Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio

Neuroscience

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Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

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Abstract

Introduction

La respiración es una actividad compleja y vital controlada por el cerebro, lo que permite dioxígeno (O 2) la captación y dióxido de carbono (CO 2) la eliminación. El impulso respiratorio central se genera por una compleja red situada en el tronco cerebral en ambos mamíferos 1, 2 anfibios, reptiles, aves 3 4 5 y peces. Incluso si el estudio de la respiración se puede procesar in vivo, las investigaciones mecanicistas precisas requieren el acceso directo a la red de control respiratorio. Con este fin, Adrian y Buytendijk desarrollaron una preparación goldfish reducida, en el que los electrodos colocados en el registro de la superficie del tronco cerebral el ritmo generado asociado con gill ventilación 5. Este enfoque fue posteriormente adaptada por Suzue en 1984 6 para su uso en roedores recién nacidos. La llegada de esta preparación ha dado lugar a importantes avances en neurobiología respiratorio. Dado que es relativamente simple, la técnica presentada hERE es susceptible de una amplia gama de investigaciones básicas de comportamientos motores rítmicos y sus orígenes en roedores recién nacidos.

El objetivo general de este método consiste en registrar el correlato neural de la actividad inspiratoria, un ritmo respiratorio similar llamado respiración ficticio, producida por la cadena respiratoria. Este método se puede emplear en una amplia gama de objetivos de la investigación, la orientación respuestas inspiratorios a variaciones respiratorias o farmacología en ambos de tipo salvaje y transgénicos 7 8 animales. Dado que los experimentos se llevan a cabo a baja temperatura, sin aferentes sensoriales, y en condiciones en las concentraciones de glucosa y de O 2 en el LCRa son altos, se han planteado interrogantes sobre la relevancia fisiológica de la señal grabada. Si bien existen diferencias claras entre in vivo e in vitro condiciones (por ejemplo., La frecuencia de ráfagas de inspiración) el hecho es que la presencia delos elementos centrales de la red respiratoria 6 hacen posible el estudio de un ritmo robusto asociado a una función homeostática vitales 9,10.

La razón fundamental detrás del desarrollo y el uso de esta técnica es facilitar el acceso directo a los elementos del tronco cerebral de la red respiratoria, que son difícilmente accesibles in vivo, especialmente en los recién nacidos. El tronco encefálico se coloca en condiciones estrictamente controladas: el ritmo grabado no es modulada por impulsos aferentes periféricas de los pulmones o los cuerpos carótidas, lo que permite el estudio se centre en la unidad central de la respiración en sí 11. Por lo tanto, se utiliza este acceso para aplicar estímulos y registrar la señal de salida. En contraste con pletismografía de grabaciones, el ritmo respiratorio es modulada por todos sus componentes en todo el cuerpo (por ejemplo., Distensión de pulmón, sensores químicos periféricos), por lo que es difícil de aplicar estímulos precisos.

En unaewborn rata, el protocolo consiste en registrar la cuarta señal ventral raíz en un tronco cerebral aislada y una médula espinal truncado, mantenido en el fluido cerebro-espinal artificial (ACSF). El ritmo generado por los preparativos de la médula espinal, tronco cerebral se compone de ráfagas lentas individuales que están vinculados a la señal inspiratoria 9. Preparaciones de cordón-tronco cerebral médula aislados se pueden grabar fácilmente en ratas desde el primer día postnatal 0-4 (P0 - P4) 7. Este enfoque se utiliza comúnmente para evaluar la respuesta hipóxica de la red respiratoria, y también la respuesta a la hipercapnia, acidosis o drogas. Un protocolo de hipoxia aguda se presenta aquí. Esta estimulación se obtiene por la captación de O 2 en el LCRa; este enfoque se utiliza comúnmente para evaluar la tolerancia y la capacidad de respuesta a insultos hipóxicas. El protocolo induce una depresión ritmo desde el primer minuto hasta el final de la exposición a la hipoxia (Figura 1) 12. Esta depresión se inviertedurante el post-hipóxica 12 de recuperación. Respecto al diseño experimental, es importante darse cuenta de que el puente de Varolio, situados en la parte rostral del tronco cerebral, tiene una acción inhibidora sobre el generador de ritmo 8. Por lo tanto, los preparativos de la plena tronco cerebral y médula espinal rostral muestran un menor ritmo. La inclusión de la protuberancia en la muestra aislada de la grabación se determina de acuerdo con el objetivo del experimento 13; el estudio de la influencia pontina en la red bulbo raquídeo requeriría grabaciones con y sin el puente de Varolio para comparar los resultados 14. Por otra parte, una de las ventajas de esta técnica es la posibilidad de ampliar la parte rostral de la preparación para incluir mesencefálico y / o regiones diencefálicas 15,16, por lo que es posible evaluar el efecto de estas regiones en la red respiratoria-ponto medular.

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Protocol

Este método requiere el uso de sujetos animales, se admiten por el Comité de Ética Animal de la Universidad Laval (protocolo # 2012-170).

1. Instalación y Preparación

  1. Soluciones
    1. Preparar soluciones madre aCSF de acuerdo con las siguientes recetas 7,17. Otras recetas con variaciones de concentración están disponibles en la literatura. Soluciones tienda de valores a 4 ° C durante hasta un mes.
      1. Solución de sal: añadir 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Disolver en 800 ml de agua destilada luego llenar a 1 l con agua destilada.
      2. Solución de bicarbonato: añadir 17,65 g de NaHCO 3 (21 mM final). Disolver en 900 ml de agua destilada y luego llenar hasta 1 L con agua destilada. Las variaciones de la concentración de bicarbonato resultarán en variaciones de pH.
      3. Solución de glucosa: añadir 54,06g de glucosa (30 mM final). Disolver en 400 ml de agua destilada y luego llenar hasta 500 ml con agua destilada.
    2. Preparar LCRa por dilución de 100 ml de solución de sal, 100 ml de solución de bicarbonato, y 50 ml de solución de glucosa en 1 L de agua destilada. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
    3. Preparar un electrodo de vidrio calentando y estirando un tubo de vidrio hasta que se rompe. Lijar la punta antes de su uso. El electrodo se puede reutilizar tantas veces como el tiempo que se mantiene limpio.
  2. Configuración experimental
    Nota: Los datos de configuración se presentan en la Figura 2.
    1. Encienda el amplificador, promediador, sistema de adquisición de datos, control de temperatura y de la bomba en movimiento. Compruebe la amplificación de la señal (ganancia = 10.000), la filtración (de bajo umbral, 10 Hz; umbral alto, 5 kHz), y la tasa de muestreo de la conversión de analógico a digital de la señal en bruto (2,5 kHz).
    2. Llene una botella con LCRa y la burbuja con carbógeno (95% O 2 2). Inducir un bubbled- y se calentó-LCRa flujo en la cámara de grabación (volumen de 5 ml) a 4 ml / min. Mantener la temperatura en la cámara de registro a 26 (± 1) ° C. pH debe ser 7,4 en estas condiciones estándar.
    3. Mantenga 50 ml de RT y carbógeno-burbujear LCRa en una jeringa de 50 ml, cerca de la cámara de disección.
    4. Encienda el ordenador e inicie el software de grabación.

2. Disección

  1. Pesar y determinar visualmente el sexo del animal (los machos tienen un ano-genital distancia más larga, mientras que las hembras tienen una distancia ano-genital corta; machos genitales son a menudo oscuro, mientras que los genitales femeninos son de color rosa).
  2. Anestesiar al roedores recién nacidos por una de las siguientes opciones: crioanestesia (sumergir completamente el animal en hielo durante 4 - 5 min 18), inyección (equitensine a 4 ml / kg) 19 o la inhalación de anestésicos volátiles (isoflurano 20 o éter 21). Confirm un plano adecuado de anestesia por la ausencia de un reflejo retirada de la pata.
  3. Colocar el animal en el banco, la cara ventral hacia abajo. Sección la parte rostral de la cabeza coronalmente con un bisturí en el nivel de bregma (visible a través de la piel y el cráneo). Realice este paso inmediatamente después se anestesia el animal.
  4. Sección coronal del cuerpo con un bisturí en virtud de los miembros anteriores.
  5. Quite la piel, los músculos, los tejidos grasos y víscera con tijeras y alicates quirúrgicos y delgadas. Desde los huesos son suaves a esta edad, tenga cuidado de no dañar el sistema nervioso. Realice este paso en el banquillo.
  6. Colocar la preparación en la cámara de disección. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación. A partir de este punto hasta el final de la grabación, usar un microscopio.
  7. En la cara dorsal de la preparación, corte el cráneo y las vértebras de la rostral a la parte caudal lo largo del eje medio con tijeras y pinzas quirúrgicas y delgadas. Abra el cráneo cortey vértebras para exponer el tejido nervioso. Utilice la LCRa strored en la jeringa para oxigenar la preparación.
  8. Con los alicates, quite la membrana aracnoide, un tejido delgado que cubre la superficie del tejido nervioso. Conserve la piamadre y los vasos sanguíneos contra el tejido nervioso. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación.
  9. Colocar la preparación con el dorsal boca abajo, y cuidadosamente hacer caer el tronco del encéfalo y la médula espinal mediante la reducción de los nervios y el tejido conectivo con las tijeras mientras mantiene la preparación en su lugar. Un enfoque dorsal también es posible. Mantener las raíces y los nervios el mayor tiempo posible. Retire los huesos para aislar el tronco del encéfalo y la médula espinal. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación.
  10. Retire el cerebelo y el restante estructuras rostrales seccionando con el bisturí. Utilice la LCRa almacenada en la aguja para oxigenar la preparación.
  11. Opcionalmente dependiendo de experimendiseño tal, retire el puente con el bisturí por una sección anterior de la corona a la arteria cerebelosa inferior 22. Tenga en cuenta que el mantenimiento de todo el puente se ralentizará el ritmo en ratas y totalmente inhibirla en ratones. Las preparaciones que incluyen sólo la parte caudal de la protuberancia muestran una actividad respiratoria como con una frecuencia estable a la raíz C4.

3. Grabación

  1. Colocar la preparación en la cámara de grabación, ventral hacia arriba. Fijar la preparación con alfileres en la parte más baja de la médula espinal y el rostral-la mayor parte del tronco cerebral.
  2. Usando una jeringa vinculado al electrodo por su aguja, inducen una depresión en el electrodo (diámetro de la punta de vidrio: 150-225 micras) tirando de la jeringa de pistón, con el fin de llenar parcialmente el electrodo con LCRa.
  3. El uso de un micromanipulador, colocar cuidadosamente el electrodo cerca de una de las cuartas raíces ventrales. Otras raíces ventrales también podrían presentar una actividad respiratoria como (e.g., nervio craneal XII, C1 raíz ventral).
  4. Inducir una depresión en el depósito de electrodo a través de la jeringa tirando del émbolo con el fin de aspirar suavemente el rootlet nervio. A continuación, mueva con cuidado el electrodo para aplicar contra la médula espinal.
    Nota: Lo ideal sería que el tamaño de la rootlet coincide con el tamaño de la abertura del electrodo y por lo tanto crea un sello entre los compartimentos internos y externos del electrodo. Desde amplificadores diferenciales se utilizan comúnmente para tales grabaciones, cualquier abertura entre el interior del electrodo y la cámara de grabación reduce la calidad de la señal y hace que sea difícil eliminar el ruido de fondo.
  5. Inicie la grabación.
  6. Graba el ritmo producido por la preparación en condiciones de normoxia (es decir, LCRa burbujeó con carbógeno: 95% O 2 y 5% de CO 2) durante al menos 20 min para determinar los parámetros basales de la preparación.
  7. Cambie la perfusión de LCRa carbógeno-burbujear aLCRa estímulo (es decir, burbujeado con 95% N 2 y 5% de CO 2 para el estímulo hipoxia) durante 15 min. Alterar duración de la exposición dependiendo del protocolo experimental. Anote la duración de la exposición en la grabación y animal hoja de datos. Utilice tubos de acero inoxidable entre la botella LCRa y la cámara siempre que sea posible para evitar la difusión del gas al exterior del tubo.
  8. Cambie la perfusión de nuevo a norma LCRa carbógeno-burbujear durante al menos 15 minutos para una grabación de recuperación. Anota esto en la grabación y animal hoja de datos.
  9. Finalice la grabación.

4. Análisis estadístico

  1. A partir de la señal integrado, calcular la frecuencia como el número de ráfagas por minuto (expresado en ráfagas / min), la amplitud como la diferencia entre la línea de base y el pico de la ráfaga (expresado en mV), la duración de la ráfaga como la duración desde el principio hasta el final de la ráfaga (expresado en s), el área de ráfaga como el área bajo la curve de la ráfaga de la señal integrada (expresado en mV · s) (Figura 3).
  2. Calcular la frecuencia, amplitud, duración de la ráfaga y la zona de la explosión bajo normóxico (línea de base), hipóxica (estímulo) y post-hipóxico condiciones (post-estímulo) de recuperación como el promedio de los últimos 5 minutos de las grabaciones para cada condición. No analizar la primera porción de cada condición porque hay un retraso entre la conmutación de la perfusión y LCRa homogeneización en la cámara de grabación.
  3. Expresar entonces estímulo (es decir, la hipoxia) y post-estímulo (es decir, post-hipóxicas) los valores de recuperación en porcentaje de los valores de línea de base para la grabación correspondiente. Exprese los resultados como medias ± SD

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Representative Results

Como se ha mencionado en la introducción, una de las ventajas más importantes de esta técnica es el acceso directo al tronco encefálico para aplicar diversos estímulos. Como ejemplo, la hipoxia se aplicó aquí. Figura 1. AB muestra una grabación protocolo completo, con ambas condiciones de normoxia e hipóxicas. 1.CE Figura muestra el ritmo en condiciones de normoxia registrado (es decir, LCRa burbujeó con 95% O 2 y 5% CO 2 a 26 ° C). Como se ha demostrado anteriormente en esta preparación exacta 11, la frecuencia es de aproximadamente 8 ráfagas / min, y la amplitud es de aproximadamente 0.800 mV. Tenga en cuenta que la amplitud es sólo indicativa, debido a sus importantes variaciones inter-preparación. El trazo superior representa la señal integrada, mientras que el trazo inferior representa la señal sin procesar. Figura 1.DF muestra el ritmo registrado en condiciones de hipoxia (es decir., LCRa burbujea con un 95% de N 2 y 5% de CO <sub> 2 a 26 ° C). Como ya se ha caracterizado 23, la frecuencia disminuyó drásticamente durante la hipoxia. Figura 1.GH muestra una sola ráfaga mostrando patrones típicos en condiciones de normoxia e hipoxia.

Figura 1
Figura 1. Ejemplos de grabaciones obtenidas a partir de preparaciones de la médula espinal. Tallo Cerebral-salida respiratoria grabado desde la raíz ventral C4 de preparaciones de ratas P4 en condiciones de normoxia, hipoxia y condiciones de recuperación post-hipóxicas ((A) de señal integrado y (B) la señal en bruto) . Para cada condición, grabaciones agrandados ((C) integrados de señal normóxico; (D) Señal hipóxico integrado; (E) Señal normóxico prima; (F) de la señal hipóxico prima) y ráfaga única ((G) ráfaga normóxicoy (H) ráfaga hipóxica) se muestran. Como se menciona en el texto, por favor tenga en cuenta que la amplitud debe interpretarse con cuidado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Esquema recapitulativo del programa de instalación. El LCRa burbujear se calienta y se envía por una bomba en la cámara de grabación. LCRa exceso en la cámara de registro es aspirado por una bomba y desecharse. La cámara de control esté conectado a la tierra y el controlador de temperatura. La salida del electrodo se retransmite directamente al amplificador, a continuación, a la promediador en movimiento y el sistema de adquisición de datos, y finalmente el equipo. Haga clic aquí to ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Analizado Parámetros ráfaga. La frecuencia se calcula como el número de ráfagas por minuto (expresado en ráfagas / min), la amplitud como la diferencia entre la línea de base y el pico de la ráfaga (expresado en mV), la duración de la ráfaga como la duración desde el principio hasta el final de la ráfaga (expresado en s), el área de ráfaga como el área bajo la curva de la ráfaga en la señal integrada (expresado en mV · s). Haga clic aquí para ver una versión más grande de este cifra.

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Discussion

La cuantificación precisa de la actividad respiratoria puede ser un reto. De hecho, la respiración es una función que puede ser tanto automática y voluntaria, y que se modula en función del entorno, las necesidades del cuerpo, el estado emocional y el comportamiento. La ventaja de esta técnica es el aislamiento de los elementos neurales responsables de producir el comando respiratorio. Por lo tanto, los registros electrofisiológicos de preparaciones de médula espinal y del tronco cerebral-pletismografía son técnicas complementarias para estudiar el conjunto de la red neuronal respiratoria in vitro e in vivo, respectivamente. Patch-clamp grabaciones en la preparación de cordón espinal del tallo cerebral (por ejemplo., Se acercan desde la superficie ventral) también son concebibles y permiten el estudio de una neurona particular en una red respiratoria conservada 24.

Este protocolo incluye algunos pasos críticos, principalmente en la disección. Con el fin de evitar daños en el tejido nervioso,todos los pasos de disección se deben ejecutar con rapidez y precisión. El tejido nervioso no debe estar dañado y se conserva cuidadosamente por inmersión constante en LCRa. Como se mencionó anteriormente, la calidad de la conexión entre el rootlet nervio y el electrodo es un segundo paso crítico. La aspiración del rootlet puede traer el electrodo más cerca de la preparación. Mientras que el contacto entre el electrodo y el tronco cerebral puede mejorar la calidad de la junta, uno tiene que evitar hacer una depresión o dañar físicamente la preparación.

La señal integrado siempre debe utilizarse para el análisis, pero las señales de primas puede ser útil para diferenciar ráfagas adecuados de ruido de fondo. Por otra parte, un altavoz puede ser añadido a la configuración para escuchar el ritmo y determinar la calidad de la señal y el ruido de fondo presente por audición. De hecho, algunas variaciones en la línea de base de fondo podrían estar presentes debido a la interferencia eléctrica y la causa para una línea de base inestable. Tal Interfcias deben prevenirse mediante la comprobación de las conexiones de cable y la aspiración de la raíz por el electrodo. Además, debido a la amplitud de ráfaga es dependiente tanto el ruido de fondo y la conexión entre la raíz y el electrodo, la frecuencia es una gran parte de un parámetro fiable. Por lo tanto, la amplitud de ráfaga siempre debe ser expresado como porcentaje de los valores de referencia para evitar variaciones inter-individuales debido a la configuración.

Limitaciones de la técnica son determinados por la edad del animal del que la preparación puede ser realizado. Esto permite un estudio preciso de la creación de la unidad central de la respiración al nacer, que es muy interesante y clínicamente relevante, pero se centra en estas edades tempranas y no puede extenderse a edades más avanzadas. Edades más avanzadas se pueden utilizar en arterialmente perfundidos de trabajo preparados corazón del tronco cerebral 25, pero con modificaciones sustanciales de protocolo (véase más adelante). Una preparación de cordón tronco cerebral médula aislado de cobayas adultos ha sido desarrollared por Morin-Surun et al. 26, en la que el tronco cerebral se perfunde a través de la arteria basilar y el ritmo se registra en el nervio craneal XII. Otra limitación es la duración del experimento. La preparación no se puede mantener durante más de 7 horas en las condiciones descritas anteriormente 6. Por lo tanto, esta técnica no es apropiada para experimentos a largo plazo, aunque los preparativos de renacuajos (ver más abajo) se han mantenido las 24 horas en el laboratorio.

Varias modificaciones se pueden aplicar a esta técnica. Aquí, simulación hipóxica se ha realizado, pero otras variaciones de gas también son concebibles (por ejemplo., Hipercapnia 27 así como las variaciones de pH 28). De la misma manera, la preparación puede ser perfundido con LCRa en el que las drogas se han disuelto y se aplicó sobre el tronco cerebral como un pre-tratamiento durante 29 o 30 la grabación. En este caso, el ritmo se puede acelerar o retrasar 29 down 30 de acuerdo con el fármaco experimental. Por otra parte, con una cámara de registro compartimentada, diferente LCRa se puede aplicar sobre partes selectivas de los preparados y 6 variaciones de temperatura 9 se pueden emplear. Esta compartimentación permite el estudio de la implicación de las partes del tronco cerebral seleccionados en los efectos inducidos de estímulo. Mientras que la técnica presentada utiliza ratas recién nacidas, también es aplicable en otros modelos animales. Utilizando un protocolo similar a la aplicada para las ratas, los ratones pueden ser utilizados de día gestacional 16 (E16) hasta 12 P4. La diferencia principal es la necesidad de calentar y burbujear el carbógeno-LCRa durante la disección. Tortugas, renacuajos y ranas adultas también pueden ser utilizados; sin embargo, estas especies requieren diferentes técnicas de disección, así como ajustes a la composición de la LCRa.

Esta técnica también se puede acoplar con patch-clamp grabaciones en la cara rostral de la preparación 31, lo que permitela visualización simultánea de la señal de salida de la red y la actividad de una célula particular de esta red. Voltaje de imágenes colorante sensible también se puede aplicar en las preparaciones de la médula espinal-tronco cerebral de rata recién nacido para localizar las áreas activadas en la cara ventral del tronco cerebral 32. análisis de c-fos en las preparaciones también se puede realizar con el fin de identificar las poblaciones neuronales implicados en las respuestas respiratorias específicas. Por último, la preparación puede ser modificado para mantener otros órganos tales como el corazón 25, las costillas 6, o la perfusión de la arteria fisiológica con otros ritmos fisiológicos 33. Sin embargo, estas modificaciones muy importantes requerirían otros protocolos de disección.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

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References

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