Метод исследования небных Fusion использует статический органной культуре

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Исследования развития нёба мотивированы заболеваемости нёба, врожденным дефектом, что накладывает огромное бремя для здоровья и может оставить прочный увечья. Мы демонстрируем здесь технику к культуре небных полки, которые могут быть использованы для изучения различных сигнальных путей, участвующих в развитии небной и слияния.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Заячья губа и Вкус являются одними из наиболее распространенным из всех врожденных дефектов. Вторичные нёба формы из мезенхимальных полках, покрытые эпителием, что придерживается формирования срединной линии эпителия шов (МЭС). Теории предполагают, что ЭСК следовать эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT), апоптоза и миграции, делая слитый небо 1. Полный распад МЧС является окончательным важным этапом небного слияния с окружающей мезенхимальные клетки. Мы предлагаем способ неба органной культуре. Разработанная в протоколе экстракорпорального позволяет изучение биологических и молекулярных процессов во время слияния. Приложения этой техники являются многочисленными, в том числе оценке реакции на экзогенные химические вещества, воздействию нормативных и факторов роста и специфических белков. Небных культура орган имеет ряд преимуществ, включая манипуляции на разных стадиях развития, что не возможно при использовании в естественных исследований.

Introduction

Орофациальные щели являются наиболее преобладающие черепно-лицевые врожденные дефекты. Кроме того, принимая во внимание все возможные дефекты черепно-лицевых, это второй наиболее распространенной аномалией рождении у новорожденных 2. Расщелиной неба возникают примерно в 1 из каждых 700 рождений в Соединенных Штатах Америки (США) каждый год заболеваемость нёба равна 475 детей, рожденных с расщелиной неба в месяц или 15 детей с расщелинами в день 3. Примерно 1% детей рождается во всем мире каждый год, обнаруживают некоторую форму черепно дисморфологии.

Трещины на небе и губы нужно очень дорогое и сложное процедуру с пожизненными последствиями для пациентов, которые имеют эту аномалию. Ориентировочная стоимость для каждого пациента с устным щели примерно $ 100,000 4. Лечение пациента с расщелиной губы и неба требует команда врачей, включая черепно-лицевых хирургов, оториноларингологов, генетиков, анестезиологов,Речь языке патологи, диетологи, ортодонты, prosthodontists, психологи, нейрохирурги, офтальмологи и.

В palatogenesis, то вторичное нёбо возникает парных выростов, которые изначально растут вертикально и проходят небной повышение годности выше спинки языка. После возвышения, парные небные в полки расти к средней линии (в E14.5 -E15 у мышей и неделю 9 в человека). Медиальный край эпителий (МЭА), которое охватывает наконечник годности придерживается формирования срединной линии эпителия шов.

Это сопровождается эпителиальных к мезенхимальных перехода и / или апоптоза, чтобы мезенхимальных слияния. Адгезия противной МЕЕ является важным событием которого изменение вызывает нёба. Тем не менее, лишь немногие исследования исследовали начальную адгезию небных полках 5. Твердое небо формы по дифференциации мезенхимальных клеток в остеобласты. Аномальная развитие неба может производить Клефт неб с или без участия губ.

Методы Вкус органов культуры были широко используется на протяжении многих лабораториях в течение последних 30 лет 6,7.

В этом протоколе мы опишем в деталях метод рассечения небной и статического органной культуры. Преимущество неподвижной органной культуры является то, что она позволяет небные полки на предохранитель. Этот метод был успешно использован в нашей лаборатории в течение многих термоядерных и сигнализации экспериментов 8,9. Однако объем техники обширна и может быть использован, когда система статического органной культуре требуется, включая оценку реакций на экзогенные химические агенты, эффекты регуляторных факторов роста в различных путей и специфических белков.

фигура 1
Рисунок 1. Мышь Palatogenesis. Стадии развития мышей неба. (БФ) Сканирование элеctron микрофотографии (SEM) вторичного нёба в представительных раз в развитии. Красные стрелки показывают: первоначальную часть небной адгезии и слияния. Желтые стрелки: Точка в пространстве между первичными и вторичными гурманов, которые исчезают после слияния (перепечатано из Kaufman 11 с разрешения PLoS One).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами для использования позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения местного Комитета Уходу за животными и использование.

1. Подготовка рассекает инструменты и культуры Медиа

  1. Предварительной стирки все инструменты, которые будут использоваться в диссекции с 3% перекиси водорода, а затем автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин. Фильтр BGJb СМИ с антибиотиками и противогрибкового раствора с использованием размера пор фильтра с вакуумным всасыванием в капюшоне 0,22 мкм.

2. Подготовка культуры оборудование

  1. Вырезать из поликарбоната мембранные фильтры, которые будут поддерживать небные органы в небольших треугольников, спрей с 70% -ным спиртом и дайте им высохнуть. Подготовка Центр-Ну органной культуре блюдо (60x15 мм) путем размещения чистую и стерилизованную равносторонний треугольный проволочной сетки (20 мм) над органной культуры пластины. Затем заполните колодец с 1 мл ВGJB медиакультуры СМИ. ПРИМЕЧАНИЕ: СМИ должны быть достаточными для достижения уровня сетки, не погружая вкусы. Поместите мембранные фильтры, блестящей стороной вниз, на верхней части сетки (3-4 мембраны в сетке) .Depending на эксперимента, лечение (белки, антитела или ингибиторы) могут быть добавлены в средствах массовой информации

3. эмбриона мыши Сбор и подготовка по культуре

  1. Чтобы получить диких эмбрионов мыши типа, использование приурочен 13,5 беременную компакт-1 мыши генетический фон штамма. Очистите рассечение зона с 70% этанола.
    Примечание: Другие штаммы мышей могут быть использованы. Мы предпочитаем CD-1 мышей из-за большего количества мусора.
  2. Эвтаназии беременных мышей на E13.5 DPC (дней после полового акта) с 5% Isoflurane последующим смещением шейных позвонков, чтобы застраховать смерть с использованием утвержденных протоколов.
  3. Спрей 70% этанола на брюшной брюшной поверхности, чтобы избежать брюшной волос палку к инструментам. Затем откройте брюшной полости вентральноИспользуя острый тупой-эксплуатационные ножницы и микро-рассечение пинцет, чтобы найти матку. Используя пинцет, поднимите весь матку и отделить его от тела за счет сокращения на теле матки и на кончиках рогов матки с легкой эксплуатации ножниц.
  4. Поместите матку на чистую бумажным полотенцем со льдом (По словам гида протокола для ухода и использования лабораторных животных). Обложка матку с другом чистым бумажным полотенцем, чтобы предотвратить загрязнение. Стерилизовать инструменты, используя 70% этанола спрей перед дальнейшим использованием. Матка и эмбрионы могут быть доставлены в лабораторию на льду.
  5. В открытом капоте ламинарного потока, тщательно сделать небольшое отверстие в желточного мешка с использованием острыми тупым операционные ножницы и микро-рассечение пинцет. Сделать открытие шире и затем слегка прижмите его к экстериоризоваться эмбрион от желтка.
  6. Передача эмбрионы сразу в чашку Петри с холодной фосфатно-солевом буфере 1X (PBS), рН 7,4. Для обеспечения надлежащего этап, эксамин эмбрион под микроскопом рассекает на тела, размер головы и конечностей морфологии.
    Примечание: Эмбрионы, которые не в нужное стадии развития не использовали для эксперимента.

Рисунок 2
Рисунок 2. конечностей Бад Морфология. Передняя и задние конечности проверяются на соискание ученой степени лямки отступа между цифрами. В E13.5, все цифры сгущения заметным, с лямки и дистальных углубления между цифрами появляются очень различны. Задние цифры позади полдня 12 Верхний ряд:. Передней конечности, нижний ряд: задних конечностей.

4. Вкус Рассечение

  1. Поместите один зародыш одновременно в чашке Петри с PBS при вскрытии микроскопом. Использование маленькие ножницы и пинцет Препаровальный отделить голову от тела эмбрионов.
  2. Осторожно держа череп мыши над уровнем глаз с щипцами (избегаяверхнечелюстной процесса) сделать два разреза на обеих сторонах линии губ. Затем снимите нижнюю челюсть и язык. Изолировать верхнечелюстной области процесса, сделав разрез на уровне глаз и удалить мозг, глаза, носовую перегородку и прилегающей ткани.

Рисунок 3
Рисунок 3. Вкус ткани собраны с 13,5 эмбрионов, когда нёбо полки были повышены, но не вступили в контакт. Небной полки были помещены в органной культуре на фильтре на границе воздушной среде в течение 72 ч в статической модели. (А) Уровень рассечение на E13.5 эмбриона. (Б) Голубой Звезды разграничить области провести ткани с щипцами во время вскрытия. (C) Вид расчлененных небных полках, расположенных на трапеции мембраны фильтра. (D) Боковой вид культуры блюдо после размещения расчлененный вкусы и добавление питательных сред.

  1. Поместите небной устное стороной вверх и снимите носовой перегородки и ткани вокруг нее, сохраняя основной вкус придает помочь ориентировать его от задней к передней. Используйте ложку шпателем и тщательно передать небные полки (носовые стороной вниз) на подготовленные фильтров на сетках в культуре блюда. ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка громкости СМИ для обеспечения надлежащего интерфейса воздушных средств массовой информации.
  2. Под стереомикроскопа, рассекают основной вкус и использовать пинцет, чтобы разместить небной полки близко друг к другу. Небной полки не расплавится, если они не находятся в контакте. Вырезать треугольную мембранный фильтр, где передняя часть неба находится. Форма трапеции поможет в локализации переднюю часть нёба.
  3. Культура небные полки по отдельности или с двумя или тремя в той же органной культуры блюдо использованием BGJb культуральной среды.

5. Культивирование мыши небных Полки

  1. Выдержите TissuES при 37 ° С в увлажненной газовой смеси (5% СО 2 и 95% воздуха) в течение 72 ч, а также изменить среду каждые 24 ч.

6. Вкус обработки для гистологического анализа

  1. Исправление вкусы после 72 ч в культуре с 4% формальдегида / фосфатно-солевом буфере O / N при 4 °   С. Затем осторожно пипетки мыть ткани в культуральной чашке с PBS. Оберните гурманов в кусок лабораторных салфеток и место в встраивания кассеты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Упаковка вкусы в лабораторных салфеток предотвратить их потерю в процессе дегидратации.
  2. Дегидрировать ткани после 70%, 80% и до 100% этанола моет в течение 1 часа, после чего в обычном порядке в парафин. Для встраивания, устанавливайте переднюю часть нёба, обращенной лоток.
  3. Вырезать последовательных 6 мкм разделы в корональной ориентации от передних к задним. Полный раздел небо даст 350-450 sectiДополнения. Пятно секции гематоксилином и эозином (Н & Е). 10 баллов каждый 20-й секции с использованием ранее описанной Среднее Fusion результат (МФС) Шкала (Таблица 1). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Техника может быть применена к различным видам experiments.The следующего исследования была разработана, чтобы проверить тератогенным эффектом никотина в пробирке на небной слияния. Два штамма мышей были использованы для этого эксперимента, CD1 и C57.Palatal ткани обрабатывали 0,06 и 6 мМ концентраци х никотина полусульфата. Было отмечено, что небные шаблоны слияния и сроки были различны в двух разных штаммов. У мышей CD1, небные полки из контрольной группы продолжили сплав по времени зависимым образом. Тем не менее, в группе, обработанной никотина задержки синтеза, особенно при 6мм концентрацией никотина (фиг.4А). Гистология разделы CD1 гурманов мыши показали общее слияние после 72 часов в контрольных образцах. При более низких дозах никотина небной полки придерживаться, но эпителиальные клетки остаются после 3 дней в культуре. Небных полки инкубировали при высоких дозах никотина не контакт после 72 часов инкубации.

(фиг.4В). Гистология разделы C57 мышей неба показали, что в группах лечения непрерывный шов эпителиальных сохраняются в средней линии. Fusion наблюдалось только в контрольной группе на 72 ч.

Мы наблюдали, что небной синтез в обоих видах мышей зависит от высоких доз никотина. Тем не менее, вкусы от C57 были более чувствительны к никотину. В заключение, наши результаты показывают, что генетический фон мышей влияет ответов никотина в небных тканей.

Рисунок 4
Два штамма неб мыши культивировали в присутствии никотина в течение 24, 48 или 72, ч. Штаммы мыши ответил на никотина в разной степени. Все вкусы воздействию высокой дозы никотина (6 мм) не сливаются и имел низкий показатель средней слияние (MFS) .Примечание, что в 24 часов, ни один из гурманов не закрыли и МФС в диапазоне от 1 (небные полки не касаясь) 3 (частичной) синтеза во всех группах. По 48 часов, многие из управления гурманов уже частично слиты (баллы) более 3 и 72 ч, вкусы CD1 были полностью слит (5 баллов), но элементы управления С57 не полностью слит (3.67). (Неопубликованные данные Мария Серрано и д-р Кэти Свобода).

Гол Критерии
1 Номера слияние с не адгезии.
2 Номера слияние с какой-то явной адгезии.
3 Адгезия с некоторым распада Ми слоев и ясной частичной мезенхимальных слияния.
4 Полное слияние с некоторых следов Ми клеток или шва оставшихся.
5 Полное слияние с каких-либо свидетельств Ми клеток или шва видимой.

Таблица 1: Среднее Fusion Счет (МФС) шкала (Кан и Свобода, 2002). Рассчитать показатели для каждого неба для передней секции (1-150), средние (150-300) Разделы и задняя (разделы 300-450). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол в этой статье предоставляет метод рассечения небные полки из эмбрионов на эмбриональной день 13,5. Небной полки из мышиных эмбрионов культивировали в бессывороточной культуральной среде в атмосфере 95% O 2 5% CO 2 при 37 ° С. Успешное небных рассечение критически зависит от нескольких факторов, на каждом шагу во время процедуры от эмбрионального время эвтаназии мышей до завершения культуры. Один из самых важных факторов, влияющих на небной слияние это время, необходимое для запуска органной культуры; эмбрионы должны быть в день эмбрионального 13,5 как вторичное нёбо полки горизонтально, но не начали сливаться (рисунок 1).

Еще одним важным пунктом во время процедуры является экстериоризации эмбрионов от желтка. Этот шаг требует большой осторожности, чтобы предотвратить повреждение лицевых структур. После того, как эмбрион удаляется из мешка, глава удаляется изорганизм и помещают в чашку Петри, чтобы быть просмотрены с помощью стереомикроскопа с волоконно-оптической подсветки с обеих сторон. Нижняя челюсть и язык удаляются, обнажая вкус. Мозг и остаточного ткань удаляются, на уровне глаз. В этот момент важно учитывать эпителиального слоя вокруг полок. Необходимо манипулировать ткани очень осторожно, чтобы сохранить целостность этих клеток. Эпителиальные клетки отвечают за соблюдение и формирования МЧС.

Каждый расчлененный неба включен устный стороной вниз, чтобы очистить любую хрящ от перегородки носа. Эта ткань на передней стороне неба и появляется белее и более конденсированных. Небной полки, свободные от нежелательных ткани перемещаются в культуральную чашку и помещают на верхнюю часть мембраны фильтра. Положение полок будет вновь установлен под стерео микроскопом рассекает. Они должны быть сдвинуты, чтобы приверженность и далее небной слияния.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
  11. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. Elsevier. (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics