אלקטרופיזיולוגיה בהכנות כבל מבודדות גזע המוח-השדרה מיילוד מכרסמים מאפשרת הקלטת תפוקת רשת הנשימה עצבית

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

נשימה היא פעילות מורכבת וחיונית הנשלטת על ידי המוח, המאפשרת dioxygen (O 2) ספיגה ופחמן דו חמצני (CO 2) חיסול. כונן הנשימה המרכזי מופק על ידי רשת מורכבת ממוקמת בגזע המוח בשני היונקים 1, דו-חיים 2, זוחלים 3, 4 ציפורים ודגים 5. גם אם המחקר של נשימה יכול להיות מעובד בvivo, חקירות מכניסטית מדויקות דורשות גישה ישירה לרשת שליטה בדרכי הנשימה. לשם כך, אדריאן וBuytendijk פיתחו הכנת דג זהב מופחתת, שבו אלקטרודות המונחת על משטח שיא גזע המוח קצב שנוצר קשור לאוורור זימים 5. גישה זו הותאמה לאחר מכן על ידי Suzue בשנת 1984 6 לשימוש במכרסמים שזה עתה נולד. כניסתו של תכשיר זה הובילה להתקדמות משמעותית בנוירוביולוגיה בדרכי הנשימה. מאז הוא פשוט יחסית, הטכניקה הציגה hבטרם ניתנים למגוון רחב של חקירות בסיסיות של התנהגויות מוטוריות קצביות ומקורותיהם במכרסמים שזה עתה נולד.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקליט את התשתית העצבית של פעילות שאיפה, קצב כמו-נשימה נקרא נשימה פיקטיבית, המיוצרת על ידי הרשת בדרכי הנשימה. שיטה זו יכולה להיות מועסק במגוון רחב של מטרות מחקר, מיקוד תגובות שאיפה לשינויים או פרמקולוגיה נשימה בסוג 7 ומהונדסים 8 שני חיות בר. בהתחשב בכך שהניסויים מבוצעים בטמפרטורה נמוכה, ללא afferents חושית, ובתנאים שבי הריכוזים של גלוקוז וO 2 בתוך aCSF גבוהים, שאלות הועלו לגבי הרלוונטיות הפיזיולוגיות של האות נרשמה. אמנם יש הבדלים ברורים בין in vivo ובתנאי מבחנה (למשל., התדירות של התפרצויות שאיפה) העובדה היא שהנוכחות שלמרכיבי הליבה של רשת הנשימה 6 לעשות את זה אפשרי ללמוד מקצב חזק הקשורים לתפקוד homeostatic חיוני 9,10.

הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו הוא להקל על גישה ישירה לאלמנטי גזע המוח של הרשת בדרכי הנשימה, שהם כמעט ולא נגישים in vivo, במיוחד בתינוקות. גזע המוח ממוקם בתנאים מבוקרים בקפדנות: קצב שנרשם לא מווסת על ידי תשומות מביא היקפיים מהריאות או גופי התרדמה, המאפשר המחקר להתמקד בכונן הנשימה המרכזי עצמו 11. לפיכך, גישה זו מנוצלת ליישם גירויים ולהקליט את אות הפלט. בניגוד לplethysmography הקלטות, קצב הנשימה הוא מווסת על ידי כל מרכיביו בכל הגוף (לדוגמא., התנפחות ריאות, chemosensors ההיקפי), ולכן קשה ליישם גירויים מדויקים.

בעכברוש ewborn, הפרוטוקול מורכב מהקלטת האות הרביעית הגחון שורש בגזע מוח מבודד וחוט השדרה קטוע, נשמר בנוזל מלאכותי Cerebro-השדרה (aCSF). קצב שנוצר על ידי הכנות כבל גזע המוח-השדרה מורכב מהתפרצויות איטיות בודדות שצמודות לאות השאיפה 9. הכנות כבל גזע המוח-השדרה מבודדות בקלות לצריבה בחולדות מיום שלאחר הלידה 0-4 (P0 - P4) 7. גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את תגובת חוסר חמצן של רשת דרכי הנשימה, וגם התגובה לhypercapnia, חמצת או סמים. פרוטוקול היפוקסיה חריף מוצג כאן. גירוי זה מתקבל על ידי נסיגה של O 2 בaCSF; גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את הסובלנות והיענות לעלבונות חוסר חמצן. הפרוטוקול גורם דיכאון קצב מהרגע הראשון ועד לסוף חשיפת היפוקסיה (איור 1) 12. דיכאון זה מתהפךבמהלך 12 התאוששות לאחר חוסר חמצן. בנוגע לעיצוב ניסיוני, חשוב לשים לב שפונס, הממוקם בחלקו מקורי של גזע המוח, יש פעולה מעכבת על הגנרטור קצב 8. כך, הכנות של גזע המוח וחוט השדרה מלאים מקורי להציג קצב נמוך יותר. הכללה של פונס במדגם המבודד להקלטה נקבעה בהתאם למטרת הניסוי 13; המחקר של השפעת פונטיני ברשת הלשד המוארכת ידרוש הקלטות עם ובלי פונס להשוות את התוצאות 14. יתר על כן, אחד היתרונות של שיטה זו היא האפשרות להארכת החלק מקורי של ההכנה לכולל mesencephalic ו / או אזורי diencephalic 15,16, כך שניתן להעריך את ההשפעה של אזורים אלה ברשת הנשימה פונטו-לשדי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שיטה זו נדרשה שימוש נושאי בעלי חיים, אפשרו על ידי הוועדה לאוואל אוניברסיטת בעלי החיים אתיקה (פרוטוקול # 2,012-170).

1. התקנה והכנה

  1. פתרונות
    1. הכן פתרונות מניות aCSF על פי המתכונים 7,17 הבאים. מתכונים אחרים עם וריאציות ריכוז זמינים בספרות. פתרונות מניות חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש.
      1. תמיסת מלח: להוסיף 75.39 גרם של NaCl (129 מ"מ סופי); 2.5 גרם של KCl (3.35 מ"מ סופי); 0.81 גרם של NaH2PO4 (0.58 מ"מ סופי); 2.33 גרם של MgCl2 (1.15 מ"מ סופי); 1.85 גרם של CaCl2 (1.26 מ"מ). ממיסים בכ -800 מיליליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן למלא לL 1 עם מים distillated.
      2. פתרון ביקרבונט: להוסיף 17.65 גרם של NaHCO 3 (21 מ"מ סופי). ממיסים בכ -900 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא לL 1 עם מים מזוקקים. וריאציות של הריכוז ביקרבונט יגרמו וריאציות pH.
      3. פתרון גלוקוז: להוסיף 54.06גרם של גלוקוז (30 מ"מ סופי). ממיסים בכ -400 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא 500 מיליליטר מים מזוקקים.
    2. הכן aCSF על ידי דילול של תמיסת מלח 100 מיליליטר, של פתרון ביקרבונט 100 מיליליטר, 50 מ"ל ושל פתרון גלוקוז ב1 ליטר של מים מזוקקים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    3. הכן אלקטרודת זכוכית על ידי התחממות ומתיחת צינור זכוכית עד שזה נשבר. חול במורד הקצה לפני השימוש. האלקטרודה ניתן לעשות שימוש חוזר הרבה זמן כל עוד הוא נשאר נקי.
  2. הגדרת ניסוי
    הערה: פרטי ההגדרה מוצגים באיור 2.
    1. הפעל את המגבר, נע Averager, נתוני מערכת רכישה, בקר טמפרטורה ומשאבה. בדוק את ההגברה האות (רווח = 10,000), סינון (סף נמוך, 10 הרץ; סף גבוה, 5 kHz), וקצב הדגימה של אנלוגי להמרה דיגיטלית של אות הגלם (2.5 kHz).
    2. מלאו בקבוק עם aCSF ובועה זה עם carbogen (95% O 2 2). לגרום bubbled- וחמם aCSF זרימה בתא ההקלטה (נפח 5 מיליליטר) בשעה 4 מיליליטר / דקה. החזק את הטמפרטורה בחדר ההקלטה ב 26 (± 1) מעלות צלזיוס. pH צריך להיות 7.4 בתנאים סטנדרטיים אלה.
    3. שמור 50 מיליליטר של RT וaCSF-בועות carbogen במזרק 50 מיליליטר ליד חדר הניתוח.
    4. הפעל את המחשב ולהפעיל את תוכנת ההקלטה.

