Método de Estudar Palatal Fusão usando estático Órgão Cultura

Developmental Biology

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Summary

Estudos de desenvolvimento palato são motivadas pela incidência de fenda palatina, um defeito de nascença que impõe uma carga tremenda de saúde e pode deixar desfiguração duradoura. Nós demonstramos aqui uma técnica para prateleiras palatinas cultura que podem ser utilizados para estudar diferentes vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do palato e de fusão.

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Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

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Abstract

A fissura labiopalatina estão entre os mais comuns de todos os defeitos de nascimento. As formas palato secundário de prateleiras mesenquimais cobertas com epitélio que adere para formar a costura linha média epitelial (MES). As teorias sugerem que as células MES seguir um epitelial para mesenquimal (EMT), apoptose e migração, fazendo um paladar fundido 1. Desintegração completa dos MES é a fase essencial final de palatal confluência com áreas células mesenquimais. Nós fornecemos um método de cultura de órgãos paladar. O protocolo desenvolvido em vitro permite o estudo de processos biológicos e moleculares durante a fusão. As aplicações desta técnica são numerosos, incluindo avaliando respostas aos agentes químicos exógenos, efeitos de fatores de regulação e de crescimento e proteínas específicas. Palatal cultura de órgãos tem um número de vantagens, incluindo a manipulação em diferentes fases de desenvolvimento que não é possível, utilizando estudos in vivo.

Introduction

Fendas orofaciais são os defeitos de nascimento craniofaciais mais predominantes. Além disso, levando em consideração todos os possíveis defeitos craniofaciais, estes são a segunda anomalia nascimento mais comum em recém-nascidos 2. Fenda palatina ocorre em aproximadamente 1 em cada 700 nascimentos nos Estados Unidos (EUA) a cada ano, a incidência de fenda palatina é igual a 475 crianças nascidas com fissuras palatinas por mês ou 15 crianças com fissuras por dia 3. Cerca de 1% das crianças nasceram em todo o mundo a cada ano apresentam alguma forma de dysmorphology craniofacial.

Fendas do palato e lábio precisa de um procedimento muito caro e complicado, com implicações ao longo da vida para os pacientes que têm essa anomalia. O custo estimado para cada paciente com fissura oral é de aproximadamente $ 100,000 4. O tratamento de um paciente com fissura labiopalatina requer uma equipe de médicos, incluindo cirurgiões craniofaciais, otorrinolaringologistas, geneticistas, anestesiologistas,fonoaudiológicas patologistas, nutricionistas, ortodontistas, prosthodontists, psicólogos, neurocirurgiões e oftalmologistas.

Em palatogenesis, o palato secundário surge como conseqüências emparelhados, que inicialmente crescem verticalmente e se submetem a elevação prateleira palatal acima do dorso da língua. Após elevação, as lâminas palatinas emparelhados crescem em direcção da linha média (em E14.5 -E15 em ratinhos e em seres humanos semana 9). O epitélio borda medial (MEE), que cobre a ponta prateleira adere formar a costura linha média epitelial.

Isto é seguido por epitelial para mesenquimal e / ou apoptose para permitir mesenquimais confluência. Adesão de se opor MEE é um evento essencial cuja alteração provoca fissura palatina. No entanto, poucos estudos investigaram a adesão inicial de 5 palatais prateleiras. As formas do palato duro através da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos. O desenvolvimento anormal do paladar pode produzir cleft paladares com ou sem envolvimento de lábio.

As técnicas de cultura de órgãos paladar tinha sido amplamente utilizado para muitos laboratórios nos últimos 30 anos 6,7.

Neste protocolo, descrever em detalhes um método de dissecção palatal e cultura de órgão estático. A vantagem de uma cultura de órgãos imóvel é que ele permite que lâminas palatinas para fundir. Esta técnica tinha sido usada com sucesso em nosso laboratório para muitos de fusão e de sinalização experimentos 8,9. No entanto, o âmbito da técnica é muito grande e pode ser utilizado sempre que sistema de cultura de órgão estático é necessário, incluindo a avaliação de respostas a agentes químicos exógenos, os efeitos de factores de crescimento em diferentes vias reguladoras e proteínas específicas.

figura 1
Figura 1. Rato Palatogenesis. Estágios de desenvolvimento do palato camundongos. (BF) ELE Digitalizaçãomicrografias ctron (SEM) do palato secundário, por vezes, de desenvolvimento representativas. As setas vermelhas: mostrar a parte inicial da adesão palatal e fusão. Setas amarelas: Ponto para o espaço entre os paladares primárias e secundárias que irão desaparecer após a fusão (reproduzido a partir de Kaufman 11 com a permissão de PLoS ONE).

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Protocol

Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o local.

1. Preparação de Instrumentos dissecação e Meios de Cultura

  1. Pré-lavagem todos os instrumentos a serem usados ​​na dissecção com 3% de peróxido de hidrogénio e, em seguida, em autoclave a 121 ° C durante 20 min. Filtrar meios BGJb com solução de antibiótico e antimicótico usando um filtro de 0,22 um do tamanho de poros com sucção de vácuo em uma capa.

2. Preparação de Equipamentos Cultura

  1. Corte filtros de membrana de policarbonato que irá apoiar os órgãos palatais em pequenos triângulos, spray com 70% de álcool e deixe secar. Prepare prato Centro de Bem-Organ Culture (60x15 mm), colocando uma grade limpos e esterilizados de forma triangular equilátero fio (20 mm) sobre a placa de cultura de órgãos. Em seguida, encher o poço com 1 ml de BGJB meios de cultura de mídia. NOTA: A mídia deve ser suficiente para atingir o nível da rede sem submergir os paladares. Colocar os filtros de membrana, o lado brilhante para baixo, em cima da grelha (3-4 membranas por grade) .Depending na experiência, o tratamento (proteínas, anticorpos ou inibidores) podem ser adicionados aos meios

3. mouse Embryo Recolha e Preparação para a Cultura

  1. Para obter embriões tipo selvagem do rato, uso cronometrado 13,5 grávida CD-1 camundongo fundo genético tensão. Limpe a área de dissecção com etanol 70%.
    NOTA: Outras estirpes de ratos pode ser usada. Nós preferimos ratinhos CD-1 por causa do maior número de maca.
  2. Euthanize camundongos grávidas em E13.5 DPC (dias pós-coito) com 5% de isoflurano seguido por deslocamento cervical para segurar a morte usando protocolos aprovados.
  3. Spray de etanol a 70% sobre a superfície abdominal ventral para evitar que o pau de cabelo abdominal para os instrumentos. Em seguida, abra a cavidade abdominal ventralusando um forte franco-tesoura operacionais e micro-dissecando fórceps para localizar o útero. Usando fórceps, levantar todo o útero e separá-lo do corpo através do corte no corpo do útero e nas pontas dos cornos uterinos com uma luz de uma tesoura de funcionamento.
  4. Coloque o útero sobre uma toalha de papel sobre o gelo (De acordo com o guia de protocolo para o cuidado e uso de animais de laboratório). Cubra o útero com outra toalha de papel limpo para evitar a contaminação. Esterilizar os instrumentos, utilizando 70% spray de etanol antes de usar ainda mais. O útero e os embriões podem ser transportadas para o laboratório em gelo.
  5. Em uma câmara de fluxo laminar aberto, cuidadosamente fazer uma pequena abertura no saco vitelino com uma tesoura afiada-operacionais sem corte e micro-dissecando fórceps. Faça a maior abertura e, em seguida, empurre-o suavemente para exteriorizar o embrião a partir do saco vitelino.
  6. Transferir os embriões imediatamente para uma placa de Petri com frio salino tamponado com fosfato 1X (PBS) pH 7,4. Para garantir o palco adequado, examina O embrião sob um microscópio de dissecação para o corpo, o tamanho da cabeça e membro morfologia.
    NOTA: Os embriões que não são na fase certa do desenvolvimento não são utilizados para o experimento.

Figura 2
Figura 2. Limb Bud Morfologia. O dianteiro e membros traseiros são verificados para o grau de recuo membrana entre os dígitos. No E13.5, todas as condensações dígitos são proeminentes, com o cinto e recortes distal entre os dígitos que aparece muito distinta. Os dígitos traseiras estão por trás por um meio-dia 12 de fileira superior:. Forelimb, fila inferior: pata traseira.

4. Palate Dissection

  1. Coloque um embrião de cada vez numa caixa de Petri com PBS sob o microscópio de dissecação. Usando as tesouras de dissecção pequenas pinças e separar a cabeça do corpo dos embriões.
  2. Segurando cuidadosamente o crânio do mouse acima do nível do olho com uma pinça (evitandoo processo maxilar) fazer duas incisões em ambos os lados da linha dos lábios. Em seguida, retire a mandíbula e língua. Isolar a região processo maxilar, fazendo um corte ao nível dos olhos e remova o cérebro, olhos, septo nasal e tecido adjacente.

Figura 3
Figura 3. Palate tecido coletado de 13,5 embriões, quando as prateleiras palato tinha elevados, mas não fez contato. As lâminas palatinas foram colocados em cultura de órgão em um filtro na interface mídia de ar durante 72 horas no modelo estático. (A) Nível de dissecação em E13.5 embrião. (B) Blue estrelas demarcar áreas para segurar o tecido com uma pinça durante a dissecção. (C) Vista de lâminas palatinas dissecados colocados em uma membrana de filtro trapezoidal. (D) Vista lateral do prato de cultura após a colocação do paladares dissecados e adição de meio de cultura.

  1. Coloque o lado bucal palatal e remover o septo nasal eo tecido em torno dele, mantendo o palato primário anexado para ajudar a orientar no sentido antero-posterior. Use uma colher espátula e transfira com muito cuidado as lâminas palatinas (lado nasal para baixo) para os filtros preparados nas grades nas placas de cultura. NOTA: Ajustar o volume de mídia para permitir a adequada interface de mídia de ar.
  2. Sob o microscópio estéreo, dissecar o palato primário e utilizar uma pinça para colocar as lâminas palatinas próximos uns dos outros. As lâminas palatinas não vai fundir se não forem colocados em contato. Cortar o filtro de membrana triangular em que a parte anterior do palato é localizado. A forma trapezoidal ajudará na localização da porção anterior do palato.
  3. Cultura das lâminas palatinas individualmente ou com dois ou três na mesma placa de cultura de órgãos utilizando meios de cultura BGJb.

5. A cultura Prateleiras Rato Palatinas

  1. Incubar a tissues a 37 ° C numa mistura de gás humidificada (5% de CO 2 e 95% de ar) durante 72 horas e mudança do meio cada 24 horas.

6. Palate Processing para análise histológica

  1. Corrigir os paladares após 72 horas em cultura com 4% de formaldeído / tampão fosfato salina O / N a 4 ° C   C. Em seguida, suavemente com uma pipeta de transferência para a lavagem do tecido na placa de cultura com PBS. Enrole os paladares em um pedaço de toalhetes de laboratório e lugar na incorporação de cassetes.
    NOTA: Envolvendo os paladares em toalhetes de laboratório evitar a sua perda durante o processo de desidratação.
  2. Desidratar o tecido a seguir 70%, 80% e até 100% lavagens de etanol durante 1 hora, seguido pelo procedimento de parafina normal. Para a incorporação, coloque a parte anterior do palato de frente para a bandeja.
  3. Corte de série 6 mm seções na orientação coronal de anterior para posterior. Um palato seção completa vai render 350-450 seçons. Corar as secções com hematoxilina e eosina (H & E). 10 Pontuação cada 20 th seção usando o escore médio de fusão anteriormente descrito (MFS) escala (Tabela 1). 8

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Representative Results

A técnica pode ser aplicada a diferentes tipos de experiments.The seguinte estudo foi concebido para testar o efeito teratogénico de nicotina in vitro em fusão palatino. Duas estirpes de ratos foram utilizados para esta experiência, CD1 e tecido C57.Palatal foi tratada com 0,06 e 6 mM concentrações de hemissulfato de nicotina. Observou-se que os padrões de fusão palatal e tempo foram diferentes nas duas estirpes diferentes. Em ratinhos CD1, lâminas palatinas do grupo controle continuou fusão no tempo maneira dependente. No entanto, no grupo tratado nicotina fusão retardada especialmente a concentração de nicotina 6 mM (Figura 4A). Os cortes histológicos de CD1 rato paladares mostrou fusão total após 72 horas nas amostras de controlo. Em doses mais baixas de nicotina as lâminas palatinas aderir as células epiteliais, mas permanecem após 3 dias em cultura. Lâminas palatinas incubadas em altas doses de nicotina não fazer contato após 72 horas de incubação.

(Figura 4B). Os cortes histológicos de paladares C57 mostrou que, em grupos de tratamento de uma costura epitelial contínua persistiu na linha média. Fusão foi observada apenas no grupo controle em 72 horas.

Observou-se que a fusão palatina em ambos os tipos de ratinhos foi afectada por altas doses de nicotina. No entanto, paladares de C57 foram mais sensíveis à nicotina. Em conclusão, nossos resultados demonstram que a base genética de camundongos influencia as respostas de nicotina nos tecidos palatais.

Figura 4
Duas estirpes de paladares rato cultivadas na presença de nicotina para 24, 48 ou 72 horas. As estirpes de murganhos responderam à nicotina em diferentes graus. Todos os paladares expostas à alta dose de nicotina (6 mM) não conseguiu fundir e teve baixa pontuação de fusão médio (MFS) .Nota que às 24 horas, nenhum dos paladares tinha fechado ea MFS variou de 1 (lâminas palatinas não tocando) a 3 (fusão parcial) em todos os grupos. Por 48 horas, muitos dos paladares de controle tinha fundido parcialmente (escores mais de 3) e por 72 horas, os paladares CD1 foram completamente fundidas (pontuação de 5), mas os controles C57 não tinha completamente fundido (3,67). (Dados não publicados de Maria Serrano e Dr. Kathy Svoboda).

Ponto Critérios
1 Não fusão sem aderência.
2 Não fusão com alguma aderência aparente.
3 Adesão com alguma desintegração das camadas MEE e clara confluência mesenquimais parcial.
4 Fusão completa com alguns traços de células MEE ou costura restante.
5 Fusão completa, sem evidência de células MEE ou costura visível.

Tabela 1: Média Fusão Score (MFS) escala (Kang e Svoboda, 2002). Calcular a pontuação para cada paladar para o anterior (seções 1-150), médio (seções 150-300) e posterior (seções 300-450). 8

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Discussion

O protocolo neste artigo fornece um método de dissecação lâminas palatinas a partir de embriões no dia embrionário 13,5. Lâminas palatinas a partir de embriões de ratinho foram cultivadas num meio de cultura isento de soro, numa atmosfera de 95% de O2 5% de CO2 a 37 ° C. Dissecção palatino bem sucedido é criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento embrionário dos ratinhos sacrificados para a realização da cultura. Um dos factores mais importantes que influenciam fusão palatino é o tempo necessário para iniciar a cultura de órgãos; embriões precisam estar em dia embrionário 13,5 como as prateleiras palato secundário são horizontais, mas ainda não começou a se fundir (Figura 1).

Outro ponto crítico durante o procedimento é a exteriorização de embriões a partir do saco vitelino. Este passo requer um grande cuidado para evitar danos para as estruturas faciais. Uma vez que o embrião é removido a partir do saco, a cabeça é removidoo corpo e colocado numa placa de Petri a ser visualizado com um estereomicroscópio com iluminação de fibra óptica a partir de ambos os lados. A mandíbula ea língua são removidos, expondo o paladar. O cérebro eo tecido residual são removidos ao nível dos olhos. Neste ponto, é importante considerar a camada epitelial para as prateleiras. É necessário manipular o tecido com muito cuidado para manter a integridade destas células. As células epiteliais são responsáveis ​​pela formação de adesão e os MES.

Cada palato dissecados está ligado lado bucal para baixo para limpar qualquer cartilagem do septo nasal. Este tecido é na face anterior do palato e aparece mais brancos condensada e mais. Lâminas palatinas livres de tecido indesejado são transferidos para um prato de cultura e colocadas em cima da membrana de filtro. A posição das prateleiras é verificada novamente sob o microscópio de dissecação estéreo. Eles devem ser unidas para permitir a aderência e mais adiante a fusão palatal.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

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References

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