Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

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Biology

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Kegel, V., Deharde, D., Pfeiffer, E., Zeilinger, K., Seehofer, D., Damm, G. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J. Vis. Exp. (109), e53069, doi:10.3791/53069 (2016).

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Abstract

Al lado de los hepatocitos parenquimatosos, el hígado consiste en células no parenquimatosas (APN), a saber las células de Kupffer (KC), hígado células endoteliales (LEC) y las células estrelladas hepáticas (HSC). De dos dimensiones (2D) cultura de hepatocitos humanos primaria (HPP) todavía se considera como el "patrón oro" para las pruebas in vitro de metabolismo de fármacos y hepatotoxicidad. Es bien sabido que el monocultivo 2D de PHH sufre de desdiferenciación y pérdida de función. Recientemente se demostró que NPC hepáticas jugar un papel central en la fisiología del hígado (patógeno) y el mantenimiento de las funciones PHH. La investigación actual se centra en la reconstrucción de la arquitectura del tejido in vivo por 3D-y co-cultivo de los modelos para superar las limitaciones de los monocultivos 2D. Previamente hemos publicado un método para aislar células de hígado humano y se investigó la idoneidad de estas células para su uso en cultivos de células en Biología y Medicina Experimental 1. Basado en el amplio interés en este technique el objetivo de este trabajo fue proporcionar un protocolo más detallado para el proceso de aislamiento de células del hígado incluyendo un video, lo que permitirá una fácil reproducción de esta técnica.

células de hígado humano se aislaron de muestras de tejido hepático humano de las intervenciones quirúrgicas por un EGTA / colagenasa técnica P perfusión de dos etapas. PHH se separaron de la NPC por una centrifugación inicial a 50 x g. Densidad etapas de centrifugación de gradiente se utilizan para la eliminación de células muertas. poblaciones de células hepáticas individuales fueron aislados de la fracción enriquecida NPC usando las propiedades de células específicas y procedimientos de clasificación de células. Al lado del aislamiento PHH fuimos capaces de separar KC, LEC y HSC para su posterior cultivo.

En conjunto, el protocolo presentado permite el aislamiento de PHH y NPC en alta calidad y la cantidad de muestra de tejido de un donante. El acceso a las poblaciones de células hepáticas purificados podría permitir la creación de in vivo como Li humanamodelos Ver.

Introduction

tejido hepático humano es muy complejo y se compone de dos entidades diferentes de células, las células del parénquima y células no parenquimatosas (APN). las células hepáticas parenquimatosas incluyen los hepatocitos y cholangiocytes. Los hepatocitos representan 60 a 70% de las células hepáticas totales y representan la mayor parte de las funciones del hígado metabólicos, por ejemplo, ácidos biliares y complementan la síntesis del factor, la biotransformación y la energía metabolismo 2,3.

La fracción más pequeña NPC constituye el 30-40% de las células hepáticas totales. NPC incluyen diferentes poblaciones de células, a saber, células de Kupffer (KC), células hepáticas endoteliales (LEC) y las células estrelladas hepáticas (HSC). Esta fracción de células heterogénea juega un papel central en los procesos fisiológicos del hígado. Además, NPC participar en la mediación de daño hepático agudo, por ejemplo, lesión hepática inducida por fármacos (DILI), así como en lesiones crónicas del hígado, como la cirrosis 4.

En los últimos años, hlas células del hígado Uman se han vuelto cada vez más importante en la investigación y el desarrollo de las pruebas de drogas, el desarrollo de medicamentos e identificación de nuevas vías bioquímicas en las enfermedades hepáticas. Para el ensayo in vitro monocultivos PHH se siguen considerando como el "patrón oro" 5. La principal limitación de los modelos actuales de hígado homotípicos es desdiferenciación y pérdida de función de los hepatocitos dentro de unos pocos días 4. El establecimiento de técnicas (3D) de cultivo de 3-dimensionales ha demostrado que estas limitaciones se pueden compensar 4,6. Sin embargo, incluso las modernas técnicas de cultivo en 3D no son capaces de mostrar todos los modos de acciones hepatotóxicos 7. Faltan las poblaciones de la APN en los modelos in vitro existentes se discuten como una posible razón de esta discrepancia a la situación in vivo. Se ha demostrado que la comunicación célula-célula entre las diferentes poblaciones de células de hígado juega un papel central en la homeostasis fisiológica, sino también en pathophysiologic procesa 8. Por lo tanto la atención científica se centra cada vez más en la APN y sus interacciones célula-célula. Su uso con propósitos específicos en co-cultivo y sistemas de ingeniería tisular podría ser una solución para la alta demanda de los modelos in vitro de hígado 8,9, que son lo más cercano a la situación in vivo como sea posible.

Actualmente, el principal reto es el desarrollo de un modelo de hígado co-cultura humana normalizada, que contiene partes claramente definidas de PHH y el CNP. En consecuencia, se necesitan técnicas de aislamiento de las células del hígado muy heterogéneos y los que tienen que ser optimizado para obtener poblaciones de células puras. Mientras que los protocolos estandarizados para el aislamiento PHH existen 10, el aislamiento normalizado de la APN humano está todavía en desarrollo. Protocolos de aislamiento de la APN más publicados se basan en experimentos con células no humanas 11,12. Sólo unas pocas publicaciones describen el proceso de aislamiento de la APN humana y la mayoría sólo cubrenmétodos para el aislamiento de un solo tipo de células 11-16. Las características de las células más importantes que han sido aprovechadas para la separación celular son el tamaño, la densidad, el comportamiento de fijación, y la expresión de proteínas de la superficie. Sobre la base de estas características se desarrolló un protocolo simplificado para aislar PHH, KC, LEC y HSC, que fue publicado previamente en Biología y Medicina Experimental 1. Debido al amplio interés en esta técnica, el objetivo de este trabajo fue proporcionar un protocolo más detallado para el proceso de aislamiento de células del hígado incluyendo un video, lo que permitirá la reproducción de la técnica con mayor facilidad. El protocolo incluye también métodos de control de calidad para la evaluación de rendimiento y la viabilidad, así como para la evaluación de la identificación y la pureza usando immunostainings específicos.

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Protocol

Nota: se aislaron Todas las células de tejido hepático resecado no tumoral humana, que se mantuvo después de la resección parcial del hígado con tumores hepáticos primarios o secundarios. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes de acuerdo con las directrices éticas de la Charité - Universidad de Berlín.

1. Preparación de materiales y soluciones

  1. Esterilizar todos los instrumentos y los materiales por adelantado para evitar la contaminación bacteriana durante el proceso de aislamiento.
  2. Preparar las soluciones necesarias para la perfusión de la muestra de tejido del hígado, el proceso de aislamiento de los hepatocitos y las células hepáticas no parenquimatosas y el cultivo de células hepáticas humanas primarias de acuerdo con las Tablas 1 y 2, con excepción de la digestión-Solution que se prepara recién antes de su uso. Todas las soluciones se pueden almacenar a 4 ° C y se recomienda para usarlos dentro de las 4 semanas después de la preparación.
  3. Esterilizartodas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 micras superior botella.

2. Preparación de los equipos de perfusión

  1. Configurar el equipo para la perfusión y la digestión de la muestra de tejido del hígado como se muestra en la Figura 1A.
  2. Ajustar la temperatura del baño de agua a 39 ° C para garantizar una actividad óptima P colagenasa durante la perfusión y la digestión.

3. perfusión y digestión de la muestra de tejido del hígado (1,5 hr)

  1. Seleccionar una muestra de tejido con la cápsula de Glisson una intacto del tejido hepático resecado. Al cortar la muestra de tejido, tratar de obtener una superficie de corte pequeña con buenos vasos visibles. Evitar los tiempos de isquemia caliente por el transporte y manipulación de la muestra de tejido hepático en hielo hasta que la perfusión.
  2. Tome el peso del tejido en condiciones estériles y colocar la muestra de tejido hepático en una placa de Petri en el flujo de aire laminar. Limpiar la superficie de la muestra de tejido con una compresa estéril de rerestante sangre y eliminar el conjunto de cánula de perfusión utilizando 1x-Solución I para garantizar que toda la cánula eran permeables.
  3. Utilice pegamento de tejido para fijar las aceitunas de las cánulas en algunos vasos sanguíneos más grandes. Dependiendo del tamaño de la muestra de tejido del hígado y el número de los vasos en la superficie, el uso de una cánula fijada con 3 a 8 cánulas. Prueba de la perfusión y comprobar si hay fugas. Cerrar todos los vasos sanguíneos, los cuales sale clara 1x-perfusión Solución I, con adhesivo tisular.
  4. Colocar la muestra de tejido del hígado canulado en el embudo Büchner en su disco de filtro perforada (Figura 1A).
  5. Ajuste el caudal de la bomba peristáltica entre 7,5 ml / min y 14,6 ml / min en función del número de cánulas usadas y en la resistencia del tejido hepático. Ajustar la velocidad de flujo cada vez para asegurar que hay una perfusión actual pero lento. Perfundir el tejido hasta que toda la sangre se vacía pero al menos 20 min. Observar el tejido vuelve más brillante en áreas con buenas perfusien.
    Nota: En algunos casos, puede ser necesario para sujetar una de las cánulas con abrazaderas de plástico o para aumentar la presión interna de un área empujando suavemente con una espátula en contra de la cápsula hepática, para optimizar la perfusión. Un cambio completo de color a un amarillo claro al color marrón claro indica una buena perfusión.
  6. Cambiar el fluido de perfusión a la digestión-Solution que contiene colagenasa P (Tabla 1).
  7. Reorganizar la configuración (Figura 1A) para la etapa de digestión. Por lo tanto realizar un flujo circular de digestión-solución de acuerdo con la Figura 1B para un máximo de 15 min.
    Nota: Es fundamental para detener la perfusión inmediatamente cuando la muestra de tejido del hígado se digiere lo suficiente. Una buena digestión se puede observar, cuando el tejido no muestra signos de elasticidad según la evaluación de mantenimiento de las deformaciones de la cápsula, cuando se empuja con una espátula.

4. Aislamiento de los hepatocitos (1 hr)

  1. Turna la bomba peristáltica fuera y colocar la muestra de tejido hepático en un plato de cristal. Enjuague el exterior de la muestra de tejido con hielo frío Stop-Solution (Tabla 1). Retire las cánulas de la muestra de tejido del hígado. Utilice un bisturí para abrir la muestra de tejido del hígado, mediante la incisión en el medio de la zona donde se unen las cánulas. Mantener la atención que la cápsula Glisson's se mantiene intacta.
  2. Enjuague el interior de la muestra de tejido y luego cubrir toda la muestra de tejido con hielo frío Stop-Solution. Agitar el tejido suavemente para liberar las células de los tejidos.
  3. Recoger la suspensión celular y se filtra a través de una mirada embudo (embudo de plástico forrada con compresas de gasa) en tubos de 50 ml de plástico. Añadir más Stop-Solución para la muestra de tejido hepático hasta que se consume un volumen final de 500 ml.
  4. Centrifugar la suspensión celular a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recoger el sobrenadante para su posterior aislamiento de células no parenquimatosas. Lavar el sedimento celular con PBS (Figura 2A).
  5. Centrifugar la suspensión celular de nuevo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recoger el sobrenadante y resuspender el sedimento en medio de hepatocitos de incubación (Tabla 2, Figura 2B).
  6. Determinar el número de células y la viabilidad en la suspensión de células resultante usando tinción con azul de tripano. Contar las células vivas y muertas en una cámara de recuento Neubauer. Calcular el número de células, la viabilidad y el rendimiento de PHH utilizando las fórmulas de abajo.

    Rendimiento (células contadas) = ​​células contadas x factor de dilución x volumen de suspensión celular (ml) x 10.000

    rendimiento (hepatocitos / (g de hígado muestra de tejido)) = (rendimiento (hepatocitos / (medios ml)) x volumen de suspensión de células (ml)) / (peso de la muestra de tejido del hígado (g))

    viabilidad (%) = 100% x (número de células vivas) / (número total de células)

5. Purificación de los hepatocitos (1 hr)

Nota: Se recomienda esta etapa de purificación, si la viabilidades inferior a 70%.

  1. Realizar todos los pasos en el hielo. Preparar un gradiente de densidad 25% mediante la mezcla de solución de gradiente de densidad de 5 ml y 15 ml de PBS para centrifugación en gradiente de densidad.
  2. Poner un máximo de 50 células Mio en total de la suspensión celular de los hepatocitos ricos lentamente y con cuidado en la parte superior de la capa de gradiente de densidad de 25% para asegurar que una clara separación de las dos capas se consigue (Figura 2C). Poner los tubos con cuidado en la centrífuga y se centrifuga a 1250 xg, 20 min, 4 ° C sin freno (Figura 2D).
  3. Aspirar la suspensión celular restante y las células muertas en la interfase. Dependiendo del contenido de grasa uno también podría aspirar el gradiente de solución de densidad.
    Nota: PHH con bajo contenido de lípidos forman un sedimento denso y el gradiente de densidad puede ser aspirado por completo. PHH con alto contenido en lípidos formar un sedimento más difuso y una gran cantidad de células viables puede permanecer en la solución de gradiente de densidad por encima de la pastilla.
  4. Vuelva a suspender los gránulos de hepatocitos con PBS y centrifugar de nuevo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Agrupar los gránulos, se lava de nuevo con PBS y resuspender purificada PHH en medio de hepatocitos de incubación. Realizar el recuento de células como se describe en el paso 4.6.

6. Cultivo de hepatocitos

  1. Preparar las placas de cultivo de células para la siembra de PHH recubriéndolos con una matriz extracelular, por ejemplo colágeno de cola de rata (colágeno de tipo I). Preparar el colágeno de cola de rata de acuerdo con el protocolo establecido por Rajan et al. 17
  2. Se diluye la cola de rata colágeno solución madre de 1: 200 en PBS. Transferencia / cm solución de 100 l 2 de rata colágeno de cola en las placas de cultivo, teniendo cuidado de que toda la superficie está cubierta. Incubar los plásticos de cultivo de células durante 20 min a temperatura ambiente. Aspirar la solución de colágeno de cola de rata restante.
  3. Semilla de 15 x 10 4 hepatocitos / cm2 en medio de hepatocitos de incubación sobre la cultura dishes recubierta con colágeno de cola de rata. Cultivar las células en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2 durante al menos 4 horas. Después de 4 horas los hepatocitos se han adherido y el medio puede ser cambiado.
  4. Realizar investigaciones en función de la configuración experimental. Se recomienda un tiempo de cultivo de 48 horas para permitir que las células se recuperen del proceso de aislamiento.

7. Aislamiento de células hepáticas no parenquimatosas (1,5-2 h)

  1. Centrifugar el sobrenadante recogido (paso 4,5 y 4,6) a 72 xg, 5 min, 4 ° C para eliminar los eritrocitos y hepatocitos restantes. Agrupar los sobrenadantes y centrifugar dos veces para obtener dos sedimentos celulares: 300 xg, 5 min, 4 ° C durante la sedimentación de HSC, LEC y en parte KC y 650 xg, 7 min, 4 ° C para la sedimentación de los restantes KC.
  2. Piscina ambos pellets y las vuelve a suspender en HBSS. Preparar un 25% y una densidad del 50% gradientes mediante la mezcla de solución de gradiente de densidad y PBS durante Centrif gradiente de densidadugation (25% de solución de gradiente de densidad: 5 ml solución de gradiente de densidad y 15 ml de PBS, solución de gradiente de densidad de 50%: solución de gradiente de 10 ml de densidad y 10 ml de PBS, ver Figura 2). Colocar la solución de gradiente de densidad 25% cuidadosamente en la parte superior de la capa de solución de gradiente de densidad de 50%.
  3. Ponga la suspensión NPC con cuidado y poco a poco en la parte superior de la capa de solución de gradiente de densidad de 25% de una manera que se consigue una clara separación de las dos capas.
  4. Centrifugar la suspensión de células en el gradiente de densidad en 1.800 xg, 20 min, 4 ° C sin freno (Figura 2.2).
  5. Aspirar las células muertas y restos de células de la capa superior. El NPC se encuentran en la interfase entre la capa de gradiente de densidad de 25% y 50% (Figura 2). Recoger la APN, lavarlos con HBSS y se centrifuga la suspensión celular aplicando el paso de doble centrifugación descrito anteriormente (punto 7.2.).

8. separación de las células de Kupffer (adherenciaEtapa de Separación) (1 h)

  1. Realizar un recuento de células para el KC en la fracción de la APN como se describe en el paso 4.6. (Para aparición de KC en suspensión véase la Figura 3B). Centrifugar la fracción NPC con la etapa de centrifugación de doble descrita anteriormente (paso 7.2) y volver a suspender el medio NPC en Kupffer la siembra de células (Tabla 2).
  2. Sembrar la fracción que contiene KC en recipientes de cultivo celular de plástico a una densidad de 5 x 10 5 KC / cm2. Los cultivos se incuban KC durante 20 minutos en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2. KC primaria se adhieren sobre plásticos de cultivo de células dentro de un corto período de tiempo (Figura 2.3).
  3. Recoger el sobrenadante que contiene no adherido APN, que consiste principalmente de LEC y HSC. Piscina los sobrenadantes para la separación posterior de LEC (véase la sección 9) y HSC (véase el apartado 10). Lavar el adherente KC con HBSS y cultivarlas en Kupffer medio de cultivo de la célula (Tabla 2) a 37 ° C, 5% de CO2 en una incubadora humidificada.

9. Separación de las células endoteliales (1,5 hr)

  1. Centrifugar el sobrenadante recogido (etapa 8.5.) En 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lavar el pellet con PBS. Después de la centrifugación a 300 xg, 5 min, 4ºC volver a suspender las células en Stellate celular / medio de separación de células endoteliales y realizar un recuento de todas las células restantes como se describe en el paso 4.6.
  2. Vuelva a suspender 1 x 10 7 células Mio en 1 ml de las células estrelladas / medio de separación de células endoteliales, añadir 20 l solución de bloqueo de la MACS-KIT y 20 l de los granos del CD31 Micro para immunolabeling e incubar la suspensión resultante durante 15 minutos a 4 temperatura ° C (Figura 2.4).
  3. LEC separado de HSC como se describe en el protocolo manufacturer's para el sistema de clasificación de células activadas magnéticamente MACS (Figura 2.5). Eluir magnéticamente retenido LEC CD31-positivas y suspenderlos en Stellate Cell / medio de cultivo de células endoteliales (Tabla 2).
  4. Realizar celular contando para LEC como se describe en el paso 4.6. LEC de semillas en una densidad de 1,25 x 10 5 células / cm 2 en recipientes de cultivo celular recubiertas con colágeno de cola de rata (véase el paso 6.1). Cultivar las células a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado.

10. Separación de células estrelladas (0,5 hr)

  1. Sin etiqueta HSC pasar la columna de separación durante el procedimiento MACS. Recoger la fracción HSC (véase el paso 9.5, figura 2.5). Realizar el recuento de células como se describe en el paso 4.6.
  2. HSC semilla con una densidad de 5 x 10 4 células / cm 2 en recipientes de cultivo celular recubiertas con colágeno de cola de rata (véase el paso 6.1) en Stellate celular / medio de cultivo de células endoteliales (Tabla 2) y cultivarlas a 37 ° C, 5% CO 2 en un incubador humidificado.

"Tabla Tabla 1: perfusión y solución de aislamiento.

Tabla 2
Tabla 2: Cultivo y aislamiento medios de comunicación.

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Representative Results

La separación en una fracción del parénquima y no parenquimatosas, usando centrifugación en gradiente de densidad como un procedimiento de limpieza en combinación con el uso de propiedades de adherencia y MACS conduce a éxito PHH y NPC aislamiento. PHH y el CNP se pueden aislar en alta calidad y en cantidad. La figura 1 muestra la configuración representante del equipo para la perfusión del hígado y la digestión. 10% de FCS se añadió a la colagenasa P que contiene de perfusión - Solución II para reducir la actividad proteolítica de las proteasas y para estabilizar la actividad de colagenasa P a cambio. En consecuencia mayores tiempos de digestión requeridas para el aislamiento de la APN puede aplicarse sin un impacto negativo sobre la viabilidad de la HPP.

Figura 1
Figura 1:. De perfusión y la configuración de la digestión, la primera etapa de la perfusión se lleva a cabo en order para eliminar la sangre residual, se caliente el tejido y eliminar Ca 2+ para disolver célula-célula conexiones mediante el uso de 1x perfusiones Solución I (PI) (A). La recirculación de la digestión-Solution (DG) se realiza para la digestión del tejido hepático durante la etapa de perfusión II (B).

Figura 2
Figura 2:. Simplificado representación esquemática del proceso completo aislamiento y PHH APN Modificado de Pfeiffer et al 1, 2014, con el permiso de Biología y Medicina Experimental.. En primer lugar, la muestra de tejido del hígado se perfunde y digerido por un EGTA / colagenasa técnica P perfusión de dos etapas (A). La suspensión celular obtenida se centrifuga inicialmente a 50 xg, 5 min, 4 ° C (B), para separar la mayor PHH-fracción (pellet) de la más pequeña NPC-fracción (supernatant). En caso de una viabilidad PHH debajo del 70%, la fracción PHH viable puede ser enriquecido por una centrifugación en gradiente de densidad a 1.250 xg, 20 min, 4 ° C (C) resultante en la solución de la PHH en la parte inferior del tubo, mientras que muertos células de escombros / célula se encuentran en la parte superior de la capa de gradiente de densidad (D). sobrenadantes recogidos de la centrifugación inicial (1) se centrifugan usando dos pasos: 1) 300 xg, 5 min, 4 ° C y 2) 650 xg, 7 min, 4 ° C. Después de la primera centrifugación KC se encuentra en parte en el sobrenadante. En este contexto, la segunda etapa de aislamiento es necesario. Los sedimentos de células obtenidas se reúnen y se re-suspendieron en HBSS. Posteriormente, la suspensión de células son cuidadosamente en capas en la parte superior de un gradiente de densidad de dos capas (25% / 50%). Los tubos de gradiente de densidad en capas se centrifugan a 1800 xg, 20 min, 4 ° C (2). se descartan las células muertas en la parte superior de la capa de gradiente de densidad de 25%. NPC situado entre la interfase del 25% y el 50% dcapa de gradiente ensity se recogen y se agruparon. La fracción NPC se siembra sobre plásticos de cultivo celular no recubiertas. El uso de un tiempo de incubación 20 min (etapa de separación adherencia) KC se separan de otras poblaciones de células de hígado (3). LEC y HSC se separan mediante el uso de la MACS-kit. Por lo tanto las células hepáticas restantes recogidos en el sobrenadante se centrifugan a 300 xg, 5 min, 4 ° C, y se marcan con microperlas CD31 conjugado con (4). Sólo CD31-negativas HSC pasar la columna de separación MACS (5). stick LEC CD31-positivas a la columna. Por último, la columna se retira del dispositivo magnético y la LEC CD31-positivo se eluyen de la columna (5). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El aislado PHH mostró un rendimiento de 14,2 x 10 6 ± 6,6 x 10 6 g de tejido viable PHH / hígado y una viabilidad sobre 760,6 ± 4,2% (Tabla 3 1). Microscópicamente características visibles eran una típica gran volumen citoplasmático en combinación con gotitas de lípidos y entre uno y cuatro núcleos, (Figura 3A). El tamaño de celda varía entre 20 a 30 micras en suspensión.

KC fueron el tipo de célula más común en la fracción de NPC. Se aislaron aproximadamente 1,9 x 10 6 ± 0,2 x 10 6 viables / g de tejido hepático KC con una viabilidad de 92,8 ± 3,5% (Tabla 3 1). KC son células muy pequeñas (alrededor de 5 micras) con una relación citoplasma / núcleo bajo y microvellosidades típica en la superficie (Figura 3B).

Finalmente se utilizó la técnica de separación MACS para separar LEC CD31-positivo desde el restante HSC-CD31 negativo. El rendimiento de la LEC fue de aproximadamente 2,7 x 10 5 ± 0,1 x 10 5 viable LEC / g liver el tejido y la viabilidad alcanzado fue del 95,6 ± 2,8% (Tabla 3 1). Los criterios de identificación son los granulae múltiple y un tamaño de aproximadamente 10 micras de suspensión de células (Figura 3C), así como la forma de huso característica después de un tiempo de cultivo corto (Figura 3G).

El proceso de aislamiento dio como resultado un rendimiento HSC aproximadamente 4,7 x 10 5 ± 0,2 x 10 5 viable HSC / g de hígado (N = 8) con una viabilidad de 89,6 ± 3,8% (Tabla 3 1). Microscópicamente características identificables eran de un tamaño de aproximadamente 20 micras y una apariencia granulada típica con una cantidad variable de gotitas de lípidos (Figura 3D).

tabla 1
Tabla 3: Los rendimientos, la viabilidad y la pureza de PHH aislado y NPC. Se evaluaron tres donantes diferentes. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Esta tabla fue publicado antes de Pfeiffer et al., 1, 2014, y se reproduce con permiso de Biología y Medicina Experimental.

Para la identificación y la determinación de la pureza del cultivo de células, cada fracción celular aislado se trató con anticuerpos contra antígenos específicos de tipo celular. Las células se trataron con anticuerpos secundarios fluorescentes e investigados por microscopía de inmunofluorescencia. La pureza se determinó contando las células teñidas fluorescentes positivos en relación con el número total de células se visualizaron mediante tinción con Hoechst.

Después de 24 horas de cultivo PHH mostró una característica forma poligonal y con frecuencia poliploidía (Figura 3E). PHH fueron positivos para CK 18 (Figura 3I) y mostró una pureza del 92,3 ± 3,2%(Tabla 3 1).

KC adherido dentro de los 20 minutos en las superficies de plástico de cultivo de células. Después se observó un tiempo de incubación de pequeñas células redondas 24 hr con un núcleo de células redondas prominente (Figura 3F). La proteína de superficie CD68 se utilizó para identificar KC (Figura 3J). La pureza de las células CD68 positivas fue de 81,0 ± 5,4% (Tabla 3 1).

A pesar de la separación MACS utilizando etiquetado CD31 durante la separación de la APN todavía era posible sellar aislado LEC con CD31. Por lo tanto la LEC aisladas y cultivadas se tiñeron con CD31 para la identificación y determinación de la pureza. Además LEC mostró inmunoreactividad para la vimentina marcador de células mesenquimales (Figura 3K). Se observó aproximadamente el 81,0 ± 1,7% de células teñidas positivas (Tabla 3 1). HSC con sus gotitas de lípidos típicos prominentes (Figura 3H) se caracterizaron por tinción de inmunofluorescencia para GFAP (Figura 3L). HSC pureza fue 93,0 ± 1,7% (Tabla 3 1).

Cada fracción celular se counterstained con otros marcadores de la APN. Todas las fracciones de células contenían un pequeño número de otros tipos de células específicas del hígado, pero fueron negativos para el marcador de hepatocitos CK18 y CK19 el marcador cholangiocyte.

figura 3
. Figura 3: Morfología del parénquima humana y células hepáticas no parenquimatosas en suspensión y después de la adhesión La columna izquierda (A - D) muestra las diferentes poblaciones de células hepáticas aisladas directamente después del proceso de aislamientoen vista microscopía de contraste de fase: PHH (A), KC (B), LEC (C), y HSC (D). La columna central (E - H) presenta imágenes de aislado y cultivado PHH (E), KC (F), LEC (G) y HSC (H) después de 24 horas de cultivo (microscopía de contraste de fase). Caracterización basada en la inmunofluorescencia de las diferentes fracciones de células se muestra en la última columna: PHH mostró señales positivas para la CK18 marcador de hepatocitos (I, 24 hr después del aislamiento), KC fueron positivas para el marcador CD68 (J, 24 hr después del aislamiento), LEC mostró señales positivas para vimentina (K, 72 horas después del aislamiento) y HSC fueron positivas para GFAP (L, 72 horas después del aislamiento). Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst; Ampliación: 400x. Modificado de Pfeiffer et al., 1, 2014, con el permiso de ExperBiología y Medicina imental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo publicado describe una técnica para aislar puro PHH y NPC, a saber, KC, HSC y LEC, a la vez de alta calidad y pureza a partir de la misma muestra de tejido hepático humano. La mayoría de las publicaciones que se ocupan de aislamientos de células del hígado cubren sólo una de esas poblaciones de células 18-20 y procedimientos de aislamiento realizadas con tejidos humanos son raros (revisado por Damm y col.) 21. Adaptación de los métodos establecidos con el tejido animal (por ejemplo, hígado de rata) de hígado humano reveló varias diferencias en las propiedades de células entre las poblaciones de células animales y humanas. El establecimiento de un método de aislamiento de células del hígado que cubre las diferentes poblaciones de células hepáticas reveló que la combinación de la parénquima y no parenquimatosas de aislamiento de células es un paso crítico debido a la diferencia en el tiempo de digestión requerido para obtener resultados optimizados. Frente a este desafío, hemos desarrollado un protocolo de aislamiento de células del hígado combinación de diferentes técnicas y adaptó laSE en nuestro protocolo de aislamiento PHH 10.

Mediante la adición de 10% de FCS a la colagenasa P que contiene la solución II hemos sido capaces de reducir la actividad proteolítica de las proteasas. Esta modificación permitió tiempos de digestión más largos, necesarios para la obtención de un alto número de NPC. En consecuencia, hemos sido capaces de aislar PHH, así como de la APN de buena calidad y en gran cantidad. el aislamiento de células de hígado exitosa depende fuertemente de la calidad inicial del tejido. El donante y los datos anamnesis pueden influir en la calidad y la cantidad de células. A partir de nuestra experiencia, no hay correlación con factores específicos de los donantes y personal muy experimentado puede ser enfrentado al aislamiento de células sin éxito. Debido a que la calidad del tejido del donante es un punto crítico, todas las fuentes externas, que pueden perjudicar la calidad de los tejidos, tienen que ser minimizado.

La mayoría de los factores críticos son tiempos de isquemia caliente después de la intervención quirúrgica y los tiempos de isquemia fría durante el transporte del tejido To el laboratorio. Además de fuentes de para las infecciones bacterianas deben ser evitados. Se ha de señalar que a veces el propio órgano puede contener la contaminación bacteriana, por ejemplo, en el caso de enfermedades del tracto biliar. Los pasos críticos en el procedimiento de aislamiento cubren los tiempos de perfusión y los pasos de centrifugación en gradiente de densidad. El primer paso de perfusión debe durar 20-30 min. tiempos de perfusión más cortas pueden conducir a desprendimiento incompleto de contactos célula-célula que resulta en la aparición de grupos de células en la suspensión celular obtenida. A primera perfusión prolongada reduce la viabilidad celular e induce estrés celular debido a Ca 2+ agotamiento.

El segundo paso de perfusión realizado para la digestión enzimática de tejidos requiere un poco de experiencia para determinar el grado de digestión óptima para la toma de decisiones acerca de detener la reacción proteolítica en el punto temporal derecha. tiempos de digestión cortos conducen a bajos rendimientos y tiempos de digestión prolongada al estrés celular y daño celular.A partir de nuestra experiencia, el período de tiempo entre el tejido no digerido y el tejido dañado durante la digestión a menudo se encuentra dentro de una ventana de 1-3 min. Una perfusión incompleta puede ser contrarrestado por el cambio de la presión dentro del tejido en otra área con abrazaderas para pellizcando cánulas. Además presión suave con una espátula hacia la muestra de tejido conduce a un cambio en la perfusión del tejido. El tejido es que aumenta la presión interior comprimido y. Posteriormente, los vasos sanguíneos también se comprimen y su radio disminuye. Con una disminución del radio, la resistencia aumenta (ley de Hagen-Poiseuille) y la solución de perfusión prefiere el camino de menor resistencia y perfunde otras áreas. De acuerdo con Baccarani y compañeros de trabajo se observó que el tejido fibrótico o cirrótico necesita un período de digestión más largo que conduce a disminuir viabilidades celulares 22. Por este motivo, se recomienda evitar los tejidos de los pacientes con fibrosis o cirrosis hepática.

La preparación yla manipulación de los gradientes de densidad, así como células de aprovechamiento de los gradientes (ver paso 5 y 7) también cubren pasos críticos. Las diferentes capas de gradiente de densidad y la suspensión de células tienen que ser transferidos de una manera lenta y cuidadosa para la creación de interfases afilados. Además, existe siempre el riesgo de dañar el gradiente durante la manipulación, especialmente cuando la recolección de las células. Durante la separación NPC la etapa de separación adherencia es crucial para el rendimiento más tarde y la pureza de todas las fracciones de la APN. Para aumentar el número de células de la APN no adherida y la pureza de KC una etapa de lavado adicional puede ser útil. La solución de lavado de este paso se combinó con los sobrenadantes para una separación adicional de la APN. Para evitar la contaminación por bacterias, hongos o virus condiciones asépticas estrictas tienen que ser asegurado de 23.

En dependencia de las poblaciones de células necesarias del protocolo se puede cambiar y modificar saltarse pasos específicos. Por ejemplo, si solamente son KCrequiere la etapa de centrifugación dual para NPC sedimentación puede ser reducido a la segunda etapa de centrifugación y los pasos para HSC y separación LEC se puede quitar. tiempos de perfusión y la fuerza g para la centrifugación pueden variar también en función del tejido y la calidad de la célula. tejido fibrótico requiere prolonga tiempos de digestión, por lo tanto, hay una necesidad de controlar cuidadosamente la elasticidad de los tejidos. La acumulación de gotas de lípidos en los hepatocitos grasos disminuye la densidad de las células y por lo tanto cambia las propiedades de sedimentación. De acuerdo con nuestras observaciones, puede ser útil para ajustar la fuerza g durante el aislamiento PHH en función del contenido en lípidos de la HPC, que requieren elevadas cantidades PHH. Tiene que tener en cuenta que cualquier cambio de la etapa inicial de centrifugación influirán negativamente en el aislamiento de la APN en términos de calidad y cantidad. Hasta el momento, se recomienda la fuerza de gravedad entre 50 xg (hepatocitos con bajo contenido de grasa) y 150 xg (hepatocitos con alto contenido de grasa). Además HEPA grasostocytes tienden a formar un sedimento de células menos compacto después de la centrifugación en gradiente de densidad y la recolección de células tiene además que ser cambiado como se describe en el paso 5.5.

Para acelerar el procedimiento de aislamiento de algunas medidas se pueden realizar de forma simultánea. Por ejemplo, en paralelo con la purificación de los hepatocitos aislados de una segunda persona puede comenzar con el aislamiento de la APN. Además las soluciones de gradiente de densidad se pueden preparar por adelantado. Si hay más de dos personas incluso más pasos se pueden realizar al mismo tiempo.

En comparación con otros protocolos de aislamiento de células de hígado humano nuestros resultados muestran rendimientos celulares similares o más altas y viabilidades como previamente publicado en Biología y Medicina Experimental 1. Para KC aislamiento Alabraba y compañeros de trabajo demostraron resultados del aislamiento con un rendimiento de 2,3 x 10 6 / g de tejido de hígado viable KC combinada con una viabilidad de 98% sobre 13, que son comparables anuestra (número de células: 1,9 x 10 6 KC viables / g de tejido hepático, la viabilidad alrededor del 93%) KC resultados. La mayoría de los datos de aislamiento de LEC publicados describen aislamientos de órganos enteros 15,24. Gerlach y compañeros de trabajo, así como Lalor y colaboradores aislaron el número de células entre 10 y 3 10 6 células / órganos 15,24. Estos datos no se pueden comparar directamente a la celda aislamientos de muestras de tejidos. Sin embargo, utilizando el protocolo, se mostró rendimientos de LEC de 2,7 x 10 5 / g tejidos del hígado viables LEC, que son, con mucho, más grande cuando se extrapola en un órgano completo. HSC se aislaron con un rendimiento de alrededor de 4,7 x 10 5 / g tejidos del hígado viables HSC y la viabilidad de 90%. Resultados existentes publicados por Friedman y sus colaboradores mostraron rendimientos mitad inferior de células (2,3 x 10 hígados 5 HSC / g), pero una pureza (91%) 14. En cuanto a nuestro protocolo, bajos rendimientos celulares pueden ser causados ​​por la mala perfusión y la digestión debido a la escasa o nula circulación de 1x-perfusión Solution I y la digestión-Solution dentro del tejido. Además burbujas de gas en el tejido pueden perturbar la circulación intra-tejido de 1x-perfusión Solución I y digestión-Solution. En estos casos, la perfusión puede ser mejorada mediante el aumento de la presión de perfusión y la eliminación de burbujas de gas por apriete cánulas individuales y / o el uso de una espátula para empujar contra la muestra de tejido. Una mala viabilidad es en la mayoría de los casos una consecuencia del estrés celular. Veces la isquemia prolongada, daños por Ca 2+ agotamiento y la proteólisis de las proteínas de membrana están vinculados al daño celular, visible por las ampollas de la membrana celular. De nuestras observaciones estas células una muy sensible a la tensión de corte y en la mayoría de los casos mueren durante el procedimiento de aislamiento. En resumen, el aislamiento exitoso y la separación de las células hepáticas parenquimatosas y no parenquimatosas requiere que los pasos críticos se realizan en el marco de tiempo correcto, pasos de pipeteado se llevan a cabo con cuidado y, en general, el tiempo para el aislamiento de células y la separación should ser lo más corto posible 21. Una desventaja del protocolo descrito es que las condiciones de aislamiento (por ejemplo, tiempos de perfusión) no pueden ser completamente estandarizada, pero tienen que ser adaptados individualmente a la calidad de los tejidos. Además, el rendimiento y la pureza de las poblaciones de células obtenidas pueden variar en dependencia de la calidad de los tejidos y el resultado digestión.

Recientemente hemos publicado un estudio que demuestra la influencia de las condiciones de cultivo combinado con la caracterización funcional de cada tipo de células NPC aislado por este método 1. La posibilidad de aislar y diferentes poblaciones de células separadas del hígado permite la creación de células de hígado humano co-cultivos innovadores y modelos de ingeniería tisular in vitro del hígado. Es bien sabido que el cultivo de PHH en 2D monocultivos conduce a la desdiferenciación y la pérdida de las funciones celulares típicos 7. Por esta razón es necesario imitar el tejido in vivo architura dentro de los modelos de hígado in vitro. Kostadinova y colaboradores (2013) 8,9, así como Messner y colaboradores (2013) 8,9 establecieron con éxito modelos de hígado de co-cultivo funcionales para la detección de efectos hepatotóxicos. Sin embargo, NPC no se caracterizaron y funciones específicas no fueron investigados en estos sistemas.

Por lo tanto, nuevas investigaciones deberían centrarse en las investigaciones sobre la supervivencia a largo plazo de la APN, sus características específicas y las interacciones dentro de co-cultivos. Para tales estudios, también podría ser de interés para establecer un protocolo para el aislamiento de cholangiocytes. La realización de los funcionales in vitro co-cultivos, incluyendo todos los tipos celulares que figuran en el hígado nativo podría ser un paso más en la dirección de los modelos in vivo como hígado humano.

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Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Liu Jia Li por su apoyo en la creación de la figura 1. Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación y Proyecto de investigación (BMBF) de hígado virtual: 0.315.741.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Equipment
PIPETBOY Eppendorf
pipettes Eppendorf
microscope Carl Zeiss
microscope Olympus
CO2-incubator Binder
Lamin Air Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R Heraeus
Urine Beaker Sarstedt 2041101
perfusor syringe 50 ml B.Braun 12F0482022
Bottle Top Filter Nalgene 1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube BD Biosciences 352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube BD Biosciences 352096
Tissue Culture plate BD Biosciences 533047 24 well
serological pipettes BD Biosciences 357525, 357551, 357543 25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips SARSTEDT 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name Company Catalog Number Comments
Isolation Equipment
water bath Lauda
peristaltic pump Carl Roth
circulation thermostat Lauda
pH meter Schott
fine scales Sartorius
stand
Büchner funnel Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel Feather 12068760
Neubauer counting chamber Optic Labor
cell lifter Costar
Surgical Drape Charité Universitätsmedizin Berlin A2013027
compress Fuhrmann 40013331
sterile surgical gloves Gammex PF 1203441104
Tissue glue B. Braun 1050052
glass bottle VWR
Collagenase P Roche 13349524
Percoll Separating Solution Biochrom L6145 Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS PAA H00911-3938
Dulbecco’s PBS PAA H15 - 002 without Mg/Ca
Ampuwa Plastipur  13CKP151 
Albumin Sigma-Aldrich A7906
NaCl Merck 1,064,041,000
KCl Merck 49,361,000
Hepes Pufferan  Roth 133196836
EDTA Sigma E-5134
Name Company Catalog Number Comments
Media Equipment 
DMEM PAA E15-005 Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M GIBCO 1135546
L-Glutamine GIBCO 25030-024 200 mM
MEM NEAA GIBCO 11140-035
penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
RPMI 1640 PAA E15 - 039 without L-Glutamine
Sodium Pyruvate GIBCO 1137663 100 mM
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154 0.4%
William’s E   GIBCO 32551-020
with GlutaMAX™
EGTA Sigma-Aldrich 03780-50G
Fortecortin Merck 49367 8 mg/2 ml
Human-Insulin Lilly HI0210 100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Fetal calf serum (FCS) PAA A15-101
Name Company Catalog Number Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68 R&D Systems, USA monoclonal
CK 19 Santa Cruz D2309 polyclonal
CK18 Santa Cruz K2105 monoclonal
Vimentin Santa Cruz monoclonal
GFAP Sigma Aldrich monoclonal
Triton X-100 Sigma Aldrich 23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE Santa Cruz C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC Santa Cruz L0412
Methanol J.T.Baker 1104509006
Formaldehyde 4% Herbeta Arzneimittel 200-001-8
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906-100G

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References

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