2. Dissection

  1. לשקול וחזותי לקבוע את מינו של בעל החיים (זכרים כבר ano-גניטלי מרחק, ואילו נקבות יש מרחק ano באיברי המין קצר; זכרי איברי מין הם בדרך כלל כהים ואילו איברי המין נקביים הם ורוד).
  2. להרדים את מכרסמים שזה עתה נולד על ידי אחת מהאפשרויות הבאות: cryoanesthesia (לטבול לחלוטין בבעלי החיים בקרח 4 - 5 דקות 18), הזרקה (equitensine ב 4 מיליליטר / קילוגרם) 19 או שאיפה של חומרי הרדמה נדיפים (isoflurane או אתר 21 20). Confirm מטוס נאות של הרדמה על ידי היעדר רפלקס נסיגת כפה.
  3. מניחים את החיה על הספסל, פני הגחון למטה. סעיף החלק מקורי של הראש coronally עם אזמל ברמת גבחת (גלויה דרך העור והגולגולת). לבצע שלב זה מייד לאחר החיה מורדמת.
  4. סעיף הגוף coronally עם אזמל תחת החברים הקדמי.
  5. להסיר עור, שרירים, רקמות שומן וקיבה עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. מאז העצמות רכות בגיל הזה, להיות זהיר שלא לפגוע במערכת העצבים. לבצע שלב זה על הספסל.
  6. מניחים את ההכנה בתא לנתיחה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. מנקודה לסוף ההקלטה זו, השתמש במיקרוסקופ.
  7. על פניו הגב של ההכנה, לחתוך את הגולגולת וחוליות מהמקוריות לחלק הזנב לאורך הציר הבינוני עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. פתח את הגולגולת לחתוךוחוליות במטרה לחשוף את רקמת העצבים. השתמש בaCSF strored במזרק לחמצן ההכנה.
  8. עם הצבת, להסיר את קרום נואיד, רקמה דקה המכסה את פני השטח של רקמת העצבים. שמור קרום רך וכלי דם נגד רקמת העצבים. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה.
  9. מניחים את ההכנה עם הגב עם פנים כלפי מטה, ובזהירות להפיל את גזע המוח וחוט השדרה על ידי חיתוך העצבים ורקמות חיבור עם המספריים תוך החזקת ההכנה במקום. גישת גב היא גם אפשרית. שמור את השורשים ועצבי זמן רב ככל האפשר. הסר את העצמות לבודד את גזע המוח וחוט השדרה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה.
  10. הסר את המוח הקטן ונותר מבנים מקורי על ידי חתכם עם האזמל. השתמש בaCSF מאוחסן במחט לחמצן ההכנה.
  11. לחלופין בהתאם experimenעיצוב טל, להסיר את פונס עם האזמל על ידי קדמי סעיף העטרה לעורק המוח הקטן הנחות 22. שימו לב שהשמירה על כל פונס יהיה להאט את קצב בחולדות ומלאה לעכב אותו בעכברים. הכנות הכוללות את חלק הזנב רק של פונס להציג פעילות כמו נשימה-עם תדר יציב בשורש C4.

3. הקלטה

  1. מניחים את ההכנה בחדר הקלטה, עם הפנים כלפי מעלה הגחון. תקן את ההכנה עם סיכות בחלק הנמוך ביותר של חוט השדרה והמקורי ביותר החלק מגזע המוח.
  2. באמצעות מזרק הצמוד לאלקטרודה על ידי מחטה, לגרום לדיכאון באלקטרודה (קוטר הקצה של כוס: 150-225 מיקרומטר) על ידי תלישת הבוכנה המזרק, כדי למלא באופן חלקי את האלקטרודה עם aCSF.
  3. באמצעות micromanipulator, למקם בזהירות את האלקטרודה קרובה לאחד משורשי הגחון הרביעי. שורשי הגחון אחרים יכולים גם להציג כמו נשימה-פעילות (ה.ז., עצב גולגולת XII, C1 שורש הגחון).
  4. לגרום לדיכאון במכל אלקטרודה באמצעות המזרק ידי משיכת הבוכנה כדי לשאוב שָׁרשׁוֹן העצב בעדינות. לאחר מכן לעבור בזהירות את האלקטרודה ליישם אותו נגד חוט השדרה.
    הערה: באופן אידיאלי בגודל של שָׁרשׁוֹן מתאים לגודל של פתיחת האלקטרודה ובכך יוצר חותם בין התאים הפנימיים וחיצוניים של האלקטרודה. מאז מגברי ההפרש משמשים בדרך כלל להקלטות כאמור, כל פתיחה בין החלק הפנימי של האלקטרודה ותא ההקלטה מפחיתה את איכות האות ומקשה על למנוע רעש רקע.
  5. התחל ההקלטה.
  6. רשום את קצב מיוצר על ידי ההכנה בתנאי normoxic (כלומר, aCSF מבעבע עם carbogen: 95% CO 2 O ו 5% 2) לפחות 20 דקות כדי לקבוע את הפרמטרים הבסיסיים של ההכנה.
  7. לעבור זלוף מaCSF-בועות carbogen לaCSF גירוי (כלומר, מבעבע עם 95% N 2, 5% CO 2 לגירוי היפוקסיה) במשך 15 דקות. לשנות משך חשיפה בהתאם לפרוטוקול הניסוי. רשום את משך החשיפה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים. השתמש בצינורות נירוסטה בין בקבוק aCSF ותא בכל הזדמנות אפשרית, כדי למנוע דיפוזיה גז לחלק החיצוני של הצינור.
  8. לעבור זלוף בחזרה לaCSF-בועות carbogen הסטנדרטי לפחות 15 דקות להקלטת התאוששות. שיא זה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים.
  9. לסיים את ההקלטה.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. מהאות המשולבת, לחשב את התדירות כמו מספר ההתפרצויות לדקה (באה לידי ביטוי בהתפרצויות / min), משרעת כהפרש בין קו הבסיס והשיא של הפרץ (בא לידי ביטוי בmV), משך הפרץ כמשך מ המתחילה ועד סופו של הפרץ (באה לידי ביטוי בים), אזור הפרץ כאזור תחת נוכve של הפרץ באות המשולבת (באה לידי ביטוי בmV · ים) (איור 3).
  2. לחשב את התדירות, משרעת, משך פרץ ואזור פרץ תחת normoxic (בסיס), חוסר חמצן (גירוי) ותנאים שלאחר חוסר חמצן התאוששות (לאחר הגירוי) כממוצע של 5 דקות האחרונות של הקלטות לכל מצב. אל תנתח את החלק הראשון של כל מצב, כי יש עיכוב בין מיתוג הומוגניזציה זלוף וaCSF בתא ההקלטה.
  3. הגעה אז גירוי (כלומר, היפוקסיה) ופוסט-גירוי ערכי התאוששות (כלומר, לאחר חוסר חמצן) כאחוז מערכי הבסיס להקלטה המקבילה. הגעה התוצאות כאמצעי ± SD

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שצוין במבוא, אחד היתרונות החשובים ביותר של טכניקה זו היא הגישה הישירה לגזע המוח ליישם גירויים שונים. כדוגמא, היפוקסיה יושמה כאן. איור 1. א.ב. מציג הקלטת פרוטוקול מלאה, עם שני תנאי normoxic וחוסר חמצן. איור 1.CE מציגה את קצב שנרשם בתנאי normoxic (כלומר, aCSF מבעבע עם 95% O 2 ו -5% CO 2 ב 26 מעלות צלזיוס). כפי שהודגם בעבר בהכנה מדויקת זה 11, התדירות היא כ -8 פרצים / דקה, ומשרעת הוא על 0.800 mV. שים לב שהמשרעת היא רק מעידה בגלל הווריאציות בין-ההכנה החשובה שלה. העקבות העליונות מייצגת את האות המשולבת בעוד העקבות הנמוכות מייצגת את אות הגלם. איור 1.DF מציג את קצב שנרשם בתנאי חוסר חמצן (כלומר., ACSF מבעבע עם 95% N 2 ו -5% CO <תת> 2 ב 26 מעלות צלזיוס). כמאופיין 23 בעבר, התדירות ירדה באופן דרמטי במהלך היפוקסיה. איור 1.GH מציגה פרץ אחד מראה דפוסים טיפוסיים בתנאי normoxic וחוסר חמצן.

איור 1
1. דוגמאות איור של הקלטות שהושגו מהכנות טבורי גזע המוח-השדרה. תפוקת נשימה שנרשמה משורש הגחון C4 מהיערכות מחולדות P4 תחת normoxic, חוסר חמצן ותנאי התאוששות לאחר חוסר חמצן ((אות משולבת) ו- (ב) אות גלם) . עבור כל מצב, הקלטות מוגדלות ((C) משולבות אות normoxic; (ד) אות חוסר חמצן משולבת; (אות normoxic גלם E); (אות חוסר חמצן גלם F)) ופרץ יחיד (() פרץ normoxic Gופרץ חוסר חמצן (H)) מוצג. כפי שהוזכר בטקסט, שים לב משרעת שיש לפרש בזהירות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. מסכם סכימה של ההתקנה. ACSF מבעבע מחומם ונשלח על ידי משאבה בתא ההקלטה. עודף aCSF בתא ההקלטה להישאף על ידי משאבה ולהיפטר ממנו. תא ההקלטה צמוד לקרקע ובקר הטמפרטורה. פלט אלקטרודה מועבר ישירות למגבר, אז למערכת רכישת נתונים Averager נע ו, ולבסוף המחשב. אנא לחץ כאן to לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
פרמטרי פרץ איור 3. מנותחות. התדירות מחושבת כמספר ההתפרצויות לדקה (באה לידי ביטוי בהתפרצויות / min), משרעת כהפרש בין קו הבסיס והשיא של הפרץ (בא לידי ביטוי בmV), משך הפרץ כ המשך מההתחלה ועד סוף הפרץ (בא לידי ביטוי בים), אזור הפרץ כשטח מתחת לעקומה של הפרץ באות משולבת (בא לידי ביטוי בmV · ים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דְמוּת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כימות מדויק של פעילות נשימה יכול להיות מאתגר. ואכן, נשימה היא פונקציה שיכולה להיות גם אוטומטי ורצון, וכי הוא מווסת בהתאם לסביבה, הצרכים של הגוף, המצב הרגשי וההתנהגות. היתרון של שיטה זו הוא הבידוד של האלמנטים העצביים האחראים לייצור את פקודת דרכי הנשימה. לפיכך, קלטות אלקטרו הכנות חוט השדרה וגזע מוח-plethysmography טכניקות משלימות ללמוד את כל הרשת עצבית בדרכי הנשימה במבחנת in vivo, בהתאמה. הקלטות תיקון מהדק בהכנת כבל גזע המוח-השדרה (למשל., מתקרבות ממשטח הגחון) הן גם מתקבלות על הדעת ולאפשר המחקר של נוירון מסוים ברשת נשימה השתמרה 24.

פרוטוקול זה כולל כמה שלבים קריטיים, בעיקר בנתיחה. כדי למנוע נזק לרקמות עצבים,יש לבצע את כל השלבים לנתיחה במהירות ובדייקנות. רקמת העצבים לא צריכה להיפגע ותשומר בקפידה על ידי טבילה קבועה בaCSF. כפי שהוזכר קודם לכן, את איכות הקשר בין שָׁרשׁוֹן העצב ואלקטרודה היא שלב קריטי שני. שאיפה של שָׁרשׁוֹן יכולה להביא את האלקטרודה קרובה יותר להכנה. בעוד הקשר בין האלקטרודה וגזע המוח יכול לשפר את האיכות של החותם, יש להימנע מדיכאון או פגיעה בהכנה פיזית.

האות המשולבת תמיד צריכה לשמש לניתוח, אבל אותות גלם יכולים להיות שימושיים כדי לבדל את הפרצים ראויים מרעשי רקע. יתר על כן, רמקול ניתן להוסיף להגדרה להקשיב לקצב ולקבוע את איכות אות ורעש רקע הווה על ידי אודישן. ואכן, כמה וריאציות בתחילת מחקר הרקע יכולות להיות נוכחת עקב הפרעה חשמלית וסיבה לבסיס יציב. interf כזהerences יש למנוע על ידי בדיקת חיבורי כבלים ושאיבת שורש על ידי אלקטרודה. יתר על כן, כי משרעת פרץ תלויה בשני רעשי הרקע ואת הקשר בין השורש ואת האלקטרודה, תדירות היא הרבה של פרמטר אמין. לפיכך, משרעת הפרץ תמיד צריך לבוא לידי ביטוי באחוזים מערכי בסיס כדי למנוע וריאציות בין-אישיות בשל התקנה.

מגבלות של הטכניקה נקבעות על ידי הגיל של החיה שממנו ניתן תהיה לממש את ההכנה. זה מאפשר מחקר מדויק של הקמת כונן הנשימה המרכזי בלידה, שהוא מאוד מעניין ורלוונטי מבחינה קלינית, אך הוא מתמקד בגילים המוקדמים אלה ולא ניתן להרחיב את הגילים מאוחרים יותר. גילים מבוגרים יותר ניתן להשתמש בperfused arterially הכנות לב-גזע המוח עובדים 25, אבל עם שינויים משמעותיים בפרוטוקול (ראו להלן). הכנת כבל מבודדת גזע המוח-השדרה משרקנים בוגרים הייתה לפתחאד על ידי מורין-Surun et al. 26, שבגזע המוח הוא perfused דרך עורק basilar והקצב נרשם בעצב גולגולת XII. מגבלה נוספת היא משך הניסוי. ההכנה לא יכולה להיות כל הזמן ליותר מ -7 שעות בתנאים שתוארו קודם לכן 6. לכן, טכניקה זו אינה מתאימה לניסויים לטווח ארוך, גם אם הכנות מראשנים (ראה להלן) נשמרו 24 שעות במעבדה.

ניתן ליישם שינויים שונים לטכניקה זו. כאן, אתגר חוסר חמצן שבוצע, אבל וריאציות גז אחרות הן גם מתקבלות על הדעת (לדוגמא., Hypercapnia 27 כמו גם וריאציות pH 28). באותו אופן, ההכנה ניתן perfused עם aCSF בי תרופות כבר נמס ומיושמות על גזע המוח כטיפול טרום 29 או במהלך 30 ההקלטה. במקרה זה, יכול להיות מואץ קצב 29 או האטת דאוn 30 על פי התרופה הניסיונית. יתר על כן, עם תא הקלטה מחולק, יכול להיות מיושם aCSF שונה על חלקים סלקטיבית של וריאציות ההכנה 6 וטמפרטורה 9 יכולים להיות מועסקות. מידור זה מאפשר לימוד המשמעות של חלקי גזע המוח שנבחרו בתופעות הנגרמות הגירוי. בעוד הטכניקה הציגה משתמשת חולדות שזה עתה נולדו, הוא גם ישים על מודלים בעלי חיים אחרים. שימוש בפרוטוקול דומה לזה שהגיש בקשה לחולדות, ניתן להשתמש בעכברים מיום הריונית 16 (E16) עד 12 P4. ההבדל העיקרי הוא הצורך לחמם וcarbogen בועות aCSF במהלך הניתוח. צבים, יכולים לשמש גם ראשנים וצפרדעים בוגרות; עם זאת, מינים אלה דורשים טכניקות שונות לנתיחה, וכן התאמות להרכב aCSF.

טכניקה זו יכולה להיות גם בשילוב עם הקלטות תיקון מהדק על הפנים מקורי של ההכנה 31, המאפשרתהדמיה בו זמנית של אות פלט הרשת והפעילות של תא של רשת זו אחת מסוים. הדמיה צבע רגיש מתח יכולה להיות מיושמת גם בהכנות כבל גזע המוח-השדרה עכברוש היילוד למקם האזורים מופעלים על הפנים הגחון של גזע המוח 32. ניתוח C-FOS ההכנות גם יכול להתממש על מנת לזהות האוכלוסיות העצביות מעורבות בתגובות נשימה ספציפיות. לבסוף, ההכנה יכולה להיות שונה כדי לשמור על איברים אחרים, כגון לב 25, צלעות 6, או זלוף עורק פיסיולוגי עם מקצבים פיסיולוגיים אחרים 33. עם זאת, שינויים מאוד חשובים אלה ידרשו פרוטוקולי נתיחה אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
  2. Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
  3. Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
  4. Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
  5. Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
  6. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  7. Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
  8. Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
  9. Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
  10. Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
  11. Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
  12. Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
  13. Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. 165-201 (2007).
  14. Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
  15. Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  18. Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
  19. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
  20. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
  21. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
  22. Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
  23. Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
  24. Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
  25. Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502, (Pt 3), 623-639 (1997).
  26. Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
  27. Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
  28. Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
  29. Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
  30. Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
  31. Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
  32. Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
  33. St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics