Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording

Neuroscience

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Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

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Abstract

Introduction

Die Atmung ist eine komplexe und Lebenstätigkeit vom Gehirn gesteuert, so dass Disauerstoff (O 2) Aufnahme und Kohlendioxid (CO 2) Beseitigung. Der zentraler Atemantrieb wird durch ein komplexes Netzwerk im Hirnstamm sowohl in Säugetieren als 1 liegt, Amphibien 2, Reptilien 3, 4 Vögel und Fische 5 generiert. Auch wenn die Untersuchung der Atmung kann in vivo verarbeitet werden, präzise mechanistische Untersuchungen erfordern einen direkten Zugang zu dem Atemsteuerungsnetz. Hierzu Adrian und Buytendijk entwickelt eine reduzierte Goldfischzubereitung, bei dem Elektroden auf der Hirnoberfläche aktenkundig den erzeugten Rhythmuskiemen Belüftung 5 verbunden. Dieser Ansatz wurde später von Suzue 1984 6 zur Verwendung bei neugeborenen Nagern angepasst. Das Aufkommen dieser Zubereitung zu erheblichen Fortschritten in der Atem Neurobiologie geführt. Da es relativ einfach ist, hat die Technik here zugänglich ist eine breite Palette von Grundlagenuntersuchungen der rhythmische motorische Verhaltensweisen und ihren Ursprung in der neugeborenen Nagern.

Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, das neuronale Korrelat inspiratorischen Aktivität aufzuzeichnen, eine Atemwegsartigen Rhythmus genannte fiktive Atmung, ausgelöst durch den Atem Netzwerk hergestellt. Dieses Verfahren kann in einem breiten Spektrum von Forschungsziele eingesetzt werden, Targeting Inspirations antwortet Atemschwankungen oder Pharmakologie in beiden Wildtyp 7 und 8 transgenen Tieren. Da die Versuche werden bei einer niedrigen Temperatur durchgeführt wird, ohne afferenten Neuronen, und unter Bedingungen, bei denen die Konzentrationen von Glucose und O 2 in der aCSF hoch sind Fragen aufgeworfen über die physiologische Bedeutung des aufgezeichneten Signals. Zwar gibt es deutliche Unterschiede zwischen den in-vivo- und in-vitro-Bedingungen (z. B. die Frequenz des inspiratorischen Bursts) bleibt die Tatsache, dass das Vorhandensein vondie Kernelemente der Atemnetz 6 ist es möglich, eine robuste Rhythmus zu einer lebenswichtigen homöostatischen Funktion 9,10 assoziiert zu studieren.

Das Grundprinzip hinter der Entwicklung und der Einsatz dieser Technik ist es, einen direkten Zugang zum Hirnstamm Elemente des Atem Netzwerk, das in vivo schwer zugänglich sind, insbesondere bei Neugeborenen zu erleichtern. Der Hirnstamm unter streng kontrollierten Bedingungen ausgesetzt: das aufgezeichnete Rhythmus nicht von peripheren afferenten Inputs der Lunge oder der Halsschlagkörpern moduliert, so dass die Untersuchung auf den zentralen Atemantrieb selbst 11 konzentrieren. Somit ist dieser Zugang genutzt, um Reize gelten und notieren Sie die Ausgangssignal. Im Gegensatz zu Aufzeichnungen Plethysmographie wird der Atemrhythmus durch alle ihre Komponenten im ganzen Körper moduliert (z. B. Lungendehnung, periphere Chemosensoren) und macht es schwierig, eine genaue Stimuli anzuwenden.

In einem (newborn Ratte, das Protokoll aus der Aufzeichnung der vierten ventralen Wurzel Signal auf einem isolierten Hirnstamm und ein verkürztes Rückenmark, in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) gehalten. Die von Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen erzeugten Rhythmus der einzelnen langsamen Bursts, die auf der Inspirationssignal 9 verknüpft sind. Isolated Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen sind leicht bei Ratten bespielbar von postnatalen Tag 0-4 (P0 - P4) 7. Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die hypoxische Reaktion der Atem Netzwerk und auch die Antwort auf Hyperkapnie, Azidose oder Arzneimittel zu bewerten. Eine akute Hypoxie Protokoll wird hier vorgestellt. Diese Stimulation wird durch Entnahme von O 2 in der aCSF erhalten; Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die Toleranz und Ansprechbarkeit auf hypoxische Beleidigungen beurteilen. Das Protokoll verursacht eine Rhythmus Vertiefung von der ersten Minute, bis zum Ende der Belichtung Hypoxie (1) 12. Diese Vertiefung wird umgekehrtwährend der post-hypoxischen Recovery 12. Bezüglich der Versuchsanordnung ist es wichtig, zu bemerken, daß die Brücke, an der rostralen Teil der Hirnstamm, eine hemmende Wirkung auf den Rhythmusgenerator 8. So Zubereitungen der volle Hirnstamm und Rückenmark rostral zeigen eine geringere Rhythmus. Einbeziehung der Brücke in der isolierten Probe auf die Aufzeichnung wird entsprechend dem Ziel des Experiments 13 bestimmt wird; das Studium der pontine Einfluss auf das verlängerte Mark Netz erfordern würde Aufnahmen mit und ohne die Brücke, um die Ergebnisse 14 zu vergleichen. Außerdem ist einer der Vorteile dieser Technik die Möglichkeit einer Ausdehnung des rostralen Teil der Vorbereitung auf Mesencephalon-und / oder Zwischenhirnregionen 15,16 umfassen, die es ermöglicht, die Wirkung dieser Regionen auf dem ponto-medullären Atemnetz bewerten.

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Protocol

Diese Methode erforderte den Einsatz von Versuchstieren, die von der Universität Laval Tierethikkommission (Protokoll # 2012-170) erlaubt.

1. Aufbau und Vorbereitung

  1. Lösungen
    1. Bereiten aCSF Stammlösungen gemäß den folgenden Rezepturen 7,17. Weitere Rezepte mit Konzentrationsschwankungen sind in der Literatur. Shop-Stammlösungen bei 4 ° C für bis zu einem Monat.
      1. Salzlösung: add 75,39 g NaCl (129 mM final); 2,5 g KCl (3,35 mM final); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g MgCl & sub2; (1,15 mM final); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Man löst in 800 ml destilliertem Wasser, dann mit 1 l mit destilliertem Wasser zu füllen.
      2. Bicarbonat-Lösung: fügen 17,65 g NaHCO 3 (21 mM final). Man löst in 900 ml destilliertem Wasser, dann auf 1 Liter mit destilliertem Wasser zu füllen. Variationen der Bicarbonat-Konzentration wird im pH-Schwankungen führen.
      3. Glucose-Lösung: fügen 54,06g Glucose (30 mM Endkonzentration). Man löst in 400 ml destilliertem Wasser und dann auf 500 ml mit destilliertem Wasser zu füllen.
    2. Vorbereitung aCSF durch Verdünnen mit 100 ml Salzlösung, 100 ml Natriumbicarbonat-Lösung und 50 ml Glukoselösung in 1 l destilliertem Wasser. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
    3. Bereiten Sie eine Glaselektrode durch Erwärmen und Strecken einer Glasröhre, bis er bricht. Sand auf der Spitze vor dem Gebrauch. Die Elektrode kann viele Zeit wiederverwendet werden, solange es sauber bleibt.
  2. Versuchsaufbau
    Hinweis: Die Setup-Details sind in Abbildung 2 dargestellt.
    1. Einschalten des Verstärkers, Bewegen Mittelwertbildner, Datenerfassungssystem, einem Temperaturregler und der Pumpe. Sie können die Signalverstärkung (Verstärkung = 10.000), die Filtration (niedrige Schwelle, 10 Hz; hohe Schwelle, 5 kHz) und die Abtastrate des Analog-Digital-Umwandlung des Rohsignals (2,5 kHz).
    2. Füllen Sie eine Flasche mit aCSF und blasen es mit Carbogen (95% O 2 CO 2). Induzieren eine bubbled- und erwärmten aCSF Fluss in der Aufzeichnungskammer (Volumen 5 ml) bei 4 ml / min. Halten der Temperatur in dem Aufnahmeraum auf 26 (± 1) ° C. pH-Wert sollte 7,4 in diesen Standardbedingungen ist.
    3. Halten Sie 50 ml RT und Carbogen blasigen aCSF in einem 50-ml-Spritze in der Nähe der Dissektion Kammer.
    4. Schalten Sie den Computer und starten Sie die Aufnahme-Software.

2. Dissection

  1. Wiegen und das Geschlecht des Tieres visuell zu bestimmen (Männer haben eine längere anogenitalen Abstand, während Frauen haben eine kurze anogenitalen Abstand; Männchen Genitalien sind oft dunkel, während weiblichen Genitalien sind rosa).
  2. Betäuben die neugeborenen Nagern durch eine der folgenden Optionen: cryoanesthesia (das Tier im Eis vollständig einzutauchen für 4 - 5 min 18), Injektion (equitensine bei 4 ml / kg) 19 oder Einatmen von volatilen Anästhetika (Isofluran 20 oder Ether-21). Konfirm ein ausreichender Ebene Anästhesie durch das Fehlen einer Pfotenrückzugsreflex.
  3. Legen Sie das Tier auf der Bank, Bauchseite nach unten. Abschnitt der rostralen Teil des Kopfes koronal mit einem Skalpell am Bregma Ebene (durch die Haut und Schädel sichtbar). Führen Sie diesen Schritt unmittelbar nach dem das Tier narkotisiert.
  4. Abschnitt der Körper koronal mit einem Skalpell unter den vorderen Mitglieder.
  5. Entfernen Sie Haut, Muskeln, Fettgewebe und Eingeweide mit chirurgischen und dünne Scheren und Zangen. Da die Knochen sind weich in diesem Alter, seien Sie vorsichtig, um das Nervensystem nicht beschädigen. Führen Sie diesen Schritt auf der Bank.
  6. Legen Sie die Zubereitung in der Dissektion Kammer. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. Von diesem Punkt an das Ende der Aufzeichnung, mit einem Mikroskop.
  7. Auf der Rückenseite der Vorbereitung, schneiden Sie den Schädel und Wirbel von der rostral zur Schwanzteil entlang der mittleren Achse mit einer chirurgischen und dünne Scheren und Zangen. Öffnen Sie die Schnitt Schädelund Wirbeln, um das Nervengewebe freizulegen. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze strored, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen.
  8. Mit der Zange, entfernen Sie die Arachnoidea, eine, die die Oberfläche des Nervengewebes dünne Gewebe. Bewahren Sie die Pia mater und der Blutgefäße gegenüber dem Nervengewebe. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen.
  9. Platzieren Sie das Präparat mit der Rückenseite nach unten, und sorgfältig bringen den Hirnstamm und Rückenmark, indem die Nerven und Bindegewebe mit der Schere, während Sie die Zubereitung vorhanden. Ein dorsalen Zugang ist ebenfalls möglich. Halten Sie die Wurzeln und Nerven so lange wie möglich. Entfernen Sie die Knochen, um den Hirnstamm und Rückenmark zu isolieren. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen.
  10. Entfernen Sie das Kleinhirn und Rest rostral Strukturen durch Schneiden sie mit dem Skalpell. Verwenden Sie die aCSF im Nadel gespeichert werden, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen.
  11. Gegebenenfalls in Abhängigkeit experimental Design, entfernen Sie die Brücke mit dem Skalpell durch einen Frontalschnitt ventral des unteren Kleinhirnarterie 22. Beachten Sie, dass das Halten der gesamten Brücke wird den Rhythmus bei Ratten zu verlangsamen und vollständig zu hemmen sie in Mäusen. Präparate, die nur das Schwanzteil der Brücke sind zeigen eine Atem-ähnliche Aktivität mit einer stabilen Frequenz am C4 Wurzel.

3. Aufnahme

  1. Legen Sie die Zubereitung in der Aufnahme Kammer, Bauchseite nach oben. Befestigen Sie die Vorbereitung mit Stiften im untersten Teil des Rückenmarks und rostral-größten Teil des Hirnstamms.
  2. Unter Verwendung einer Spritze zu der Elektrode durch die Nadel verbunden ist, induzieren eine Vertiefung in der Elektrode (Glas Spitze einen Durchmesser von 150 bis 225 um) durch Herausziehen des Spritzenkolbens, um die Elektrode teilweise zu füllen mit aCSF.
  3. Mit einem Mikromanipulator, vorsichtig die Elektrode in der Nähe von einer der vierten Vorderwurzeln. Andere ventralen Wurzeln könnte auch präsentieren eine Atem-ähnliche Aktivität (z.g., XII Hirnnerv, C1 ventralen Wurzel).
  4. Induzieren eine Vertiefung in der Elektrodentank über der Spritze durch Herausziehen des Kolbens, um sanft saugen Sie den Nerven rootlet. Dann vorsichtig die Elektrode zu bewegen, um es gegen das Rückenmark an.
    Anmerkung: Idealerweise wird die Größe des rootlet passt die Größe der Elektrodenöffnung und schafft so eine Dichtung zwischen den inneren und äußeren Kammern der Elektrode. Da Differenzverstärker werden üblicherweise für solche Aufzeichnungen verwendet, jede Öffnung zwischen der Innenseite der Elektrode und dem Aufzeichnungsraum reduziert die Qualität des Signals und macht es schwierig, Hintergrundrauschen zu beseitigen.
  5. Starten Sie die Aufnahme.
  6. Aufzeichnung der durch die Herstellung unter normoxischen Bedingungen hergestellt Rhythmus (dh geperlt aCSF mit Carbogen: 95% O 2 und 5% CO 2) für mindestens 20 min, um die Basislinienparameter der Zubereitung bestimmen.
  7. Schalten Sie die Perfusion von Carbogen blasigen aCSF zuaCSF Stimulus (dh mit 95% N 2 und 5% CO 2 für Hypoxie Stimulus perlt) für 15 min. Alter Expositionsdauer in Abhängigkeit der Versuchsprotokoll. Notieren Sie sich die Expositionsdauer auf das Aufzeichnungs und Tier Datenblatt. Verwenden Edelstahlrohre zwischen aCSF Flasche und der Kammer, wenn möglich, Gasdiffusion zu der Außenseite des Rohres zu vermeiden.
  8. Schalten Sie die Durchblutung wieder in Standard Carbogen blasigen aCSF für mindestens 15 Minuten auf eine Erholung Aufnahme. Nehmen Sie diese auf dem Aufzeichnungs und Tier Datenblatt.
  9. Beenden Sie die Aufnahme.

4. Statistische Analyse

  1. Aus dem integrierten Signal, die Berechnung der Frequenz wie die Anzahl der Bursts pro Minute (in Bursts / min ausgedrückt wird), die Amplitude der Differenz zwischen dem Ausgangswert und der Spitze des Bursts (in mV), die Burstdauer als die Dauer von Anfang bis zum Ende des Bursts (ausgedrückt in s), die Burst-Fläche wie die Fläche unter der curve des Bursts auf dem integrierten Signal (in mV · s) (Abbildung 3).
  2. Berechnen Sie die Frequenz, Amplitude, Burstdauer und Burst-Bereich unter normoxischen (Baseline), hypoxische (Stimulus) und Post-hypoxischen (post-Stimulus) Erholung Bedingungen wie der Durchschnitt der letzten 5 Minuten der Aufnahmen für jede Bedingung. Analyse nicht den ersten Abschnitt einer jeden Zustand, da es eine Verzögerung zwischen dem Einschalten der Perfusion und aCSF Homogenisierung im Aufnahmeraum.
  3. Express dann Stimulus (dh Hypoxie) und Post-Stimulus (dh post-hypoxischen) Recovery-Werte als Prozentsatz der Baseline-Werte für die entsprechende Aufnahme. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD

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Representative Results

Wie in der Einleitung erwähnt, ist einer der wichtigsten Vorteile dieser Technik die direkten Zugang zum Hirnstamm verschiedene Stimuli anzuwenden. Als Beispiel wurde hier Hypoxie aufgetragen. Abbildung 1. AB zeigt eine vollständige Protokollaufzeichnung, mit beiden normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Abbildung 1.CE zeigt den Rhythmus in normoxischen Bedingungen (dh aufgezeichnet, sprudelte aCSF mit 95% O 2 und 5% CO 2 bei 26 ° C). Wie zuvor in diesem genauen Zubereitung 11 demonstriert wird, ist die Frequenz von 8 Bursts / min, und die Amplitude beträgt ca. 0.800 mV. Man beachte, daß die Amplitude nur indikativ ist aufgrund seiner wichtigen inter Zubereitung Variationen. Die obere Kurve stellt das integrierte Signal, während die untere Kurve stellt die Rohsignal. Abbildung 1.DF zeigt den Rhythmus in hypoxischen Bedingungen aufgezeichnet (dh., Sprudelte aCSF mit 95% N 2 und 5% CO <sub> 2 bei 26 ° C). Wie vorher gekennzeichnet 23, die Frequenz drastisch während Hypoxie vermindert. Abbildung 1.GH zeigt einen einzelnen Burst, das typische Muster in normoxischen und hypoxischen Bedingungen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Beispiele für Aufnahmen aus Hirnstamm-Rückenmarks Vorbereitungen erhalten. Atem Ausgabe aus dem C4 ventralen Wurzel von Präparaten aus P4 Ratten unter normoxischen, hypoxischen und Post-Recovery-hypoxischen Bedingungen ((A) integriert Signal und (B) Rohsignal) aufgezeichnet . Für jede Bedingung vergrößerte Aufnahmen ((C) integriert normoxic Signal; (D) integriert hypoxischen Signal; (E) raw normoxic Signal; (F) raw hypoxischen Signal) und Einzel-Burst ((G) normoxic Burstund (H) hypoxischen Burst) dargestellt. Wie im Text erwähnt, beachten Sie bitte, dass Amplitude muss sorgfältig interpretiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Zusammenfassende Schema des Setup. Das sprudelte aCSF wird erwärmt und durch eine Pumpe in der Aufnahme Kammer geschickt. aCSF Schuß im Aufnahmeraum wird durch eine Pumpe angesaugt und entsorgt. Die Aufzeichnungskammer auf dem Boden und dem Temperaturregler verbunden. Die Elektrode Ausgang direkt an den Verstärker mit dem beweglichen Mittelwertbilder und des Datenerfassungssystems und schließlich den Computer weitergeleitet und dann. Hier klicken to vergrößern Version dieser Figur.

Figur 3
Abbildung 3 Analysierte Burst-Parameter. Die Frequenz wird als die Anzahl der Bursts pro Minute (in Bursts / min ausgedrückt wird), der Amplitude der Differenz zwischen dem Ausgangswert und der Spitze des Bursts (in mV), die Burstdauer, berechnet Die Dauer vom Beginn bis zum Ende des Bursts (in s ausgedrückt), die Burst-Fläche wie die Fläche unter der Kurve des Bursts auf integrierte Signal (in mV · s). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.

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Discussion

Genaue Quantifizierung der Atmungsaktivität kann eine Herausforderung sein. In der Tat ist die Atmung eine Funktion, die automatische und freiwillig sein kann, und das ist entsprechend der Umgebung, die Bedürfnisse des Körpers, den emotionalen Zustand und das Verhalten moduliert. Der Vorteil dieser Technik ist die Isolierung von den neuronalen Elementen zur Erzeugung des Atembefehl verantwortlich. Somit elektrophysiologische Aufzeichnungen von Hirnstamm-Rückenmarkspräparaten und Plethysmographie komplementäre Techniken, um das gesamte neuronale Netzwerk Atem in vitro und in vivo jeweils studieren. Patch-Clamp-Messungen im Hirnstamm-Rückenmarks-Präparat (z. B. nähert sich von der Bauchseite) sind denkbar und ermöglichen die Untersuchung eines bestimmten Neurons in einem erhaltenen Atem Netzwerk 24.

Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, vor allem in der Präparation. Um Nervenschäden Gewebe zu vermeiden,alle Dissektion Schritte sollten schnell und präzise ausgeführt werden. Das Nervengewebe nicht beschädigt werden und sorgfältig durch ständiges Eintauchen in aCSF konserviert werden. Wie zuvor erwähnt, ist die Qualität der Verbindung zwischen den Nerven rootlet und der Elektrode ein zweiter kritischer Schritt. Aspiration des rootlet kann die Elektrode näher an der Vorbereitung zu bringen. Während der Kontakt zwischen der Elektrode und den Hirnstamm kann die Qualität der Abdichtung zu verbessern, muss man verhindern, dass eine Vertiefung oder physikalisches Zerstören der Präparation.

Das integrierte Signal immer für die Analyse verwendet werden, aber Rohsignale kann nützlich sein, um eine ordnungsgemäße Bursts von Hintergrundrauschen zu unterscheiden. Darüber hinaus kann ein Lautsprecher zum Setup hinzugefügt werden, um den Rhythmus zu hören und zu bestimmen, Signalqualität und Hintergrundgeräusche durch Vorsingen vor. In der Tat, einige Variationen im Hintergrund Basislinie vorhanden sein könnten durch elektrische Interferenzen und die Ursache zu einer instabilen Basislinie. Solche interferenzen sollte durch Überprüfung Kabelverbindungen und Wurzel Absaugen von der Elektrode verhindert werden. Da außerdem Burstamplitude hängt sowohl von Hintergrundrauschen und die Verbindung zwischen der Wurzel und der Elektrode wird die Frequenz eine viel zuverlässiger Parameter. Somit sollte die Burstamplitude immer ausgedrückt werden als Prozentsatz der Grundlinienwerte, um interindividuelle Schwankungen aufgrund von Setup zu vermeiden.

Beschränkungen der Technik werden von dem Alter des Tieres, von dem die Präparation realisiert werden bestimmt. Dies ermöglicht eine präzise Studie über die Einrichtung der zentralen Atemantrieb bei der Geburt, die sehr interessant und klinisch relevante, aber es konzentriert sich auf diese frühen Alter und können nicht auf spätere Zeiten verlängert werden. Ältere Altersgruppen können in arteriell perfundierten arbeiten heart-Hirnpräparate 25 verwendet werden, aber mit erheblichen Modifikationen Protokoll (siehe unten). Eine isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Herstellung von erwachsenen Meerschweinchen hat sich zu entwickelnMorin-Surun et al. 26, in dem der Hirnstamm wird über die Arteria basilaris perfundiert und der Rhythmus ist im XII Hirnnerven aufgezeichnet ed. Eine weitere Einschränkung ist die Dauer des Experiments. Das Präparat kann nicht für mehr als 7 Stunden in den zuvor beschriebenen Bedingungen 6 gehalten werden. Daher ist diese Technik nicht für Langzeitexperimente geeignete, wenn auch Präparate aus Kaulquappen (siehe unten) wurden 24 Stunden im Labor gehalten.

Verschiedene Modifikationen an diesem Verfahren angewendet werden. Hier hypoxischen Aufgabe durchgeführt wurde, sondern ein anderes Gas Variationen sind denkbar (z. B. Hyperkapnie 27 sowie pH-Schwankungen 28). In gleicher Weise kann die Zubereitung mit aCSF in denen Medikamente wurden gelöst und auf die Hirnstamm als Vorbehandlung 29 oder 30 während der Aufzeichnung aufgetragen perfundiert werden. In diesem Fall kann der Rhythmus beschleunigt oder verlangsamt werden 29 Down 30 gemß der experimentellen Medikament. Außerdem mit einer kompartimentierten Aufnahmekammer unterschiedliche aCSF auf selektive Teile der Zubereitung 6 und Temperaturschwankungen 9 verwendet werden können, angewendet werden. Diese Trennung ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der ausgewählten Hirnteile in den Stimulus-induzierten Effekten. Während die Technik vorgestellt verwendet neugeborenen Ratten, ist es auch auf andere Tiere Modelle anwendbar. Verwendung eines Protokolls, ähnlich der für Ratten angewendet wird, kann Mäuse aus Schwangerschafts Tag 16 (E16) bis P4 12 verwendet werden. Der Hauptunterschied ist die Notwendigkeit, die aCSF während der Präparation erwärmen und Carbogen-Blase. Schildkröten, Kaulquappen und Frösche Erwachsenen kann ebenfalls verwendet werden; Allerdings sind diese Arten erfordern unterschiedliche Dissektion Techniken sowie Anpassung der Zusammensetzung des aCSF.

Diese Technik kann auch mit Patch-Clamp-Aufzeichnungen auf dem rostralen Fläche der Zubereitung 31 gekoppelt werden, so dassgleichzeitige Darstellung der Netzwerkausgangssignal und die Aktivität einer bestimmten Zelle dieses Netzwerks. Spannungsempfindlichen Farbstoff Bildgebung kann auch bei neugeborenen Ratten-Hirnstamm-Rückenmarks Präparate angewendet werden, um die aktivierten Bereiche auf der Bauchseite des Hirnstamms 32 zu lokalisieren. c-fos-Analyse in den Zubereitungen auch, um die neuronale Populationen in bestimmten Atemwegsreaktionen beteiligt sind realisierbar. Schließlich kann die Zubereitung so geändert werden, wie das Herz 25, Rippen 6 oder physiologischen Arterie Perfusion mit anderen physiologischen Rhythmen 33 auf andere Organe zu halten. Allerdings würde diese sehr wichtige Modifikationen anderen Dissektion Protokolle erfordern.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

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References

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