प्राथमिक मल्टीपल मायलोमा प्रकोष्ठों की दवा संवेदनशीलता की विशेषता के लिए एक Organotypic उच्च Throughput सिस्टम

Medicine

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Silva, A., Jacobson, T., Meads, M., Distler, A., Shain, K. An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells. J. Vis. Exp. (101), e53070, doi:10.3791/53070 (2015).

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Abstract

इस काम में हम मरीज ​​व्युत्पन्न एकाधिक myeloma (एम एम) कोशिकाओं की chemosensitivity और विविधता का अनुमान लगाने के लिए पूर्व vivo दवा संवेदनशीलता assays और डिजिटल छवि विश्लेषण को जोड़ती है कि एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन। यह दृष्टिकोण रोगी हौसले बाह्य मैट्रिक्स (कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) और स्ट्रोमा (सहित प्रत्येक अस्थि मज्जा microenvironment के पुनर्निर्माण से मिलकर, बहु अच्छी तरह प्लेटें में लागू microfluidic कक्षों में अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से निकाले प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं बोने में होते हैं व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल) या मानव व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं (HUVECs)। कक्षों अलग एजेंटों और सांद्रता के साथ नशा कर रहे हैं, और एक डिजिटल कैमरा से लैस एक मोटर चालित माइक्रोस्कोप में, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 96 घंटे के लिए क्रमिक रूप से imaged हैं। डिजिटल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर उपस्थिति या झिल्ली प्रस्ताव के अभाव से रहते हैं और मृत कोशिकाओं का पता लगाता है, और एक समारोह ओ के रूप में व्यवहार्यता में परिवर्तन का घटता उत्पन्न करता हैएफ दवा एकाग्रता और जोखिम समय। हम प्रत्येक दवा ट्यूमर आबादी का chemosensitivity के मापदंडों, साथ ही ट्यूमर विविधता का एक उपाय के रूप में उपस्थित उप आबादी की संख्या निर्धारित करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल मॉडल का उपयोग करें। ये रोगी सिलवाया मॉडल तो चिकित्सीय परहेजों अनुकरण और नैदानिक ​​प्रतिक्रिया का अनुमान किया जा सकता है।

Introduction

इस पद्धति का लक्ष्य है और इन परिणामों chemoresistant उप पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पर्याप्त परिशुद्धता के साथ, शारीरिक स्थितियों के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में, पूर्व vivo एजेंटों के एक पैनल को प्राथमिक कोशिकाओं एकाधिक myeloma (एम एम) की दवा संवेदनशीलता को चिह्नित करने के लिए है ट्यूमर बोझ और, भीतर आबादी अंततः, नैदानिक ​​प्रतिक्रिया का अनुमान लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया कम्प्यूटेशनल मॉडल parameterize करने के लिए।

कम्प्यूटेशनल मॉडल इस तरह के कैंसर मेजबान-चिकित्सा बातचीत के रूप में जटिल प्रणाली, विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। हालांकि, मॉडल केवल डेटा उन्हें parameterize करने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में अच्छा कर रहे हैं। दुर्भाग्य से, साहित्य में उपलब्ध सबसे अधिक डेटा वे अक्सर परस्पर अनन्य प्रयोगात्मक शर्तों में प्राप्त कर रहे हैं, के रूप में इस तरह के मॉडल parameterize करने के लिए अपने मौजूदा रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, नए प्रयोगों अक्सर जरूरत प्रयोगात्मक मापदंडों के सेट प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ आवश्यक हैं। अधिकांश व्यवहार्यता assays के लिए, तथापि, विनाशकारी और वें रहे हैंहमें समय बिंदुओं की एक छोटी संख्या है, जो अक्सर केवल एक सीमित करने के लिए। यह बहुत ऐसे प्रयोगों प्रणाली के अस्थायी गतिशीलता के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने में विफल बाद chemosensitivity assays के उपयोग, कम्प्यूटेशनल मॉडल parameterize करने के लिए बाधाओं। इस बार इस प्रकार उपलब्ध प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या सीमित है, नमूना प्रति कुछ लाखों लोगों के लिए सीमित है, और बायोप्सी के बाद एक कम देता है जो कर रहे हैं प्राथमिक कैंसर की कोशिकाओं, के साथ विशेष रूप से सच है। इसके अलावा, सबसे व्यवहार्यता assays के आगे कोशिकाओं perturbs, और प्रदर्शन किया जा सकता है कि प्रयोगों की संख्या की सीमा, प्रोटोकॉल के लिए अतिरिक्त काम के लिए कहते हैं, जो मात्रा का ठहराव, के समय में गैर कैंसर (स्ट्रोमा) कोशिकाओं से कैंसर की जुदाई की आवश्यकता होती है ।

40 साल पहले, सामन और सहयोगियों 1 ट्यूमर कोशिकाओं के chemosensitivity के आकलन के लिए इन विट्रो कॉलोनी गठन परख में उनकी प्रसिद्ध प्रस्ताव रखा। दुर्भाग्य से इस परख के कारण कई mye की छोटी संख्या को मिश्रित सफलता मिलीनियंत्रण की शर्तों के तहत कालोनियों बनाने में सक्षम थे कि लोमा (एम एम) रोगी के नमूने: यह, मुरली कोशिकाओं के 0.1% के लिए 0.001% की केवल एक छोटा सा उपसमूह प्रतिकृति करने में सक्षम थे कि अनुमान लगाया गया था एकाधिक myeloma स्टेम कोशिकाओं 2 के रूप में कहा जा रहा है। यह महत्वपूर्ण भी अधिक हाल के मॉडल 3 में, परख की सफलता की दर और एक समय में परीक्षण किया जा सकता है कि दवाओं की संख्या सीमित है। (मानक या प्रयोगात्मक) एम एम एजेंटों चार दशक पहले की तुलना में अधिक कई हैं जब यह समस्या अब और अधिक महत्वपूर्ण है।

या तो एक मरीज को एक विशेष दवा के लिए "संवेदनशील" या "प्रतिरोधी" है: इन प्रारंभिक assays के एक प्रमुख सीमा उनके dichotomized उत्पादन होता है। कोई सूचना नहीं ट्यूमर आबादी की संवेदनशीलता और विविधता की डिग्री के बारे में प्रदान की जाती है। इस प्रकार, तेजी से बढ़ रही प्रतिरोधी कोशिकाओं के छोटे उप आबादी के साथ रोगियों के उपचार के लिए "संवेदनशील" के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा, लेकिन शीघ्र ही पतन होता है, और इस तरह नहीं बेनउपचार से efit। कैंसर रोगियों 4,5 के समग्र अस्तित्व (ओएस) में प्रतिक्रिया की अवधि के महत्व को देखते हुए यह इन assays ठीक से लगातार ओएस अनुमान लगाने के लिए सक्षम नहीं थे कि कैसे स्पष्ट है।

आदेश इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए, और दवाओं के एक पैनल के लिए व्यक्तिगत नैदानिक ​​प्रतिक्रिया का अनुमान होता है कि मरीज को विशिष्ट कम्प्यूटेशनल मॉडल उत्पन्न करने के लिए सक्षम होने के लिए में, हम एकाधिक myeloma (एम एम) सेल लाइनों के गैर विध्वंस परीक्षण दवा संवेदनशीलता के लिए एक तरीका विकसित किया है और बाह्य मैट्रिक्स और स्ट्रोमा 6 सहित अस्थि मज्जा microenvironment के एक पूर्व vivo पुनर्निर्माण में प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं। यह परख, हालांकि, जिसका आयाम और लागत के उपकरण का एक दिया टुकड़ा में एक ही बार में प्रदर्शन किया जा सकता है कि प्रयोगों या दवाओं की संख्या सीमित एक विशेष वाणिज्यिक microfluidic स्लाइड, पर भरोसा कर के सीमा थी।

यहाँ वर्णित प्रणाली एक उच्च में इस मूल परख फैलीगैर विध्वंस सेल व्यवहार्यता यों के लिए एक डिजिटल छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म पर आधारित दवाओं की इन विट्रो में स्क्रीनिंग के लिए organotypic खुराक प्रतिक्रिया मंच, -throughput। अच्छी तरह से 384 या 1536 अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स, और रोगी व्युत्पन्न स्ट्रोमा और वृद्धि कारकों सहित अस्थि मज्जा microenvironment के एक 3 डी पुनर्निर्माण है। लाइव माइक्रोस्कोपी और डिजिटल छवि विश्लेषण खुराक प्रतिक्रिया सतहों उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है जो विभिन्न दवा सांद्रता में कोशिका मृत्यु की घटनाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है। इन विट्रो डेटा से, एक गणितीय मॉडल मरीज ​​के ट्यूमर बोझ के भीतर आकार और उप आबादी के chemosensitivity दिखाता है, और ट्यूमर (एक नैदानिक ​​आहार 6 में शारीरिक स्थितियों में दवा (एस) का जवाब होता है कि कैसे अनुकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चित्र 1)।

इस मंच का मुख्य नवाचारों हैं: दवा एकाग्रता प्रति अपेक्षित कैंसर की कोशिकाओं (क) छोटी संख्या (1,000-10,000राशन); (ख) दवा शारीरिक स्थितियों में प्रभावकारिता (बाह्य मैट्रिक्स, स्ट्रोमा, रोगी व्युत्पन्न वृद्धि कारकों) के आकलन; (ग) केवल उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के बाद से व्यवहार्यता मार्करों 7 से कोई विषाक्तता, प्रतिदीप्ति 8 या 9 bioluminescence के साथ कोशिकाओं transfect करने के लिए इस प्रकार की कोई जरूरत नहीं प्रयोग किया जाता है; (घ) निरंतर इमेजिंग एकाग्रता और जोखिम समय (pharmacodynamics) के एक समारोह के रूप में नशीली दवाओं के प्रभाव प्रदान करता है; और (ई) में इन विट्रो और कम्प्यूटेशनल विकास के मॉडल के बीच एकीकरण, नैदानिक ​​परिणाम 6 (सिल्वा एट अल।, तैयारी में) अनुमान लगाने के लिए।

डिजिटल छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म stromal कोशिकाओं से कैंसर विचार करने के लिए अनुमति देता है कि महत्वपूर्ण कारक के नीचे करने के लिए उनके अलग अलग आकर्षण है अच्छी तरह से: एम एम कोशिकाओं का पालन करना, और stromal कोशिकाओं के नीचे का पालन करते हुए, मैट्रिक्स में निलंबन में नहीं रहते हैं अच्छी तरह से और फिर खिंचाव।

इस जुदाई भी एमएम और स्ट्रोमा एक यद्यपि होती हैएक ही समय में वरीयता प्राप्त है, और ऊष्मायन के हे / एन प्रक्रिया के दौरान होता है फिर से। थाली के सेंट्रीफ्यूज में नीचे कताई निम्नलिखित बोने आगे इस प्रक्रिया accelerates। स्ट्रोमा एक कम प्रोफ़ाइल और एक गहरा शेड (चित्रा 2) का कहना है जबकि एक परिणाम के रूप में, एम एम कोशिकाओं, एक अंधेरे अंगूठी से घिरा दौर उज्ज्वल डिस्क के रूप में छवि में दिखाई देते हैं। एल्गोरिथ्म में समायोजन इस तरह के आकार और आकार के रूप में अन्य भागों सुविधाओं के आधार पर अलग कैंसर और स्ट्रोमा के लिए किया जा सकता है, हालांकि इस प्रकार, अपने मौजूदा रूप में परख, गैर पक्षपाती कोशिकाओं के कैंसर के लिए सबसे उपयुक्त है। इस प्रोटोकॉल में हम (अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल) BMSC और HUVECS, अस्थि मज्जा के मध्य और परिवाहकीय आलों का प्रतिनिधित्व करने के साथ, बाह्य मैट्रिक्स (कोलेजन और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) के दो प्रकार के साथ ही सह संस्कृतियों के दो प्रकार का वर्णन , क्रमशः।

384 अच्छी तरह से थाली का प्रयोग, दवा प्रति 5 सांद्रता और दो प्रतिकृति, हम टीईएस करने में सक्षम थेएक भी मरीज के नमूने के साथ 31 विभिन्न दवाओं के लिए टी। पूरक चित्रा 1 एक रोबोट pipettor का उपयोग इष्टतम वितरण का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि 1536 अच्छी तरह प्लेटें में यह संख्या 3 वर्तमान में मैनुअल सेल बोने के लिए इस्तेमाल किया लेआउट को दर्शाया गया है 127. आंकड़ा है। चित्रा 3 से डिजाइन में, प्रत्येक 384 अच्छी तरह से थाली 21 दवाओं के साथ परीक्षण किया 7 विभिन्न दवाओं, या एक रोगी के नमूने के साथ 3 रोगी के नमूने ले जा सकता है। प्रत्येक दवा 5 सांद्रता का प्रतिनिधित्व करती है, और हर हालत डुप्लिकेट में वरीयता प्राप्त है। 4 नियंत्रण कुओं (कोई दवा जोड़ा) 7 दवाओं (जैसे, कुओं 36-39, 126-129 और 200-203) के प्रत्येक सेट के लिए वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। इस्तेमाल दवाओं की शक्ति सुनिश्चित करने के लिए एक मानव मायलोमा सेल लाइन (जैसे, H929 या MM1.S) को भी वरीयता प्राप्त है, और (कुओं 76-89) का इस्तेमाल किया दवाओं में से प्रत्येक के सर्वोच्च एकाग्रता पर डुप्लिकेट में नशा है। सकारात्मक सेल लाइन नियंत्रण उनकी खुराक प्रतिक्रिया घटता तुलनीय एसी रहे हैं के बाद से इस्तेमाल किया दवाओं, पर्याप्त शक्ति सुनिश्चित करता है किरॉस प्रयोगों। दो कुओं (कुओं 75 और 90) इमेजिंग के दौरान बेंच शीर्ष इनक्यूबेटर में संभव समस्याओं का पता लगाने के लिए, दूसरे शब्दों में, पर्यावरण की स्थिति के लिए नियंत्रण के रूप में एक मायलोमा सेल लाइन के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। कुओं की गणन अधिग्रहण के समय को कम करता है और उपकरणों के पहनने कम कर देता है जो माइक्रोस्कोप की मोटर चालित चरण, द्वारा तय दूरी को कम करने के क्रम में एक वक्र पैटर्न इस प्रकार है।

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Protocol

नीचे वर्णित मोफिट के संस्थागत समीक्षा बोर्ड ने मंजूरी दे दी है और एच ली मोफिट कैंसर केंद्र और अनुसंधान संस्थान में आयोजित क्लिनिकल परीक्षण एमसीसी # 14,745 के तहत आयोजित किया गया था के रूप में बायोप्सी से निकाली गई मानव कोशिकाओं का उपयोग करें।

अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से एम.एम. प्रकोष्ठों के 1. छंटनी

  1. सोडियम हेपरिन सिरिंज में रोगियों से अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस (20 मिलीग्राम) ले लीजिए।
  2. परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर एक बाँझ जलीय मध्यम centrifugation के ढाल से अधिक: (बाँझ पीबीएस के साथ 1 1) पतला मज्जा centrifuging द्वारा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग।
  3. मोनोन्यूक्लियर सेल शामिल हैं जो इंटरफेस है, ले लीजिए। व्यवहार्यता के निर्धारण के लिए trypan नीले रंग का उपयोग कर, ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग गिनती।
  4. प्लाज्मा सेल प्रतिशत 11 का आकलन करने के लिए राइट-Giemsa दाग के साथ एक पतली परत सेल तैयार स्लाइड 10 और दाग तैयार करें।
  5. गणनाCD138 मोतियों की राशि के आधार कोशिकाओं और प्लाज्मा सेल प्रतिशत की संख्या इस्तेमाल किया जाएगा। नमूना शुरू कर कम से कम 20% प्लाज्मा कोशिकाओं है, तो जुदाई बफर के 90 μl और 5 x 10 6 कोशिकाओं प्रति CD138 मोतियों की 10 μl का उपयोग कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं। नमूना शुरू कर 20% से अधिक प्लाज्मा कोशिकाओं है, तो जुदाई बफर के 80 μl और 1 10 x 7 कोशिकाओं प्रति CD138 मोतियों की 20 μl का उपयोग कर resuspended।
  6. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मोती के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. एक 35 माइक्रोन झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को पूर्व गीला जुदाई जोड़ा दर्रा (रास) कॉलम (सामग्री की सूची देखें) चुंबकीय क्षेत्र विभाजक में रखा।
  8. चुंबक से स्तंभ निकालें। जुदाई बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कॉलम 3 बार धोने से CD138-चयनित कोशिकाओं को इकट्ठा।
  9. 10 स्लाइड एक और दाग पतली परत सेल तैयारी के साथ CD138 संवर्धन का आकलन करें।
  10. फ़िल्टर प्लाज्मा 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ प्रत्येक रोगी से अस्थि मज्जा बायोप्सी से प्राप्त की। ताजा प्लाज्मा का प्रयोग करेंCD138 + कोशिकाओं के रूप में एक ही मरीज से।
  11. 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 10% रोगी प्लाज्मा और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ RPMI-1640 सप्लीमेंट द्वारा प्रयोग के लिए मीडिया को तैयार है।
  12. चयन (CD138-) के प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और अस्थि मज्जा mesenchymal कोशिकाओं (BMSCs) के लिए चयन करने के लिए शास्त्रीय विधि आसंजन 12 का पालन करें। BMSCs इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं इससे पहले इस प्रक्रिया को सप्ताह की आवश्यकता है, यह पिछले रोगियों या स्वस्थ दाताओं से BMSCs तैयार करने के लिए आवश्यक है।

(एक मैनुअल मल्टी चैनल pipettor का उपयोग) प्लेट्स में 2. सीडिंग प्रकोष्ठों

  1. अधिमान्यतया एक ऑप्टिकल अनुप्रयोगों और सेल संस्कृति के लिए अनुकूलित काली दीवारों के साथ एक बहु अच्छी तरह से थाली (384 या 1536) और एक पारदर्शी फ्लैट नीचे, का प्रयोग करें।
  2. कोलेजन प्रकार मैं या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में या तो सह संस्कृति BMSCs साथ एम.एम. कोशिकाओं, हालांकि, HUVECs तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की आवश्यकता होती है।
  3. में प्रत्येक कोशिका प्रकार की अंतिम घनत्व रखेंनिम्न श्रेणी: मिमी सेल लाइनों के लिए 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल, HUVECs या BMSCs के लिए 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल, और रोगी व्युत्पन्न एमएम की कोशिकाओं के लिए 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल।
    नोट: ये घनत्व assays में जैविक प्रासंगिकता को बनाए रखते हुए उच्चतम संभव छवि गुणवत्ता और सबसे लंबे समय तक संभव इमेजिंग समय के लिए अनुमति देने के लिए प्रयोगात्मक अनुकूलन के परिणाम हैं। एम एम सेल लाइनों उनके तेजी से प्रतिकृति दर और बड़े आकार की वजह से प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं की तुलना में कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं।
  4. BMSCs के साथ प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं के सह संस्कृति:
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x सदस्य के 20 μl, विआयनीकृत एच 2 ओ के 20 μl, 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 10 μl, और 1x RPMI 1,640 के 50 μl और दुकान से मिलकर पूर्व मिश्रित मीडिया के 100 μl aliquots तैयार करें।
    2. एम.एम. कोशिकाओं के साथ प्लेटों बोने के समय, 250 μl के अंतिम मात्रा 3.1 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय कोलेजन प्रकार मैं के 150 μl के साथ पूर्व मिश्रित मीडिया की aliquots मिश्रण।
    3. पुन: Susp केछह बार फाइनल में वांछित घनत्व पर RPMI 1,640 में कोशिकाओं के 50 μl खत्म होता है।
    4. एक P200 पिपेट का उपयोग कर 300 μl के अंतिम मात्रा बनाने के लिए कोलेजन मिश्रण के साथ सेल निलंबन के लिए मिलाएं।
    5. एक मैनुअल या अपराधी पिपेट का उपयोग करना, अच्छी तरह से 1536 में अच्छी तरह से प्लेट (स्थानिक व्यवस्था का एक उदाहरण के लिए कदम 2.6 देखें का प्रत्येक कुएं में 384 अच्छी तरह प्लेटें, या 2 μl में प्रत्येक के केंद्र में / मैट्रिक्स मिश्रण अंतिम सेल के 8 μl ड्रॉप जमा कुओं की)।
    6. 500 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र प्लेट इमेजिंग के दौरान ही फोकल हवाई जहाज़ के लिए सभी कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करने के लिए।
    7. जेल polymerization के लिए, 1 घंटे के लिए एक मशीन (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) में थाली छोड़ दें।
    8. 1536 अच्छी तरह से प्लेट में पूरक विकास मीडिया के 80 μl (RPMI-1640, 10% FBS के हाय, 10% रोगी व्युत्पन्न प्लाज्मा, 1% पी / एस) प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से में 384 अच्छी तरह प्लेटें, या 8 μl जोड़ें।
    9. थाली हे / एन स्ट्रोमा के आसंजन के लिए इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) में प्लेट के नीचे करने के लिए छोड़ दें।
  5. सह-घनHUVECs के साथ प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं के lture:
    1. बर्फ के साथ एक बाल्टी के लिए -80 डिग्री सेल्सियस से स्थानांतरण तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिघलना करने के लिए।
    2. गणना और एक अलग ट्यूब में 4 बार फाइनल घनत्व, प्रत्येक में RPMI-1640 मीडिया में प्राथमिक कोशिकाओं और HUVECs फिर से निलंबित।
    3. 1 अनुपात: एक 1 पर मरीज की कोशिकाओं और HUVECs संस्करणों मिलाएं।
    4. पिछले चरण से सेल मिश्रण के साथ 1: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स thawed, लेकिन अभी भी polymerized नहीं है, एक बार 1 मिश्रण।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक के केंद्र में सेल-मैट्रिक्स मिश्रण की पर्याप्त मात्रा के साथ बीज बूंदों (384 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 8 μl और 1536 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 2 μl, कुओं की स्थानिक व्यवस्था का एक उदाहरण के लिए कदम 2.6 देखें)।
    6. 10 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र थाली।
    7. इनक्यूबेटर में प्लेस थाली मैट्रिक्स polymerization के लिए 1 घंटे के लिए (5% सीओ 2, 37 सी)।
    8. विकास मीडिया जोड़ें, 384 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए (प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 80 μl (RPMI-1640 10% FBS के, 10% रोगी प्लाज्मा और 1% पी / एस के साथ पूरक) 1,5 के लिए 8 μl36 अच्छी तरह से प्लेट)।
    9. प्लेट के नीचे करने के HUVECs के आसंजन के लिए इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) में थाली हे / एन छोड़ दें।
  6. । एक 384 अच्छी तरह से थाली बीज 3 बोने के एक ठेठ स्थानिक वितरण दर्शाया गया चित्र।
    1. दवाओं का परीक्षण किया जा करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से B2 पर प्रारंभ हो, के रूप में कई कॉलम बीज। चित्रा 3 के उदाहरण में, सात दवाओं का उपयोग करें।
    2. सांद्रता के रूप में रूप में कई बार बोने दोहराएँ इस्तेमाल किया जाएगा। चित्रा 3 में उदाहरण में, पाँच सांद्रता का उपयोग करें।
    3. नियंत्रण स्थितियों के लिए चार और कुओं बीज।
    4. दोहराएँ 2.6.1 और दूसरे को दोहराने के लिए 2.6.2 कदम।
    5. दोहराएँ हर मरीज का नमूना थाली में परीक्षण किया जा करने के लिए 2.6.4 करने के लिए 2.6.1 कदम।
    6. दवाओं (दो प्रतियों में) का परीक्षण किया जा करने के लिए के रूप में कई कुओं के साथ कुओं की दो लाइनों, प्रत्येक में एक मिमी सेल लाइन बीज। इन कुओं में से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया स्टॉक पर्याप्त poten था कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक दवा के सर्वोच्च एकाग्रता के साथ इलाज किया जाएगाcy (उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें)।
    7. एक मिमी सेल लाइन के साथ बीज दो कुओं आदि बेंच शीर्ष इनक्यूबेटर के समुचित कार्य, विकास मीडिया, के रूप में प्रयोगात्मक शर्तों के नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।

3. प्लेट्स में कोशिकाओं सीडिंग (एक रोबोट pipettor का उपयोग)

नोट: चरणों बीज की इस श्रृंखला में एक रोबोट pipettor का उपयोग एक 384 अच्छी तरह से थाली। थाली के डिजाइन प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं दो प्रतिकृति में पांच अलग सांद्रता में 31 विभिन्न दवाओं के एक पैनल के खिलाफ जांच की जाती है जहां से पूरक चित्रा 1,, प्लस नकारात्मक नियंत्रण में दिखाया गया है। एक सेल लाइन भी दवा की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में वरीयता प्राप्त और दो प्रतिकृति में, सर्वोच्च एकाग्रता में सभी 31 दवाओं के खिलाफ जांच कर रहा है। प्रदान की फ़ाइलों को एक विशेष ब्रांड और मॉडल के लिए कर रहे हैं (सामग्री तालिका देखें) लेकिन एल्गोरिथ्म किसी भी रोबोट Pipettors करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. प्राथमिक मिमी सेल के सह संस्कृतिBMSCs साथ एस:
    1. 10x सदस्य के 240 μl, विआयनीकृत एच 2 ओ के 240 μl, 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 120 μl, 600 1x RPMI 1,640 के μl और 1.8 मिलीलीटर 3.1 मिलीग्राम की / एमएल गोजातीय कोलेजन प्रकार मैं लेबल से मिलकर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब तैयार "CD138 + के लिए पूर्व मिश्रण" के रूप में ट्यूब। बर्फ पर उपयोग करें जब तक रखें।
    2. 10x सदस्य के 50 μl, विआयनीकृत एच 2 ओ के 50 μl, 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 25 μl, 1x RPMI 1,640 के 125 μl और 3.1 मिलीग्राम की 375 μl से मिलकर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब तैयार / एमएल गोजातीय कोलेजन प्रकार मैं लेबल "सेल लाइन के लिए पूर्व मिश्रण" के रूप में ट्यूब। बर्फ पर उपयोग करें जब तक रखें।
    3. छह बार फाइनल में वांछित घनत्व पर RPMI 1,640 में CD138 + कोशिकाओं के 300 μl फिर से निलंबित। छह बार फाइनल में वांछित घनत्व पर RPMI 1640 में BMSC कोशिकाओं के 300 μl फिर से निलंबित। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और लेबल "CD138 + 'में एक साथ दोनों संस्करणों मिलाएं। इनक्यूबेटर में उपयोग करें जब तक रखें।
    4. 60 μl पुनः निलंबितछह बार फाइनल में वांछित घनत्व पर RPMI 1640 में सेल लाइन। छह बार फाइनल में वांछित घनत्व पर RPMI 1640 में BMSC कोशिकाओं के 60 μl फिर से निलंबित। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और लेबल "सेल लाइन 'में एक साथ दोनों संस्करणों मिलाएं। इनक्यूबेटर में उपयोग करें जब तक रखें।
    5. रोबोट pipettor के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, पहले स्क्रिप्ट फ़ाइल, "cell_seedingPt47.PGM" लोड। रोबोट की, क्रमशः, स्टेशनों ए, बी और ई में एक 200 μl विंदुक टिप बॉक्स, एक microtiter प्लेट, और एक बाँझ 384 अच्छी तरह से थाली रखें।
    6. ट्यूब की सामग्री और "CD138 +" "CD138 + के लिए पूर्व मिश्रण" मिलाएं। Microtiter प्लेट की अच्छी तरह से # 1 के लिए अपनी सामग्री के 1.5 एमएल हस्तांतरण। बर्फ पर मात्रा शेष के साथ ट्यूब रखें। कार्यक्रम की शुरुआत करें। रोबोट 384 अच्छी तरह से थाली के पहले 176 कुओं (11 बाएँ सबसे कॉलम) बीज और फिर रुकेगा। Microtiter प्लेट की अच्छी तरह से # 2 के लिए बर्फ पर ट्यूब के शेष स्थानांतरण। कार्यक्रम फिर से शुरू।रोबोट 384 अच्छी तरह से थाली और ठहराव के शेष 144 कुओं बीज जाएगा।
    7. ट्यूब की सामग्री "सेल लाइन के लिए पूर्व मिश्रण" और "सेल लाइन" मिश्रण और microtiter प्लेट की अच्छी तरह से # 3 के लिए सामग्री हस्तांतरण। कार्यक्रम फिर से शुरू। रोबोट 384 अच्छी तरह से थाली के शेष 64 कुओं बीज जाएगा।
    8. 500 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रीफ्यूज में 384 अच्छी तरह से थाली रखें। स्थानांतरण थाली कोलेजन polymerization के लिए 1 घंटे के लिए (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) इनक्यूबेटर।
    9. दूसरी स्क्रिप्ट फ़ाइल, "media_layer.PGM" लोड। 120 μl विंदुक टिप बॉक्स, 10% FBS के, 10% रोगी प्लाज्मा और 1% पी / एस के साथ पूरक RPMI-1640 के 31 मिलीलीटर के साथ एक अभिकर्मक जलाशय, और स्टेशनों ए, बी और ई में कोशिकाओं के साथ 384 अच्छी तरह से थाली प्लेस क्रमशः। कार्यक्रम चलाओ। रोबोट में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए मीडिया के 81 μl हस्तांतरण होगा। समाप्त होने पर, / एन ओ सब्सट्रेट करने के लिए पालन करने के लिए स्ट्रोमा इनक्यूबेटर और अनुमति देने के लिए 384 अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण।
  2. 4. ड्रग तैयारी और प्लेट्स के Drugging (एक मैनुअल मल्टी चैनल pipettor का उपयोग)

    1. वेल्स को दवा जोड़ने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने और भ्रम की संभावना को कम करने के क्रम में 3 चित्रा करने के लिए इसी तरह की एक टेम्पलेट तैयार करें।
    2. एक 96 अच्छी तरह से थाली में, दवाओं में से प्रत्येक के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने 3 गुना कमजोर पड़ने का उपयोग करते हुए पाँच सांद्रता के लिए, उदाहरण के लिए, थाली में परीक्षण किया जा करने के लिए, तैयार:
      1. अच्छी तरह से 10x पर सर्वोच्च एकाग्रता में वांछित एकाग्रता दवा के 120 μl जोड़ें। कोशिकाओं की थाली में उजागर किया जाएगा सर्वोच्च एकाग्रता 50 माइक्रोन होगा अगर उदाहरण के लिए, 500 माइक्रोन melphalan का उपयोग करें।
      2. विकास मीडिया के 80 μl जोड़ें चार बाद कुओं (RPMI 10% FBS, 10% रोगी व्युत्पन्न प्लाज्मा और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक)।
      3. स्थानांतरण दूसरे के लिए सबसे पहले अच्छी तरह से 40 μl और पहले अच्छी तरह से की दवा एकाग्रता का 1/3, या 1 पर 120 μl की कुल मात्रा के लिए, मिश्रण67 माइक्रोन।
      4. शेष कुओं को दोहराएँ चरण 4.2.3 (उदाहरण के लिए, तीसरे, मिश्रण करने के लिए दूसरे से 40 μl हस्तांतरण, फिर तीसरे चौथे, आदि से 40 μl हस्तांतरण)।
    3. सेल थाली में अच्छी तरह से करने के लिए इसी अच्छी तरह से युक्त प्रत्येक दवा से 8 μl स्थानांतरण। अच्छी तरह से युक्त प्रत्येक दवा सेल थाली में 10 कुओं के लिए पर्याप्त मात्रा होनी चाहिए। चित्रा 3 के उदाहरण में, प्रत्येक दवा एकाग्रता 8 कुओं में जोड़ा जाता है जो सर्वोच्च एकाग्रता, के लिए छोड़कर, 6 अलग कुओं में जोड़ा जाता है।
    4. विकास मीडिया के 8 μl जोड़ें नियंत्रण कुओं (RPMI 10% FBS, 10% रोगी व्युत्पन्न प्लाज्मा और 1% पी / एस के साथ पूरक)।
    5. माइक्रोस्कोप में रखें कोशिकाओं के रूप में जल्द ही तैयार के रूप में और बेंच शीर्ष ऊष्मायन पर बारी।

    प्लेट्स 5. ड्रग तैयारी और Drugging (एक रोबोट pipettor का उपयोग)

    1. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS फाई से रोबोट pipettor के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलें डाउनलोड करेंles.zip
    2. रोबोट pipettor का यूजर इंटरफेस में स्क्रिप्ट "media_layer_DRUGPLATE.PGM" लोड। एक 120 μl विंदुक टिप बॉक्स, 10% FBS के, 10% रोगी प्लाज्मा और 1% पी / एस और स्टेशनों क्रमश: ए, बी और ई, में एक खाली 384 अच्छी तरह से थाली के साथ पूरक RPMI-1,640 के 21 मिलीलीटर के साथ जलाशय रखें। कार्यक्रम चलाने के लिए, रोबोट pipettor के 384 अच्छी तरह से थाली में सभी कुओं के लिए मीडिया के 30 μl जोड़ देगा।
    3. पूरक चित्रा 2 से टेम्पलेट के बाद एक microtiter प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए 20x अधिकतम एकाग्रता में दवा के 200 μl जोड़ें। इस सेटअप 31 दवाओं के लिए ऊपर रह सकता है। नियंत्रण अच्छी तरह से (Ctrl) करने के लिए, 10% FBS के, 10% रोगी प्लाज्मा और 1% पी / एस के साथ पूरक RPMI-1640 जोड़ें।
    4. स्टेशनों क्रमश: ए, बी और सी में (5.1 कदम से) मीडिया के साथ 384 अच्छी तरह से 20X एकाग्रता में दवाओं के साथ एक 120 μl विंदुक टिप बॉक्स, microtiter प्लेट प्लेस, और। कार्यक्रम "drug_plate.PGM" लोड। रोबोट pipettor का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाएगापूरक चित्रा 1 में स्थानिक वितरण निम्नलिखित 3: 1 की।
    5. एक 120 μl विंदुक टिप बॉक्स, स्टेशनों क्रमश: ए, बी और सी, में दवा (5.3 कदम से) कमजोर पड़ने और (चरण 3.1.9) से कोशिकाओं के साथ 384 अच्छी तरह से थाली के साथ 384 अच्छी तरह से थाली रखें। लोड और रन प्रोग्राम "drug_add.PGM"। रोबोट pipettor का सेल थाली में अपने समकक्ष के लिए दवा की थाली में हर अच्छी तरह से दवा के 8 μl हस्तांतरण होगा। समाप्त होने पर, जितनी जल्दी हो सके डिजिटल माइक्रोस्कोप की इनक्यूबेटर करने के लिए सेल प्लेट हस्तांतरण।

    प्लेट में कोशिकाओं के 6. इमेजिंग

    नोट: नीचे की प्रक्रिया EVOS ऑटो फ्लोरिडा खुर्दबीन के लिए लागू होता है, लेकिन आसानी से बेंच शीर्ष ऊष्मायन या इनक्यूबेटर एम्बेडेड सूक्ष्मदर्शी के साथ अन्य मोटर चालित चरण सूक्ष्मदर्शी करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

    1. साथ बेंच शीर्ष इनक्यूबेटर का इंटीरियर साफ एक इथेनॉल-गीले पोंछे और ध्यान से उद्योग जगत के ढक्कन देते हुए प्लेट के ढक्कन हटाubator।
    2. बीकन जोड़ने के लिए सॉफ्टवेयर चरणों का पालन करें। यह ब्याज के क्षेत्रों के लिए स्थलों का उल्लेख किया जाता शब्द है, प्रयोग (विवरण के लिए सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता गाइड देखें) के दौरान क्रमिक imaged किया जाना है।
    3. एक 5x या 10x बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग करें। फोकस 2 चित्रा के समान है: सुनिश्चित करें कि एम.एम. कोशिकाओं को एक अंधेरे अंगूठी और BMSCs या HUVECs मुश्किल से दिखाई दे रहे हैं से घिरा के रूप में उज्ज्वल डिस्क दिखाई देते हैं। कुछ प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं बहुत छोटा है और इस तरह एक ठीक ट्यूनिंग इष्टतम फोकस खोजने के लिए आवश्यक हो सकता है कर रहे हैं।
    4. 10-30 मिनट के बीच और कम से कम 96 घंटे की अवधि के लिए अधिग्रहण के अंतराल को समायोजित करें। अधिग्रहण के बीच लंबे समय तक के अंतराल से स्वीकार्य हैं, 45 मिनट या अधिक के अंतराल में काफी व्यवहार्यता की माप की शुद्धता को कम कर सकते हैं।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से की छवियों बीकन -1, बीकन -2, आदि रोबोट pipettor का इस्तेमाल किया गया था, तो नामित अलग फ़ाइलों में जमा हो जाती है कि इतने में दर्शाया क्रम में बीकन सेट, सॉफ्टवेयर विन्यास करेंपूरक चित्रा 3।
    6. कोशिकाओं इष्टतम स्थितियों में हो जाएगा तो यह है कि इनक्यूबेटर humidifier और गैस में पर्याप्त पानी है, वहाँ है कि सुनिश्चित करें।
    7. प्रयोग के पूरा होने पर, विश्लेषण चलेगा कंप्यूटर के लिए छवियों वाले फ़ोल्डरों की नकल।

    दवा संवेदनशीलता की मात्रा 7.

    नोट: निम्न निर्देश एक पर्सनल कंप्यूटर में एक बहु अच्छी तरह से थाली के विश्लेषण के बाद से, एक कंप्यूटर क्लस्टर का उपयोग कर छवि विश्लेषण के उपयोग के लिए गाइड बहुत समय लगता है।

    1. एनआईएच की वेबसाइट से ImageJ सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें: http://imagej.nih.gov/ij/
    2. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ पर स्क्रिप्ट और plugins डाउनलोड
    3. डिजिटल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf निर्देश का पालन करें। परिणाम पूर्वी वायु कमान के लिए नियमित अंतराल पर व्यवहार्यता माप युक्त Results.csv नाम के एक स्प्रेडशीट होना चाहिएप्रयोग (यानी, 96 घंटा) की अवधि के लिए थाली में एच अच्छी तरह से।
    4. एक मैनुअल मल्टी चैनल pipettor का उपयोग करते हैं, तो निम्न चरणों का प्रदर्शन करते हैं।
      1. फ़ाइल http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt डाउनलोड करें और 3.1 कदम में परिभाषित थाली के लेआउट मैच के लिए इसे संशोधित (जैसे, चित्रा 3)।
      2. सॉफ्टवेयर http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar डाउनलोड और कदम इनपुट पैरामीटर के रूप में 5.3 और 5.4 में बनाई गई फ़ाइलों का उपयोग कर इसे चलाते हैं। परिणाम कई स्प्रेडशीट वाले फ़ोल्डर के नाम रिपोर्ट, प्रत्येक एक विशेष दवा के लिए परिणाम समूहीकरण किया जाएगा।
      3. स्प्रेडशीट टेम्पलेट http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx में कॉपी और पेस्ट सामग्री
        नोट: परिणाम ऐसी दवा एकाग्रता और जोखिम समय के एक समारोह के रूप में विभिन्न दवाओं के नमूने की chemosensitivity का प्रतिनिधित्व चित्रा 4 में दिखाया गया एक के रूप में रेखांकन किया जाना चाहिए।
      4. </ राजभाषा>
      5. एक रोबोट pipettor का उपयोग करते हैं, तो निम्न चरणों का प्रदर्शन करते हैं।
        1. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic खाका Files.zip से रोबोट pipettor के लिए डाउनलोड स्क्रिप्ट फाइलों से टेम्पलेट फ़ाइलों को डाउनलोड करने और एक निर्देशिका में फ़ाइलों को निकालने के।
        2. कोशिकाओं के साथ थाली में दवाओं की सूची और उच्चतम दवा एकाग्रता के अनुसार DrugList.csv फ़ाइल को संशोधित करें। पूरक चित्रा 2 के लेआउट का पालन करें।
        3. पैरामीटर के रूप में कदम 7.3 से कदम 7.5.1 में निकाली गई फ़ाइलों और फ़ाइलों Results.csv वाले फ़ोल्डर गुजर कार्यक्रम BuildExperimentalDesign.java चलाएँ। परिणाम दो फ़ोल्डरों MM1_S और PtSample नाम होना चाहिए। पहली सेल लाइन सकारात्मक नियंत्रण के लिए कुओं (ड्रग्स और सांद्रता) के एक विवरण शामिल हैं। दूसरा मरीज की कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त थाली के हिस्से के बारे में ही जानकारी है, लेकिन होता है।
        4. कदम 7.5.3 में बनाया निर्देशिका में से प्रत्येक में फ़ाइल Results.csv कॉपी करें। डाउनलोडसॉफ्टवेयर http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar और दोनों फ़ोल्डर के लिए कदम 7.5.3 में बनाई गई फ़ाइलों का उपयोग कर इसे चलाते हैं। परिणाम 7.5.3 में निर्मित फ़ोल्डर में से प्रत्येक में एक फ़ोल्डर का नाम रिपोर्ट किया जाएगा। रिपोर्ट फ़ोल्डर प्रत्येक एक विशेष दवा के लिए परिणाम समूहीकरण, कई स्प्रेडशीट शामिल हैं।
        5. कार्यक्रम BuildGraphPadFile.java चलाने के लिए और पैरामीटर के रूप में कदम 7.5.1 में निकाली गई फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर पास और फ़ाइलों कदम 7.3 से Results.csv। परिणाम नियंत्रण से एक GraphPad 31 दवाओं में से प्रत्येक के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता युक्त फ़ाइल, और सामान्यीकृत किया जाएगा। प्रत्येक चार्ट प्राथमिक एमएम की कोशिकाओं के लिए 5 दवा सांद्रता और सकारात्मक सेल लाइन पर नियंत्रण के लिए एक एकाग्रता में शामिल होंगे।

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Representative Results

प्रयोग के प्रवाह को संक्षेप में चित्रा 1 में वर्णित सभी चरणों को सफलतापूर्वक पूरा कर रहे हैं, तो माइक्रोस्कोप से प्राप्त छवियों 2 चित्रा के बराबर होना चाहिए:। एम.एम. कोशिकाओं स्पष्ट रूप से के रूप में उज्ज्वल डिस्क और BMSCs या HUVECs मुश्किल से दिखाई जानी चाहिए देखा जाना चाहिए जीना और अच्छी तरह से पृष्ठभूमि में वितरित की। 2A चित्रा में देखा, एम.एम. कोशिकाओं एक रोगी से दूसरे से आकार में सीमा, लेकिन सामान्य तौर पर वे सेल लाइनों की तुलना में छोटे होते हैं। वे व्यावहारिक प्रयोग के अंतराल के दौरान पूर्व vivo नहीं दोहराने के बाद से (96 घंटा) वे उच्च सांद्रता (1-3 मिलियन कोशिकाओं / एमएल) पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। BMSC एक कम प्रोफ़ाइल पेश, अच्छी तरह से और खिंचाव के नीचे का पालन के रूप में स्ट्रोमा, मुश्किल से पहचाने होना चाहिए। मानव मायलोमा सेल लाइन H929 रोगी व्युत्पन्न एम.एम. कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) की तुलना में काफी बड़ा है, और 24 घंटे के भीतर replicates। छवि की भीड़ को रोकने के लिए, एम एम सेल लाइनों देख रहे हैंएक कम घनत्व, 0.3 लाख / मिलीलीटर ded। -2 सी और 2 डी रोगी व्युत्पन्न एम.एम. कोशिकाओं और मानव मायलोमा सेल लाइनों H929 का प्रतिनिधित्व करते हैं आंकड़े, क्रमशः, सह सुसंस्कृत HUVECS साथ। HUVECS पहले अच्छी तरह से नीचे का पालन करना और फिर बाद में मोटा और साथ में lumens बन जो एक दूसरे को और फार्म नेटवर्क, से संपर्क करने के लिए शुरू करते हैं।

चित्रा 4 प्रयोग के अंत में BMSCs और HUVECs में नहीं या बहुत कम हरी झंडी के साथ हरी (चित्रा -4 ए) में छद्म रंग लाइव एम.एम. कोशिकाओं का पता चला दिखा रहा है, छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म द्वारा उत्पन्न संसाधित वीडियो से उम्मीद की जा रही है क्या मिसाल उच्चतम दवा एकाग्रता, सभी एम.एम. कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) मर रहे हैं जब में। सॉफ्टवेयर अलग कुओं से परिणाम समग्र और विभिन्न दवा सांद्रता (चित्रा 4C) में जोखिम के समय के साथ व्यवहार्यता का ह्रास का चित्रण एक चार्ट का निर्माण करना चाहिए। की खुराक प्रतिक्रिया की वक्रनियंत्रण सेल लाइन (जैसे, H929 या MM1.S) पिछले प्रयोगों के लिए के रूप में ही किया जाना चाहिए; महत्वपूर्ण विचलन प्रयोग में इस्तेमाल दवा के स्टॉक समाधान के साथ समस्याओं का संकेत हो सकता है।

कलाकृतियों छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को गुमराह और झूठे परिणामों को जन्म दे सकती, क्योंकि यह ध्यान से इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करने से पहले वरीयता प्राप्त सभी कुओं का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5A clumps के गठन में इन कोशिकाओं के लिए अग्रणी। चित्रा 5 ब एम.एम. कोशिकाओं के "कालोनियों" पता चलता है, trypsinization और बोने के बीच गुजरे अच्छी तरह से या बहुत अधिक समय में BMSCs का एक अत्यधिक घनत्व के परिणाम से पता चलता है। सेल लाइनों उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं तो यह एक दूसरे से सेल विचार करने के लिए तेजी से मुश्किल हो जाता है, के रूप में वे दोहराने के रूप में वे कालोनियों के रूप में होगा और इस डिजिटल छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म की सटीकता कम कर देता है। चित्रा 5C विपरीत, जहां का एक उदाहरण है बहुत कुछ मिमी कोशिकाओं वरीयता प्राप्त थे। टीअस्थि मज्जा महाप्राण से प्राप्त एम.एम. कोशिकाओं की संख्या से नीचे 500,000 है, और फिर से निलंबन से पहले ट्यूब में छोड़ दिया "मृत मात्रा" उच्च घनत्व में एम एम कोशिकाओं फिर से निलंबित करने के लिए आवश्यक मीडिया की मात्रा करने के लिए तुलनीय हो जाता है जब उसकी अक्सर तब होता है । इस समस्या को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा ट्यूब के लिए मृत मात्रा का निर्धारण और यह कमजोर पड़ने की गणना में शामिल हैं। चित्रा 5D विषम फोकल हवाई जहाज़ का एक उदाहरण है। ऊपर छोड़ दिया पर एम.एम. कोशिकाओं उज्ज्वल है और नीचे सही में लोगों को अंधेरे रहे हैं कि कैसे ध्यान दें। इस AM असमान रखा थाली या गलत तरीके से रखा उद्देश्य के कारण होता है। इस छवि के विभिन्न वर्गों में एम एम कोशिकाओं को अलग ढंग से गिना जा करने के लिए प्रेरित करेगा। स्केल सलाखों (प्रत्येक छवि के नीचे दाएं) 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्र 1
एक हड्डी marro दौरान चित्रा 1. प्रोटोकॉल समग्र विवरण। (ए)बायोप्सी डब्ल्यू महाप्राण में से एक अतिरिक्त ट्यूब प्रोटोकॉल के लिए प्राप्त की है। (बी) मल्टीपल मायलोमा (एम एम) कोशिकाओं चुंबकीय महाप्राण में अन्य कोशिकाओं से अलग हो रहे हैं। एम.एम. कोशिकाओं (मिमी), गैर-एम एम कोशिकाओं, और प्लाज्मा युक्त (सी) तीन ट्यूबों, क्रमशः, जुदाई प्रक्रिया से प्राप्त कर रहे हैं। पिछले रेस्पायरेट्रस से (डी) अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (BMSCs) हौसले से प्राप्त एम.एम. कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित कर रहे हैं, और बाह्य मैट्रिक्स (कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) में निलंबित कर रहे हैं। (ई) थाली संभव ही फोकल हवाई जहाज़ में हैं और BMSC अच्छी तरह से नीचे का पालन करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि के रूप में के रूप में कई एम.एम. सुनिश्चित करने के लिए नीचे घूमती है। मैट्रिक्स polymerizes तक थाली इनक्यूबेटर में रखा गया है। (एफ) प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया और मरीज ​​व्युत्पन्न प्लाज्मा का मिश्रण के साथ भरा है। प्लेट एक मशीन हे / एन में रखा गया है। (जी) ड्रग्स प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ रहे हैं और थाली एक माइक्रोस्कोप में रखा गया हैएक डिजिटल कैमरा, मोटर चालित मंच और बेंच शीर्ष इनक्यूबेटर से सुसज्जित है, और 96 घंटे की अवधि के लिए नियमित अंतराल पर imaged। (एच) प्रत्येक के लिए अच्छी तरह छवि फ़ाइलों खंडों झिल्ली गति के आधार पर एम एम कोशिकाओं रहते हैं कि एक कलन विधि का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं (जीवित कोशिकाओं छद्म हरे रंग में रंग के होते हैं) और हर समय बिंदु के लिए प्रत्येक के लिए अच्छी तरह cellularity में परिवर्तन के साथ एक स्प्रेडशीट बनाता है। स्केल बार (नीचे सही) 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (I) एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम दवाओं और सांद्रता द्वारा समूहों कुओं और प्रारंभिक उपायों 100% कर रहे हैं। इसलिए सामान्यीकृत खुराक प्रतिक्रिया का घटता के साथ एक स्प्रेडशीट बनाता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
कुओं की 2. पूर्व दवा की उम्मीद उपस्थिति चित्रा। (ए) स्ट्रोमा के साथ सह सुसंस्कृत एम.एम. कोशिकाओं। (बी) के मानव मायलोमा सेल लाइन H929 सह सुसंस्कृत स्ट्रोमा के साथ। (सी) HUVECS के साथ सह-संस्कृति में एम एम कोशिकाओं रोगी व्युत्पन्न। (डी) मानव कोशिका लाइन H929 HUVECS के साथ सह-संस्कृति में मायलोमा। स्केल सलाखों (प्रत्येक चित्र के नीचे सही) 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एक 384 अच्छी तरह से थाली में कुओं के स्थानिक वितरण की सिफारिश की। प्रत्येक 384 अच्छी तरह से थाली 21 दवाओं के साथ परीक्षण किया 7 विभिन्न दवाओं, या एक रोगी के नमूने के साथ 3 रोगी के नमूने ले जा सकता है। हल्के हरे रंग में वेल्स, नीले और तन प्रकाश, तीन अलग-अलग मरीजों से एम.एम. कोशिकाओं होते हैं। RX1, RX2, आदि, पांच अलग-अलग चुनाव में प्रत्येक, विभिन्न दवाओं का प्रतिनिधित्वcentrations और दो प्रतियों में। चार कुओं प्रत्येक रोगी के लिए नियंत्रण (रोगी 2 के लिए मरीज को 1 के लिए 36-39, 126-129 और 200-203 रोगी 3 के लिए) के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। नारंगी में वेल्स दो प्रतियों में, प्रत्येक दवा के उच्चतम दवा एकाग्रता में सेल लाइनों होते हैं। पीले रंग में वेल्स सेल लाइन नियंत्रण (कोई दवा) कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा डिजिटल छवि विश्लेषण और खुराक प्रतिक्रिया चार्ट के 4. उदाहरण। (ए) कोलेजन मैं में एम्बेडेड BMSCs के साथ सह-संस्कृति, में एम एम कोशिकाओं, 50 एनएम carfilzomib की एकाग्रता से अवगत कराया। छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म हरे रंग में जीवित कोशिकाओं और छद्म रंग उन्हें पता लगाता है। (बी) छवियां प्रयोग की अवधि के लिए नियमित अंतराल पर हासिल किया है। इस concentrati मेंदवा के पर, लगभग सभी कोशिकाओं को 96 घंटे के अंत में मर चुके हैं। (सी) चार्ट 96 घंटा के अंतराल के साथ carfilzomib के पाँच विभिन्न सांद्रता के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन, समय के लिए सामान्यीकृत = 100% के रूप में 0 घंटा पता चलता है। मानव मायलोमा सेल लाइन MM1.S दवा की प्रभावकारिता के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। स्केल सलाखों (ए के नीचे सही और बी) 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. आम त्रुटियों को बोने या इमेजिंग थाली। (ए) स्ट्रोमा कोशिकाओं "उलझ" है। एम.एम. कोशिकाओं की (ख) "कालोनियों"। (सी) बहुत कुछ मिमी कोशिकाओं। (डी) टेढ़ी फोकल हवाई जहाज़। स्केल सलाखों (प्रत्येक छवि के नीचे दाएं) 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 1 समर्थन
पूरक चित्रा एक रोबोट pipettor का उपयोग कर 384 अच्छी तरह से थाली में कुओं की 1. इष्टतम स्थानिक वितरण। इस विन्यास 31 विभिन्न दवाओं में 5 अलग अलग सांद्रता और 2 प्रतिकृति (हरा) पर परीक्षण किया जा सकता है। इसके अलावा, एक सेल लाइन के साथ सकारात्मक नियंत्रण दवा शक्ति (गुलाबी) सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2 समर्थन
पूरक चित्रा 2 के स्थानिक वितरण दवा 'मास्टर थाली "। नशीली दवाओं के कमजोर पड़ने प्लेट बनाने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से 20x एकाग्रता में 31 दवाओं में से एक में शामिल है जहां इस प्लेट का उपयोग करेगा रोबोट pipettor। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 समर्थन
एक रोबोट pipettor के साथ एक थाली तैयार करते समय कुओं की पूरक चित्रा 3. क्रमांकन इस्तेमाल किया जाएगा। प्रोटोकॉल में वर्णित सॉफ्टवेयर पर्याप्त रूप से दवाओं और सांद्रता के कुओं को मैप करने के क्रम में कुओं की इस नंबरिंग की आवश्यकता है। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

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Microfluidic स्लाइड के बीच पूरक चित्रा 4. तुलना (Khin एट अल। 2014) और वर्तमान प्रोटोकॉल। पिछले प्रणाली में 24 घंटा (ऊपर छोड़ दिया bortezomib, मध्य बाईं melphalan) के लिए और मौजूदा प्रणाली में मापा H929 एकाधिक myeloma सेल लाइन की खुराक प्रतिक्रिया ( शीर्ष सही bortezomib और मध्य सही melphalan)। तुलना प्रयोजनों के लिए, दोनों प्लेटफार्मों के लिए 24 घंटा में LD50 3.9 एनएम और bortezomib के लिए 4.1 एनएम, और 6.4 माइक्रोन और melphalan के लिए 14.65 माइक्रोन था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सारांश में, यह अस्थि मज्जा के पुनर्निर्माण में प्राथमिक एम.एम. कोशिकाओं और दवाओं के पूर्व vivo pharmacodynamics की chemosensitivity यों के लिए एक शक्तिशाली और उच्च throughput विधि है। इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम कुओं की उचित बोने कर रहे हैं और पर्याप्त (अपेक्षित परिणाम के लिए चित्र 2 देखें) ध्यान केंद्रित: एमएम और stromal कोशिकाओं को समान रूप से वितरित कर रहे हैं, सुनिश्चित करें कि कि stromal कोशिकाओं, अच्छी तरह से नीचे के अनुयायी हैं एम.एम. है कि सभी कोशिकाओं एम.एम. कोशिकाओं को एक अंधेरे अंगूठी से घिरा हुआ एक उज्ज्वल डिस्क का पहलू है ही फोकल हवाई जहाज़ में, और कहा कि कर रहे हैं।

अनुचित बोने के मामले में प्रयोग के साथ जारी रखने के लिए नहीं है, (चित्रा 5), बल्कि एक दूसरे की थाली बीज। समस्या कम या उच्च मिमी या स्ट्रोमा सेल घनत्व, कोशिकाओं के सजातीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए बोने की प्रक्रिया के दौरान बोने और नियमित अंतराल पर resuspend के पहले ट्यूब में सेल एकाग्रता जाँच था पता चला हैमीडिया में। अपराधी समारोह या रोबोट मशीन के साथ एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग इस समस्या को काफी कम कर सकते हैं। इस परख में इस्तेमाल किया मीडिया (1:10) के लिए सेल / मैट्रिक्स के अनुपात वरीयता प्राप्त है और इस तरह की स्थितियों का अध्ययन किया जा सकता है कि कुओं की संख्या को अधिकतम करने की मांग की। हालांकि, उत्पादन या कैंसर की कोशिकाओं या स्ट्रोमा से भस्म घुलनशील कारकों का अध्ययन करने के लिए, यह मीडिया के लिए सेल / मैट्रिक्स के अनुपात 1 हो सकता है कि सिफारिश की है: 1।

वर्तमान में लागू है, इस प्रणाली केवल गैर-पक्षपाती कोशिकाओं quantifies। स्ट्रोमा की cellularity में परिवर्तन यों के लिए आदेश में सॉफ्टवेयर स्ट्रोमा की रूपात्मक विशेषताओं को संशोधित और समायोजित करने की आवश्यकता होगी। इस स्ट्रोमा डिब्बे में कैंसर की कोशिकाओं या दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी सुविधा होगी। यहाँ वर्णित प्रणाली वे पक्षपाती स्ट्रोमा के साथ संयुक्त कर रहे हैं, खासकर अगर यह भी पक्षपाती कैंसर कोशिकाओं के cellularity यों करने में असमर्थ है। समाधान डिजिटल imag में संशोधन होगाई विश्लेषण एल्गोरिथ्म रूपात्मक सुविधाओं के आधार पर स्ट्रोमा से कैंसर अलग करने के लिए, या तो जनसंख्या से कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ आबादी या तो पूर्व सेते हैं।

कि अनुक्रमिक माप इस प्रकार और अधिक विस्तृत उपलब्ध कराने के लिए बनाया जा सकता है तो पिछले तरीकों की तुलना में इस प्रोटोकॉल के महत्व, एक गैर विनाशकारी तरीके से अस्थि मज्जा microenvironment के एक पूर्व vivo पुनर्निर्माण में प्राथमिक कैंसर की कोशिकाओं की दवा की प्रतिक्रिया का आकलन करने की क्षमता है pharmacodynamics, के बजाय निश्चित समय के बिंदुओं पर जानकारी। हमारे पूर्व परख 6 की सीमाओं में से एक ही सांद्रता में से एक रेखीय खिड़की के भीतर दवा संवेदनशीलता के आकलन अनुमति दी है जो दवा प्रसार, द्वारा उत्पन्न रैखिक ढाल था। प्रत्येक अच्छी तरह से एक अलग इकाई है के बाद से वर्तमान परख, दवा सांद्रता के किसी भी सीमा के पार व्यवहार्यता का आकलन अनुमति देता है। दोनों assays, तथापि, (समकक्ष परिणाम उत्पन्न

इस दृष्टिकोण के कई भविष्य आवेदन पत्र के अलावा, हमारे समूह नैदानिक ​​प्रतिक्रिया में इन assays द्वारा प्रदान की pharmacodynamics जानकारी एक्सट्रपलेशन करने के लिए गणितीय मॉडल का उपयोग करने में ध्यान केंद्रित कर रहा है। हम दवा प्रेरित कोशिका मृत्यु की गतिशीलता का वर्णन, अंतर समीकरणों की एक प्रणाली के लिए प्रत्येक दवा के लिए प्राप्त आंकड़ों अंक (चित्रा 4C) फिट करने का प्रस्ताव इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए। फिर, इन गणितीय मॉडल एक नैदानिक ​​आहार में प्रत्येक दवा के नाम से जाना जाता फार्माकोकाइनेटिक संपत्तियों को लागू करने के द्वारा, यह रोगी 6 की वास्तविक प्रतिक्रिया का अनुमान लगाने के लिए संभव हो जाएगा। बोने स्वचालित और एक रोबोट प्रणाली का उपयोग drugging करके, यह ख्याल दवाओं के न केवल मानक परीक्षण करने के लिए संभव हो सकता है, लेकिन यह भी एक सौ से अधिक प्रायोगिक दवाओं नमूना प्रति (एक 1536 अच्छी तरह से थाली में) होगा। इस प्रयोगात्मक दवाओं के सैकड़ों की संख्या में परीक्षण किया जा सकता है, जहां सिलिको में क्लिनिकल परीक्षण के लिए संभावना खुला होतामरीजों के नमूनों की साथियों, इस प्रकार आभासी क्लिनिकल परीक्षण 13 के लिए अस्तित्व घटता बनाने।

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Acknowledgments

इस शोध फ्लोरिडा के Bankhead-Coley टीम विज्ञान अनुदान (2BT03), स्वास्थ्य / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (1R21CA164322-01) और मोफिट कैंसर केंद्र की टीम विज्ञान अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों के राज्य द्वारा वित्त पोषित किया गया। इस काम के एच ली मोफिट कैंसर केंद्र एवं अनुसंधान संस्थान, एक NCI नामित व्यापक कैंसर केंद्र (P30-CA076292) में translational अनुसंधान कोर सुविधा के हिस्से में समर्थित किया गया है। प्राथमिक कोशिकाओं तक पहुंच मोफिट कैंसर केंद्र में कुल कैंसर केयर प्रोटोकॉल के माध्यम से संभव बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EVOS FL AUTO AMG AMAFD1000 + AMC1000 Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind CORNING CLS3683 SIGMA Corning CellBIND 384 well plates
384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind CORNING CLS3832 ALDRICH Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus  GE Healthcare GE17-1440-02 SIGMA For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads Miltenyi  130-051-301 Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns Miltenyi   130-042-401 Column for separation of cells.
MidiMACS Separator Miltenyi  130-042-302 Magnet for separation column.
Matrigel Sigma-Aldrich E6909 SIGMA ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex Life Technologies A1413201 LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC Life Technologies C-003-25P-B Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media GIBCO 11875-093 RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated GIBCO 10082-147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I Advanced Biomatrix 5005-B Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS BIOTEK PRC3841 Robotic pipettor system

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References

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