Método de estudio palatina Fusión usando estático Organ Culture

Developmental Biology

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Summary

Los estudios sobre el desarrollo del paladar están motivados por la incidencia de paladar hendido, un defecto de nacimiento que impone una carga de salud tremenda y puede dejar la desfiguración permanente. Se demuestra aquí una técnica para estantes cultura palatinas que se pueden utilizar para estudiar diferentes vías de señalización implicadas en el desarrollo de paladar y la fusión.

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Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

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Abstract

El labio leporino y el paladar se encuentran entre los más comunes de todos los defectos congénitos. Las formas de paladar secundario de estantes mesenquimales cubiertas de epitelio que se adhiere al formar la costura epiteliales de la línea media (MES). Las teorías sugieren que las células MES siguen un epitelio de transición mesenquimal (EMT), la apoptosis y la migración, haciendo un paladar fusionado 1. La desintegración completa de la economía de mercado es la fase esencial definitiva de confluencia del paladar y la zona células mesenquimales. Ofrecemos un método para cultivo de órganos paladar. La desarrollado protocolo in vitro permite el estudio de los procesos biológicos y moleculares durante la fusión. Las aplicaciones de esta técnica son numerosas, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, efectos de los factores de regulación y de crecimiento y proteínas específicas. Cultivo de órganos Palatal tiene una serie de ventajas, incluyendo la manipulación en diferentes etapas de desarrollo que no es posible utilizando los estudios in vivo.

Introduction

Hendiduras orofaciales son los defectos congénitos craneofaciales más predominantes. Además, tomando en consideración todos los posibles defectos craneofaciales, se trata de la segunda anomalía de nacimiento más común en los recién nacidos 2. Paladar hendido ocurren en aproximadamente 1 de cada 700 nacimientos en los Estados Unidos (US) todos los años, la incidencia de paladar hendido es igual a 475 niños nacidos con paladar hendido al mes o 15 niños con hendiduras por día 3. Aproximadamente el 1% de los niños nacidos en todo el mundo cada año presentan algún tipo de dismorfología craneofacial.

Las hendiduras del paladar y el labio necesitan un procedimiento muy costoso y complicado con implicaciones para toda la vida para los pacientes con esta anomalía. El costo estimado para cada paciente con fisura oral es de aproximadamente $ 100.000 4. El tratamiento de un paciente con labio leporino y paladar hendido requiere un equipo de médicos, incluyendo craneofaciales cirujanos, otorrinolaringólogos, genetistas, anestesiólogos,patólogos del habla-lenguaje, nutricionistas, ortodoncistas, protesistas, psicólogos, neurocirujanos y oftalmólogos.

En palatogénesis, paladar secundario surge como excrecencias pareadas, que inicialmente crecen verticalmente y se someten a la elevación estante palatina sobre el dorso de la lengua. A raíz de la elevación, los palatinos pareadas crecen hacia la línea media (en E14.5 -E15 en ratones y la semana 9 en los seres humanos). El epitelio borde medial (MEE) que cubre la punta estante se adhiere formando la costura epitelial línea media.

Esto es seguido por epitelial a mesenquimal transición y / o apoptosis para permitir la confluencia mesenquimales. Adhesión de oponerse MEE es un evento esencial cuya alteración provoca paladar hendido. Sin embargo, sólo unos pocos estudios investigaron la adhesión inicial de palatinos 5. Las formas de paladar duro por la diferenciación de las células mesenquimales en osteoblastos. El desarrollo anormal del paladar puede producir cleft paladares con o sin la participación del labio.

Técnicas de cultivo de órganos Paladar habían utilizado ampliamente durante muchos laboratorios en los últimos 30 años 6,7.

En este protocolo se describe en detalle un método de la disección del paladar y de la cultura de órganos estática. La ventaja de un cultivo de órganos inmóvil es que permite palatinos se fusionen. Esta técnica se ha utilizado con éxito en nuestro laboratorio para muchos de fusión y de señalización experimentos 8,9. Sin embargo, el ámbito de aplicación de la técnica es muy amplia y se puede utilizar siempre que se requiera el sistema de cultivo de órganos estática, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, los efectos de los factores de crecimiento de regulación en diferentes vías y proteínas específicas.

Figura 1
Figura 1. Ratón palatogénesis. Etapas de desarrollo del paladar ratones. (BF) ele Escaneomicrografías ctron (SEM) del paladar secundario en tiempos de desarrollo representativas. Flechas rojas: muestran la parte inicial de la adhesión del paladar y la fusión. Flechas amarillas: punto al espacio entre los paladares de primaria y secundaria que desaparecerán después de la fusión (Tomado de Kaufman 11 con permiso de PLoS ONE).

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Protocol

Todos los procedimientos descritos deben realizarse de acuerdo con las directrices y normas para el uso de los animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa del Comité local de Animal Institucional de Cuidado y Uso.

1. Preparación de disección Instrumentos y Medios de Cultivo

  1. Prelavado todos los instrumentos que se utilizarán en la disección con peróxido de hidrógeno 3% y luego autoclave a 121 ° C durante 20 min. Filtra medios BGJb con solución antibiótica y antimicótica usando un filtro de 0,22 micras de poro mediano con succión al vacío en una campana.

2. Preparación del Equipo de Cultura

  1. Cortar filtros de membrana de policarbonato que apoyarán los órganos palatinas en pequeños triángulos, rocíe con un 70% de alcohol y dejar que se sequen. Preparar Center-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) mediante la colocación de una rejilla limpio y esterilizado equilátero de forma triangular de alambre (20 mm) sobre la placa de cultivo de órganos. Luego llene el pozo con 1 ml de BGJB medios de cultivo medios. NOTA: Los medios de comunicación deberían ser suficientes para alcanzar el nivel de la red sin sumergir los paladares. Coloque los filtros de membrana, el lado brillante hacia abajo, sobre la parte superior de la rejilla (3-4 membranas por cuadrícula) .Depending en el experimento, de tratamiento (proteínas, anticuerpos o inhibidores) se pueden añadir a los medios de comunicación

3. embrión de ratón Recogida y preparación para la Cultura

  1. Para obtener salvaje embriones de ratón de tipo, el uso programado 13.5 embarazada CD-1 de ratón cepa antecedentes genéticos. Limpiar la zona de disección con etanol al 70%.
    NOTA: Otras cepas de ratones pueden ser utilizados. Preferimos ratones CD-1 debido a la cantidad de arena más grande.
  2. La eutanasia a los ratones embarazadas en E13.5 dpc (días después del coito) con 5% isoflurano seguido por dislocación cervical para asegurar la muerte a través de protocolos aprobados.
  3. Pulverizar etanol al 70% en la superficie abdominal ventral para evitar que el palillo del pelo abdominal de los instrumentos. A continuación, abra la cavidad abdominal ventralutilizando una de bordes romos tijeras de operación y pinzas de micro-disección para localizar el útero. Utilizando las pinzas, levantar todo el útero y separarlo del cuerpo mediante el corte en el cuerpo uterino y en las puntas de los cuernos uterinos con una luz tijeras de funcionamiento.
  4. Coloque el útero sobre una toalla de papel limpia sobre hielo (De acuerdo con la guía de protocolo para el cuidado y uso de animales de laboratorio). Cubra el útero con otra toalla de papel limpia para evitar la contaminación. Esterilizar los instrumentos que utilizan el 70% de etanol aerosol antes de usar más. El útero y los embriones pueden ser transportados al laboratorio en hielo.
  5. En una campana de flujo laminar abierta, hacer cuidadosamente una pequeña abertura en el saco vitelino con unas tijeras de funcionamiento de bordes romos y pinzas de micro-disección. Haga la mayor apertura y luego empuje suavemente a exteriorizar el embrión desde el saco vitelino.
  6. La transferencia de los embriones inmediatamente a una placa Petri con fría tamponada con fosfato salino 1X (PBS) pH 7,4. Para asegurar el escenario adecuado, examina El embrión bajo un microscopio de disección para el cuerpo, tamaño de la cabeza y la integridad física morfología.
    NOTA: Los embriones que no son en la etapa correcta del desarrollo no se utilizan para el experimento.

Figura 2
Figura 2. Limb Bud Morfología. La proa y extremidades traseras se comprueba el grado de sangrado membrana entre los dígitos. En E13.5, todas las condensaciones dígitos son prominentes, con la cincha y hendiduras distales entre los dígitos que aparecen muy distinta. Los dígitos traseras están detrás de un medio-día 12 Fila superior:. Extremidad anterior, fila inferior: extremidad posterior.

4. Boca Disección

  1. Coloque un embrión a la vez en una placa de Petri con PBS bajo el microscopio de disección. Usando pequeñas tijeras de disección y pinzas separar la cabeza del cuerpo de los embriones.
  2. Sosteniendo con cuidado el cráneo del ratón sobre el nivel del ojo con pinzas (evitandoel proceso maxilar) hacer dos incisiones en ambos lados de la línea del labio. A continuación, retire la mandíbula y la lengua. Aislar la región maxilar proceso haciendo un corte a nivel del ojo y quitar el cerebro, los ojos, tabique nasal y el tejido adyacente.

Figura 3
Figura tejido 3. Boca obtiene de 13,5 embriones, cuando los estantes de paladar habían elevados pero no hizo contacto. Los palatinos se colocaron en cultivo de órganos en un filtro en la interfaz de medios aéreos durante 72 horas en el modelo estático. (A) Nivel de disección de embriones E13.5. (B) Azul estrellas demarcan áreas para mantener el tejido con pinzas durante la disección. (C) Vista de palatinos disecados colocados sobre una membrana de filtro trapezoidal. (D) Vista lateral de la placa de cultivo después de la colocación del paladares diseccionaron y adición de medios de cultivo.

  1. Coloque el lado oral, paladar y quitar el tabique nasal y el tejido que lo rodea, manteniendo el paladar primario unido para ayudar a orientar de anterior a posterior. Use una espátula de cuchara y transferir con mucho cuidado los procesos palatinos (lado nasal abajo) para los filtros preparados en las rejillas de las placas de cultivo. NOTA: Ajuste el volumen de los medios de comunicación para permitir adecuada interfaz aire-media.
  2. Bajo el microscopio estereoscópico, diseccionar el paladar primario y utilizar pinzas para colocar los procesos palatinos cerca uno del otro. Los estantes de paladar no se fusionan si no se ponen en contacto. Cortar el filtro de membrana triangular donde se encuentra la parte anterior del paladar. La forma trapezoidal ayudará en la localización de la porción anterior del paladar.
  3. Cultura de los procesos palatinos individual o con dos o tres en la misma placa de cultivo de órganos usando BGJb medios de cultivo.

5. Estantes cultivo ratón palatinos

  1. Incubar la tissues a 37 ° C en una mezcla de gas humidificado (5% de CO2 y 95% de aire) durante 72 horas, y cambian el medio cada 24 horas.

6. Paladar procesamiento para el análisis histológico

  1. Fijar los paladares después de 72 horas en cultivo con formaldehído al 4% / buffer fosfato salino O / N a los 4 °   C. Luego, suavemente con una pipeta de transferencia lavar el tejido en la placa de cultivo con PBS. Envuelva los paladares en un pedazo de toallitas de laboratorio y lugar en la incrustación de casetes.
    NOTA: Envolver los paladares en toallitas de laboratorio a prevenir su pérdida durante el proceso de deshidratación.
  2. Deshidratar el tejido después de 70%, 80% y hasta el 100% lavados de etanol durante 1 hora, seguido por el procedimiento ordinario inclusión en parafina. Para incrustar, coloque la parte anterior del paladar hacia la bandeja.
  3. Cortar serie 6 micras secciones en la orientación coronal de anterior a posterior. Una sección paladar completa producirá 350-450 sections. Teñir las secciones con hematoxilina y eosina (H & E). Cada sección 20ª utilizando el descrito anteriormente Mean Fusión Puntuación (MFS) escala de 10 Score (Tabla 1). 8

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Representative Results

La técnica se puede aplicar a diferentes tipos de experiments.The siguiente estudio fue diseñado para probar el efecto teratogénico de la nicotina in vitro en la fusión palatal. Dos cepas de ratones fueron utilizados para este experimento, CD1 y el tejido C57.Palatal se trató con concentraciones mM de hemisulfato de nicotina 0,06 y 6. Se observó que los patrones de fusión palatinas y el momento eran diferentes en las dos cepas diferentes. En ratones CD1, estantes palatales del grupo de control continuaron de fusión en forma dependiente del tiempo. Sin embargo, en la nicotina grupo de fusión retardada tratada especialmente en la concentración de nicotina 6 mM (Figura 4A). Secciones Histología de paladares ratón CD1 mostraron fusión total después de 72 horas en las muestras de control. A dosis más bajas de la nicotina los estantes palatinas se adhieren pero las células epiteliales permanecen después de 3 días en cultivo. Palatinos incubadas a altas dosis de nicotina no hacen contacto después de 72 h de incubación.

(Figura 4B). Secciones Histología de paladares ratones C57 mostraron que en los grupos de tratamiento de una costura continua epitelial persistía en la línea media. Fusión se observó sólo en el grupo de control a 72 hr.

Hemos observado que la fusión palatal en ambos tipos de ratones se vio afectada por altas dosis de nicotina. Sin embargo, los paladares de C57 eran más sensibles a la nicotina. En conclusión, nuestros resultados demuestran que los antecedentes genéticos de los ratones influye en las respuestas de nicotina en los tejidos del paladar.

Figura 4
Dos cepas de paladares de ratón cultivadas en la presencia de nicotina durante 24, 48, o 72 hr. Las cepas de ratón respondieron a la nicotina en diferentes grados. Todos los paladares expuestos a la alta dosis de nicotina (6 mM) logrado fusionar y tenía bajo puntaje de fusión media (MFS) .Nota que a las 24 horas, ninguno de los paladares había cerrado y el MFS oscilado entre 1 (palatinos no tocar) a 3 (fusión parcial) en todos los grupos. Por 48 horas, muchos de los paladares de control habían fusionado parcialmente (puntuaciones más de 3) y 72 horas, los paladares CD1 fueron fusionados por completo (puntuación de 5), pero los controles C57 no habían fusionado por completo (3.67). (Datos no publicados de María Serrano y el Dr. Kathy Svoboda).

Puntuación Criterios
1 No son de fusión sin adherencia.
2 No son de fusión con un poco de adherencia aparente.
3 Adhesión con un poco de desintegración de capas mecánicas y clara confluencia mesenquimales parcial.
4 Fusión completa con algunos rastros de células mecánicas o costura restante.
5 Fusión completa sin evidencia de células mecánicas o costura visible.

Tabla 1: Media Fusión Puntuación (MFS) escala (Kang y Svoboda, 2002). Cálculo de las puntuaciones de cada paladar para el anterior (secciones 1-150), medio (secciones 150-300) y posterior (secciones 300-450). 8

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Discussion

El protocolo en este artículo proporciona un método de disección palatinos de los embriones en el día embrionario 13.5. Palatinos de embriones de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% de O 2 5% de CO 2 a 37 ° C. Disección palatina éxito depende fundamentalmente de factores múltiples en cada paso durante el procedimiento desde el momento embrionario de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura. Uno de los factores más importantes que influyen en la fusión del paladar es el tiempo necesario para iniciar el cultivo de órganos; embriones deben ser en el día embrionario 13,5 como los estantes paladar secundario son horizontales, pero no han comenzado a fusionarse (Figura 1).

Otro punto crítico durante el procedimiento es la exteriorización de los embriones desde el saco vitelino. Este paso requiere gran cuidado para evitar daños a las estructuras faciales. Una vez que el embrión se retira de la salida, la cabeza se retira deel cuerpo y se coloca en una placa de Petri para ser visto con un microscopio estereoscópico con iluminación de fibra óptica desde ambos lados. La mandíbula y la lengua se retiran, dejando al descubierto el paladar. El cerebro y el tejido residual se retiran a nivel del ojo. En este punto es importante considerar la capa epitelial alrededor de los estantes. Es necesario manipular el tejido con mucho cuidado para mantener la integridad de estas células. Las células epiteliales son responsables de la adherencia y la formación de la economía de mercado.

Cada paladar diseccionado está con el lado bucal hacia abajo para limpiar el cartílago del tabique nasal. Este tejido está en el lado anterior del paladar y aparece condensada blanca y más. Palatinos libre de tejido no deseado se mueven a una placa de cultivo y se colocan en la parte superior de la membrana de filtro. La posición de los estantes se comprueba de nuevo bajo el microscopio de disección estéreo. Deben ser puestas juntas para permitir la adherencia y más adelante la fusión del paladar.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

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References

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