Generation und quantitative Analyse der Pulsed niederfrequenter Ultraschall, um die Sensitivität der Sonic Unbehandelte ermitteln und behandelten Tumorzellen

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Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

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Abstract

Introduction

Ultraschall bezieht sich auf jedes oszillierende Schalldruckwelle mit einer Frequenz von mehr als der oberen Grenze des menschlichen Gehörs Kapazitäten (~ 20 kHz) 1. Niederfrequenz-Ultraschall im 20-60 kHz-Bereich wurde im Labor als Mittel zur Erzeugung von Emulsionen, die Vorbereitung Zellproben für die Nukleinsäureextraktion, zur Gewebezerstörung genutzt worden sind, und für eine Vielzahl von anderen Tests. Die Nützlichkeit von niederfrequentem Ultraschall wurde auch zur industriellen Umgebung zum Schweißen erweitert, Reinigen verschiedener Materialien und der Materialverarbeitung. Im Handel erhältliche Ultraschallgeneratoren kommen Frequenzen im Bereich von 18 bis 60 kHz, und Full-Scale-Wattagen von 100-1,200 W.

Obwohl Ultraschall ist seit langem in der klinischen Einstellung für die diagnostische Bildgebung verwendet wurden, wurde es als ein therapeutisches Mittel erst kürzlich angewendet. Ultraschall ≥1 MHz ist in der Lage sicher zu stören Harnsteinen (Nierensteine) und Gallensteine ​​(Steine ​​in the Gallenblase oder in der Leber) in Patienten, um die Symptome zu 2,3 zu reduzieren. Dieser Ansatz als extrakorporale Stoßwellenlithotripsie (ESWL) bekannt, ist nun weit verbreitet in der Klinik (mehr als eine Million Patienten werden jährlich mit ESWL in den Vereinigten Staaten allein 4 behandelt) aufgebracht wird, und bietet eine Modalität, durch die nicht-invasiv brechen Kalküle mit minimalen Kollateralschaden durch die Verwendung von extern angelegten, fokussiert, Hochintensitätsschallimpulse 2-4.

Aufgrund der einzigartigen direkten Scherkräfte sowie Kavitationsblasen durch hochintensiven Ultraschall erzeugt wird, haben diese Methoden in der Krebstherapie für die Behandlung von kastrationsresistentem Prostatakarzinom und Adenokarzinom des Pankreas in einem Ansatz als hoher Intensität bekannt sucht fokussierter Ultraschall (HIFU ) 5-8. In einer sehr ähnlichen Weise ESWL verwendet HIFU mehreren Ultraschallstrahlen und fokussiert sie auf eine ausgewählte Fokusbereich auf Temperaturen von 60 ° C oder hig erzeugensie durch die Verwendung von Schallenergie und induziert Koagulationsnekrose in dem Zielgewebe 5. Obwohl auch andere Modalitäten der thermischen Ablation gibt es derzeit (Radiofrequenz-Ablation und Mikrowelle Ablation) bietet HIFU einen deutlichen Vorteil gegenüber diesen Verfahren, dass es das einzige nicht-invasive Hyperthermie Modalität 5. HIFU hat gemischte Ergebnisse in die Klinik erreicht und ist derzeit nur in klinischen Studien 8-11 zur Verfügung. Nichtsdestotrotz haben die begrenzten Erfolg erreicht hat, und die sehr vielversprechend in präklinischen Säugetiermodelle erworben vivo-Daten das Potenzial von Ultraschall in der Krebstherapie gezeigt.

In dem Bemühen, HIFU verbessern, haben Forscher versucht, Ultraschall mit geeigneten antineoplastische Mittel zu kombinieren, um eine Form der sonochemotherapy generieren. Sonodynamischen Therapie (SDT) ist eine vielversprechende neue Behandlungsmethode, die beeindruckende antineoplastische Aktivität in in vitro und gezeigt hat, 1. Es hat sich gezeigt, dass Ultraschall bevorzugt Schäden malignen Zellen basierend auf der Größe Differenz zwischen solchen Zellen und denen der normale Histologie 1,5. SDT enthält spezielle Wirkstoffe wie sonosensitizers um das Ausmaß der durch Ultraschall gegen Tumorzellen ausgeübt Vorzugs Schäden erhöhen bekannt. Während therapeutische Anwendungen von SDT wurden zuvor untersucht worden, Ultraschallsystemen verwenden typischerweise höhere Frequenz Ultraschall (≥1 MHz), und die Auswirkungen der niedrigen kHz Frequenzultraschall ist noch nicht vollständig erforscht. Niedrigere Frequenzen von Ultraschall sind oft auf die Herstellung Inertial Kavitation, ein Phänomen, das in der Zerstörung von Zellen führt zu mehr beherrschen aufgrund der schnellen Kollabieren der Mikrobläschen, induzieren physikalisch Schaden 12-14. Dieser Unterschied in der Erzeugung des Inertial Kavitation zwischen MHz und niedriger kHz Ultraschall hat, dass untere Wellenfrequenzen ermöglichen Mikroblasen zugeschriebens mehr Zeit, um durch gleichgerichtete Diffusion in den Ausbau Halbzyklus während der folgenden Kompressionshalbwelle 12 wachsen, damit die Herstellung heftiger Zusammenbrüche.

Wir haben zuvor gezeigt, dass U937 humanen monozytären Leukämie-Zellen empfindlich gegenüber niederfrequenten Ultraschall (23,5 kHz) ist, und dass diese Empfindlichkeit kann deutlich durch die Anwendung von antineoplastischen Mitteln, die das Zytoskelett 15 stören erhöht werden. Ferner haben wir gezeigt, dass Zellen beschädigt werden vorzugsweise anhand von Größe, mit größeren Zellen, die eine höhere Ultraschallempfindlichkeit. Außerdem sind normale menschliche hämatopoetische Stammzellen (hHSCs) und Leukozyten bei vergleichbaren Zellgrößen wesentlich beständiger gegen Beschallung als ihre Pendants neoplastischen 15 vorläufig darauf hindeutet, dass Niederfrequenz-Ultraschall kann verwendet werden, um bösartige Zellen zu beschädigen bevorzugt in Gegenwart von normalem Gewebe.

Zur weiteren Untersuchung der einzigartigen propschaften von Niederfrequenz-Ultraschall für mögliche therapeutische Anwendung haben wir Reinigungs- und Stabilisierungsverfahren entwickelt, um die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit einer unserer aktuellen Beschallungssystemen zu erhöhen, die Branson Modell SLPE 150 W, 40 kHz Zellaufschlussgerät, mit einem 20 mm Horn ausgestattet ausgestattet in einen 7,62 cm Tasse. Darüber hinaus haben wir in der Lage, genaue Proben Kavitation Energien sowie konsequente Wellenformen und Amplituden innerhalb der 40 kHz-Bereich mit einer Kavitation Meter und Oszilloskop mit Hydrophon zu bestimmen. Durch Raffination und Systematisierung unserer Protokolle, konnten wir die Konsistenz in unsere experimentellen sonications etablieren, so dass wir quantitativ vergleichen die sonic Empfindlichkeit von Tumorzellen und normalen Zellen verschiedener histogenetischen Abstammungslinien. Unser Protokoll für die 40 kHz-System wird in umfangreichen Detail, um für interessierte Laboratorien der Lage ist, vergleichbare Experimente zu sein und unsere Ergebnisse der antineoplastischen Wirkungen durch ausgelöst bewerten vorgestelltNiederfrequenz-Ultraschall. Außerdem prüfen wir die dosisabhängige Wirkung von Methyl-β-Cyclodextrin (MeβCD; Abbildung 1), einen Cholesterin-abbauende Mittel, auf die Erhöhung der Empfindlichkeit des Ultraschall U937 und THP1 menschliche monozytäre Leukämie-Zellen.

Protocol

1. Reinigung Zell Sonifier-System

  1. Reinigen Sie die Verbindung zwischen dem Horn und dem Wandler unter Verwendung von Chloroform und einem Tupfer aus Baumwolle. Tragen Sie eine dünne Öl oder Mineralöl auf das Gewinde des Horns und Konverter, um Ablagerungen von Metallspänen, Rost oder Oxidation weiter zu entfernen.
  2. Verwenden Chloroform, um das Öl und andere Verunreinigungen aus der Union nach dem Wischen Sie die Gewinde mit Öl zu entfernen.

2. Zusammenbau des Zell Sonifier und Einrichten des Systems

  1. Bringen Sie die Hupe, um den Konverter. Richtig Drehmoment des Systems den montierten Wandler und das Horn aus der Becheranordnung durch Ziehen des Horns aus dem Boden der Schale (2A). Legen Sie einen Slot Schlüssel innerhalb einer der drei kleinen Öffnungen in der Nähe der Spitze des Wandlers (2B). Dann positionieren Sie einen Drehmomentschlüssel mit einem ½ Zoll Luft Fuß auf dem geschlitzten Teil des Horns (2B) ausgestattet. Ziehen Sie in standard Uhrzeigersinn, bis der Drehmomentmesser liest 54,23 N. m (2C), das Drehmoment durch den Hersteller 16 empfohlen. Den angezogen Wandler und Horn wieder in die Tasse, und montieren Sie die Hupe und Konverter, um einen Ring Stand in einer aufrechten Position. Bringen Sie den Konverter an das Netzteil, bevor Sie das System für die experimentelle Impuls Dosierung.
  2. Stellen Sie das System für die Pulsdosierung mit 1 sec der Beschallung mit 1 s zwischen den Impulsen. Unterschiedlichen Dosierungs Modelle können für andere experimentelle Bedingungen verwendet werden. Viele Variablen, wie Wasservolumen und dem Horndurchmesser würde möglicherweise erfordern Änderungen an dieser Dosierung. Verwendung der vorgenannten Zellprobentypen, Volumen und Konzentration haben empirische Daten und Beobachtung der Formulierung dieser Dosierungsregime geführt.
  3. Das System an der gewünschten Amplitude. In diesem Protokoll verwenden 33% und 50% Amplitude, um eine vollständige Zell-Zerstörung, die die Wirksamkeit sonosensit machen würde, zu verhindernstalter schwer oder gar nicht zu messen.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden die Amplituden miteinander verglichen werden.

3. Bewertung Systemvoraussetzungen Intensität und Funktion

  1. Halten Sie die Kavitation Messer 1,5 cm, der die Höhe der Probe Beschallen ist. Beachten Sie die Messwerte in die Beurteilung der System bei einer erwarteten Intensität ausgeführt wird. Mit dem aktuellen System und Wasserstände, zwischen 100-110 W / cm 2 für 33% Amplitude und 115-125 W / cm 2 für 50% Amplitude erwartet. Beachten Sie die Kavitation Zählerstände aus dem Zähler-Display, das Kavitationsenergie in W / cm 2 direkt repräsentiert. Nehmen Sie diese Messwerte an der Oberfläche des Wassers, und sicherzustellen, dass keine Luftblasen in das Gesicht des m-Sonde vorhanden sind.
    Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Verfahren ohne die Kappe für den Zugriff über das Horn getan. Sie brauchen nicht nach jeder Beschallung wiederholt werden. Vielmehr sollten sie nur nach der Reinigung, Zusammenbau und Einrichten des Systems durchgeführt werden. Legen Sie das Hydrophon in einem Probengefäß mit 12,5 ml Wasser, um das Hydrophon-Sensor vollständig einzutauchen. Hängen Sie das Hydrophon mit dem Ringständer.
  2. Befestigen Sie das Hydrophon an den Eingang des Oszilloskops, um die Wellenformeigenschaften zu bewerten. Untersuchen Sie das Oszilloskop für eine klare Sinuswelle, wie anomale Wellen können die Frequenz des Systems aus den Angaben des Herstellers zu verändern. Sowohl die Kavitation Meter Oszilloskop und geben einen Frequenzmesswert, sondern nur das Oszilloskop wird aberrant Wellen, die von guter fehlerhafte System oder unsachgemäße Montage sind zu zeigen.

4. Herstellung von Zellen und Medium

  1. Vorbereiten des Mediums unter Verwendung von 240 ml Iscove modifiziertem Dubecco-Medium (IMDM) und 50 ml fetalem Rinderserum. Auftauen nicht fötalem Rinderserum in einem heißen Wasserbad, da eine rasche Zunahme der Temperatur kann zu einem Kompromiss in Serumstabilität führen. 240 ul kombiniert Gentamicin 50 mg / ml und 5 ml Penicillin/ Streptomycin 100x in einer Standard-Kulturflasche, und fügen Sie dem Medium. Lagern Sie das Medium bei 4 ° C.
  2. Samen U937 Zellen bei ~ 4 × 10 4 Zellen / ml in einem 25 cm 2 -Kolben unter Verwendung der hergestellten Mediums. Beurteilen Zellen für die Konzentration und die Lebensfähigkeit unter Verwendung eines Zellzählers TC20 und Trypanblau-Ausschluss, indem 15-20 ul Zellen und 15-20 ul Trypanblau in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Mischen des Inhalts. Pipette15-20 ul dieser Mischung in eine TC20 Probenahmerutsche, und initiieren zählt, indem Sie den Schieber in die TC20 Zellzähler.
  3. Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2, und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau-Ausschluss und die TC20 Zellzähler. Wenn die Zellen in einer geeigneten Konzentration und / oder die mit sonosensitizers für einen angemessenen Zeitraum, Transfer 3 ml von Zellen aus der Kulturflasche mit einer 20 ml Glasszintillationsröhrchen behandelt. In diesem Protokoll wachsen U937-Zellen für 48 Stunden und dann mit 0,5, 1 zu behandeln,oder 5 mM MeβCD 30 min ausreichend das Cholesterin, Zellen vor der Ultraschallbehandlung zum Abbau.

5. Zell Beschallung

  1. Degas entionisiertem destilliertem Wasser mit einem Staubsauger und Buchner-Kolben. Übertragen die Wasser der Schale Horn und füllen bis zu einem Niveau von 15 mm über der Oberseite des Horns. Beschallungsprozesses bewirkt eine weitere Entgasung des Wassers für eine Zeitdauer von wenigen Minuten und kann zu Inkonsistenzen im Laufe des Versuchs führen, wenn das System nicht laufen vor Beschallung abzutasten. Daher führen Sie das System für ca. 7 Min vor der Ultraschallbehandlung zu probieren.
  2. Befestigen Sie die Szintillationsfläschchen mit den Zellen an der Haltevorrichtung. Befestigen Sie dann die Haltevorrichtung an der Oberseite der Schale Horn und auf eine Höhe von 15 mm von der Spitze des Horns (an der Wasseroberfläche mit Hilfe des Schiebemechanismus) eingestellt.
  3. Die Zellen werden typischerweise mit Ultraschall behandelt unter Verwendung von drei 1 sec Impulse von Ultraschall mit 1 sec Abstand zwischen jedem dieser Impulse. DafürProtokoll Sonikat Zellen bei 33% und 50% Amplitude mit der oben genannten Stoßdosierung.

6. Die Beurteilung Cells für Schäden Post-Beschallung

  1. Beurteilen Sie die suspendierten Zellen auf Beschädigungen und die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau und das TC20 Zellzähler. Darüber hinaus analysieren die Probe unter Verwendung eines Zählers Z2. Für Z2 Zähler-Analyse, Pipette 100 ul Zellsuspension in 20 ml isotonischer Kochsalzlösung (200: 1-Verhältnis). Vor der Analyse, spülen Sie die Öffnung des Z2 Teilchenanalysator mindestens zweimal mit isotonischer Kochsalzlösung. Legen Sie die Z2 Probe in der Gegenhalter und die Plattform, um die Öffnung zu erhöhen vor Einleitung zählt.
  2. Erwerben Sie die Daten aus den TC20 und Z2-Zähler unter Verwendung von Software, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Analysieren dieser Daten für eine Zellschädigung, die Lebensfähigkeit und die Schaffung von Zelltrümmern von Beschallung.

7. XTT Assay zur Zelllebensfähigkeit ermitteln und mitochondriale Aktivität der behandelten U937 und THP1 Cells

  1. Prior den XTT-Assays wachsen U937 und THP1-Zellen unter den gleichen Bedingungen. Vorzubehandeln Zellen mit dem gleichen Konzentrationsbereich von MeβCD für 30 min vor der Ultraschallbehandlung. Verwenden Sie dieselben Ultraschallparameter wie zuvor, außer dass Zellen werden jetzt mit einer Reihe von 1-3 sec ein Impulse beschallt Abstand einer Sekunde auseinander, um eine Reihe von Schäden für die XTT-Kit zu beurteilen, zu entwickeln.
    Hinweis: Viele dieser Schritte werden direkt aus dem Kit Handbuch XTT genommen und werden nur für die Bequemlichkeit der interessierten Laboratorien wiederholt.
  2. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 10 min. Resuspendieren Zellpellet in Wachstumsmedium zuvor beschrieben. Die Zellen bei ~ 1 x 10 5 Zellen / ml. Seed U937-Zellen mit 100 ul pro Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Mikrotiterplatte in dreifacher Ausfertigung, und wiederholen Sie dann für THP1 Zellen mit einem separaten 96-Well-Platte. Zählen 3 Kontrollvertiefungen, die 100 & mgr; l von kompletten Wachstumsmedium allein als leere Absorptionswerte. Dann bebrüten die beimpften Platten für 24 Std.
  3. Abzutauen zwei Aliquots des XTT-Reagenz und dem Aktivierungsreagenz bei 37 ° C vor der Verwendung. Swirl Teilmengen vorsichtig, bis klare Lösungen erhalten. 0,1 ml des Aktivierungsreagenz bis 5,0 ml der XTT-Reagenz, das ausreichend aktiviert XTT-Lösung für eine 96-well Mikrotiterplatte Assay bildet. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Platte.
  4. Dann werden 50 ul der Aktiv XTT Lösung in jede Kammer. Gibt die Platte an der Zellkultur CO 2 Inkubator für 2 Std. Schütteln Sie die Platte vorsichtig nach der Inkubationszeit zu verteilen die orange Farbe in den positiven Vertiefungen. Die Extinktion der Testvertiefungen mit den Zellen und den leeren Hintergrund Kontrollvertiefungen bei einer Wellenlänge zwischen 450 bis 500 nm Wellenlänge mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät.
  5. Entweder Null die Mikrotiterplatten-Lesegerät mit den leeren Kontrollvertiefungen oder subtrahieren ihr Mittelwert aus den spezifischen Ergebnisse. Die Absorption aller Testvertiefungen wieder auf einem wavelength zwischen 630-690 nm und subtrahieren Sie die Werte aus den 450-500 nm erhalten Werte. Hinweis: Diese zweite Absorptionsbestimmung hilft dabei, nicht-spezifische Messwerte von den Testergebnissen. Das XTT-Assay wurde viermal für beide Zelllinien wiederholt.

Representative Results

Ausfallsicherheit ist von größter Bedeutung bei der Beschaffung wiederholbare und zuverlässige Ergebnisse. Das korrekte Drehmoment Spezifikation 54.23 N. M erreicht richtige Kopplung des Wandlers und Sonotrode 2, wobei die Konsistenz der Wellenform durch die Verwendung eines Oszilloskops und Hydrophon (3A) beurteilt. 3B zeigt Messungen in der Probenampulle und 3C bewertet Stabilitäts innerhalb der Schale Horn. Wie erwartet, wurde die Amplitude etwas reduziert aufgrund einiger Energie durch das Glas absorbiert wird. Jedoch wurde die Wellenform nicht gestört oder in beiden Panel B oder C, die für eine zuverlässige Lieferung von Ultraschallenergie zu der Probe erforderlich ist, verzerrt. Eine Wellenform, die nicht als eine klare Singular Sinuswelle scheint zeigt eine fehlerhafte Wandler oder unsachgemäße Installation. Dies ist in Figur 3D der mehrere aberrant Wellen zeigt, klarer Abwesenheit einer Sinuswelle ausgedrückt, und eine Frequenz Lesung Nrt mit einem ordnungsgemäß funktionierenden System zu erwarten. Kavitation Zählwerk die Kavitationsenergie erzeugt (Figur 4) zu messen fanden die Schallintensität auf 100-110 W / cm 2 bei 33% Amplitude und 125-130 W / cm 2 bei 50% Amplitude.

Sobald die 40 kHz-System wurde entsprechend kalibriert und in ihrer Gesamtheit (5) zusammengebaut wurde zuverlässige Zellzerstörung leicht erreicht, da sowohl von den TC20 und Z2-Zähler (6) bestimmt. Wie erwartet, wurde umfangreicheren Zellschäden in Zellpopulationen, auf 50% mit Ultraschall behandelt, anstatt bei 33% Amplitude beobachtet. Nichtsdestotrotz ist 33% Amplitude, die als Ausgangspunkt für potenzielle sonic sensibilisierende Wirkung der verabreichten Mittel zu erfassen, wie es sichtbare Schäden erzeugt, sondern lässt Raum für weitere Schäden festgestellt, wenn Mittel werden angewendet, um ihre Potenzierung der Ultraschallempfindlichkeit zu bewerten. Dies ist in 7A gezeigt, wo dasdosisabhängige Wirkung von MeβCD auf Potenzierung der Ultraschallempfindlichkeit von U937-Zellen präsentiert werden. Obwohl nicht-beschallte MeβCD behandelten Zellen wurden in Fähigkeit sehr ähnlich zu nicht-beschallte, unbehandelte Zellen, die Tragfähigkeit deutlich sank, nachdem drei Impulse von 1 s 40 kHz Ultraschall angewendet wurde. Darüber hinaus scheint die Abnahme der Lebensfähigkeit nach Beschallung dosisabhängig sein können, wie 5 mM MeβCD erzeugt das größte Abfall der Zellzahl, gefolgt von 1 mM, und 0,5 mM MeβCD.

Ähnliche Wirkungen auf die Zelllebensfähigkeit und mitochondriale Aktivität wurden in beiden U937 und THP1-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an MeβCD vor Beschallung behandelt wurden, wie mit dem XTT-Kit (7B) beurteilt beobachtet. Obwohl THP1 Zellen zu sein scheinen etwas Schall resistenter als U937-Zellen werden beide menschlichen Leukämie-Linien in einer dosisabhängigen Art und Weise beschädigt wird. Höhere Konzentrationen von MeβCD und mehr Impulse von Ultraschall produced die niedrigste Reduktion von XTT zu einem löslichen, bunten Orangen derivative sowohl U937 und THP1 Zellen, was die Lebensfähigkeit der Zellen und mitochondriale Aktivität zu senken.

Abbildung 1
Abbildung 1. Molekülstruktur methyl- β-Cyclodextrin ist. (A) vollständige Struktur methyl-β-Cyclodextrin (MeβCD). (B) ein Polymer ist MeβCD sieben Wiederholungseinheiten mit einer Gruppe R entweder für H oder CH 3 ist. Molekülformel: C 56 H 98 O 35. Molekulargewicht = 1331,36.

Figur 2
Abbildung 2. Richtig Anziehhülse die 40 kHz-Ultraschallsystem. (A) Die Hupe und Wandler werden aus der Tasse pri entferntoder Anziehhülse. (B) Positionieren Sie den Schlitzschraubenschlüssel und Drehmomentschlüssel auf ihren jeweiligen Positionen. (C) Anwenden 54,23 N. M des Drehmoments im Uhrzeigersinn vor Wiederanbringen des Horns und Wandler in den Becher.

Figur 3
Abbildung 3. Verwendung eines Oszilloskops, um die Wellenform des Ultraschallsystems zu charakterisieren. (A) Ein Oszilloskop mit Hydrophon kann zur Amplitude und Wellenform Konsistenz zu bewerten. (B) Eine Aufnahme mit der Tasse direkt über dem Horn bei 1,5 cm entnommen und bei 33% Amplitude eingestellt. (C) Die Wellenform hier dargestellt wird, aus der Lektüre erworben, wenn das Hydrophon in der 20 ml Glasszintillationsröhrchen platziert. Das Fläschchen wird bei 1,5 cm über dem Horn positioniert und erneut bei 33% Amplitude eingestellt. (D) ein Oszilloskop Bildschirm ofa-System mit abweichenden Frequenzen, wie es bei einem fehlerhaften System oder unsachgemäße Kopplung der Hornwandler Union erwarten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Verwendung einer Kavitation Messer, um die Schallintensität der Ultraschallsystem zu charakterisieren. Die Kavitation meter hier gesehen wird verwendet, um Kavitation Energie in W / cm 2 darstellen. Dies ist ein sehr wichtiges Instrument zur Bestimmung der Konsistenz von Energie mit Bezug auf die Probe.

Figur 5
Abbildung 5: Die wichtigsten Komponenten des 40 kHz-Ultraschallsystem. Das Ultraschall-System wird komplett mit Schale Horn gezeigt ( (B), der Wandler (C) und der Probenpositionierungsmechanismus (D). Dieses Design erlaubt eine einfache Positionierung der Probe (E) oberhalb des Horns (F).

Figur 6
Abbildung 6. Effekte der verschiedenen Ebenen der Amplitude auf der Ultraschall-Lyse von U937-Zellen mit den TC20 und Z2 Zähler. Zellen wurden mit dem 40 kHz-Zelle Dismembrator bei 33% Amplitude (100-110 W / cm 2) bzw. 50% Amplitude (125-130 W / cm 2) unter Verwendung von drei 1 sec Impulse von Ultraschall beschallt, mit 1 sec Abstand zwischen jedem dieser Impulse. (A) Ein Screenshot von der Z2-Zähler-Software zeigt die Wirkung von Ultraschall auf U937-Zellen. (B) Die Daten der TC20 Zähler wurden in einem Graphen kompiliert, um die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses zu demonstrierens. Diese Daten gehören die Gesamt und Live-Zellzahlen, sowie die Trypanblau beurteilt die Lebensfähigkeit der Zellen. Bars spiegeln die Standardfehler des Mittelwertes (SEM) für 4 unabhängige Zellpopulationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7 Auswirkungen von methyl- β-Cyclodextrin auf Potenzierung der Ultraschallempfindlichkeit von U937 und THP1-Zellen. (A) U937-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von MeβCD 30 Minuten, bevor sie mit 40 kHz Ultraschall (105 W / cm 2 beschallt behandelten ) mit drei 1 sec Impulsen im Abstand von 1 Sekunde auseinander. Zellpopulationen wurden in ≥12 ≥17 um und um gruppiert. (B) oder THP1 U937 Zellen wurden erneut mit unterschiedlichen concent behandeltRationen MeβCD 30 Minuten, bevor es mit dem 40 kHz-System unter Verwendung von 1-3 Impulsen von 1 sec Ultraschall beschallt im Abstand von 1 Sekunde auseinander. Die Lebensfähigkeit der Zellen und Mitochondrien-Aktivität wurden mit dem XTT-Kit bewertet. 100 ul Zellen wurden pro Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Mikrotiterplatte ausgesät. Die Platte wurde 24 h vor der Zugabe von XTT-Lösung inkubiert. Zellen wurden dann für weitere 2 Stunden inkubiert, bevor die Wellenlänge gelesen wurde. Bars spiegeln SEM für 4 unabhängige Zellpopulationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie besonders vorsichtig, sorgfältig zu positionieren, die Probe und reinigen Sie die Konverter-horn Union. Das Platzieren des Musters in dem Horn ist wichtig für den Erhalt von konsistenten Zellzerstörung als Veränderung des Abstands von der Hupe des akustischen Brennpunkten zu ändern, und deshalb verändern die Energie, die der Probe ausgesetzt ist. Die akustische Energie innerhalb des Bechers Horn kann mit der Kavitation Messer, um die Position der maximalen Kavitation finden abgebildet werden. Darüber hinaus sind die Kavitation Messer zusammen mit dem Oszilloskop von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung der Schallintensität der Zellen, die zu belichtende sowie die Homogenität der Wellenform. Deshalb sollten diese Instrumente verwendet werden, um Probleme mit dem System zu erfassen, und um festzustellen, was zur Fehlerbehebung benötigt werden, um Systeminstabilität zu korrigieren werden.

Wie bereits erwähnt, kann die Niederfrequenzsystem zur weiteren Entgasung während des Experiments, wenn nicht für das Wasser laufen zu handelnEinige Minuten vor der Ultraschallbehandlung zu probieren. Dieser Initiallauf durchgeführt werden muss, um eine relativ entgast Beschallung Medium und damit konsistente Ergebnisse bei Versuchen ergeben. Zusätzlich können Zellen, sollte nicht bei oder nahe der maximalen Amplitude bei der Beurteilung der Wirksamkeit von sonosensitizers, da das wahre Ausmaß der Sensibilisierung wäre schwierig zu beurteilen, beschallt werden. Verwenden von 33% Amplitude auf der 40 kHz-System ist ein idealer Ort, da es bemerkenswerte Schäden produziert, aber bietet sonosensitizers reichlich Platz, um ihre Wirksamkeit zu demonstrieren, wie mit MeβCD gegen U937 und THP1 Zellen (Abbildung 7) gezeigt. Diese Daten bestätigen, dass MeβCD sensibilisiert mehrere Leukämie Leitungen Niederfrequenz-Ultraschall in einer dosisabhängigen Weise.

Es wurden eine Reihe von Experimenten mit einer höheren Frequenz im Bereich von 0,75 MHz bis 8 MHz die Anzeichen von Intra Kavitationsblasen geführt wird durch Beschallung 17-19 erzeugt. Allerdings questions immer noch in Bezug auf die genaue Mechanismus der Ultraschall-induzierte Zelllyse 18 verbleiben. Wir haben einen Zusammenhang zwischen Wirbel das Zytoskelett gezeigt und unter Verwendung niederfrequenter Ultraschall 15, ein Phänomen, das von anderen Laboratorien 20 zeigten erhöhte Schallempfindlichkeit 21. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Mikrofilament-stören Mittel wie Cytochalasin B potenzieren Ultraschallempfindlichkeit in mehreren Leukämie Linien, aber nicht hHSCs oder Leukozyten 22, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Aktin-Polymerisation kann ein sonosensitizing Mechanismus von besonderem Interesse sein. Wir haben auch beobachtet, dass Vincristin, ein Mikrotubuli-unterbrechenden Substanzen, die Tubulin-Polymerisation 23, 24 verhindert, deutlich erhöht die Ultraschallempfindlichkeit verschiedener Leukämietypen in vitro einschließlich akute myeloische Leukämie, chronische myeloische Leukämie und akute lymphatische Leukämie. Dagegen Zytoskelett-gerichtete Mittel, die Zytoskelett-Komponenten zu stabilisieren (Paclitaxel eind Jasplakinolid) erscheinen Zellen resistent gegenüber Ultraschallbehandlung, durch niedrigere Zelllyse 22 reflektiert zu machen. Zusammengenommen zeigen diese Daten die Hypothese, dass die Komponenten des Cytoskeletts von neoplastischen Zellen Fluidisierung ist in der Tat ein wichtiger Faktor bei der Erhöhung der Wirksamkeit von SDT 25. Die vorliegende Studie zeigt auch, dass Cholesterinabbau kann ein anderes Verfahren, mit dem weiteren potenzieren die Ultraschall Empfindlichkeit neoplastischer Zellen, wie MeβCD behandelten U937 Zellen merklich zu 40 kHz Ultraschall sensibilisiert werden.

Während unsere Beschallung Protokolle deutliche antineoplastische Aktivität in vitro gezeigt, wird die aktuelle Methode auf die Verwendung in der Kultur und kleinen Wirbeltiermodelle, die in der Lage, in den für die Beschallung verwendeten Phiolen passen zu arbeiten. Wir haben gezeigt, daß Zebrafisch kann sicher mittels gepulster niederfrequenter Ultraschall (20 kHz) mit Ultraschall behandelt werden gezeigt, und dass ihre Toleranz gegenüber Chemotherapeutika sind quantitativ vergleichbarDosen von murinen Modellen 26 toleriert, was darauf hindeutet, dass die Tumor-tragenden Zebrafisch in vorläufigen Untersuchungen verwendet, um die in vivo antineoplastische Aktivität dieser Protokolle zu beurteilen. Dennoch Verabreichung chemotherapeutische Mittel vor dem Beschallen von Säugetiermodellen hat im MHz-Bereich 1 berichtet worden, und solche Protokolle können wahrscheinlich erweitert niederfrequenter Ultraschall, sowie Cholesterin-abbauenden und Zytoskelett-gerichtete Mittel einzuarbeiten.

Potentielle klinische Anwendungen dieser Form kann es sich um SDT extrakorporalen Blut Beschallung in dem antineoplastischen Mittel werden intravenös (iv) vor dem Blut, die für Ultraschallbehandlung 25 entfernt. Diese Methode entfernt potenziellen Lärmschutzwände durch die menschliche Anatomie gestellt und kann ein wirksames Mittel, um Leukämiezellen sowie Metastasen von soliden Tumoren zu beschädigen. Es ist auch möglich, dass Cholesterin abbauenden und Zytoskelett gerichtete Agenten könntenin HIFU-Protokolle, die bereits in der Klinik, in einem Versuch, um die Wirksamkeit dieser Behandlungsmodalität verbessern sucht werden, verwendet werden.

Die in der vorliegenden Studie beschriebenen Verfahren sind in der Lage, der Bewertung von potenziellen sonosensitizers und weitere System Verfeinerung kann dieses Dienstprogramm zu verbessern. Allerdings gibt es viele Variablen, um bei der Verwendung solcher Ultraschall entwirft, einschließlich Stromversorgungsqualität, Akustik Brennpunkte, und individuelle Unterschiede zwischen den Wandlern zu berücksichtigen. Daher wird die zukünftige Forschung auf die Visualisierung der Schallwellen und das Verständnis ihres Einflusses auf Ergebnisse zu konzentrieren. SDT gezeigt Zelllyse in vitro zu verbessern und kann sich als klinisch brauchbare wenn mehr in-vivo-Daten in Säugermodellen erfasst werden zu können. Experimenten, die andere potenziell nutzbaren Eigenschaften von malignen Zellen, sowie verschiedene kombinierte Modalitäten mit mehreren Agenten und Ultraschall weiter in unserem Labor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

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References

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