Yenidoğan Kemirgenler İzole Beyin Sapı-spinal Kordon Müstahzarlar Elektrofizyoloji Sinir Solunum Ağı Çıktı Kayıt verir

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Solunum dioksijen (O 2) alımı ve karbondioksit (CO 2) eliminasyon izin beyin tarafından kontrol edilen karmaşık ve hayati faaliyeti vardır. Merkezi solunum sürücü hem memelilerde 1 beyin sapı bulunan karmaşık bir ağ, amfibiler 2, sürüngenler 3, kuşlar ve balıklar 4 5 tarafından oluşturulur. Nefes çalışma in vivo olarak işlenebilir bile, hassas mekanik araştırmalar solunum kontrolü ağına doğrudan erişim gerektirir. Bu amaçla, Adrian ve Buytendijk beyin yüzeyi kayıt solungaç havalandırma 5 ile bağlantılı üretilmiş bir ritm yerleştirilmiş elektrodlar olan bir düşük akvaryum balığı hazırlama, geliştirdi. Bu yaklaşım sonradan doğan kemirgenler kullanılmak üzere 1984 yılında 6 Suzue tarafından uyarlandı. Bu hazırlık gelişi solunum nörobiyoloji önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu, nispeten basit olduğundan, bu teknik h sunulmaktadırere ritmik motor davranışlar ve yenidoğan kemirgenlerde kökenleri temel araştırmaların geniş bir mükellef olduğunu.

Bu yöntemin genel amacı inspiratuar aktivite nöral korelasyonu kaydetmek için, bir solunum benzeri ritim solunum ağı tarafından üretilen kurgusal nefes çağırdı. Bu yöntem, hem de vahşi tip 7 ve transjenik 8 hayvan solunum varyasyonlar ve farmakoloji inspiratuar yanıtları hedef araştırma amaçları geniş bir aralığında kullanılabilmektedir. Kaydedilen sinyalin fizyolojik alaka ilgili deneyler duyusal aferentlerde olmadan, düşük bir sıcaklıkta gerçekleştirilir ve aCSF içinde glikoz ve O 2 konsantrasyonları yüksek olduğu koşullarda, sorular gündeme getirilmiştir göz önüne alındığında. In vivo ve in vitro koşullarda arasında belirgin farklılıklar olmakla birlikte (örn., Inspiratuar patlamaların sıklığı) gerçeği varlığı kalırSolunum ağının 6 temel unsurları mümkün hayati homeostatik işlevi 9,10 ilişkili sağlam bir ritim eğitimi yapmak.

Geliştirilmesi ve bu tekniğin kullanılması ardındaki mantık, özellikle yenidoğanlarda, in vivo pek erişilebilir solunum şebekenin beyin sapı elemanları, doğrudan erişim kolaylaştırmaktır. Beyin sapı sıkı kontrol koşulları altında yerleştirilir: kaydedilen ritim akciğerlerde veya karotid organları periferik afferent girdiler modüle değil, çalışma merkezi solunum sürücünün kendisini 11 odaklanmasını sağlar. Bu nedenle, bu erişim uyaranlara uygulanır ve çıkış sinyalini kaydetmek için kullanılır. Kayıtları, pletismografi aksine, solunum ritminde vücut boyunca tüm bileşenleri ile modüle (örn., Akciğer şişliği, periferal chemosensors), zor hassas uyaranlara uygulamak adrestir.

Bir Inewborn sıçan, protokol yapay beyin-omurilik sıvısı (aCSF) muhafaza izole bir beyin sapında dördüncü ventral kök sinyali ve bir kesik omuriliği, kayıt oluşmaktadır. Beyin-omurilik preparasyonlar tarafından oluşturulan ritim inspiratuar sinyali 9 bağlanmış, tek tek ağır patlamaları oluşmaktadır. 7 - İzole beyin sapı-omurilik hazırlıkları kolayca 4 (P4 P0) post-natal 0. günden sıçanlarda kaydedilebilen vardır. Bu yaklaşım, genellikle, solunum ağın hipoksik yanıtı ve aynı zamanda hiperkapni, asidoz ve ilaçlara yanıtını değerlendirmek için kullanılır. Akut hipoksi protokol sunulmuştur. Bu uyarım aCSF içinde O 2 çekilmesi ile elde edilir; Bu yaklaşım genellikle hipoksiktir hoşgörü ve yanıt değerlendirmek için kullanılır. Protokol hipoksi maruziyeti sonunda (Şekil 1) 12 kadar ilk dakikadan itibaren bir ritim depresyon neden olur. Bu depresyon tersine çevrilirPost-hipoksik iyileşme 12'ye sırasında. Deneysel tasarım ile ilgili, beyin sapı rostral kısmında bulunan pons, ritim jeneratörü 8 üzerinde inhibitör etkiye sahip olduğunu fark etmek önemlidir. Böylece, tam beyin sapı ve rostral omurilik hazırlıklar daha düşük bir ritim gösterir. Kayıt için izole numunede pons dahil edilmesi Deney 13 hedefine göre belirlenir; soğanilik ağdaki pons etkisi çalışma sonuçlarını 14 karşılaştırmak pons olan ve olmayan kayıtları gerektirecektir. Ayrıca, bu tekniğin avantajlarından biri, mezensefalik ve / veya diensefalik bölgeleri 15,16 dahil hazırlık rostral bir kısmının etrafında uzanan mümkün ponto-medüller solunum ağda bu bölgelerin etkisini değerlendirmek için yapma imkanı vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu yöntem, Laval Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (protokol # 2012-170) tarafından izin verilen hayvan deneklerin kullanımını gerekli.

1. Kurulum ve Hazırlık

  1. Çözümler
    1. Aşağıdaki tarifleri 7,17 göre aCSF stok çözümleri hazırlayın. Konsantrasyon varyasyonları ile diğer yemek tarifleri literatürde mevcuttur. En fazla bir ay süreyle 4 ° C'de saklayın stok çözeltileri.
      1. Tuz çözüm: NaCl 75,39 g (129 mM nihai) ekleyin; KCl 2,5 g (3,35 mM nihai); NaH2PO4, 0.81 g (0.58 mM nihai); MgCl2 2.33 g (1.15 mM nihai); CaCl2 1.85 g (1.26 mM). Daha sonra damıtılmış su ile 1 L damıtılmış su içinde dolgu 800 ml içinde çözülür.
      2. Bikarbonat çözeltisi: NaHCO 3 (21 mM nihai) 17.65 g ekleyin. Daha sonra damıtılmış su ile 1 L damıtılmış su doldurun 900 ml içinde çözülür. Bikarbonat konsantrasyonunun varyasyonlar pH varyasyonları ile sonuçlanacaktır.
      3. Glikoz çözüm: 54.06 ekleyinglikoz g (30 mM nihai). Daha sonra damıtılmış su ile 500 ml'ye kadar damıtılmış su doldurun 400 ml içinde çözülür.
    2. Tuz çözeltisi 100 ml, bikarbonat çözeltisi, 100 ml damıtılmış su, 1 L glikoz solüsyonu 50 ml seyreltilerek aCSF hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
    3. Isınma ve kopana kadar bir cam tüp gererek cam elektrot hazırlayın. Kullanmadan önce ucu aşağı Kum. Elektrot sürece temiz kalır gibi birçok zaman yeniden kullanılabilir.
  2. Deneysel kurulum
    Not: kurulum detayları Şekil 2'de sunulmuştur.
    1. Ortalaması alınmış, veri toplama sistemi, sıcaklık kontrolörü ve pompayı hareketli, amplifikatörü açın. Ve ham sinyal (2.5 kHz) dijital dönüşüm analog örnekleme oranını, sinyal amplifikasyon (= 10,000 kazanç), filtrasyon (yüksek eşik, 5 kHz düşük eşik, 10 Hz) kontrol edin.
    2. ACSF ve karbojen (% 95 O 2 ile kabarcık onu bir şişe doldurun b>% 5 CO2). / Dakika 4 ml'de kayıt odasına (hacim 5 mL) 'de bir bubbled- ve ısıtılmış aCSF akış neden. ° 26 de kayıt bölümü içinde sıcaklığı (± 1) tutun. pH, bu standart koşullarda 7,4 olmalıdır.
    3. Diseksiyon odasının yakınında, bir 50 ml şırınga içinde, oda sıcaklığında ve karbojen-kabarmış aCSF 50 ml tutun.
    4. Bilgisayarı açın ve kayıt yazılımı başlatın.

2. Diseksiyon

  1. Tartılır ve görsel hayvanın cinsiyeti belirlemek (kadın kısa ano-genital mesafe varken erkek, uzun bir ano-genital mesafe var; kadın genital pembe iken genital genellikle koyu erkeklerin).
  2. Aşağıdaki seçeneklerden birine göre yeni doğmuş kemirgenler anestezisi: cryoanesthesia (tam 4 buz içinde hayvan daldırın - 5 dakika 18) (4 ml / kg equitensine), enjeksiyon, uçucu anestezikler (izofluran 20 veya eter 21) 19 ya da inhalasyon. Confirm Bir pençe geri çekme refleksinin yokluğu ile anestezi yeterli bir uçak.
  3. Aşağı bankta hayvan, ventral yüzü koyun. Bölüm (deri ve kafatası yoluyla görülebilir) Bregma düzeyinde bir neşter ile koronal başın rostral parçası. Hayvan anestezi hemen sonra bu adımı gerçekleştirin.
  4. Bölüm vücut koronal anterior üyeleri altında bir neşter ile.
  5. Cerrahi ve ince makas ve pense ile cilt, kaslar, yağ doku ve organ çıkarın. Kemikler bu yaşta yumuşak olduklarından, sinir sistemine zarar değil dikkatli olun. Bankta bu adımı gerçekleştirin.
  6. Diseksiyon odasında hazırlık yerleştirin. Preparasyonunu oksijen şırınga saklanan aCSF kullanın. Kaydın sonuna Bu açıdan bakıldığında, bir mikroskop kullanılır.
  7. Hazırlık dorsal yüzünde, cerrahi ve ince makas ve pense ile orta eksen boyunca kaudal kısmına rostral gelen kafatası ve vertebralar kesti. Kesim kafatası açınve sırayla omurganın sinir dokusunun ortaya çıkarmak. Preparasyonunu oksijen olması enjektördeki strored aCSF kullanın.
  8. Pense ile Araknoid membran, sinir dokusunun yüzeyini örten ince bir doku çıkarın. Sinir dokusunun karşı pia mater ve kan damarlarını korur. Preparasyonunu oksijen şırınga saklanan aCSF kullanın.
  9. Dorsal ile hazırlık yüzü aşağı gelecek şekilde ve dikkatle yerine hazırlık tutarken makasla sinirleri ve bağ dokusu kesilerek beyin sapı ve omurilik aşağı getirmek yerleştirin. Bir dorsal yaklaşım da mümkündür. Mümkün olduğunca uzun kökleri ve sinirleri tutun. Beyin sapı ve omurilik izole etmek için kemikleri çıkarın. Preparasyonunu oksijen şırınga saklanan aCSF kullanın.
  10. Beyincik çıkarın ve neşter ile kesit ile rostral yapıları kalan. Preparasyonunu oksijen iğne saklanan aCSF kullanın.
  11. İsteğe bağlı olarak experimen bağlı olaraktal tasarım, alt serebellar arterin 22 koronal kesit ön tarafından neşterle pons kaldırın. Bütün pons tutarak sıçanlarda ritmi yavaşlatmak ve tam farelerde bunu inhibe unutmayın. Pons sadece kaudal bölümünü içerir hazırlıklar C4 kökünde istikrarlı bir frekans ile solunum benzeri aktivite gösterirler.

3. Kayıt

  1. Kayıt odası, ventral yüzü yukarı hazırlık yerleştirin. Omurilik ve beyin sapında rostral-çoğunlukla en alt kısmında yer pimleri ile hazırlık sabitleyin.
  2. Kısmen aCSF ile elektrot doldurmak için, şırınga pistonu çekerek: - (225 mikron 150 cam ucu çapı) olan iğne ile elektrot bağlanan bir şırınga kullanarak, elektrot bir depresyon neden olur.
  3. Bir mikromanipülatör kullanarak, dikkatle dördüncü ventral köklerin birine yakın elektrot yerleştirin. Diğer ventral kökleri de solunum benzeri aktivite (e sunabilir.g., XII kranial sinir, C1 ventral kök).
  4. Yavaşça sinir kökçük aspire için pistonu çekerek şırıngayla elektrot tankında bir depresyon neden olur. Sonra dikkatlice omurilik karşı uygulamak için elektrot taşıyın.
    Not: İdeal olarak ince kök boyutu elektrot açıklığının boyutu ile eşleşen ve böylece elektrot iç ve dış bölümler arasında bir sızdırmazlık sağlar. Diferansiyel amplifikatör genellikle bu tür kayıtlar için kullanılan bu yana, elektrodun iç ve kayıt odasının arasında herhangi bir açıklık sinyalinin kalitesini düşürür ve zor arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için yapar.
  5. Kayda başlayın.
  6. Normoksik koşullar altında hazırlanması tarafından üretilen ritmi kaydedin (örneğin, aCSF karbojen ile fokurdatıldı:% 95 O2 ve% 5 CO2), en az 20 dakika Preparat başlangıç ​​parametrelerini belirlemek için.
  7. Için karbojen-kabarmış aCSF gelen perfüzyon Anahtarıuyaran CSF (yani,% 95 N2 ve% 5 hipoksi uyarıcı CO2 ile kabarcıklandırılmış) 15 dakika karıştırıldı. Deneysel protokol bağlı pozlama süresini değiştirin. Kayıt ve hayvan veri sayfasında pozlama süresini kaydedin. ACSF şişe ve tüp dışına gaz difüzyonu önlemek için mümkün olduğunca odasına arasındaki paslanmaz çelik borular kullanın.
  8. Kurtarma kayıt için en az 15 dakika süreyle standart karbojen-kabarmış aCSF geri perfüzyon geçin. Kayıt ve hayvan veri sayfasında bu kaydedin.
  9. Kaydı bitirmek.

4. İstatistiksel Analiz

  1. Entegre sinyal, (patlamaları / dak olarak ifade edilmiştir) Dakikada patlamaları sayısı sıklığı, başlangıç ​​ve (mV) olarak ifade patlama tepe arasındaki fark olarak genlik gelen süresi olarak patlama süresini hesaplamak (s) olarak ifade patlama sonuna başlangıcı, cur altındaki alan olarak patlama alanı(mV cinsinden ifade edilmiştir · s), entegre bir sinyal (Şekil 3) kaymasının ettik.
  2. Her durum için kayıtların son 5 dakika ortalama olarak frekans, genlik, patlama süresi ve patlama alanı normoksik altında (başlangıç), hipoksik (uyaran) ve post-hipoksik (post-uyaran) kurtarma koşullarını hesaplayın. Kayıt odasına perfüzyon ve aCSF homojenizasyon anahtarlama arasında bir gecikme olduğundan, her durumda ilk kısmını analiz etmeyin.
  3. İlgili kayıt için temel değerlerinin bir yüzdesi olarak daha sonra uyaran (örneğin, hipoksi) ve post-uyaran (örneğin, post-hipoksik) kurtarma değerleri ifade eder. SD ± aracı olarak sonuçları Express

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Girişte belirtildiği gibi, bu tekniğin en önemli avantajlarından biri beyin sapı doğrudan erişim çeşitli uyaranlara uygulamaktır. Bir örnek olarak, hipoksi burada uygulandı. Şekil 1. AB hem normoksik ve hipoksik koşullarda, bir tam protokolü kayıt gösterir. Şekil 1.CE yani normoksik koşullar (kaydedilen ritmi görüntüler aCSF% 95 O2 ve% 5 ile kabarcıklandırılmış 26 ° C'de CO2). Daha önce tam olarak bu hazırlama 11 de gösterildiği gibi, frekans, yaklaşık 8 patlamaları / dakikadır ve genliği yaklaşık 0,800 mV'dir. Genlik nedeniyle önemli arası hazırlık varyasyonları sadece gösterge olduğunu unutmayın. Alt iz ham sinyal temsil ederken, üst iz entegre sinyal temsil etmektedir. Şekil 1.DF (hipoksik koşullarda kaydedilen yani., ACSF% 95 N 2 ve% 5 CO ile kabarmış ritim görüntüler <alt> 2) 26 ° C'de ilave edildi. Daha önce 23 karakterize edilen, frekans dramatik hipoksi sırasında düşmüştür. Şekil 1.GH normoksik ve hipoksik koşullarda tipik desenleri gösteren tek bir patlama görüntüler.

figür 1
Beyin Sapı-omurilik Kordon Hazırlıkları Elde Edilen Kayıtların Şekil 1. örnekler. Normoksik, hipoksik ve post-hipoksik kurtarma koşullarında ((A) entegre sinyal ve (B) ham sinyal) altında P4 sıçanların hazırlıklar C4 ventral kök kaydedilen Solunum çıktı . Ve tek patlama ((G) Normoksik patlama her bir durum için, genişlemiş kayıtları (; (D) entegre hipoksik sinyalini; (E) ham Normoksik sinyali (F) ham hipoksik sinyali (C) Normoksik sinyal entegre)ve (H) hipoksik patlaması) gösterilmektedir. Metinde de belirtildiği gibi, bu genlik dikkatle yorumlanmalıdır lütfen unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Kur Şekil 2. rekapitülasyon Şeması. Kabarmış aCSF ısındı ve kayıt odasına bir pompa tarafından gönderilir. kayıt bölümü içinde aCSF aşırı bir pompa ile aspire edilir ve atılır. Kayıt bölmesi zemin ve sıcaklık kontrol birimi ile bağlantılıdır. Elektrodu çıkışı doğrudan hareketli ortalama alma ve veri toplama sistemi ve nihayet bilgisayar, sonra amplifikatöre iletilir. Tıklayınız to bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntüleyin.

Şekil 3,
Şekil 3. Analiz Burst Parametreleri. Frekans (patlamaları / dk olarak ifade edilmiştir) Dakikada patlamaları sayısı, taban ve (mV) olarak ifade patlama tepe arasındaki fark olarak genlik, patlama süresi olarak hesaplanır (s) olarak ifade çoğuşmanın başından sonuna kadar süre, entegre sinyal üzerindeki patlamanın eğri altındaki alan olarak patlama alanı (mV cinsinden ifade · ler). Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Solunum aktivitesinin doğru miktar zor olabilir. Nitekim, nefes otomatik ve gönüllü hem de olabilecek bir fonksiyondur ve bu ortamda, vücudun ihtiyaçlarına duygusal durumu ve davranış göre modüle edilir. Bu tekniğin avantajı, solunum komutu üretmekten sorumlu nöral elemanların izolasyondur. Bu nedenle, beyin sapı-omurilik preparatları ve pletismografi elektrofizyolojik ölçümler sırasıyla in vitro ve in vivo olarak bütün nöronal solunum ağ çalışma tamamlayıcı tekniklerdir. Beyin sapı-omurilik hazırlık patch-kelepçe kayıtları (örn., Ventral yüzeyinden yaklaşan) de düşünülebilir ve korunmuş solunum ağda 24 belirli bir nöronun çalışma izin verir.

Bu protokol esas diseksiyon, bazı kritik adımları içermektedir. Sinir dokusu hasar görmesini önlemek amacıyla,tüm diseksiyon adımlar hızla ve tam olarak yürütülmelidir. Sinir dokusu zarar olmamalıdır ve dikkatle aCSF sürekli daldırma ile korunacak. Daha önce belirtildiği gibi, sinir kökçük ve elektrot arasındaki bağlantının kalitesini ikinci önemli bir adımdır. Kökçük aspirasyonu hazırlanması yakın elektrot getirebilir. Elektrot ve beyin sapı arasındaki temas mühür kalitesini artırmak mümkün olmakla birlikte, tek bir depresyon yapmadan veya fiziksel hazırlık zarar vermemek için vardır.

Entegre sinyali her zaman analiz için kullanılması gerektiğini, ancak çiğ sinyaller arka plan gürültü uygun patlamaları ayırt etmek yararlı olabilir. Dahası, bir hoparlör ritmine dinlemek ve sinyal kalitesi ve seçmelere göre mevcut arka plan gürültü belirlemek için kurulum eklenebilir. Aslında, arka plan taban bazı varyasyonlar nedeniyle istikrarsız taban elektrik parazit sebep ve mevcut olabilir. Bu interferences elektrod tarafından kablo bağlantılarını ve kök aspirasyon kontrol ederek önlenmelidir. Kayma amplitüd hem arka plan gürültüsü ve kök ve elektrot arasındaki bağlantı bağlıdır çünkü Ayrıca, frekans güvenilir bir parametrenin fazla. Böylece, patlama genliği daima başlangıç ​​değerleri yüzdeleri nedeniyle kurulumu bireyler arası farklılıkları önlemek için ifade edilmelidir.

Tekniğin kısıtlamaları hazırlanması fark edilebilir olan hayvanın yaşına göre belirlenir. Bu çok ilginç ve klinik olarak anlamlı olan doğumda santral solunum sürücünün kurulmasına, kesin bir çalışma sağlar, ancak bu erken yaşlarda odaklanır ve ileri yaşlara kadar uzatılabilir edilemez. Eski yaşları arteriyel perfüze çalışma kalp-beyin sapı hazırlıkları 25 kullanılan, ancak önemli protokol değişiklikleri ile (aşağıya bakınız) olabilir. Yetişkin kobay izole edilmiş bir beyin sapı-omurilik hazırlık geliştirmek olmuşturMorin-Surun ve ark., 26, beyin sapı baziler arter yoluyla perfüze ve ritm XII kraniyal sinir kaydedildiği ederek hazırlanabilir. Başka bir sınırlama deney süresidir. Hazırlanması daha önce tarif edilen koşullar 6 fazla 7 saat boyunca muhafaza edilemez. Bu nedenle, bu teknik tadpoles (aşağıya bakınız) ile ilgili preparasyonlar laboratuarda 24 saat tutulmuştur bile, uzun süreli deneyler için uygun değildir.

Çeşitli modifikasyonlar bu teknik de uygulanabilir. Burada, hipoksik zorluk gerçekleştirilmiştir, ama başka gazlar, varyasyonları de düşünülebilir (örneğin., Hiperkapni 27 yanı sıra pH değişimleri 28). Aynı şekilde, preparat ilaçlar çözülmüş ve bir ön-muamele olarak 29 ya da 30 kayıt sırasında beyin üzerine tatbik edildiği aCSF ile perfüze edilebilir. Bu durumda, ritim 29 hızlandırılmış veya dow yavaşlatılabilirn 30 deneysel ilaç göre. Ayrıca, bir bölmeli kayıt odasına ile farklı aCSF 9 kullanılabilir hazırlanması 6 ve sıcaklık farklılaşmalarına seçici parça üzerine uygulanabilir. Bu bölmelere uyaran kaynaklı etkilerin seçilen beyinsapı parçalarının ima çalışma sağlar. Sunulan teknik, yenidoğan sıçan kullanır iken, aynı zamanda diğer hayvanlar modellerinde geçerlidir. Fareler için uygulanan benzer bir protokol kullanılarak, farenin P4 12 kadar, gebelik 16. günde (E16) elde kullanılabilir. Temel fark diseksiyonu sırasında aCSF sıcak ve karbojen-kabarcık ihtiyacıdır. Turtles, tadpoles ve yetişkin kurbağa da kullanılabilir; Ancak, bu tür aCSF bileşimi farklı diseksiyon teknikleri yanı sıra düzenlemeyi gerektirir.

Bu teknik aynı zamanda, preparasyon 31 rostral yüzünde patch-clamp kayıtları ile birleştirilmiş izin edilebilireşzamanlı ağ çıkış sinyalinin görselleştirme ve bu ağın belirli bir hücrenin etkinliği. Gerilim duyarlı boya görüntüleme de beyin sapı 32 ventral yüzünde aktive alanları lokalize etmek yenidoğan sıçan beyin sapı-omurilik hazırlıkları uygulanabilir. preparasyonlarda c-fos analizi de belirli bir solunum yanıtlarında rol oynayan nöral popülasyonları tanımlamak için gerçekleştirilebilir. Son olarak, preparat başka fizyolojik ritimler 33 kalbine 25 kaburga 6, ya da fizyolojik arter perfüzyon gibi diğer organları korumak için modifiye edilebilir. Ancak, bu çok önemli değişiklikler diğer diseksiyon protokollerini gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
  2. Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
  3. Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
  4. Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
  5. Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
  6. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  7. Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
  8. Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
  9. Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
  10. Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
  11. Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
  12. Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
  13. Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. 165-201 (2007).
  14. Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
  15. Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  18. Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
  19. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
  20. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
  21. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
  22. Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
  23. Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
  24. Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
  25. Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502, (Pt 3), 623-639 (1997).
  26. Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
  27. Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
  28. Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
  29. Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
  30. Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
  31. Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
  32. Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
  33. St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics