestein) og gallesten (steiner i the galleblæren eller i leveren) hos pasienter for å redusere symptomene 2,3. Denne tilnærmingen kalles ekstra shockwave lithotripsy (ESWL) er nå mye brukt i klinikken (mer enn en million pasienter behandles årlig med ESWL i USA alene 4), og tilbyr en modalitet der til ikke-invasiv bryte opp sten med minimal sivile skader ved bruk av eksternt påført, fokuserte høy intensitet akustiske pulser 2-4.

På grunn av de unike direkte skjærkrefter, samt kavitasjonsbobler som genereres av høy intensitet ultralyd, har disse metoder blitt undersøkt i cancerterapi for behandling av kastrering resistent prostatakarsinom og pankreatisk adenokarsinom i en metode kjent som høy intensitet fokusert ultralyd (HIFU ) 5-8. På en måte som er svært lik ESWL bruker hifu flere ultralydstråler og fokuserer dem på et valgt samlingsområde for å generere temperaturer på 60 ° C eller highenne gjennom bruk av akustisk energi, indusere koagulative nekrose i målvevet 5. Selv om andre modaliteter av termisk ablasjon dag eksisterer (radiofrekvensablasjon og mikrobølgeovn ablasjon), HIFU tilbyr en klar fordel over disse metodene i at det er den eneste ikke-invasive hyperthermic modalitet 5. HIFU har oppnådd blandede resultater i klinikken og er foreløpig kun tilgjengelig i kliniske studier 8-11. Likevel har den begrensede suksessen den har oppnådd, og det meget lovende in vivo data innhentet fra prekliniske pattedyr modeller demonstrert potensialet av ultralyd i kreftbehandling.

I et forsøk på å forbedre HIFU, har forskere forsøkt å kombinere ultralyd med passende antineoplastiske midler for å generere en form for sonochemotherapy. Sonodynamic terapi (SDT) er en lovende ny behandlingsform som har vist imponerende antineoplastisk aktivitet både in vitro og 1. Det er blitt vist at ultralyd preferensielt skader ondartede celler basert på størrelsen forskjellen mellom slike celler, og de ​​av normal histologi 1,5. SDT omfatter spesialiserte midler kjent som sonosensitizers å øke omfanget av preferanse skade utøves av ultralyd mot neoplastiske celler. Selv om terapeutiske anvendelser av SDT har tidligere blitt undersøkt, ultralydsystemer brukt anvender typisk høyere frekvens ultralyd (≥1 MHz), og effekten av lave kHz ultralyd har ennå ikke fullt utforsket. Lavere frekvenser av ultralyd er ofte mer dyktig til å produsere treghets kavitasjon, et fenomen som resulterer i ødeleggelsen av celler som på grunn av den raske sammenleggingen av mikrobobler, indusere fysikalsk skade 12-14. Denne forskjellen i generering av treghet kavitasjon mellom MHz og lav kHz ultralyd har blitt tilskrevet det faktum at lavere wave frekvenser aktivere mikrobobleer mer tid til å vokse med utbedret diffusjon i utvidelsen halvperiode, dermed produsere mer voldelige kollapser under følgende komprimering halvperiode 12.

Vi har tidligere vist at U937 humane monocyttiske leukemiceller er følsomme for lavfrekvente ultralyd (23,5 kHz), og at denne følsomhet kan økes betydelig ved anvendelse av antineoplastiske midler som forstyrre cytoskjelettet 15. Videre har vi vist at cellene er fortrinnsvis skadet basert på størrelse, med større celler som utviser høyere ultralyd følsomhet. I tillegg normale humane hematopoetiske stamceller (hHSCs) og leukocytter ved sammenlignbare cellestørrelser er mye mer motstandsdyktig mot ultralydbehandling enn sine motstykker neoplastiske 15, forsøksvis som tyder på at lavfrekvent ultralyd kan brukes for fortrinnsvis å ødelegge maligne celler i nærvær av normalt vev.

For ytterligere å undersøke den unike propskapene til lavfrekvent ultralyd for potensiell terapeutisk bruk, har vi utviklet rengjøring og stabiliserings prosedyrer for å øke effektiviteten og påliteligheten til en av våre nåværende ultralydsystemer, Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, utstyrt med en 20 mm horn montert inn i en 7,62 cm cup. I tillegg har vi vært i stand til å bestemme nøyaktig prøve kavitasjon energier, samt konsistente bølgeformer og amplitude innenfor 40 kHz ved hjelp av en kavitasjon meter og oscilloskop med hydrofon. Ved raffinering og systematisere våre protokoller, har vi vært i stand til å etablere konsistens i våre eksperimentelle sonications, tillater oss å kvantitativt sammenligne de soniske sensitiviteter av neoplastiske og normale celler i ulike histogenetic linjene. Vår protokoll for 40 kHz system er vist i detalj for omfattende for interesserte laboratorier for å være i stand til å utføre tilsvarende forsøk, og for å evaluere våre funn av antineoplastiske effekter fremkalt avlavfrekvent ultralyd. I tillegg har vi undersøke de doseavhengige virkninger av metyl-β-cyklodekstrin (MeβCD; figur 1), et kolesterolreduserende middel, for å øke følsomheten av ultralyd U937 og THP1 humane monocyttiske leukemiceller.

Protocol

1. Rengjøring Cell Sonifier System

  1. Rengjør union mellom horn og konverter bruker kloroform og en vattpinne av bomull. Påfør en lett olje eller mineralolje til gjengene på hornet og omformeren for å fjerne oppbygging av metallspon, rust eller oksydasjon ytterligere.
  2. Bruk kloroform for å fjerne olje og andre forurensninger fra unionen etter tørke gjengene med olje.

2. Sette sammen Cell Sonifier og sette opp systemet

  1. Fest horn til konverteren. Til riktig dreiemoment systemet, fjerne den sammensatte omformer og horn fra koppen ved å trekke hornet ut av bunnen av skålen (figur 2A). Plasser en spalte skrunøkkel i en av de tre små hull nær toppen av konverteren (figur 2B). Deretter plasserer en dreiemomentnøkkel utstyrt med en ½ tommers kråke foten på slisset del av horn (figur 2B). Stram i standard urviseren til dreiemoment måleravles 54.23 N. m (figur 2C), dreiemomentet er anbefalt av produsenten 16. Monter strammet omformer og horn tilbake i koppen, og montere horn og konverter til en ring stå i oppreist stilling. Fest converter til strømforsyningen før du setter systemet for eksperimentell puls dosering.
  2. Sett systemet for puls dosering bruker 1 sek for lydbehandling med 1 sek mellom pulser. Forskjellige doserings modeller kan brukes til andre eksperimentelle betingelser. Mange variabler, for eksempel vannvolum og horn diameter ville potensielt kreve endringer i dette dosering. Ved hjelp av de ovennevnte celleprøvetyper, volum og konsentrasjon, har empiriske data og observasjoner førte til utformingen av denne doseringsregime.
  3. Tilpasse systemet til den ønskede amplitude. I denne protokollen, å bruke 33% og 50% amplitude for å hindre fullstendig celle ødeleggelse, noe som ville gjøre effekten av sonosensitderfor ansett vanskelig eller umulig å måle.
    Merk: I denne studien amplitudene er sammenlignet.

3. Vurdere System Intensitet og funksjon

  1. Hold kavitasjon meter på 1,5 cm, hvilket er nivået av prøven sonication. Oppmerksom på målingene for å vurdere at systemet kjører på en forventet intensitet. Ved hjelp av dagens system og vannstand, forventer mellom 100-110 W / cm 2 for 33% amplitude og 115-125 W / cm 2 for 50% amplitude. Legg merke til kavitasjon måleravlesninger fra måleren skjerm som representerer kavitasjon energi i W / cm 2 direkte. Ta disse målingene på overflaten av vannet, og at ingen bobler er til stede på overflaten av meter sonden.
    MERK: Det er viktig å merke seg at disse prosedyrene er gjort uten cap for tilgang over hornet. De må ikke bli gjentatt etter hvert sonikering. Snarere bør de kun utføres etter rengjøring, remontere, og å sette opp systemet. Plasser hydrofon i et prøveglass som inneholder 12,5 ml vann for å fordype hydrofon sensor. Heng opp hydrofon hjelp ringen stand.
  2. Fest hydrofon med inngangen til oscilloskopet for å vurdere bølgeformegenskaper. Undersøk oscilloskop for en klar sinusbølge, som avvikende bølger kan endre frekvensen til systemet fra spesifikasjonene til produsenten. Både kavitasjon meter og oscilloskop gi en frekvens lesing, men bare oscilloskop viser avvikende bølger som er en indikasjon på en defekt system eller feil montering.

4. Utarbeidelse av celler og Medium

  1. Forbered mediet ved hjelp av 240 ml Iscoves Modifisert Dubecco medium (IMDM) og 50 ml føtalt bovint serum. Ikke tin føtalt bovint serum i et varmt vannbad, slik rask økning i temperaturen kan føre til et kompromiss i serumstabilitet. Kombiner 240 ul gentamicin 50 mg / ml og 5 ml penicillin/ Streptomycin 100x i en standard kultur kolbe, og legge til mediet. Oppbevar medium ved 4 ° C.
  2. Seed U937-celler på ~ 4 x 10 4 celler / ml i en 25 cm2 kolbe ved å bruke den fremstilte medium. Bedømme celler for konsentrasjon og levedyktighet ved anvendelse av en celleteller TC20 og trypanblått-eksklusjon ved å plassere 15-20 ul av celler og 15-20 pl trypanblått i et mikro-sentrifugerør og blande innholdet. Pipette15-20 ul av denne blandingen i en TC20 sampling slide, og initiere teller ved å plassere lysbilde i TC20 celleteller.
  3. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2, og kontroller for cellelevedyktigheten ved hjelp av trypan blå eksklusjon, og TC20 celleteller. Når cellene er i en passende konsentrasjon, og / eller er blitt behandlet med sonosensitizers for et passende tidsrom, overførings 3 ml av celler fra kulturen kolben til et 20 ml glass tellekar. I denne protokollen, vokser U937-celler i 48 timer, og deretter behandle med 0,5, 1,eller 5 mM MeβCD i 30 min for å utarme tilstrekkelig kolesterol av celler før sonikator.

5. Cell Sonikering

  1. Degas avionisert, destillert vann ved hjelp av et vakuum og Buchner-kolbe. Overfør vannet til koppen horn, og fyll opp til et nivå på 15 mm over toppen av hornet. Sonikasjonsprosessen fører til ytterligere avgassing av vannet i en periode på noen få minutter, og kan føre til uoverensstemmelser i løpet av forsøket dersom systemet ikke er kjørt før prøveultralydbehandling. Derfor kjøre systemet for ~ 7 min før prøve lydbehandling.
  2. Fest scintillasjonsglass inneholder cellene til holderen. Deretter fester festeanordningen til toppen av koppen horn og satt til en høyde av 15 mm fra toppen av hornet (ved vannoverflaten ved hjelp av glidemekanismen).
  3. Cellene er vanligvis sonikert ved bruk av en tre sek pulser av ultralyd, med en sec mellomrom i mellom hver av disse pulser. For detteprotokoll, sonicate celler ved 33% og 50% amplitude ved hjelp av nevnte puls dosering.

6. Vurdere Cells for Damage Post-lydbehandling

  1. Vurdere de suspenderte celler for skader og levedyktighet ved hjelp trypanblått og TC20 celleteller. I tillegg analyserer prøven ved hjelp av en teller Z2. For telleren Z2 analyse, pipette en 100 ul cellesuspensjon til 20 ml isoton saltoppløsning (200: 1 forhold). Før analyse spyle åpningen av Z2 partikkelanalysator minst to ganger ved bruk av isoton saltvann. Plasser Z2 prøven i skranken holder, og hev plattformen til åpningen før oppstart teller.
  2. Tilegne seg data fra TC20 og Z2 tellere bruker programvare levert av produsenten. Analysere disse dataene for celleskader, levedyktighet, og etableringen av mobilnettet rusk fra lydbehandling.

7. XTT analyse for å bestemme Cell Livskraftig og mitokondrielle aktivitet Behandlet U937 og THP1 Cells

  1. Prior til XTT analyser, vokse U937 og THP1 celler under samme forhold. Forbehandle celler med samme konsentrasjonsområde av MeβCD i 30 min før ultralydbehandling. Bruk samme ultralyd parametrene som før, bortsett fra at cellene er nå sonikert ved bruk av en rekke 1-3 en SEC pulser adskilt ett sekund fra hverandre for å utvikle en rekke skade for XTT kit for å vurdere.
    Merk: Mange av disse trinnene er tatt direkte fra XTT kit manuell og er bare gjentas for bekvemmeligheten av interesserte laboratorier.
  2. Samle celler ved sentrifugering ved 200 xg i 10 min. Resuspender cellepelleten i vekstmediet beskrevet ovenfor. Resuspender celler i ~ 1 x 10 5 celler / ml. Seed U937 celler i 100 mL per brønn i en flat-bottom 96-brønners mikrotiterplate i tre eksemplarer, og deretter gjenta for THP1 celler ved hjelp av en egen 96-brønns plate. Består av tre kontrollbrønner som inneholdt 100 ul av fullstendig vekstmedium alene som tomme avlesninger. Deretter inkuber inokulerte plater for to4 timer.
  3. Tine to alikvoter av XTT-reagens og aktiverings reagens ved 37 ° C før bruk. Swirl porsjoner forsiktig til klare løsninger oppnås. Tilsett 0,1 ml av aktiverings reagens til 5,0 ml av XTT-reagens, som danner nok aktivert XTT-løsning for en 96-brønners mikrotiterplate assay. Gjenta prosessen for den andre plate.
  4. Tilsett 50 pl av den aktiverte XTT-løsning til hver brønn. Returnere platen til cellekulturen CO 2 inkubator i 2 timer. Rist platen forsiktig etter inkubasjonsperioden for å fordele den oransje fargen i positive brønner. Mål absorbansen til analysebrønnene som inneholdt celler og de blanke bakgrunnskontrollbrønner ved en bølgelengde mellom 450-500 nm bølgelengde ved anvendelse av en mikrotiter plateleser.
  5. Enten nullstille mikrotiterplateleser bruke de tomme kontrollbrønner eller trekke fra deres gjennomsnittsverdi fra de konkrete resultatene. Mål absorbansen til alle analysebrønnene på nytt på et wavelength mellom 630-690 nm og trekke verdiene fra 450-500 nm verdier oppnådd. Merk: Denne andre absorbans bestemmelse bidrar til å eliminere uspesifikke opplesninger fra analyseresultatene. Den XTT-analysen ble gjentatt fire ganger for begge cellelinjer.

Representative Results

System stabilitet er avgjørende i å skaffe repeterbare og pålitelige resultater. Den riktige moment av N 54,23. M oppnådd korrekt kopling av svingeren og sonotrode 2, med den konsekvens av bølgeformen blir vurdert ved hjelp av et oscilloskop og hydrofon (figur 3A). Figur 3B viser målinger inne i prøveglass, og Figur 3C vurderer stabilitet i koppen horn. Som forventet, ble amplituden noe redusert på grunn av noen energi som blir absorbert av glass. Imidlertid bølgeformen ikke ble forstyrret eller forvrengt i enten panel B eller C, som er nødvendig for pålitelig levering av sonisk energi til prøven. En bølgeform som ikke vises som et klart flertall sinuskurve indikerer en defekt svinger eller feil oppsett. Dette kommer til uttrykk i Figur 3D, som viser flere avvikende bølger, en klar fravær av en sinusbølge, og en frekvens leser not forventet med et fungerende system. Kavitasjon meter anvendt for å måle energien som genereres kavitasjon (figur 4) funnet lydintensiteten å være 100 til 110 W / cm 2 til 33% amplitude, og 125 til 130 W / cm 2 til 50% amplitude.

Når 40 kHz system var passende kalibrert og satt sammen i sin helhet (figur 5), er pålitelig celle ødeleggelse lett oppnådd, som bestemt ved både TC20 og Z2 tellere (figur 6). Som forventet, var mer omfattende celleskade observert i cellepopulasjoner sonikert ved 50%, i stedet for ved 33% amplitude. Likevel er 33% amplitude nyttig som et utgangspunkt for å oppdage mulige sonisk sensibiliserende virkningene av administrert midler, da det frembringer merkbar skade, men gir rom for flere skader som skal detekteres når midler anvendes for å vurdere deres potensering av ultralydsensitivitet. Dette er vist i figur 7A, derdoseavhengige virkninger av MeβCD på potensiering av ultralyd følsomheten av U937-celler er presentert. Selv om ikke-sonikerte MeβCD-behandlede cellene var svært like i levedyktighet til ikke-lydbehandlet, ubehandlede celler, levedyktighet markert falt etter tre pulser av 1 sek 40 kHz ultralyd ble brukt. I tillegg vises det redusert levedyktighet etter sonikering å ha vært doseavhengig, så 5 mM MeβCD produserte den største nedgang i celletall, etterfulgt av 1 mM, og deretter 0,5 mM MeβCD.

Lignende virkninger på cellelevedyktigheten og mitokondrielle aktivitet ble observert hos både U937 og THP1 celler som ble behandlet med varierende konsentrasjoner av MeβCD før ultralydbehandling, som målt med XTT-sett (figur 7B). Selv THP1 cellene synes å være litt mer motstandsdyktig enn sonisk U937 celler, både humane leukemi linjene skadet på en doseavhengig måte. Høyere konsentrasjoner av MeβCD og flere pulser av ultralyd produced den laveste reduksjon av XTT til en oppløselig, lyst farget orange-derivat for både U937 og THP1 celler, svarende til å senke cellenes levedyktighet og mitokondrielle aktivitet.

Figur 1
Figur 1. molekylære strukturen av metyl- β-cyklodekstrin. (A) Fullstendig struktur metyl-β-cyklodekstrin (MeβCD). (B) MeβCD er en polymer av syv gjentatte enheter med en R-gruppe av enten H eller CH3. Molekylær formel: C 56 H 98 O 35. Molekylvekt = 1331,36.

Figur 2
Figur 2. Riktig torqueing 40 kHz ultralyd system. (A) Hornet og konverter blir fjernet fra koppen prieller til torqueing. (B) Plasser sporet fastnøkkel og momentnøkkel på sine respektive posisjoner. (C) Påfør 54.23 N. M dreiemoment i klokkens retning før du fester horn og konverter til koppen.

Figur 3
Figur 3. Anvendelse av et oscilloskop for å karakterisere bølgeformen av det ultrasoniske system. (A) Et oscilloskop med hydrofon kan benyttes for å evaluere amplituden og bølgeformen konsistens. (B) Et opptak tatt med koppen direkte over hornet på 1,5 cm og satt til 33% amplitude. (C) Den bølgeform som er avbildet her fra en avlesning oppnås når hydrofonen er plassert i 20 ml scintillasjonsglass. Ampullen er plassert 1,5 cm over hornet og igjen satt til 33% amplitude. (D) Et oscilloskop skjermbilde ofa system med avvikende frekvenser som kan forventes med en defekt system eller feil kobling av hornet Kalkulator union. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Anvendelse av en kavitasjon meter for å karakterisere lyden intensiteten av ultralydsystemet. Kavitasjon meter som her brukes til å representere kavitasjon energi i W / cm2. Dette er en meget viktig instrument for å vurdere konsistensen av energi i forhold til prøven.

Figur 5
Figur 5. Viktige komponenter i 40 kHz ultralyd system. Ultralydsystemet er vist komplett med cup horn ( (B), konverteren (C), og prøve posisjonering mekanisme (D). Denne utformingen gjør det mulig for enkel plassering av prøven (E) over hornet (F).

Figur 6
Figur 6. Effekter av ulike nivåer av amplitude på ultralyd lyse av U937 celler ved hjelp av TC20 og Z2 tellere. Cellene ble ultralydbehandlet med 40 kHz cellen Dismembrator på 33% amplitude (100-110 W / cm 2) eller 50% amplitude (125-130 W / cm 2) ved hjelp av tre 1 sek pulser av ultralyd, med en sec avstanden mellom hvert av disse pulser. (A) En skjermdump fra Z2 teller programvare demonstrerer effekten av ultralyd på U937 celler. (B) av data fra TC20 telleren ble samlet i et diagram for å vise reproduserbarheten av resultatenes. Disse data omfatter de totale og levende celletall, samt trypanblått vurderes celleviabilitet. Barer reflektere standard feil av gjennomsnittet (SEM) for fire uavhengige cellepopulasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Virkning av metyl- β-syklodekstrin på potensiering av ultralyd følsomheten av U937 og THP1 celler. (A) U937-celler ble behandlet med varierende konsentrasjon av MeβCD i 30 min før de ble ultralydbehandlet med 40 kHz ultralyd (105 W / cm 2 ) ved hjelp av tre 1 sek pulser avstand 1 sek fra hverandre. Cellepopulasjoner ble gruppert i ≥12 mikrometer og ≥17 mikrometer. (B) U937 eller THP1 celler ble igjen behandlet med varierende concentrasjoner av MeβCD i 30 minutter før den ble behandlet med ultralyd ved 40 kHz systemet med 1-3 pulser av 1 sek 1 sek ultralyd i avstand fra hverandre. Celleviabilitet og mitokondrie aktivitet ble vurdert med XTT kit. 100 ul av celler ble sådd per brønn i en flatbunnet 96-brønners mikrotiterplate. Platen ble inkubert i 24 timer før tilsetning av XTT-løsning. Cellene ble deretter inkubert i ytterligere 2 timer før den bølgelengden ble avlest. Barer reflektere SEM for fire uavhengige cellepopulasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For å oppnå optimale resultater, bør man være spesielt forsiktig å nøye plassere prøven og rengjør converter-horn union. Plassering av prøven i hornet er viktig for å oppnå konsistent celle ødeleggelse, som å endre avstanden fra hornet vil forandre den akustiske brennpunkter, og dermed endrer energien prøven blir utsatt for. Den akustiske energi innenfor koppen horn kan kartlegges ved hjelp av kavitasjon apparatet til å finne posisjonen av maksimal kavitasjon. I tillegg er det kavitasjon meter, sammen med oscilloskopet er avgjørende for bestemmelse av lydintensitet cellene blir utsatt for, såvel som homogeniteten av bølgeformen. Derfor bør disse instrumentene brukes til å oppdage problemer med systemet, og bidra til å bestemme hva feilsøking kan være nødvendig å korrigere ustabilitet i systemet.

Som tidligere nevnt, kan den lavfrekvente systemet virke til ytterligere avgasse vann gjennom hele forsøket hvis ikke kjøre forflere minutter før prøve lydbehandling. Dette første løp må utføres for å gi en forholdsvis avgasset sonikering medium og således ensartede resultater i løpet av eksperimentene. I tillegg bør ikke cellene sonikert ved eller i nærheten av den maksimale amplitude ved vurdering av effekten av sonosensitizers, som det virkelige omfanget av sensibilisering ville være vanskelig å vurdere. Ved hjelp av 33% amplitude på 40 kHz system er en ideell setting, som den produserer bemerkelsesverdig skade, men gir sonosensitizers god plass til å vise sin effekt, som demonstrert med MeβCD mot U937 og THP1 celler (figur 7). Disse data bekrefter også at MeβCD sensitizes flere leukemi linjer til lavfrekvent ultralyd på en doseavhengig måte.

Det har vært et antall forsøk utført med høyere frekvens i området på 0,75 MHz til 8 MHz som viser tegn på intramembrane kavitasjonsbobler som blir generert gjennom ultralydbehandling 17-19. Men questions fortsatt i forhold til den eksakte mekanismen av ultralyd-indusert cellelyse 18. Vi har vist en kobling mellom fluidisering av cytoskjelettet og sonisk økt følsomhet ved hjelp av lavfrekvente ultralyd 15, et fenomen som demonstrert ved andre laboratorier 20, 21. I tillegg er det funnet at filaforstyrrende midler slik som cytochalasin B potensere ultralydsensitivitet i multiple leukemi linjer, men ikke hHSCs eller leukocytter 22, tyder på at inhibering av aktin Polymeriseringen kan være en sonosensitizing mekanisme av spesiell interesse. Vi har også observert at vincristin, et mikrotubulus-forstyrre middel som inhiberer tubulin polymerisering 23, 24, vesentlig øker følsomheten av ultralyd forskjellige leukemityper in vitro, inkludert akutt myelogen leukemi, kronisk myelogen leukemi, og akutt lymfoid leukemi. I motsetning cytoskeletal-rettede midler som stabiliserer cytoskeletal komponenter (paclitaxel end jasplakinolide) ser ut til å gjøre cellene motstandsdyktig mot lydbehandling, reflekteres av lavere priser på cellelysis 22. Samlet utgjør disse data støtter hypotesen om at fluidisering av cytoskeletal komponentene av neoplastiske celler er faktisk en viktig faktor for å øke effekten av SDT 25. Den foreliggende undersøkelse viser også at kolesterol uttømming kan være en annen metode for å ytterligere forsterke den ultrasoniske følsomheten av neoplastiske celler, som MeβCD-behandlede U937 celler er markert sensibilisert for 40 kHz ultralyd.

Mens våre ultralyd protokoller har vist markert antineoplastisk aktivitet in vitro, er den nåværende metodikk begrenset til å jobbe i kultur og små virveldyr modeller som er i stand til å passe i hetteglassene brukes for lydbehandling. Vi har vist at sebrafisk kan trygt sonikert ved bruk av pulset lavfrekvent ultralyd (20 kHz), og at deres toleranse overfor kjemoterapeutiske midler er kvantitativt sammenligndoser tolereres av murine modeller 26, noe som tyder på at tumorbærende sebrafisk kan anvendes i innledende undersøkelser for å bedømme in vivo antineoplastisk aktivitet av disse protokollene. Likevel administrering kjemoterapeutiske midler før sonikering av pattedyrmodeller har blitt rapportert i MHz-området 1, og slike protokoller kan sannsynligvis bli utvidet til å innlemme lavfrekvent ultralyd, så vel som kolesterolreduserende og cytoskeletal styrt midler.

Potensielle kliniske anvendelser av denne form for SDT kan involvere utenomlegemlig blod sonikering i hvilken antineoplastiske midler administreres intravenøst ​​(iv) før blodet blir fjernet for 25 ultralydbehandling. Denne metoden fjerner potensielle støyskjermer som utgjøres av menneskets anatomi, og kan være en effektiv måte å ødelegge leukemi blasts, samt metastaser fra solide tumorer. Det er også mulig at kolesterolreduserende og cytoskeletal styrt midler kunnebrukes i HIFU protokoller som allerede er undersøkt i klinikken i et forsøk på å forbedre effektiviteten ved denne behandlingsform.

Metodene som er beskrevet i denne studien er i stand til å vurdere verdien av potensielle sonosensitizers, og videre system raffinement kan forsterke dette verktøyet. Men det er mange variabler som skal vurderes ved bruk av slike ultralyd planlegger, inkludert strømforsyningen kvalitet, akustiske brennpunkter, og individuell variasjon blant omformere. Derfor vil fremtidig forskning fokusere på å visualisere de soniske bølger og forstå deres innflytelse på resultatene. SDT har vist seg å forbedre cellelysis in vitro, og kan vise seg å være klinisk levedyktig dersom mer in vivo data i pattedyr modeller er anskaffet. Eksperimenter som undersøker andre potensielt utnyttbare kjennetegn ved ondartede celler, samt ulike kombinerte modaliteter som involverer flere agenter og ultralyd fortsette i vårt laboratorium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33, (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179, (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174, (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15, (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4, (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110, (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11, (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29, (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23, (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5, (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65, (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19, (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32, (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34, (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30, (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84, (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8, (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11, (95), 20140071 (2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17, (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11, (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28, (6), 1021-1031 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics