신생아 설치류에서 분리 뇌간 - 척수 준비에 전기 생리학은 신경 호흡 네트워크 출력 녹화를 할 수 있습니다

Neuroscience

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Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

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Abstract

Introduction

호흡 옥시젠 (O 2) 흡수 및 이산화탄소 (CO 2)를 제거 가능하게 뇌에 의해 제어 복잡하고 생명 활동이다. 중앙 호흡기 드라이브는 모두 포유류 1 뇌간에있는 복잡한 네트워크, 양서류 2, 파충류 3, 조류 4 물고기 (5)에 의해 생성된다. 호흡의 연구는 생체 내에서 처리 할 수없는 경우에도, 정확한 역학적 조사 호흡 제어 네트워크에 직접 액세스를 필요로한다. 이를 위해, 아드리안과 Buytendijk는 뇌간 표면 레코드 아가미 환기 5와 연관된 리듬을 생성하는 전극을 배치 감소 금붕어 제제를 개발 하였다. 이 방법은이어서 신생아 설치류에서 사용하기 위해 1984 년 6 Suzue 의해 채택되었다. 이 제제의 출현은 호흡 신경 생물학에서 중요한 발전을 주도하고있다. 그것은 상대적으로 간단하기 때문에,이 기술은 H를 제시감수 리듬 모터 행동과 신생아 설치류 기원의 기본 조사의 넓은 범위에 의무입니다.

이 방법의 전체 목표는 흡기 신경 활동의 상관 관계를 기록하는 것, 호흡기 같은 호흡 리듬 네트워크에 의해 생성 된 가상의 호흡을했다. 이 방법은 모두 야생형 78 트랜스 제닉 동물의 호흡 변화 또는 약리학에 흡기 응답들을 타겟팅, 연구 목적의 넓은 범위에서 사용할 수있다. 기록 된 신호의 생리 학적 관련성에 관한 실험 구 심성 감각없이 낮은 온도에서 수행되며, ACSF 내 글루코스와 O 2의 농도가 높은 조건 하에서, 문제가 발생되었음을 주어진다. 생체 내시험 관내 조건 사이의 명확한 차이가 있지만 (예., 흡기 버스트의 주파수는) 사실이 존재한다는 남아호흡 네트워크 (6)의 핵심 요소는 가능한 중요 기능 항상성 9,10- 연결된 강력한 리듬을 연구 할 수 있도록.

이러한 기술 개발의 사용 배후의 이론적 근거는 신생아에서 특히, 생체 내에서 거의 액세스 네트워크의 호흡 뇌간 요소에 직접 액세스를 용이하게하는 것이다. 뇌간은 엄격하게 통제 된 조건 아래에 배치되어 기록 된 리듬이 폐 또는 경동맥의 몸에서 말초 구 심성 입력에 의해 변조되지 않은, 연구 중심 호흡 드라이브 자체 11 일에 집중할 수 있습니다. 따라서, 이러한 액세스는 자극을 적용하고 출력 신호를 기록하기 위해 이용된다. 녹음 혈량 측정법 달리 호흡 리듬 체내 모든 구성 요소에 의해 변조된다 (예., 폐 팽만, 주변 화학 센서)를 어렵게 정확한 자극을 적용 할 수있다.

에서ewborn 쥐, 프로토콜은 인공 뇌 - 척수 (ACSF) 유지 고립 뇌간에 네 번째 복부 루트 신호와 절단 된 척수를 기록으로 구성되어 있습니다. 뇌간 - 척수 제제에 의해 생성 된 리듬 흡기 신호 (9)에 연결되어 각각의 느린 버스트들로 구성된다. 7 - 고립 된 뇌간 - 척수 준비 쉽게 4 (P4 P0)에 산후 일 0에서 쥐에서 촬영 가능한된다. 이 방법은 일반적으로 네트워크의 호흡 저산소 반응하고, 또한 탄산 혈증, 산증 또는 약물에 대한 반응을 평가하는 데 사용된다. 급성 저산소증 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 이 자극은 ACSF의 O 2의 인출에 의해 얻어진다; 이 방법은 일반적으로 저산소증 욕설 공차 및 응답 성을 평가하는 데 사용된다. 프로토콜은 저산소증 노출 단부 (도 1)까지 12 분부터 제 리듬 우울증을 유도한다. 이 우울증은 반전후 저산소 복구 12시. 실험 설계에 관하여, 그것은 뇌간의 주동이의 부분에있는 뇌교는, 리듬 발생기 (8)에 억제 작용을 가지고주의하는 것이 중요하다. 따라서, 전체 뇌간과 주동이의 척수의 준비는 낮은 리듬을 표시합니다. 기록 용 절연 샘플 뇌교의 포함은 실험 (13)의 목표에 따라 결정된다; 연수 나 네트워크에 뇌교 영향의 연구 결과 (14)를 비교하는 뇌교와없이 녹음을 필요로한다. 또한,이 기술의 이점 중 하나는, 중뇌 및 / 또는 diencephalic 영역 (15, 16)를 포함하는 제제의 입쪽 부분을 연장하는 것이 가능 본토 수질 호흡 네트워크에 이들 영역의 효과를 평가하기 위해 제조하는 가능성이다.

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Protocol

이 방법은 라발 대학 동물 윤리위원회 (프로토콜 # 2,012에서 170 사이)에 의해 허용되는 동물 환자의 사용을 요구했다.

1. 설치 및 준비

  1. 솔루션
    1. 다음과 같은 조리법 7,17에 따라 ACSF 재고 솔루션을 준비합니다. 농도 변화와 다른 조리법은 문학에서 사용할 수 있습니다. 최대 1 개월 4 ℃에서 보관 재고 솔루션을 제공합니다.
      1. 염 용액 : 염화나트륨 75.39 g의 (129 mM의 최종)를 추가; 의 KCl 2.5 g (3.35 mM의 최종); NaH2PO4의 0.81 G (0.58 mM의 최종) 의 MgCl2의 2.33 G (1.15 mM의 최종) CaCl2를 1.85 g (1.26 mm)이다. 다음 증류수 1 L에 기입 증류수 800 ㎖에 용해.
      2. 중탄산염 용액 :의 NaHCO3 (21 mM의 최종)의 17.65 g을 추가합니다. 증류수 1 L에 기입 증류수 900 mL에 녹인다. 중탄산염 농도의 변화는 산도의 변화가 발생합니다.
      3. 포도당 용액 : 54.06 추가포도당의 G (30 mM의 최종). 다음 증류수 500㎖의 증류수로 채워 400 ml의 용해.
    2. 염 용액 100 ㎖, 중탄산 용액 100 ㎖, 증류수 1 L의 글루코스 용액 50 mL로 희석하여 준비 ACSF. 사용까지 4 ℃에서 보관.
    3. 가온하고 휴식까지 유리관을 연신하여 유리 전극을 준비한다. 사용하기 전에 팁 아래로 모래. 전극은 오랫동안 청결 유지로 많은 시간을 재사용 할 수 있습니다.
  2. 실험 설정
    참고 : 설정 세부 사항은 그림 2에 제시되어있다.
    1. 평균 기, 데이터 수집 시스템, 온도 컨트롤러와 펌프를 이동, 앰프의 전원을 켭니다. 및 원시 신호 (2.5 kHz로)의 아날로그 디지털 변환의 샘플링 속도는 신호 증폭 (이득 = 10,000), 여과 (높은 문턱 값, 5 kHz의 낮은 임계 값, 10 Hz로)를 확인한다.
    2. ACSF과 carbogen (95 % O 2와 거품을 가진 병 채우기 2). / 분에서 4 ml의 기록 챔버 (부피 5 ㎖) 및 가온 bubbled--ACSF 흐름을 유도한다. 26 ° C에서 기록 챔버 내 온도 (± 1)을 잡아. pH는이 표준 조건에서 7.4이어야한다.
    3. 해부 실 근처 50 ML의 주사기에 RT와 carbogen - 버블 ACSF 50 ㎖를 유지합니다.
    4. 컴퓨터를 켜고 레코딩 소프트웨어를 시작합니다.

2. 해부

  1. 무게를 시각적으로 동물의 성별을 결정 (여성 짧은 항문 생식기의 거리를 반면 남성, 긴 항문 생식기의 거리를 가지고, 여성 성기 핑크 동안 성기 종종 어두운 수컷).
  2. 다음 옵션 중 하나를 사용하여 신생아 쥐를 마취 : cryoanesthesia을 (완전히 4 얼음 동물을 담그지 - 5 분 18) (4 ㎖ / ㎏에서 equitensine), 주입 휘발성 마취제 (이소 플루 란 (20) 또는 에테르 21)의 19 또는 흡입을. 눌러 확인RM 발 철수 반사의 부재에 의한 마취의 적절한 비행기.
  3. 아래 벤치에 동물, 복부 얼굴을 놓습니다. 제 (피부와 두개골을 통해 볼 수) 브레 그마 수준에서 메스와 coronally 머리의 주동이의 부분. 동물이 마취 후 즉시이 단계를 수행합니다.
  4. 제 몸 coronally 전방 회원에서 메스와.
  5. 수술 얇은 가위와 집게와 피부, 근육, 지방 조직 및 viscus를 제거합니다. 뼈가이 나이에 부드러운 때문에, 신경 시스템에 아무런 영향을 미치지에주의. 벤치에서이 단계를 수행합니다.
  6. 해부 실의 준비를 놓습니다. 준비 산소를 위해 주사기에 저장된 ACSF를 사용합니다. 기록의 끝이 시점에서 현미경을 사용합니다.
  7. 준비 등의면에서 수술 얇은 가위와 집게와 매체 축을 따라 꼬리 부분에 주동이의 두개골과는 척추를 잘라. 절단 된 두개골을 열고그리고 순서는 척추가 신경 조직을 노출. 준비 산소를 위해 주사기에 strored ACSF를 사용합니다.
  8. 펜치로, 거미 막, 신경 조직의 표면을 덮는 얇은 조직을 제거합니다. 신경 조직에 대한 피아 교인과 혈관을 유지. 준비 산소를 위해 주사기에 저장된 ACSF를 사용합니다.
  9. 지느러미와 준비가 아래로 향하게 조심스럽게 자리에 준비를 잡고 가위로 신경과 결합 조직을 절단하여 뇌간과 척수를 가져 놓습니다. 등의 방법도 가능합니다. 가능한 한 오랫동안 뿌리 신경을 유지합니다. 뇌간과 척수를 분리하기 위해 뼈를 제거합니다. 준비 산소를 위해 주사기에 저장된 ACSF를 사용합니다.
  10. 소뇌를 제거하고 메스를 절편으로 주동이의 구조를 나머지. 준비 산소를하기 위해 바늘에 저장된 ACSF를 사용합니다.
  11. 선택적 experimen에 따라탈 디자인은 열등한 소뇌 동맥 (22)에 관상 부 전방에 의해 메스와 뇌교를 제거합니다. 전체 뇌교를 유지하는 것은 쥐의 리듬을 느리게하고 완벽하게 쥐를 억제하는 것에주의. 뇌교의 꼬리 부분을 포함 할 준비가 C4 루트에서 안정적인 주파수의 호흡과 같은 활동을 표시합니다.

3. 녹음

  1. 기록 챔버, 복부 얼굴까지의 준비를 놓습니다. 척수와 뇌간의 주동이 - 대부분의 가장 낮은 부분에 핀 준비를 수정합니다.
  2. 부분적 ACSF으로 전극을 채우기 위해, 주사기 피스톤 당겨서 - (225 μm의 150 유리 팁 직경)의 바늘 전극에 연결된 주사기를 이용하여, 전극의 함몰을 유도한다.
  3. 미세 조작기를 사용하여 조심스럽게 네 번째 복부 뿌리 중 하나에 가까운 전극을 배치합니다. 기타 복부 뿌리는 호흡과 같은 활동 (예를 들어 제시 할 수있다.G., XII 뇌신경, C1 복부 루트).
  4. 부드럽게 신경 어린 뿌리를 흡인하기 위하여 피스톤을 잡아 당겨 주사기를 통해 전극 탱크 내 우울증을 유도한다. 조심스럽게 척수에 적용하기 위해 전극을 이동합니다.
    주의 : 이상적으로 어린 뿌리의 크기가, 전극 개구의 크기와 일치하고, 따라서 전극의 내부 및 외부 사이의 시일 구획을 생성한다. 차동 증폭기는 일반적으로 이러한 기록을 위해 사용되기 때문에, 전극의 내부 챔버와 기록 사이에 개구 된 신호의 품질을 감소시키고 어려운 배경 잡음을 제거 할 수있다.
  5. 녹화를 시작합니다.
  6. 정상 산소의 조건 하에서 제조 제조 리듬을 기록 (즉, ACSF carbogen 버블은 95 % O 2를, 5 % CO 2) 적어도 20 분의 제조 기준 파라미터를 결정하기 위해.
  7. 에 carbogen - 버블 ACSF에서 관류 전환자극 ACSF (즉, 95 % N 2와 5 %의 저산소증 자극에 대한 CO 2와 버블) 15 분. 실험 프로토콜의 따라 노출 시간을 변경합니다. 기록과 동물 시트에 노출 지속 시간을 기록한다. ACSF 병 및 튜브의 외부로의 가스의 확산을 피하기 위해 가능한 챔버 사이에 스테인레스 스틸 튜브를 사용한다.
  8. 복구 기록을 위해 적어도 15 분 동안 표준 carbogen - 버블 ACSF로 다시 관류를 전환합니다. 기록과 동물의 데이터 시트에서이를 기록한다.
  9. 녹음을 종료합니다.

4. 통계 분석

  1. 통합 된 신호로부터, (버스트 / 분으로 표현) 분당 버스트들의 개수와 주파수, 기준선 및 (MV 표현됨) 버스트의 피크 사이의 차이와 같은 진폭으로부터 통화 시간, 버스트 지속 시간을 계산 (S 표현됨) 버스트의 끝부터 시작하여 아래 CUR 지역 버스트 영역(MV 표현 · S) 통합 신호 (그림 3)에 버스트했습니다.
  2. 각 조건에 대한 기록의 마지막 5 분의 평균과 주파수, 진폭, 버스트 기간 및 버스트 영역 정상 산소에서 (베이스 라인), 저산소 (자극)과 후 저산소 (포스트 자극) 복구 조건을 계산합니다. 기록 챔버 내에서 관류 ACSF 균질화 스위칭 사이에 지연이 있기 때문에, 각 상태의 제 1 부분을 분석하지 않는다.
  3. 해당 기록 용 기준 값의 백분율로 자극 후 (즉, 저산소증) 및 후 자극 (즉, 포스트 - 저산소) 복구 값을 표현한다. SD ± 수단으로서 결과를 표현

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Representative Results

서두에서 언급 한 바와 같이,이 기술의 중요한 장점 중 하나는 뇌간에 직접 액세스 다양한 자극을 적용하는 것이다. 예를 들어, 저산소증 여기에 적용 하였다. 그림 1. AB 두 정상 산소와 저산소 조건, 전체 프로토콜 기록을 표시합니다. 그림 1.CE 정상 산소 조건 (기록 리듬을 표시 ACSF는 95 % O 2 5 %로 버블 26 ° C에서 CO 2). 이전에이 정확한 제제 (11)에서 입증 된 바와 같이, 주파수는 약 8 버스트 / 분이고, 진폭이 약 0.800 MV이다. 진폭이 때문에 중요한 간 준비 변화의 나타내는합니다. 낮은 추적 원시 신호를 나타내고 상단 추적은 통합 된 신호를 나타냅니다. 그림 1.DF은 (저산소 조건에 기록 된 예., ACSF가 95 %, N 2, 5 % CO와 버블 리듬을 표시 <서브> 2) 26 ° C에서. 이전에 (23)를 특징으로, 주파수는 극적으로 저산소증 동안 감소 하였다. 그림 1.GH은 정상 산소와 저산소 조건에서 전형적인 패턴을 보여주는 하나의 버스트를 표시합니다.

그림 1
뇌간 - 척수 준비에서 획득 녹음 그림 1. 예. 정상 산소, 저산소 및 사후 저산소 복구 조건 ((A) 통합 신호와 (B)의 원시 신호)에서 P4 쥐에서 준비의 C4 복부 루트에서 기록 호흡 출력 . 단일 버스트 ((사) 정상 산소의 버스트 각 조건의 경우, 확대 녹음 ((D) 통합 저산소 신호, (E) 원료 정상 산소의 신호 ​​(F) 원시 저산소 신호 (C)는 정상 산소의 신호를 통합)및 (H) 저산소 버스트) 표시됩니다. 본문에서 언급 한 바와 같이, 그 진폭은 신중하게 해석되어야한다주의하시기 바랍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2의 설치 Recapitulative 스키마. 버블 ACSF는 가온하고, 기록 챔버 내의 펌프에 의해 전송된다. 기록 챔버 ACSF 과잉는 흡인 펌프에 의해 처리된다. 기록 챔버는 지상 및 온도 제어기에 연결된다. 전극 출력은 직접 이동 평균 기 및 데이터 수집 시스템, 그리고 마지막 컴퓨터 다음, 증폭기에 중계된다. 여기를 클릭하세요 tO이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 3
도 3 분석 버스트 파라미터. 주파수 (버스트 / 분으로 표현) 분당 버스트들의 개수, 기준선 및 (MV 표현됨) 버스트의 피크 사이의 차이와 같은 크기, 버스트 기간만큼 계산 (S 표현됨) 버스트의 처음부터 끝까지 기간, 적분 신호에 버스트의 곡선 아래의 영역으로서, 버스트 영역 (MV 표현 · S). 이것의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요 그림.

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Discussion

호흡 활동의 정확한 정량화가 어려울 수 있습니다. 실제로, 호흡 자동 자발적 모두 일 수 함수이며, 즉, 환경, 인체의 요구, 감정 상태와 행동에 따라 변조된다. 이 기술의 장점은 호흡기 명령을 생성 할 책임 신경 요소의 분리이다. 따라서, 뇌간, 척수 - 제제와 혈량 측정법의 전기 생리 학적 기록은 각각 시험 관내 및 생체 내에서 신경 세포 호흡 전체 네트워크를 연구하는 상보적인 기술이다. 뇌간 - 척수 준비에 패치 클램프 녹음 (예., 복부 표면에서 접근)도 생각할 수 있고 보존 호흡 네트워크 (24)의 특정 신경 세포의 연구를 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 주로 해부에, 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 신경 조직 손상을 방지하기 위해,모든 해부 단계는 신속하고 정확하게 실행해야합니다. 신경 조직이 손상되어서는 안 조심스럽게 ACSF 상수 침수에 의해 보존 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 신경 어린 뿌리와 전극 사이의 접속의 품질은 초 임계 공정이다. 어린 뿌리의 포부는 준비에 가까운 전극을 가져올 수 있습니다. 전극 및 뇌간과의 접촉은 시일의 품질을 개선 할 수 있지만, 하나는 우울증을 제조 또는 물리적 손상을 방지한다.

통합 된 신호는 항상 분석을 위해 사용되어야하지만 원시 신호가 배경 잡음에서 적절한 버스트를 구별하는 것이 유용 할 수있다. 또한, 라우드 스피커는 청취 리듬 및 신호 품질과 시청 의해 본 배경 잡음을 결정하도록 셋업에 추가 될 수있다. 실제로, 배경베이스 라인에 약간의 변화로 인해 불안정한 기준에 전기 간섭 및 원인에 존재할 수있다. 이러한 INTERFerences은 전극에 의해 케이블 연결 및 루트 흡인을 확인하여 방지해야한다. 버스트 진폭 모두 배경 잡음 및 루트와 전극 사이의 접속에 의존하기 때문에, 또한, 주파수는 안정적인 파라미터의 많은이다. 따라서, 버스트 크기는 항상 초기 값의 백분율로 인해 설치 개인간 편차를 방지하기 위해 다음과 같이 표현한다.

기술의 한계 준비가 실현 될 수있는 동물의 나이에 의해 결정됩니다. 이것은 매우 흥미로운 임상 관련성 출생시 호흡 중앙 드라이브의 설정까지의 정밀한 연구를 허용하지만, 이러한 초기 연령에 집중하고 후세으로 확장 될 수 없다. 이전 연령, 동맥 관류 작업 심장 뇌간 준비 (25)에 사용하지만, 실질적인 프로토콜 수정 (아래 참조) 할 수 있습니다. 성인 기니아 피그에서 고립 된 뇌간 - 척수 준비를 개발하고있다모린-Surun 외. 26, 뇌간을 통해 기저 동맥 관류되고 리듬 XII 뇌 신경에 기록되어있는 의해 에디션. 또 다른 한계는 실험 기간이다. 제제는, 전술 한 조건 (6)에 이상 7 시간 동안 유지 될 수 없다. 따라서,이 기술은 올챙이 (아래 참조)로부터의 제제는 실험실에서 24 시간 유지 한 경우에도, 장기 실험에 적합하지 않다.

다양한 변형은이 기술에 적용될 수있다. 여기서, 저산소 과제가 수행되었지만, 다른 가스 변형도 생각할 수있다 (예., 고탄 산혈증 (27)뿐만 아니라 pH를 변화 28). 동일한 방식으로, 제제는 약물을 용해시키고, 전처리로서 29 또는 30의 기록 중에 뇌간 도포 된 ACSF되는 관류 될 수있다. 이때, 리듬 29 가속 또는 다우 둔화 될 수N (30)는 실험에 따른 약물. 또한, 기록 복실 챔버와 상이한 ACSF 9가 사용될 수 6- 및 온도 변화의 선택 부에 적용될 수있다. 이 구획화는 자극 유발 효과 선택 뇌간 부분의 의미에 대한 연구를 할 수 있습니다. 제시된 기법은 신생아 래트를 사용하는 반면, 또 다른 동물 모델에서 적용 가능하다. 래트에 적용되는 것과 유사한 프로토콜을 이용하여, 마우스 P4까지 임신 12 일 16 (E16)에서 사용될 수있다. 주요 차이점은 해부시 ACSF 쬐어 carbogen 기포 필요하다. 거북, 올챙이 성인 개구리도 사용될 수있다; 그러나,이 종은 ACSF의 구성에 다른 해부 기술뿐만 아니라 조정을 필요로한다.

이 기술은 또한, 제제 (31)의 입쪽 얼굴 패치 클램프 기록과 결합 될 수 있도록동시 네트워크 출력 신호의 시각화와이 네트워크의 특정 셀의 활동. 전압 감응 염료 촬상 또한 뇌간 (32)의 복부 표면에 활성 영역을 지역화 신생아 래트 뇌간 - 척수 제제에 적용 할 수있다. 제제 중 c-FOS 분석은 또한 특정 호흡기 반응에 관여하는 신경 집단을 식별하기 위해서 실현 될 수있다. 마지막으로, 제제는 다른 생리적 리듬 33 심장 (25)의 리브 (6), 또는 생리 동맥 관류 같은 다른 장기를 유지하기 위해 변경 될 수있다. 그러나, 이러한 변형은 매우 중요한 다른 해부 프로토콜을 필요로한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

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References

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