Génération et analyse quantitative des pulsé basse fréquence échographie pour déterminer la sensibilité de Sonic traité et non traité cellules néoplasiques

1Department of Biology, Syracuse University
Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Ultrason se réfère à toute onde de pression sonore oscillant avec une fréquence supérieure à la limite supérieure des capacités auditives de l'homme (~ 20 kHz) 1. Ultrasons à basse fréquence dans la plage de 20 à 60 kHz a été utilisée en laboratoire en tant que moyen de génération d'émulsions, pour la préparation d'échantillons cellulaires extraction d'acide nucléique, pour la rupture des tissus, et pour une variété d'autres essais. L'utilité des ultrasons à basse fréquence a également été étendue à l'environnement industriel pour la soudure, nettoyage divers matériaux, et dans le traitement des matériaux. Disponibles dans le commerce générateurs d'ultrasons viennent dans des fréquences allant de 18 à 60 kHz, et à grande échelle des puissances de 100-1,200 W.

Bien que les ultrasons est utilisé depuis longtemps dans le cadre clinique pour l'imagerie diagnostique, elle a été appliquée comme une modalité thérapeutique que récemment. Ultrason ≥1 MHz est capable de perturber toute sécurité calculs urinaires (calculs rénaux) et calculs biliaires (pierres dans ee vésicule biliaire ou du foie) chez les patients à réduire les symptômes 2,3. Cette approche appelée lithotripsie extracorporelle par ondes (LEC) est maintenant largement appliquée dans la clinique (plus d'un million de patients sont traités chaque année avec la LEC aux États-Unis à eux seuls 4), et offre une modalité par laquelle la non-invasive briser calculs avec minimum de dommages collatéraux grâce à l'utilisation de appliqué à l'extérieur, concentré, haute intensité des impulsions acoustiques 2-4.

En raison des forces uniques directs de cisaillement, ainsi que des bulles de cavitation générées par ultrasons de haute intensité, ces méthodes ont été examinés dans le traitement du cancer pour le traitement du carcinome de la prostate résistant à la castration et l'adénocarcinome du pancréas dans une approche connue sous le nom de haute intensité ultrasons focalisés (HIFU ) 8/5. D'une manière très similaire à la LEC, HIFU utilise plusieurs faisceaux d'ultrasons et les concentre sur une zone focale sélectionnée pour générer des températures de 60 ° C ou higelle par l'utilisation de l'énergie acoustique, ce qui induit une nécrose de coagulation dans le tissu ciblé 5. Bien que d'autres modalités d'ablation thermique existent actuellement (ablation par radiofréquence et micro-ondes ablation), HIFU offre un net avantage sur ces méthodes en ce qu'elle est la seule modalité hyperthermique non-invasive 5. HIFU a atteint des résultats mitigés dans la clinique et est actuellement disponible uniquement dans les essais cliniques 8-11. Cependant, le succès limité qu'il a atteint, et la très prometteuse dans les données acquises in vivo à partir de modèles de mammifères précliniques ont démontré le potentiel des ultrasons dans le traitement du cancer.

Dans un effort pour améliorer HIFU, les chercheurs ont tenté de combiner l'échographie avec des agents antinéoplasiques appropriées pour générer une forme de sonochemotherapy. Thérapie sonodynamique (SDT) est un roman modalité de traitement prometteuse qui a démontré une activité antinéoplasique impressionnante à la fois in vitro et 1. Il a été montré que les ultrasons préférentiellement dommages des cellules malignes basé sur la différence de taille entre ces cellules et celles de 1,5 histologie normale. SDT incorpore des agents spécialisés appelés sonosensibilisateurs pour accroître l'étendue des dommages préférentiel exercée par ultrasons contre les cellules néoplasiques. Alors que les applications thérapeutiques de SDT ont été examinées précédemment, des systèmes à ultrasons utilisés emploient généralement plus élevés ultrasons de fréquence (≥1 MHz), et les effets de la faible fréquence kHz échographie n'a pas encore été pleinement explorées. Les basses fréquences de l'échographie sont souvent plus aptes à la production de cavitation inertielle, un phénomène qui se traduit par la destruction des cellules due à l'effondrement rapide des microbulles, provoquant des dommages physico 12-14. Cette différence dans la génération de la cavitation inertielle entre MHz et bas ultrasons kHz a été attribuée au fait que les fréquences d'ondes inférieures permettent de microbulless plus de temps à se développer par diffusion rectifiée dans le cycle d'expansion de la moitié, en produisant par conséquent effondrements les plus violents au cours de la demi-cycle de compression qui suit 12.

Nous avons précédemment montré que les cellules leucémiques monocytaires humaines U937 sont sensibles aux ultrasons à basse fréquence (23,5 kHz), et en ce que cette sensibilité peut être nettement augmenté grâce à l'application d'agents antinéoplasiques qui perturbent le cytosquelette 15. En outre, nous avons démontré que les cellules endommagées sont préférentiellement basés sur la taille, avec des cellules plus grandes présentant une sensibilité supérieure à ultrasons. En outre, les cellules humaines normales souches hématopoïétiques (de hHSCs) et les leucocytes dans des tailles de cellules comparables sont beaucoup plus résistants à une sonication que leurs homologues néoplasiques 15, ce qui indique à titre provisoire que ultrasons à basse fréquence peut être utilisé pour endommager de manière préférentielle les cellules malignes en présence de tissu normal.

Pour examiner davantage le pilier unique,proprié- de ultrasons à basse fréquence pour une utilisation thérapeutique potentielle, nous avons développé des procédures de nettoyage et de stabilisation pour augmenter l'efficacité et la fiabilité de l'un de nos systèmes de sonication actuelles, le Branson Modèle SLPE 150 W, 40 kHz cellulaire Disrupter, équipé d'un avertisseur sonore de 20 mm équipé en 7,62 cm tasse. En outre, nous avons été en mesure de déterminer précises énergies échantillon de cavitation, ainsi que des formes d'ondes cohérentes et d'amplitude dans la plage de 40 kHz à l'aide d'un mètre de cavitation et l'oscilloscope avec hydrophone. Par raffinage et systématiser nos protocoles, nous avons été en mesure d'établir une cohérence dans nos sonications expérimentales, ce qui nous permet de comparer quantitativement les sensibilités sonores de cellules néoplasiques et normales de différentes lignées histogénétiques. Notre protocole pour le système de 40 kHz est présenté de façon très détaillée pour que les laboratoires intéressés à être capable de réaliser des expériences comparables, et d'évaluer nos conclusions des effets antinéoplasiques provoquées parultrasons à basse fréquence. En outre, nous examinons les effets de doses dépendantes de méthyl-β-cyclodextrine (MeβCD; Figure 1), un agent de cholestérol appauvrissant, sur l'augmentation de la sensibilité des ultrasons U937 et THP1 cellules leucémiques monocytaires humaines.

Protocol

1. Nettoyage cellulaire Système Sonifier

  1. Nettoyez l'union entre la corne et le convertisseur en utilisant le chloroforme et un tampon de coton. Appliquer une huile légère ou de l'huile minérale pour les fils de la corne et le convertisseur pour éliminer davantage l'accumulation de copeaux métalliques, de rouille ou oxydation.
  2. Utilisez chloroforme pour éliminer l'huile et d'autres contaminants de l'union après avoir essuyé les discussions avec de l'huile.

2. Remontage la Cellule Sonifier et Configuration du Système

  1. Remettez la corne au convertisseur. Pour serrer correctement le système, retirez le convertisseur assemblé et de la corne de l'ensemble de coupe en tirant la corne sur le fond de la tasse (figure 2A). Placer une clé à fente à l'intérieur de l'un des trois petits trous à proximité de la partie supérieure du convertisseur (figure 2B). Ensuite, placez une clé dynamométrique équipé d'un pied de ½ pouce corneille sur la partie de la corne fendue (figure 2B). Serrer en sTANDARD sens horaire jusqu'à ce que le compteur de couple lit 54,23 N. m (figure 2C), le couple recommandé par le fabricant 16. Monter le convertisseur resserré et de la Corne de retour dans la tasse, et monter la corne et le convertisseur à un stand de l'anneau dans une position verticale. Remettez le convertisseur à l'alimentation électrique avant de mettre le système à des fins expérimentales dosage d'impulsion.
  2. Réglez le système pour le dosage de l'impulsion à l'aide d'ultrasons 1 sec avec 1 sec entre les impulsions. Différents modèles de dosage peuvent être utilisées pour d'autres conditions expérimentales. De nombreuses variables, telles que le volume d'eau et le diamètre de la corne seraient potentiellement exiger des modifications à ce dosage. Utilisation des types mentionnés ci-dessus de l'échantillon cellulaire, le volume et la concentration, et l'observation des données empiriques ont conduit à la formulation de ce schéma posologique.
  3. Ajuster le système à l'amplitude souhaitée. Dans ce protocole, utiliser 33% et 50% d'amplitude pour empêcher la destruction complète des cellules, ce qui rendrait l'efficacité de sonosensitsateurs difficiles ou impossibles à évaluer.
    NOTE: Dans cette étude, les amplitudes sont comparées.

3. Évaluer l'intensité du système et Fonction

  1. Tenez le lecteur de cavitation à 1,5 cm, ce qui est le niveau de l'échantillon ultrasons. Notez les lectures d'évaluer que le système fonctionne à une intensité attendue. En utilisant les niveaux du système et de l'eau actuels, attendre entre 100-110 W / cm 2 pour 33% d'amplitude et de 115-125 W / cm 2 pour 50% d'amplitude. Notez le relevé des compteurs cavitation de l'affichage du compteur qui représente l'énergie de cavitation en W / cm 2 directement. Prenez ces lectures à la surface de l'eau, et de veiller à l'absence de bulles sont présents à la surface de la sonde mètres.
    NOTE: Il est important de noter que ces procédures sont effectuées sans le capuchon pour l'accès au dessus de la corne. Ils ne doivent pas être répétées après chaque traitement par ultrasons. Au contraire, ils doivent être réalisées uniquement après le nettoyage, remontage, et la mise en place du système. Placez l'hydrophone dans un flacon d'échantillon contenant 12,5 ml d'eau pour immerger complètement le capteur de l'hydrophone. Suspendre l'hydrophone utilisant le support de l'anneau.
  2. Fixez l'hydrophone à l'entrée de l'oscilloscope afin d'évaluer les caractéristiques de forme d'onde. Examinez l'oscilloscope pour une onde sinusoïdale clair, comme des vagues aberrantes peuvent modifier la fréquence du système à partir des spécifications du fabricant. Tant le compteur de cavitation et l'oscilloscope donnent une lecture de fréquence, mais seulement l'oscilloscope montrera vagues aberrantes qui sont révélatrices d'un système défectueux ou un montage incorrect.

4. Préparation des cellules et le milieu

  1. Préparer le milieu en utilisant 240 ml de modification de Dubecco moyenne (le) de IMDM Iscove et 50 ml de sérum de veau fœtal. Ne décongelez pas de sérum de veau foetal dans un bain d'eau chaude, les hausses rapides de température peuvent conduire à un compromis dans la stabilité du sérum. Moissonneuse 240 ul de gentamicine 50 mg / ml et 5 ml de pénicilline/ Streptomycine 100x dans un flacon de culture standard, et ajouter au milieu. Conserver le milieu à 4 ° C.
  2. Graine cellules U937 à 4 x 10 ~ 4 cellules / ml dans un ballon de 25 2 cm en utilisant le milieu préparé. Évaluer les cellules de concentration et de viabilité en utilisant un compteur de cellules TC20 exclusion au bleu Trypan et en plaçant 15 à 20 pi de cellules et de 15 à 20 pi de bleu de trypan dans un tube de micro-centrifugeuse et mélanger le contenu. Ul Pipette15-20 de ce mélange dans un échantillonnage lame de TC20, et d'initier les chiffres en plaçant la lame dans le compteur de cellules TC20.
  3. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, et vérifier la viabilité des cellules en utilisant l'exclusion au bleu trypan et le compteur de cellules TC20. Lorsque les cellules sont à une concentration appropriée et / ou ont été traités avec sonosensibilisateurs pour un laps de temps approprié, le transfert de 3 ml de cellules du flacon de culture à 20 ml flacon à scintillation en verre. Dans ce protocole, cultiver des cellules U937 pendant 48 heures, puis traiter avec 0,5, 1,ou MeβCD 5 mM pendant 30 min à épuiser suffisamment le cholestérol des cellules avant la sonication.

5. Cellule Sonication

  1. Degas déminéralisée, eau distillée en utilisant un vide et Buchner flacon. Transférer l'eau à la corne de tasse, et de remplir à un niveau de 15 mm sur le dessus de la corne. Le processus de sonication provoque en outre le dégazage de l'eau pour une période de quelques minutes, et peut conduire à des incohérences au cours de l'essai si le système n'a pas été exécutée avant la sonication de l'échantillon. Par conséquent, le système de fonctionner pendant environ 7 minutes avant sonication déguster.
  2. Attacher le flacon à scintillation contenant les cellules pour le dispositif de maintien. Ensuite, fixez le dispositif de maintien au sommet de la corne de bocal et réglez une élévation de 15 mm à partir du haut de la corne (à la surface de l'eau en utilisant le mécanisme coulissant).
  3. Les cellules sont typiquement traitées par ultrasons en utilisant une trois impulsions d'ultrasons sec, avec une seconde espacement entre chacune de ces impulsions. Pour çaprotocole, les cellules sonication à 33% et de 50% d'amplitude en utilisant le dosage d'impulsions précité.

6. Évaluation de cellules pour les dommages post-traitement aux ultrasons

  1. Évaluer les cellules en suspension pour les dommages et la viabilité à l'aide de bleu trypan et le compteur de cellules TC20. En outre, l'analyse de l'échantillon en utilisant un compteur Z2. Pour Z2 contre-analyse, la pipette une cellule suspension de 100 ul dans 20 ml de solution saline isotonique (200: 1 ratio). Avant l'analyse, rincer l'ouverture de l'analyseur de particules Z2 au moins deux fois en utilisant une solution saline isotonique. Placer l'échantillon Z2 dans le contre-support, et d'élever la plate-forme à l'ouverture avant de lancer chefs d'accusation.
  2. Acquérir les données des compteurs TC20 et Z2 en utilisant le logiciel fourni par le fabricant. Analyser ces données pour les dommages cellulaires, la viabilité et la création de débris cellulaires de sonication.

7. XTT Test pour déterminer la viabilité cellulaire et l'activité mitochondriale du traité U937 et des cellules THP1

  1. Prior pour les essais de XTT, U937 et THP1 croître les cellules dans les mêmes conditions. Pré-traiter les cellules avec la même gamme de concentration de 30 min pour MeβCD avant sonication. Utilisez les mêmes paramètres d'ultrasons comme avant, sauf que les cellules sont maintenant traitées par ultrasons en utilisant une gamme de 1-3 l'un des impulsions sec espacés l'un sec à part pour développer une gamme de dommages pour le kit XTT à évaluer.
    Note: Plusieurs de ces mesures sont prises directement à partir du manuel du kit XTT et ne sont répétés pour la commodité des laboratoires intéressés.
  2. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 10 min. Resuspendre le culot cellulaire dans le milieu de culture précédemment décrit. Resuspendre les cellules à 1 x 10 ~ 5 cellules / ml. cellules U937 de semences à 100 pi par puits dans une plaque à 96 puits de microtitrage à fond plat, en trois exemplaires, puis répétez pour THP1 cellules en utilisant une plaque de 96 puits séparé. Inclure les 3 puits témoins contenant 100 ul de milieu de croissance complet comme seul lectures d'absorbance à blanc. Ensuite, incuber les plaques inoculées pour 24 h.
  3. Dégivrage deux aliquotes du réactif XTT et le réactif d'activation à 37 ° C avant utilisation. Aliquotes agiter doucement jusqu'à ce que des solutions claires sont obtenues. Ajouter 0,1 ml de réactif d'activation à 5,0 ml du réactif XTT, qui forme suffisamment de solution XTT activé pour une essai de 96 puits de plaque de microtitrage. Répétez le processus pour l'autre plaque.
  4. Ajouter 50 ul de la solution activée par XTT dans chaque puits. Retourner la plaque pour la culture de cellules de l'incubateur CO 2 pendant 2 heures. Secouer doucement la plaque suivant la période d'incubation pour répartir uniformément la couleur orange dans les puits positifs. Mesurer l'absorbance des puits d'essai contenant les cellules et les puits témoins vierges de fond à une longueur d'onde entre la longueur d'onde de 450 à 500 nm en utilisant un lecteur de plaque de microtitrage.
  5. Soit zéro, le lecteur de plaques de microtitrage en utilisant les puits témoins à blanc ou soustraire la valeur moyenne à partir des résultats spécifiques. Mesurer l'absorbance de tous les puits d'essai dans un nouveau wavelenge entre 630 à 690 nm et soustraire les valeurs à partir des valeurs de 450 à 500 nm obtenus. Remarque: Cette seconde détermination de l'absorbance permet d'éliminer les mesures non spécifiques à partir des résultats de dosage. Le test XTT a été répétée quatre fois pour les deux lignées cellulaires.

Representative Results

La stabilité du système est primordiale pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Le couple de serrage approprié de 54,23 N. M obtenue accouplement correct du transducteur et la sonotrode 2, ayant la consistance de la forme d'onde en cours d'évaluation à l'aide d'un oscilloscope et hydrophone (figure 3A). La figure 3B représente des mesures à l'intérieur du flacon d'échantillon, et Figure 3C évalue la stabilité dans la corne de tasse. Comme prévu, l'amplitude a été légèrement réduite en raison d'une énergie étant absorbée par le verre. Cependant, la forme d'onde n'a pas été perturbé ou déformé de panneau soit B ou C, ce qui est nécessaire pour la livraison fiable de l'énergie sonique à l'échantillon. Une forme d'onde qui ne semble pas comme une onde sinusoïdale singulière clair indique un transducteur défectueux ou une mauvaise configuration. Cela est exprimé dans la figure 3D qui montre de multiples vagues aberrantes, une absence évidente d'une onde sinusoïdale, et une fréquence de lecture past attend avec un système qui fonctionne correctement. Le compteur de cavitation utilisé pour mesurer l'énergie de cavitation généré (Figure 4) a constaté l'intensité sonore d'être 100-110 W / cm 2 à 33% d'amplitude, et de 125-130 W / cm 2 à 50% d'amplitude.

Une fois que le système 40 kHz a été étalonné de manière appropriée et assemblé dans sa totalité (figure 5), la destruction des cellules fiable a été facilement atteint, tel que déterminé par les deux compteurs TC20 et Z2 (figure 6). Comme prévu, plus étendue des dommages aux cellules a été observée dans des populations de cellules traitées aux ultrasons à 50%, plutôt qu'à 33% d'amplitude. Néanmoins, 33% d'amplitude est utile comme point de départ pour détecter les effets potentiels sonore de sensibilisation des agents administrés, car il produit des dommages visibles, mais laisse de la place pour plus de dégâts à détecter lorsque les agents sont appliqués pour évaluer leur potentialisation de la sensibilité à ultrasons. Ceci est démontré dans la figure 7A, où laeffets dépendants de la dose de MeβCD sur potentialiser la sensibilité à ultrasons de cellules U937 sont présentés. Bien que les cellules traitées MeβCD non-traitées aux ultrasons ont été très semblables à la viabilité de cellules non traité aux ultrasons, non traités, la viabilité a diminué de façon marquée au bout de trois impulsions d'une seconde ultrasons 40 kHz a été appliquée. En outre, la diminution de la viabilité après sonication semble avoir été dose-dépendants, comme mM MeβCD 5 produit la plus forte baisse du nombre de cellules, suivie par 1 mM, puis 0,5 mM MeβCD.

Des effets similaires sur la viabilité des cellules et l'activité mitochondriale ont été observés dans les cellules U937 et THP1 qui ont été traitées avec des concentrations variables de MeβCD avant sonication, comme évalué avec le kit XTT (figure 7B). Bien que les cellules THP1 semblent être légèrement plus résistantes que les cellules U937 sonique, les deux lignes de leucémie humaine sont endommagées d'une manière dépendant de la dose. Des concentrations plus élevées de MeβCD et plusieurs impulsions d'ultrasons produced la plus basse de réduction de XTT, un dérivé d'orange brillamment colorée soluble à la fois pour les cellules U937 et THP1, correspondant à diminuer la viabilité des cellules et l'activité mitochondriale.

Figure 1
Figure 1. Structure moléculaire du méthyl β-cyclodextrine. (A) la structure complète de méthyl-β-cyclodextrine (MeβCD). (B) est un polymère MeβCD de sept unités récurrentes avec un groupe R soit H ou CH 3. Formule moléculaire: C 56 H 98 O 35. Poids moléculaire = 1331,36.

Figure 2
Figure 2. radiculaire correctement le système à ultrasons de 40 kHz. (A) La corne et le convertisseur sont retirés de la pri tasseou radiculaire. (B) la position de la clé de fente et une clé dynamométrique à leurs positions respectives. (C) Appliquer 54,23 N. M de couple dans le sens des aiguilles d'une montre avant de rebrancher la corne et le convertisseur à la tasse.

Figure 3
Figure 3. L'utilisation d'un oscilloscope pour caractériser la forme d'onde du système à ultrasons. (A) Un oscilloscope avec hydrophone peut être utilisé pour évaluer la cohérence amplitude et la forme d'onde. (B) Un enregistrement avec la Coupe directement au-dessus de la corne à 1,5 cm et fixé à 33% d'amplitude. (C) La forme d'onde en photo ici est d'une lecture acquise lors de l'hydrophone est placé dans le 20 ml flacon à scintillation en verre. Le flacon est positionné à 1,5 cm au-dessus de la corne et de nouveau fixé à 33% d'amplitude. (D) Un oscilloscope o capture d'écransystème fa avec des fréquences aberrantes comme on pourrait s'y attendre avec un système défectueux ou le couplage abusif de l'union de convertisseur de corne. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Utilisation d'un appareil de mesure de la cavitation pour caractériser l'intensité du son du système à ultrasons. Le compteur de cavitation vu ici est utilisé pour représenter l'énergie de cavitation en W / cm 2. Ceci est un instrument très important pour évaluer l'uniformité de l'énergie par rapport à l'échantillon.

Figure 5
Figure 5. Les principales composantes du système à ultrasons de 40 kHz. Le système à ultrasons est représenté avec la corne de tasse ( (B), le convertisseur (C), et un mécanisme de positionnement de l'échantillon (D). Cette conception permet un positionnement facile de l'échantillon (E) ci-dessus la corne (F).

Figure 6
Figure 6. Les effets de différents niveaux d'amplitude sur la lyse par ultrasons de cellules U937 en utilisant les compteurs TC20 et Z2. Les cellules ont été soniquées avec le désintégrateur 40 kHz cellulaire à 33% d'amplitude (100 à 110 W / cm 2) ou 50% d'amplitude (125 à 130 W / cm 2) en utilisant trois impulsions de 1 s d'ultrasons, avec une distance de seconde entre chaque de ces impulsions. (A) montre l'effet de sonication sur des cellules U937 Une copie d'écran à partir du logiciel de compteur Z2. (B) Les données du compteur TC20 ont été compilées dans un graphique pour démontrer la reproductibilité du résultats. Ces données comprennent le nombre de cellules totales et en direct, ainsi que le bleu trypan évalué la viabilité cellulaire. Bars reflètent l'erreur standard de la moyenne (SEM) pour 4 populations de cellules indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Effets de méthyl β-cyclodextrine sur la potentialisation de la sensibilité à ultrasons de cellules U937 et THP1. (A) cellules U937 ont été traitées avec une concentration variant de MeβCD pendant 30 minutes avant d'être soumis à une sonication avec 40 kHz ultrasons (105 W / cm 2 ) en utilisant trois impulsions de 1 s 1 s espacée de l'autre. Les populations de cellules ont été regroupés en ≥12 um et ≥17 um. (B) des cellules U937 ou THP1 ont de nouveau été traités avec concent variablerations de MeβCD pendant 30 minutes avant d'être soumis à une sonication avec le système de 40 kHz en utilisant des impulsions d'une 3/1 sec 1 sec ultrasons espacés à part. La viabilité cellulaire et l'activité mitochondriale ont été évalués avec le kit XTT. 100 ul de cellules ont été ensemencées par puits dans une plaque à 96 puits de microtitrage à fond plat. La plaque a été incubée pendant 24 heures avant l'addition de solution XTT. Les cellules ont été ensuite incubées pendant 2 h de plus avant de la longueur d'onde a été lu. Bars reflètent SEM pour 4 populations de cellules indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Pour atteindre des résultats optimaux, une attention particulière doit être prise pour positionner soigneusement l'échantillon et nettoyer l'union convertisseur corne. Le placement de l'échantillon dans la corne est important pour l'obtention de la destruction des cellules cohérente, que de changer la distance de la corne va modifier les foyers acoustique, et donc modifier l'énergie de l'échantillon est exposé. L'énergie acoustique dans la corne de coupe peut être mappé en utilisant le compteur de cavitation pour trouver la position de la cavitation maximale. En outre, l'appareil de mesure de la cavitation, en même temps que l'oscilloscope sont essentiels pour déterminer l'intensité du son, les cellules sont exposés à, ainsi que l'homogénéité de la forme d'onde. Par conséquent, ces instruments doivent être utilisés pour détecter des problèmes avec le système, et aider à déterminer ce qui peut être nécessaire dépannage pour corriger une instabilité du système.

Comme mentionné précédemment, le système à basse fréquence peut agir en outre pour dégazer l'eau tout au long de l'expérience si pas fonctionner pourplusieurs minutes avant de déguster ultrasons. Cette course initiale doit être effectuée pour obtenir un milieu de sonication relativement dégazé et résultats ainsi cohérents au cours des expériences. En outre, les cellules ne doivent pas être exposés à des ultrasons à ou près de l'amplitude maximale lors de l'évaluation de l'efficacité de sonosensibilisateurs, comme la véritable mesure de la sensibilisation serait difficile à évaluer. En utilisant 33% d'amplitude sur le système de kHz 40 est un cadre idéal, car elle produit des dommages importants, mais fournit sonosensibilisateurs amplement d'espace pour démontrer leur efficacité, comme l'a démontré avec MeβCD contre U937 et les cellules THP1 (figure 7). Ces données confirment également que MeβCD sensibilise plusieurs lignes de leucémie à ultrasons à basse fréquence d'une manière dépendant de la dose.

Il ya eu un certain nombre d'expériences effectuées avec une fréquence plus élevée de l'ordre de 0,75 MHz à 8 MHz présentant des signes de bulles de cavitation intramembranaires étant généré par ultrasons 17-19. Cependant, questioNS resterait en ce qui concerne le mécanisme exact de la lyse cellulaire induite par échographie-18. Nous avons montré un lien entre la fluidisation du cytosquelette et une sensibilité accrue sonore utilisant ultrasons à basse fréquence 15, un phénomène démontré par d'autres laboratoires 20, 21. En outre, nous avons constaté que les agents de microfilaments perturbateurs tels que la cytochalasine B potentialisent la sensibilité à ultrasons dans la leucémie multiples des lignes, mais pas hHSCs ou les leucocytes, ce qui suggère que 22 l'inhibition de la polymérisation de l'actine peut être un mécanisme de sonosensitizing un intérêt particulier. Nous avons également observé que la vincristine, un agent de microtubules perturbateurs qui inhibe la polymérisation de la tubuline 23, 24, augmente nettement la sensibilité à ultrasons de différents types de leucémie in vitro, y compris la leucémie myéloïde aiguë, la leucémie myéloïde chronique, et la leucémie lymphoïde aiguë. En revanche, les agents du cytosquelette dirigée qui stabilisent les composants du cytosquelette (paclitaxel und jasplakinolide) semble rendre les cellules résistantes à ultrasons, reflétée par la baisse des taux de lyse cellulaire 22. Pris ensemble, ces données soutiennent l'hypothèse que les composants du cytosquelette fluidification des cellules néoplasiques est en effet un facteur important dans l'augmentation de l'efficacité de la SDT 25. La présente étude démontre également que le cholestérol épuisement peut être un autre procédé permettant de potentialiser encore la sensibilité des cellules néoplasiques à ultrasons, que les cellules U937 MeβCD-traitées sont nettement sensibilisés à ultrasons 40 kHz.

Alors que nos protocoles de sonication ont démontré une activité antinéoplasique marquée in vitro, la méthode actuelle est limitée à travailler dans la culture et petite vertébrés modèles qui sont en mesure d'adapter dans les flacons utilisés pour ultrasons. Nous avons montré que le poisson zèbre peut être soumis à une sonication par impulsions en toute sécurité à l'aide des ultrasons à basse fréquence (20 kHz), et en ce que sa tolérance aux agents chimiothérapeutiques est quantitativement comparable àdoses tolérées par les modèles murins, ce qui suggère que 26 porteur d'une tumeur du poisson zèbre peuvent être utilisés dans investigations préliminaires pour évaluer l'activité antinéoplasique in vivo de ces protocoles. Néanmoins, l'administration d'agents chimiothérapeutiques avant sonication de modèles de mammifères a été rapporté dans la gamme MHz 1, et ces protocoles peut probablement être étendue à incorporer ultrasons à basse fréquence, ainsi que le cholestérol de l'ozone et des agents du cytosquelette dirigée.

Applications cliniques potentielles de cette forme de traitement spécial et différencié peuvent impliquer extracorporelle sonication de sang dans lequel des agents antinéoplasiques sont administrés par voie intraveineuse (iv) avant le sang étant enlevés pour traitement par ultrasons 25. Cette méthode supprime les barrières sonores potentiels posés par l'anatomie humaine, et peut être un moyen efficace pour endommager explosions leucémiques, ainsi que les métastases de tumeurs solides. Il est également possible que le cholestérol de l'ozone et des agents du cytosquelette dirigée pourraitêtre utilisés dans des protocoles de HIFU qui sont déjà en cours d'examen dans la clinique dans une tentative d'améliorer l'efficacité de cette modalité de traitement.

Les méthodes décrites dans la présente étude sont capables d'évaluer la valeur de sonosensibilisateurs potentiels, et l'affinement du système peut améliorer cet utilitaire. Cependant, il ya beaucoup de variables à prendre en considération lors de l'utilisation de tels legs ultrasons, y compris la qualité de l'alimentation, des foyers acoustique, et la variation individuelle entre les convertisseurs. Par conséquent, la recherche future se concentrera sur la visualisation des ondes sonores et de comprendre leur influence sur les résultats. SDT a montré pour améliorer la lyse cellulaire in vitro et peut se révéler cliniquement viable si plus des données in vivo dans des modèles de mammifères sont acquis. Des expériences portant sur d'autres caractéristiques potentiellement exploitables de cellules malignes, ainsi que diverses modalités combinés impliquant plusieurs agents et les ultrasons continuent dans notre laboratoire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33, (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179, (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174, (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15, (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4, (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110, (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11, (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29, (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23, (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5, (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65, (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19, (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32, (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34, (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30, (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84, (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8, (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11, (95), 20140071 (2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17, (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11, (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28, (6), 1021-1031 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics