Metod för att studera Palatal Fusion använder statiska orgel kultur

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Studier av gommen utveckling motiveras av förekomsten av gomspalt, en missbildning som innebär en enorm hälsa börda och kan lämna bestående vanställdhet. Vi visar här en teknik att odla palatala hyllor som kan användas för att studera olika signalvägar som är involverade i palatal utveckling och fusion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Läpp och gommen är bland de vanligaste av alla fosterskador. De sekundära gom blanketter från mesenkymala hyllor täckt med epitel som vidhäftar att bilda mittlinjen epitel sömmen (MES). Teorierna tyder på att MES celler följer en epitelial till mesenkymala övergång (EMT), apoptos och migration, vilket gör en smält gommen 1. Komplett sönderdelning av MES är den sista avgörande fasen av palatal sammanflödet med omgivande mesenkymala celler. Vi tillhandahåller en metod för gommen organodling. Den utvecklade in vitro-protokoll möjliggör studiet av de biologiska och molekylära processer under sammansmältning. De tillämpningar av denna teknik är många, bland annat utvärdera svar på exogena kemiska medel, effekter av reglerande och tillväxtfaktorer och specifika proteiner. Palatal organkultur har ett antal fördelar, inklusive hantering i olika utvecklingsstadier som inte är möjligt med in vivo-studier.

Introduction

Orofaciala klyftor är de mest dominerande kraniofaciala missbildningar. Dessutom tar i beaktande alla tänkbara kraniofaciala defekter, dessa är de näst vanligaste födelse anomali hos nyfödda 2. Gomspalt förekommer vid ungefär 1 av 700 födslar i USA (US) varje år, är förekomsten av gomspalt lika med 475 barn som föds med gomspalt per månad eller 15 barn med klyftor per dag 3. Cirka 1% av barn födda runt om i världen varje år uppvisar någon form av kraniofaciala dysmorfologi.

Klyftor av gommen och läppen behöver en mycket dyr och komplicerad procedur med livslångt konsekvenser för patienter som har denna anomali. Den beräknade kostnaden för varje patient med oral kluven är ungefär $ 100.000 4. Behandlingen av en patient med läpp- och gomspalt kräver ett team av läkare, inklusive kraniofaciala kirurger, otolaryngologer, genetiker, narkosläkare,tal språk patologer, dietister, ortodontister, protetiker, psykologer, neurokirurger och ögonläkare.

I palatogenesis uppkommer sekundära gommen såsom parade utväxter, som initialt växer vertikalt och genomgår palatal hylla höjd ovanför dorsum av tungan. Efter höjd, de parade palatala hyllorna växer mot mittlinjen (vid E14.5 -E15 hos möss och vecka 9 hos människa). Den mediala kant epitel (ANM) som täcker hyllan spetsen fastnar bildar mittlinjen epitel sömmen.

Detta följs av epitelial till mesenkymala övergång och / eller apoptos att tillåta mesenkymala sammanflödet. Adhesion av motsätta ANM är en viktig händelse vars förändring orsakar gomspalt. Men bara få studier undersökt initiala vidhäftningen av palatala hyllor 5. De hårda gom former genom differentiering av mesenkymala celler till osteoblaster. Onormal utveckling av gommen kan producera klavt smaklökar med eller utan inblandning av läppen.

Palate organodlingstekniker hade använts i stor utsträckning för många laboratorier under de senaste 30 åren 6,7.

I detta protokoll beskriver vi i detalj en metod för palatinal dissekering och statisk organkultur. Fördelen med en orörlig organkultur är att det tillåter palatinala hyllor att smälta. Denna teknik har använts med framgång i vårt laboratorium för många fusion och signaleringsexperiment 8,9. Men omfattningen av tekniken är omfattande och kan användas när statiskt organodlingssystemet krävs, inklusive utvärdering av svar på exogena kemiska medel, effekterna av regel tillväxtfaktorer i olika vägar och specifika proteiner.

Figur 1
Figur 1. Mouse Palatogenesis. Utvecklingsstadier hos mössen gommen. (BF) Scanning electron mikrofotografier (SEM) av den sekundära gommen vid representativa utvecklings gånger. Röda pilarna: visa den första delen av palatal vidhäftning och fusion. Gula pilar: peka på utrymmet mellan de primära och sekundära gommar som kommer att försvinna efter fusion (omtryckt från Kaufman 11 med tillstånd från PLoS One).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs måste utföras i enlighet med de riktlinjer och regler för användningen av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande från den lokala Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Framställning av dissekera Instrument och Odlingsmedia

  1. Förtvätt alla instrument som skall användas i dissekering med 3% väteperoxid och sedan autoklav vid 121 ° C under 20 minuter. Filter BGJb media med antibiotika och antimykotika lösningen med en 0,22 um por stora filter med vakuumsug i en huv.

2. Framställning av kultur Equipment

  1. Skär polykarbonatmembranfilter som kommer att stödja de palatala organ i små trianglar, spraya med 70% alkohol och låt dem torka. Förbered Center-Tja organodlingsskål (60x15 mm) genom att placera en ren och steriliseras liksidig triangulär trådgaller (20 mm) över organodlingsplattan. Fyll sedan brunnen med 1 ml BGJB media odlingsmedia. OBS: Medierna bör vara tillräckligt för att nå den nivå på nätet utan att dränka gommar. Placera membranfilter, blanka sidan nedåt, ovanpå gallret (3-4 membran per rutnät) .Depending om försöket, kan behandling (proteiner, antikroppar eller hämmare) tillsättas till media

3. Mouse Embryo Insamling och förberedelse för kultur

  1. För att erhålla vildtyp musembryon, tids användning 13.5 gravida CD-1 mus genetisk bakgrund stam. Rengör dissektion med 70% etanol.
    OBS: Andra stammar av möss kan användas. Vi föredrar cd-1-möss på grund av den större kullnummer.
  2. Euthanize dräktiga möss vid E13.5 DPC (dagar efter samlag) med 5% isofluran följt av cervikal dislokation att försäkra döden med godkända protokoll.
  3. Spray 70% etanol på den ventrala buken ytan för att undvika att buken håret hålla sig till instrumenten. Öppna sedan bukhålan ventraltAnvänd en vass-trubbig drifts sax och mikro dissekera pincett för att lokalisera livmodern. Med hjälp av pincett, lyft hela livmodern och skilja den från kroppen genom att skära i livmoderkroppen och tips av livmoderhornen med en lätt rörelse sax.
  4. Placera livmodern på en ren pappershandduk över is (Enligt protokollet guide för skötsel och användning av försöksdjur). Täck livmodern med en annan ren pappershandduk för att förhindra kontaminering. Sterilisera instrument som använder 70% etanol spray innan vidare användning. Livmodern och embryona kan transporteras till laboratoriet på is.
  5. I ett öppet laminärt flöde huva, försiktigt göra en liten öppning i gulesäcken med hjälp av skarpa trubbig drifts sax och mikro dissekera pincett. Gör öppningen bredare och sedan tryck försiktigt att exteriorize embryot från gulesäcken.
  6. Överföra embryon omedelbart till en petriskål med kall fosfatbuffrad saltlösning (1X PBS), pH 7,4. För att säkerställa riktig scen, examin embryot under ett dissektionsmikroskop för kroppen, huvudstorlek och lem morfologi.
    OBS: Embryon som inte i rätt utvecklingsstadium inte används för experimentet.

Figur 2
Figur 2. Limb Bud Morphology. Den främre och bakbenen kontrolleras för graden av bandet fördjupning mellan siffrorna. Vid E13.5, alla siffer kondensation är framträdande, med bandet och distala fördjupningar mellan Talen mycket tydlig. De bakre siffrorna är kvar av en halv dag 12 Övre raden:. Forelimb, nedre raden: bakben.

4. Smak Dissektion

  1. Placera ett embryo åt gången i en petriskål med PBS under dissekera mikroskop. Med små dissekera sax och pincett separera huvudet från kroppen av embryona.
  2. Försiktigt hålla musen kraniet ovanför ögonhöjd med pincett (undvikandemaxillary processen) göra två snitt på båda sidor av läppkanten. Ta sedan bort underkäken och tungan. Isolera maxillary processområdet genom att göra ett snitt i ögonhöjd och avlägsna hjärna, ögon, nässkiljeväggen och omkringliggande vävnader.

Figur 3
Figur 3. Palate vävnad som samlats in från 13,5 embryon, när gommen hyllorna hade förhöjda, men inte tagit kontakt. De palatala hyllorna placerades i organkultur på ett filter vid luft media gränssnitt för 72 timmar i den statiska modellen. (A) Nivå dissekering på E13.5 embryo. (B) Blue stjärnor avgränsa områden för att hålla vävnaden med pincett under dissektion. (C) Vy över dissekerade palatala hyllor placeras på en trapetsfiltermembranet. (D) från sidan odlingsskål efter placering av dissekerade gommar och tillsättning av odlingsmedier.

  1. Placera palatinala oral sida upp och ta bort näsans skiljevägg och vävnaden runt det, hålla det primära gommen bifogas hjälpa orientera det från främre till bakre. Använd en sked spatel och mycket noggrant överföra palatala hyllorna (nasal nedåt) till de framställda filtren gallren i odlingsskålar. OBS: Justera volymen av media för att möjliggöra ordentlig luft media gränssnitt.
  2. Under stereomikroskop, dissekera den primära gommen och använda pincett för att placera palatala hyllorna nära varandra. De palatala hyllorna kommer inte smälta om de inte placeras i kontakt. Skär den triangulära membranfilter där den främre delen av gommen är belägen. Den trapetsoid form kommer att hjälpa till att lokalisera den främre delen av gommen.
  3. Kultur palatala hyllorna individuellt eller med två eller tre i samma organodlingsskål med hjälp BGJb odlingsmedier.

5. Odling Mus Palatal Hyllor

  1. Inkubera tissues vid 37 ° C i en fuktad gasblandning (5% CO2 och 95% luft) under 72 h, och ändra mediet varje 24 timmar.

6. Palate Behandling för histologisk analys

  1. Fäst smaklökar efter 72 timmar i kultur med 4% formaldehyd / fosfatbuffrad saltlösning O / N vid 4 °   C. Sedan försiktigt med en pipett tvätta vävnaden i kulturen skålen med PBS. Wrap gommarna i en bit av laboratorie våtservetter och plats i bädda kassetter.
    OBS: Inslag gommarna i laboratorie våtservetter förhindra deras förlust under dehydratiseringsprocessen.
  2. Dehydratisera vävnad efter 70%, 80% och upp till 100% etanol tvättar för en timme, följt av den vanliga paraffininbäddning förfarande. För inbäddning, placera den främre delen av gommen mot facket.
  3. Skär Serial 6 pm avsnitt i koronala orientering från främre till bakre. En komplett avsnitt gom kommer att ge 350-450 avsons. Färga sektioner med hematoxylin och eosin (H & E). 10 Värdering varje 20: e avsnittet med hjälp av den tidigare beskrivna Mean sammansmältningsresultat (MFS) skalan (tabell 1). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tekniken kan användas för olika typer av experiments.The följande studie var utformad för att testa den teratogena effekten av nikotin in vitro på palatal fusion. Två stammar av möss användes för detta experiment, var CD1 och C57.Palatal vävnad som behandlats med 0,06 och 6 mM koncentrationer av nikotin hemisulfat. Det konstaterades att palatala fusions mönster och timing var olika i de två olika stammar. I CD 1-möss, palatinala hyllor från kontrollgruppen fortsatte fusion i tidsberoende sätt. Men i den behandlade gruppen nikotin fördröjd fusions särskilt vid 6 mM nikotinkoncentration (figur 4A). Histologi delar av CD 1 mus gommar visade total fusion efter 72 timmar i kontrollprover. Vid lägre doser av nikotin de palatinala hyllorna vidhäftar men epitelcellerna kvar efter 3 dagar i kultur. Palatal hyllor inkuberade vid höga doser av nikotin inte ta kontakt efter 72 timmar av inkubation.

(Figur 4B). Histologi delar av C57 möss gommar visade att behandlingsgrupperna en kontinuerlig epitel söm framhärdade i mittlinjen. Fusion iakttogs bara i kontrollgruppen vid 72 h.

Vi konstaterade att palatal fusion i båda typerna av möss har påverkats av höga doser av nikotin. Men gommar från C57 var klokare att nikotin. Sammanfattningsvis, våra resultat visar att genetisk bakgrund av möss påverkar nikotinsvar hos palatala vävnader.

Figur 4
Två stammar av mus gommar som odlats i närvaro av nikotin för 24, 48 eller 72 h. De musstammar svarade på nikotinet i olika grad. Alla gommar utsätts för hög dos av nikotin (6 mM) misslyckades med att smälta och hade låg medel fusion poäng (MFS) .Note att vid 24 timmar, hade ingen av gommar stängd och MFS varierade från 1 (palatala hyllor inte röra) till 3 (partiell smältning) i samtliga grupper. Med 48 timmar, många av de kontrollsmaklökar hade delvis smält (poäng över 3) och med 72 timmar, ades CD1 smaklökar helt smält (poäng av 5), men C57 kontroller hade inte helt smält (3,67). (Opublicerade data från Maria Serrano och Dr Kathy Svoboda).

Värdering Kriterier
1 Icke-fusion med någon vidhäftning.
2 Icke-fusion med viss uppenbar vidhäftning.
3 Vidhäftning med viss sönderdelning av ANM skikt och tydlig partiell mesenkymala konfluens.
4 Fullständig sammansmältning med några spår av ANM celler eller söm kvar.
5 Fullständig sammansmältning utan några tecken på ANM celler eller sömmen synlig.

Tabell 1: Mean Fusion Score (MFS) skalan (Kang och Svoboda, 2002). Beräkna poängen för varje smak för den främre (avsnitt 1-150), mellersta (avsnitt 150-300) och bakre (avsnitt 300-450). 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet i denna artikel ger en metod för att dissekera palatala hyllor från embryon på embryonala dag 13,5. Palatal hyllor från musembryon odlades i ett serumfritt odlingsmedium i en atmosfär av 95% O2 5% CO2 vid 37 ° C. Framgångsrik palatal dissektion är kritiskt beroende på flera faktorer vid varje steg under förfarandet från embryonala tiden för euthanized mössen för fullbordandet av kulturen. En av de viktigaste faktorerna som påverkar palatal fusion är den tid det tar att starta organkultur; embryon måste vara på embryonala dag 13,5 som de sekundära gommen hyllorna är horisontella, men har inte börjat att smälta (Figur 1).

En annan kritisk punkt under förfarandet är exteriorisering av embryon från gulesäcken. Detta steg kräver stor omsorg för att undvika skador på ansiktet strukturer. När embryot tas bort från säcken, är huvudet avlägsnas frånkroppen och placeras i en petriskål som skall betraktas med ett stereomikroskop med fiberoptisk belysning från båda sidor. Underkäke och tungan avlägsnas, exponerar i gommen. Hjärnan och vävnadsrester avlägsnas i ögonhöjd. Vid denna punkt är det viktigt att beakta de epiteliala skikt runt hyllorna. Det är nödvändigt att manipulera vävnaden mycket noggrant för att hålla integriteten hos dessa celler. Epitelceller är ansvariga för vidhäftning och bildning av MES.

Varje dissekerade gommen vänds oral nedåt för att rengöra någon brosk från nässkiljeväggen. Denna vävnad är på den främre sidan av gommen och verkar vitare och mer kondenserad. Palatal hyllor fria från oönskad vävnad flyttas till en odlingsskål och placeras på toppen av filtermembranet. Positionen för hyllorna kontrolleras igen under stereo dissektionsmikroskop. De måste skjutas ihop för att möjliggöra vidhäftning och vidare palatal fusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
  11. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. Elsevier. (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics