एक Screenable

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Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (104), e53083, doi:10.3791/53083 (2015).

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Abstract

Introduction

इस प्रक्रिया के समग्र उद्देश्य सी की ऊर्जा स्थिति के तेजी मात्रा का ठहराव है परिसर की जांच में एक समापन बिंदु के रूप में इस का उपयोग करने की दृष्टि से इन विवो में एलिगेंस। औचित्य निमेटोड सी में जुगनू luciferase की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति पर आधारित है प्लाज्मिड pSLGCV (1 के माध्यम से एलिगेंस 1-3 https://www.addgene.org/49862 )। luciferase एंजाइम (संकेत को निशाना luciferase peroxisome हटा दिया गया था) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP के लिए जुड़े हुए है और कोशिका द्रव्य में अनिवार्यता और सर्वत्र व्यक्त किया है। सब्सट्रेट luciferin exogenously प्रदान की जाती है जब यह प्रकाश उत्सर्जन होता है। कीड़ा पारदर्शी है, प्रकाश के रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLU) के रूप में एक luminometer में मापा जा सकता है। Bioluminescence प्रतिक्रिया और इसकी उपलब्धता सेलुलर एटीपी ईंधन उत्पादित प्रकाश का स्तर निर्धारित करता है। नतीजतन, luminometry एक convenien प्रदान करता हैएटीपी उत्पादन माइटोकॉन्ड्रिया में मुख्य रूप से होता है के बाद से टी, रिश्तेदार एटीपी के स्तर का आकलन करने का और विस्तार माइटोकॉन्ड्रियल समारोह से मतलब है। माइटोकॉन्ड्रियल समारोह और bioluminescence स्तरों के बीच एक कड़ी माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला जीन और सहवर्ती कम हो प्रकाश उत्पादन का मुंह बंद करने के माध्यम से पहले से प्रदर्शन किया गया है। 1

PE254 (feIs4) नामित किया गया उत्पन्न bioluminescence तनाव और PE255 (feIs5) 1 (सामग्री की सूची देखें) और 3। दूसरे के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता अध्ययन का एक नंबर जैसे सोडियम azide 1, कैडमियम 2, सीवेज के रूप में विभिन्न xenobiotic रसायनों के संपर्क में आने के बाद इन विवो में सेलुलर एटीपी के स्तर पर रिपोर्ट करने के लिए इन सेंसर उपभेदों का उपयोग किया है कीचड़ निकालने 3, 5'-फ्लोरो 2-डिऑक्सीयूरिडीन 6, और एक तंबाकू-विशिष्ट nitrosamine 7। उपभेदों भी पराबैंगनी सी विकिरण के लिए जोखिम के प्रभाव पर नजर रखने के लिए उपयोगी किया गया है 1,9 एक GFP संलयन (PE39) के बिना luciferase जीन व्यक्त luminescence सेंसर की एक प्रारंभिक संस्करण भी भारी धातुओं के प्रभाव की जांच में और एक सांस की इस्तेमाल किया गया है । uncoupler 10 खींच PE254 और PE255 luciferase ले: GFP संलयन और GFP प्रतिदीप्ति चमक मूल्यों को सामान्य बनाने के लिए एक सुविधाजनक साधन की पेशकश, निमेटोड जन के साथ आनुपातिक वृद्धि दर्ज की गई थी 6.9 प्रति अच्छी तरह से कीड़े की अंतर राशि का प्रभाव भी हो सकता है। परख (शर्त के अनुसार 5 कुओं की एक न्यूनतम) में कई तकनीकी प्रतिकृति को शामिल करके खाते में ले लिया। 3

प्रोटोकॉल ऊर्जा के स्तर के vivo निगरानी की संभावना प्रदान करता है (के रूप में विरोध करने के लिए और अधिक तकनीकी रूप से थका देने वाली इन विट्रो एटीपी निर्धारण) परिसर स्क्रीनिंग सक्रिय करने के लिए और एक पूरे म्यू के शारीरिक संदर्भ में repositioninglticellular जीव। प्रक्रिया और / या शाही सेना के हस्तक्षेप से जीन मुंह बंद करके उपलब्ध उत्परिवर्ती उपभेदों में chromosomally एकीकृत transgene पार करके आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक किस्म के लिए बढ़ाया जा सकता है; इस प्रकार, सी का पूरा लाभ उठा एक मॉडल के रूप में जीव एलिगेंस। विधि कारण माइटोकॉन्ड्रियल विषाक्तता के लिए दवा उम्मीदवारों की देर चरण विफलता को कम करने और उच्च पशु परीक्षण की कमी की दिशा में एक योगदान करने में मदद करनी चाहिए।

Protocol

नोट: (126 डिग्री सेल्सियस, 11 मिनट autoclaving द्वारा) बाँझ शर्तों (लामिना का प्रवाह कैबिनेट) के तहत और पूर्व निष्फल सामग्री के साथ सभी कदम बाहर ले। बाहर परेशान के साथ एक लेग थाली कोलाई OP50 हर महीने, पर बाहर लकीर ताजा लेग प्लेटों की आवश्यकता है और restreak है 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा।

1. बैक्टीरिया भोजन (कोलाई OP50) तैयारी

  1. 1 दिवस टीका लगाना की एक कॉलोनी के साथ दो सार्वभौमिक बोतलों में 2 एक्स 5 मिलीलीटर लेग कोलाई OP50 और 8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (220 आरपीएम) में इनक्यूबेटर झटकों में जगह।
  2. 8 घंटे ऊष्मायन के बाद, के 2 मिलीलीटर का उपयोग कोलाई OP50 पौंड संस्कृति 3 एक्स 200 मिलीलीटर पौंड के प्रत्येक टीका लगाना इनक्यूबेटर झटकों में रखें बोतल (220 आरपीएम) हे / 37 डिग्री सेल्सियस पर एन (17 घंटा)।
  3. 20 एक्स 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब वजन और ट्यूब पर वजन लिखें।
  4. दिन एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का प्रयोग 2., विभाज्य हे की 30 मिलीलीटर / एन पूर्व में कोलाई OP50 संस्कृति अपकेंद्रित्र ट्यूब तौला। 7741 x पर अपकेंद्रित्रजी, 10 डिग्री सेल्सियस, 8 मिनट।
  5. ध्यान से, सतह पर तैरनेवाला छानना पर ढक्कन के साथ उल्टे ट्यूब रखने के लिए और कई मिनट के लिए खड़े करने के लिए छोड़ दें। एक विंदुक का प्रयोग ढक्कन में एकत्र हो सकता है कि किसी भी अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला हटा दें। ट्यूब वजन और गोली के वजन की गणना।
  6. 30 ग्राम / एल के निलंबन प्रदान करते हैं और ट्यूब पर इस मात्रा को चिह्नित करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना। 1-3 महीने के भीतर या कम से उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर तिथि, लेबल और जगह ट्यूबों - 80 डिग्री सेल्सियस से अधिक समय 3 महीने के लिए भंडारण कर सकते हैं।
  7. नेमाटोड बढ़ के लिए जीवाणु निलंबन तैयार करें; भंवर धीरे गोली resuspend पिघलना और प्रत्येक ट्यूब 11,12 पूरा मध्यम एस के लिए आवश्यक मात्रा में जोड़ने के लिए बैक्टीरिया गोली की अनुमति है, विभिन्न ट्यूबों के पूल सामग्री आवश्यक मात्रा प्राप्त करने के लिए। बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं।

एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में नशीली दवाओं के मानकों के 2. तैयारी

नोट: एक दवा पुस्तकालय का उपयोग करते हैं, तो दवा प्लेटें एक एकल में प्रदान की जाती हैंDMSO में यौगिक की एकाग्रता। प्राथमिक जांच में एक भी एकाग्रता में यौगिकों का परीक्षण करेंगे। निर्देश 10 माइक्रोन से कम सांख्यिकीय महत्व के बाद चयनित, 0-160 माइक्रोन के बीच सांद्रता की एक श्रृंखला में पुष्टि यौगिक परीक्षण के लिए दवा की थाली की तैयारी के लिए का पालन करें। नीचे दिए गए चरणों अन्य सांद्रता का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

चेतावनी! दवाओं से निपटने के लिए आवश्यक सावधानियों का पालन करें (आम तौर पर नकाब, सुरक्षा चश्मे का सामना, दस्ताने आवश्यक हैं)।

  1. पुष्टि स्क्रीनिंग के लिए मानकों काम करने के साथ दवा की थाली तैयार: बाँझ 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में यौगिक के लिए आवश्यक राशि का वजन और DMSO में 16 मिमी यौगिक तैयार (यानी, 100x तक पहुंचाने के लिए वांछित शीर्ष एकाग्रता के सापेक्ष केंद्रित)।
  2. 8, 4, 2, 1, 0.5 और 0.25 मिमी मानकों (बाँझ शर्तों) प्राप्त करने के लिए DMSO में 2: क्रमानुसार 16 मिमी शेयर 1 पतला। ये केंद्रित 100x हैं और 0 (वाहन केवल) के अंतिम सांद्रता के नीचे पतला हो जाएगादवा प्रदर्शन के दौरान (1% DMSO में) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 और 160 माइक्रोन।
  3. एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में, उदाहरण के प्लेट स्थिति A1 के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक स्तंभ के भीतर यौगिक मानकों के प्रति अच्छी तरह 20-50 μl जगह: 16 मिमी, बी 1: 8 मिमी, सी 1: 4 मिमी, डी 1: 2 मिमी, ई 1: 1 मिमी, एफ 1: 0.5 मिमी, G1: 0.25 मिमी दवा और एच 1: DMSO। विभिन्न दवाओं के कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए विभिन्न स्तंभों का प्रयोग करें।
  4. दवा की थाली में स्तंभ 12 के कुओं के लिए अशेष वाहन।
    नोट: यह है कि वाहन पूरी थाली के पदों के प्रतिनिधि में परीक्षण किया है, यह सुनिश्चित वाहन नियंत्रण नीचे पंक्ति एच के साथ परीक्षण के अलावा कॉलम के परीक्षण की सुविधा होगी।
    नोट: पुष्टि स्क्रीनिंग के लिए प्रत्येक दवा प्लेट का परीक्षण किया जा करने के लिए 11 विभिन्न दवाओं की एक अधिकतम के साथ साथ वाहन पर नियंत्रण के लिए कमजोर पड़ने श्रृंखला रखती है।
  5. जब तक आवश्यक लेबल और सील की थाली, -20 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी और जगह के साथ कवर किया।

3. निमेटोड प्रयोगों

नोट: सभी कदम यू बाहर लेnder बाँझ शर्तों, aseptically और पूर्व निष्फल सामग्री और अभिकर्मकों के साथ। सी बनाए रखें एलिगेंस ई के साथ एन जी एम प्लेटों पर नियमित रूप से उपभेदों अलग प्रोटोकॉल चरणों के लिए कोलाई OP50। 12 सुझाई समय तालिका 1 में प्रदान की जाती हैं।

  1. दिन 1 काम: बाद में तुल्यकालन के लिए biosensor तनाव के तरल संस्कृति की स्थापना की।
    1. 2 मिलीलीटर एस पूरा में (भोजन सिर्फ बाहर चला गया है, जहां युवा लार्वा का सेवन के साथ) एक 6 सेमी एन जी एम थाली से नेमाटोड ले लो और 30 ग्राम / एल के साथ कुप्पी के लिए स्थानांतरण एस पूरा (कुल मात्रा 250 मिलीलीटर क्षमता शंक्वाकार कांच फ्लास्क में 30 मिलीलीटर) में कोलाई OP50। 20 डिग्री सेल्सियस, 160 rpm पर 3 दिन सेते हैं।
  2. 4 दिन कार्य (लगभग 30-35 मिनट की अनुमति): ब्लीच संस्कृति अंडे फसल और कीड़ा आबादी सिंक्रनाइज़ करने के लिए। 1 मिनट, 600 x जी के लिए सभी centrifugation कदम बाहर ले।
    1. बस का उपयोग करने से पहले ब्लीच समाधान तैयार: 0.156 एम KOH / NaOH के प्रत्येक 16 मिलीलीटर 4 मिलीलीटर ब्लीच जोड़ें।
    2. 2 एक्स 14 मिलीलीटर डालो15 मिलीलीटर शंक्वाकार centrifugation ट्यूबों में कीड़ा संस्कृति। कीड़े गुरुत्वाकर्षण (3 मिनट) द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। निकालें और तरल ऊपर बसे नेमाटोड त्यागें। प्रत्येक ट्यूब ब्लीच समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें और टाइमर शुरू। एक ट्यूब में संस्करणों का मिश्रण।
    3. 2 मिनट के लिए धीरे ट्यूब उलटें कीड़े के टूटने और निलंबन में अंडे की रिहाई के लिए स्टिरियोस्कोप के तहत की जाँच करें। जब सबसे अंडे जारी कर रहे हैं या ब्लीच समाधान में 2 मिनट, सेंट्रीफ्यूज की एक अधिकतम समय में।
    4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें। 14 मिलीलीटर एस पूर्ण और सेंट्रीफ्यूज के साथ गोली 1x धो लें।
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें 10 मिलीलीटर ब्लीच समाधान जोड़ने और टाइमर शुरू (इस दूसरे ब्लीच कदम कीड़ा शवों का सबसे बिखर और अब स्टिरियोस्कोप के तहत देखा जाता है कि यह सुनिश्चित करता है)। 2 मिनट, सेंट्रीफ्यूज की ब्लीच समाधान में एक अधिक से अधिक समय के बाद।
    6. धो गोली 3x एस पूरा में, धीरे प्रत्येक centrifugation के बाद पूरा 14 मिलीलीटर एस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली छानना। 14 मिलीलीटर एस सी में अंतिम धोने के बाद, resuspend अंडा गोलीomplete।
    7. एक शंक्वाकार कांच फ्लास्क मात्रा स्थानांतरण। 20 डिग्री सेल्सियस, 160 rpm पर 18-24 घंटे सेते हैं।
      नोट: काटा अंडे हे / एन हैच और पहली लार्वा instar (एल 1) में विकास की गिरफ्तारी के कारण भोजन की कमी के कारण है, इसलिए वे सभी विकास का एक ही चरण में हो जाएगा।
  3. 5 दिन काम: दवा assays के लिए सिंक्रनाइज़ कीड़ा संस्कृतियों की स्थापना की।
    नोट: भुखमरी माध्यम में निलंबित कीड़े ऐसे पिपेट सुझाव और ट्यूब के रूप में हाइड्रोफोबिक प्लास्टिक सतहों का पालन करते हैं। 0.01% बीच 20 प्लास्टिक की सतहों अधिक हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करना और उनकी गिनती में अधिक से अधिक सटीकता (0.01% ट्राइटन X100 भी इस्तेमाल किया जा सकता है) की अनुमति देने के लिए यहां इस्तेमाल एक surfactant है। नेमाटोड बैक्टीरियल पूरक मध्यम में हैं, वे प्लास्टिक के लिए छड़ी करने के लिए करते हैं नहीं है।
    1. मंच (160 आरपीएम) मिलाने का कुप्पी रखने के लिए, फ्लास्क में रची एल 1 के की संख्या का निर्धारण करें।
      1. कुप्पी से 100 μl नमूने 3x ले लो 900 μl तरल मीटर के साथ अलग से 1.7 मिलीलीटर microtubes में (एक साफ टिप हर बार का उपयोग करें)edium 0.01% बीच 20।
        नोट: केवल एक बार साफ टिप में आकांक्षा 100 μl नमूना। वितरण तब, जब बीच पूरक मध्यम में पिपेट ऊपर और नीचे एक बार कुछ टिप का पालन करने के लिए किसी भी कीड़े जारी करने के लिए।
      2. प्रत्येक तीन प्रतियों कमजोर पड़ने ट्यूब से 4x 10 μl बूंदों में नेमाटोड गणना। औसत मूल्य की गणना और शंक्वाकार कांच फ्लास्क में मौजूद कीड़े की संख्या का अनुमान है।
    2. 10 μl प्रति 10 नेमाटोड के साथ एक 2 x 20 मिलीलीटर संस्कृति की स्थापना के लिए आवश्यक रची निमेटोड निलंबन की मात्रा की गणना। Centrifugation कदम के दौरान कुछ बाद में निमेटोड नुकसान के लिए खाते में 10% द्वारा गणना की मात्रा में वृद्धि।
    3. छानना मात्रा 2 एक्स 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूबों में आवश्यक (पूर्व तौला)। धीरे वास्तविक तिरस्कृत मात्रा, भंवर प्राप्त करने और एक 5 मिलीलीटर पिपेट (केवल बाँझ टिप ट्यूब में प्रवेश करना चाहिए) के साथ अतिरिक्त मात्रा को हटाने के द्वारा मात्रा को लक्षित करने के लिए समायोजित करने के लिए ट्यूब के वजन।
    4. था करने के लिए पूरा ताजा एस के साथ 14 मिलीलीटर की मात्रा को बनाओज नेमाटोड। अपकेंद्रित्र (1 मिनट, 600 ग्राम)। निकालें और निमेटोड गोली परेशान नहीं देखभाल के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. 30 ग्राम / एल के साथ पूरा एस के 5 मिलीलीटर जोड़ें pelleted नेमाटोड के लिए कोलाई OP50। 30 ग्राम / एल के साथ पूरा 15 मिलीलीटर एस युक्त एक शंक्वाकार कांच कुप्पी के लिए प्रत्येक ट्यूब में 5 मिलीलीटर स्थानांतरण कोलाई OP50। नीचे नोट समय नेमाटोड पहले भोजन के साथ प्रदान किया गया।
    6. सूक्ष्म स्लाइड नेमाटोड गिनती करने के लिए (ताजा सुझावों का हर समय का उपयोग) और लगभग 10 (± 2) 10 प्रति μl की औसत पुष्टि पर धीरे कुप्पी (160 आरपीएम) हिला, 9 एक्स 10 μl बूंदों ले।
    7. 20 डिग्री सेल्सियस, 42-44 घंटे के लिए 160 rpm पर इनक्यूबेटर झटकों में निमेटोड बोतल रखें।
  4. 7 दिन कार्य: हस्तांतरण 96 अच्छी तरह प्लेटें नेमाटोड और दवा जोखिम आरंभ करें।
    1. एक एकल फ्लास्क में निमेटोड संस्कृतियों का मिश्रण धीरे कुप्पी घूमता रखने के लिए और एक 60 मिलीलीटर बाँझ गर्त में निमेटोड संस्कृति के 3 एक्स 4 मिलीलीटर जगह है। एक मिलाते हुए प्लेटफार्म (160 आरपीएम) पर गर्त रखें।
    2. उपयोग 8 चाननेल पिपेट एक फ्लैट पारदर्शी नीचे के साथ साथ 96 काले microtiter प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 25 μl निलंबित नेमाटोड विभाज्य (दोनों चमक और प्रतिदीप्ति रीडिंग लेने के लिए, या केवल चमक के लिए सफेद प्लेट)। थाली ढक्कन के साथ कवर और अलग निर्धारित करें।
      1. बाद हर 2 प्लेटों के सेट अप, खो मात्रा को बदलने के लिए गर्त में एक और 2 एक्स 2.5 मिलीलीटर नेमाटोड जगह (लगभग 7 मिलीलीटर की गर्त में एक 'मृत मात्रा' रखने के लिए)।
      2. नेमाटोड के साथ 13/14 प्लेटों को निर्धारित करें। 11 निमेटोड प्लेटों दो 96 अच्छी तरह से दवा प्लेटों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। 12 वें निमेटोड प्लेट विशेष रूप से एक नियंत्रण के रूप में वाहन के साथ लोड किया जाएगा। 13 वें प्लेट दिन 8 पर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (देखें नीचे) स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। गलतियों सेट अप के दौरान हो जाना चाहिए एक अतिरिक्त प्लेट इस्तेमाल के लिए तैयार किया जा सकता।
    3. एक मिलाते इनक्यूबेटर में एक नम कक्ष में प्रत्येक अच्छी तरह से और जगह की थाली के लिए पूरा एस विभाज्य 74 μl (सामग्री की सूची देखें) (20 डिग्री सेल्सियस, 160 आरपीएम) UNTआईएल (भोजन उपलब्ध कराया बाद जैसे, 45 घंटा 30 मिनट) चुने हुए विकास समय पर विभाज्य परीक्षण यौगिकों के लिए तैयार है। [प्रति अच्छी मात्रा अब 99 μl है]।
    4. परीक्षण करने के लिए दवा प्लेट (ओं) का पहले गला लें।
    5. सुझाव के लिए हर बार बदल रहा है, दवा के साथ निमेटोड प्लेटों स्थापित करने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें। दवा aliquoting के लिए 96 अच्छी तरह से थाली प्रति 5 मिनट की अनुमति दें।
      1. दवा थाली के 1 सेंट स्तंभ से 1 μl ले लो और स्तंभों नेमाटोड युक्त थाली के 1-5 को जोड़ने; कॉलम नेमाटोड युक्त थाली के 8-12 में दवा की थाली में 2 एन डी स्तंभ से दोहराएँ। कॉलम 6 और निमेटोड प्लेट की 7 के लिए वाहन की 1 μl जोड़ें।
        नोट: यौगिक / वाहन की: 100 कमजोर पड़ने निमेटोड थाली में अच्छी तरह से प्रति कुल मात्रा एक 1 में जिसके परिणामस्वरूप 100 μl हो जाएगा।
      2. स्तंभों के लिए दवा की थाली के 3/4 वें स्तंभ के 1 μl जोड़कर दोहराएँ प्रक्रिया दूसरे निमेटोड थाली के 1-5 / 8-12; कॉलम 6 और निमेटोड प्लेट की 7 के लिए वाहन जोड़ें।
      3. शेष दवा प्लेट स्तंभों का परीक्षण करने के लिए आगे बढ़ें। दवा प्लेट के कॉलम 12 से नमूने द्वारा सभी कुओं में वाहन के साथ एक निमेटोड प्लेट की एक न्यूनतम निर्धारित करें। वापस इनक्यूबेटर 20-22 घंटे के लिए (20 डिग्री सेल्सियस, 160 आरपीएम) झटकों में नम कक्षों में जगह प्लेट (8 दिन के लिए नोट देखें)।
    6. अगले दिन के लिए luminescence बफर भाग- तैयार: 1% DMSO और 0.15% ट्राइटन X-100 प्राप्त करने के लिए पूरा एस के लिए आवश्यक मात्रा को DMSO और 10% ट्राइटन X-100 जोड़ें। चमक के लिए प्लेट पढ़ने के प्रति 5 मिलीलीटर, प्लस luminometer इंजेक्टर भड़काना के लिए 1 मिलीलीटर की अनुमति दें।
  5. दिवस 8 कार्य: प्रयोगात्मक अंतिमबिंदुओं पढ़ें - प्रतिदीप्ति और bioluminescence। (GFP प्रतिदीप्ति रीडिंग bioluminescence डेटा सामान्य करने के लिए एक साधन के रूप में सिफारिश कर रहे हैं।)
    नोट: खाद्य वर्णित प्रयोगात्मक परिस्थितियों में महत्वपूर्ण संतान उत्पादन को रोकने के क्रम में नेमाटोड के लिए प्रदान के बाद 66-67 घंटे से समापन के पढ़ने के लिए निशाना लगाओ।
    1. सेट अप प्लेट GFP रीडिंग के लिए पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए। सीएक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 13 वीं की थाली से ombine अच्छी तरह से सामग्री। नेमाटोड (2-3 मिनट) व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। अच्छी तरह से प्रति 100 μl जीवाणु निलंबन के साथ एक microplate (पारदर्शी नीचे के साथ काले) लोड करने के लिए सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें।
      1. नेमाटोड देखा जा सकता है जहां कुओं नीचे टिप्पण खुर्दबीन के नीचे पृष्ठभूमि नियंत्रण प्लेट का निरीक्षण करें। बाद में डेटा विश्लेषण में इस्तेमाल पृष्ठभूमि अनुमान से इन बाहर निकालें।
    2. पृष्ठभूमि नियंत्रण सहित प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रतिदीप्ति, पढ़ें। (सेटिंग्स: प्लेट के नीचे से प्रकाशिकी; 485/20 उत्तेजना फिल्टर; 528/20 उत्सर्जन।)
    3. Luminescence रीडिंग के लिए बफर तैयार: luciferin (20 मिमी) भाग से तैयार करने के लिए बफर (पिछले दिन से) जोड़ने के लिए, 1% के साथ DMSO (1x), 0.15% ट्राइटन X100 (3x) और 0.3 मिमी luciferin (3x luminescence बफर प्राप्त करने के लिए )। 150 μl luminescence बफर के साथ प्रधानमंत्री luminometer इंजेक्टर 6x।
      1. पिछले चरण दवा प्रदर्शन के दौरान वाहन के रूप में 1% DMSO हो जाती है। वाहन पानी हो गया है, सह समायोजित3% की चमक बफर में DMSO के ncentration (यानी, 3x)।
    4. एक बार में एक ही थाली के साथ काम करते हैं। अच्छी तरह से प्रति 50 μl luminescence बफर बांटना। (अच्छी तरह से में 150 μl अंतिम मात्रा; luminescence बफर के 3x कमजोर पड़ने: 1% DMSO, 0.05% ट्राइटन X100 और 0.1 मिमी luciferin अंतिम सांद्रता।) प्लेस तुरंत मंच मिलाते और टाइमर शुरू पर।
      1. मंच (160 आरपीएम) मिलाते पर 3 मिनट के बाद, luminescence (माप 1 प्रति सेकंड) पढ़ा।

4. डेटा विश्लेषण

  1. प्रतिदीप्ति परिणामों से पढ़ने औसत GFP पृष्ठभूमि घटाना। संबंधित GFP पढ़ने से bioluminescence फूट डालो।
    1. एक उच्च GFP मूल्य एक यौगिक के संपर्क में नेमाटोड के लिए पता लगाया जाता है, तो किसी भी यौगिक प्रतिदीप्ति के लिए खाते में करने के लिए अपने दम पर परिसर के प्रतिदीप्ति उपाय। औसत से अधिक है, तो बजाय पृष्ठभूमि के रूप में इस का उपयोग करें।
  2. एक्सप्रेस bioluminescence, GFP सामान्यीकृत bioluminescence एकप्रत्येक थाली में वाहन पर नियंत्रण के लिए औसत मूल्य का एक प्रतिशत के रूप में एन डी GFP प्रतिदीप्ति डेटा।
  3. प्रत्येक एकाग्रता के लिए औसत मूल्यों और त्रुटि सलाखों प्लॉट।
  4. 'एकाग्रता', 'प्रयोग' और उनके बातचीत के प्रभाव के साथ 2-तरह विचरण (एनोवा) का विश्लेषण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व के लिए टेस्ट (प्रत्येक डेटा बिंदु एक भी अच्छी तरह से करने के लिए संदर्भित करता है), और बनाम (पोस्ट-हॉक परीक्षण के रूप में Dunnett परीक्षण का उपयोग । वाहन नियंत्रण)।
    नोट: "प्रयोग" या "बातचीत" शर्तों महत्वपूर्ण हैं, तो आगे के प्रयोगों प्रतिक्रिया पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो सकता है। प्रयोगों के बीच कोई परिवर्तनशीलता डेटा भूखंडों के अवलोकन से स्पष्ट है, जहां एक तरह से एनोवा स्वतंत्र प्रयोगों से जमा डेटा पर प्रदर्शन किया जा सकता है।
    1. केवल वाहन के साथ प्लेट (ओं) के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कॉलम 6 -7 में सभी कुओं और नियंत्रण समूह के रूप में पंक्ति एच में सभी कुओं का चयन करें (इन नियमित तौर पर परिसर के परीक्षण के दौरान वाहन को सौंपा पदों पर रहे हैं)।

Representative Results

विधि वर्णन करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम rotenone (चित्रा 1), paraquat (चित्रा 2), oxaloacetate (चित्रा 3), और एक दवा पुस्तकालय 13 (चित्रा 4) की स्क्रीनिंग के दौरान के रूप में जुगनू luciferase अवरोधकों उठाया गया था कि 4 यौगिकों के लिए प्राप्त किया गया। दवा जोखिम सभी मामलों में L4 मंच पर शुरू किया गया था, लेकिन भोजन के पहले अन्य यौगिकों के लिए 45-46 घंटे की तुलना में नेमाटोड के लिए प्रदान के बाद paraquat जोखिम प्रयोगों 41 घंटा में शुरू किए गए। प्रोटोकॉल दवा जोखिम की दीक्षा और जोखिम लंबाई के लिए समय के चयन में लचीलेपन की एक डिग्री के लिए अनुमति देता है। हालांकि, जांच के प्रयोजनों के लिए, निर्धारित समय में एक बार प्रयोगों के बीच reproducibility के लिए, चयनित पालन किया जाना चाहिए। Endpoints व्यापक अंडे बिछाने और कुओं में संतान के अंडे सेने को रोकने के क्रम में 66-67 घंटा विकास समय से मापा जाना चाहिए। समय के लिए दिशानिर्देश टी में प्रदान की जाती हैं1 में सक्षम।

Rotenone, मैं अवरोध करनेवाला एक माइटोकॉन्ड्रियल जटिल, सांद्रता की एक श्रृंखला के लिए दोनों अपेक्षाकृत कम (2 घंटा) और अब निवेश (24 घंटे) (चित्रा 1) के बाद bioluminescence कम कर दिया। इस उदाहरण में, कोई GFP माप लिया गया था, लेकिन तकनीकी प्रतिकृति की संख्या में इस्तेमाल किया (एन = 6) कुओं के बीच 3 कीड़ा संख्या में कोई मतभेद बाहर भी करने के लिए पर्याप्त है। 24 घंटा जोखिम bioluminescence में गिरावट के लिए योगदान करने की उम्मीद थी जटिल मैं निषेध का एक परिणाम के रूप में एक नेमाटोड बढ़ने, जिस पर समय की खिड़की, और धीमी विकास है। यह विशेष रूप से ऊपर 20 माइक्रोन और की सांद्रता में देखा देरी विकास के साथ स्टिरियोस्कोप के तहत दृश्य अवलोकन द्वारा पुष्टि की गई; इसके अलावा में कुछ मारक (गुणात्मक टिप्पणियों मात्रा निर्धारित नहीं) 40 माइक्रोन से देखा गया था। कोई मारक 2 घंटा प्रदर्शन के बाद मनाया गया लेकिन कीड़ा आंदोलन पर प्रभाव देखा गया। नियंत्रण occu को bioluminescence रिश्तेदार में तेज गिरावटrotenone की सबसे कम एकाग्रता पर rred प्रभाव को आसानी से 2 घंटा जोखिम पर त्वरित दृश्य अवलोकन से पता नहीं कर रहे थे, जिसके लिए 2.5 माइक्रोन, का परीक्षण किया। Bioluminescence में यह गिरावट कम सेलुलर एटीपी के अनुरूप है। अधिकतम निषेध विशेष rotenone को निशाना बनाने के लिए किसी भी बाद के प्रयोगों के 0 और 5 माइक्रोन [एकाग्रता रेंज 0-160 माइक्रोन के बीच बाहर किया जाना चाहिए यह दर्शाता है कि इस्तेमाल किया rotenone की सबसे कम एकाग्रता (2.5 माइक्रोन) के साथ हासिल की थी अन्य दवाओं के साथ एक तुलना के हिस्से के रूप में चयनित किया गया था शुरू में 10 माइक्रोन से कम महत्वपूर्ण प्रभाव होने के रूप में पहचान] (कहीं और प्रकाशित करने के लिए)।

शाक paraquat प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की वृद्धि के माध्यम से mitochondrial समारोह को प्रभावित करता है। यहाँ, हम सी के bioluminescence पर उसके प्रभाव का प्रदर्शन 24 घंटा (चित्रा 2) के लिए सांद्रता की एक श्रृंखला के लिए जोखिम के बाद एलिगेंस तनाव PE254। तनाव एक ल्यूक :: GFP संलयन किया जाता है के रूप में, GFP प्रतिदीप्ति ए एल एस थाओ सामान्य बनाने का एक साधन के रूप में मापा जाता है। 6,9 Paraquat काफी bioluminescence, GFP प्रतिदीप्ति और सामान्यीकृत bioluminescence की कमी हुई। Dunnet पद अस्थायी परीक्षण वाहन पर नियंत्रण के संबंध में महत्वपूर्ण अंतर के साथ paraquat की सांद्रता bioluminescence और सामान्यीकृत bioluminescence के लिए 4 और 8 मिमी थे, साथ ही सामान्यीकृत bioluminescence के लिए 2 मिमी कि संकेत दिया। काफी GFP प्रतिदीप्ति को कम ही एकाग्रता मिमी, विकास प्रभाव और सामयिक मृत कीड़ा (गुणात्मक टिप्पणियों) में देखा गया था, जिस पर एक एकाग्रता 8 था। bioluminescence (और सामान्यीकृत bioluminescence) में गिरावट, mitochondrial समारोह और एटीपी उत्पादन पर प्रभाव में कमी आई संगत के साथ प्रतिदीप्ति की तुलना में अधिक था।

सी पर परीक्षण साइट्रिक एसिड चक्र मध्यवर्ती oxaloacetate 8 मिमी की एक भी एकाग्रता में एलिगेंस तनाव PE254, bioluminescence में वृद्धि (चित्रा 3) का नेतृत्व किया। कोई GFP प्रतिदीप्तिnce माप प्राप्त या अतिरिक्त दृश्य अवलोकन बाहर किए गए; लेकिन एक भी एकाग्रता के लिए इस तरह की प्रतिक्रिया आगे सांद्रता की एक श्रृंखला के लिए पुष्टि जोखिम, और प्रभाव के बारे में अधिक विस्तृत टिप्पणियों योग्यता होगा। यह फिर भी यह GFP प्रतिदीप्ति का आकलन करने से luciferase के स्तर पर कोई प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए उचित होगा एटीपी (अंततः अधिक से अधिक उत्पादन के साथ, साइट्रिक एसिड चक्र का अधिक से अधिक गतिविधि के लिए नेतृत्व की माने जा सकते हैं के रूप में इस परिसर से bioluminescence की एक वृद्धि आश्चर्य की बात नहीं है बाद के प्रयोगों में)। oxaloacetate डेटा सेट luciferase आधारित प्रयोगों में देखा प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता की हद तक पता चलता है दिखाया गया है। हमारे अनुभव में इस परिवर्तनशीलता विशेष रूप से कम हानिकारक जोखिम की स्थिति के लिए परीक्षा प्रणाली की एक विशेषता है।

जुगनू luciferase निरोधात्मक यौगिकों DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 और DDD00023047 पु पर प्रभाव को देखकर इन विट्रो में दोनों का परीक्षण किया गयाrified एंजाइम और इन विवो में सी का उपयोग कर एलिगेंस ल्यूक: GFP तनाव व्यक्त। परीक्षण किया यौगिकों के किसी भी जोखिम की स्थिति के तहत निमेटोड मौत का कारण बना है कि कोई सबूत नहीं था। सभी 4 यौगिकों 25 और 100 माइक्रोन (चित्रा -4 ए) का परीक्षण दो सांद्रता में इन विट्रो में luciferase गतिविधि को प्रभावित किया। DDD00001434 इन विवो bioluminescence (चित्रा 4 बी) में बड़ी गिरावट के लिए एक विश्वसनीय औचित्य प्रदान की है, जो लगभग पूरी तरह से शुद्ध luciferase की गतिविधि को मार डाला। सीधे तुलना नहीं कर रहे हैं, इन विट्रो और इन विवो assays में, DDD00023047 के जवाब दोनों assays में इसी तरह की थी। DDD0001477 और DDD00000635 में इन विट्रो से विवो में एक बड़ी गिरावट का कारण बना। इन यौगिकों 22 घंटे से पहले luciferin सब्सट्रेट के लिए जीना कीड़े के लिए प्रदान किया गया है, और परिणाम luciferin बन गया जब वे आसानी से luciferase सक्रिय साइट से विस्थापित नहीं किया गया है कि प्रतिबिंबित कर सकते हैं available। वैकल्पिक रूप से, DDD0001477 और DDD00000635 सेलुलर एटीपी के स्तर पर एक अतिरिक्त प्रभाव पड़ सकता है। इस जुगनू luciferase शामिल नहीं है कि माध्यम से मूल्यांकन करना होगा। नोट के DDD00000635 यौगिक के संपर्क में रहते हैं कीड़े में GFP संकेत की मजबूत वृद्धि था। यह नीचे चर्चा की जाएगी।

चित्र 1
माइटोकॉन्ड्रियल जटिल 1. चित्रा मैं rotenone सी की ऊर्जा स्थिति में कमी आई अवरोध करनेवाला एलिगेंस तनाव PE254 के bioluminescence द्वारा मापी गई। सिंक्रनाइज़ L4 मंच कीड़े 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 और 2 के लिए 1% DMSO में 160 माइक्रोन rotenone के संपर्क में (45-46 घंटा एल 1 लार्वा को उपलब्ध कराई भोजन के बाद) मानव संसाधन (कम) या क्रमश: 48 पर 24 घंटा (लंबे समय जोखिम) bioluminescence की पूर्व रीडिंग और कीड़ा विकास के 69 घंटा भोजन उपलब्ध कराया है। Bioluminescence (इकाई सापेक्ष प्रकाश इकाइयों, RLU) वाहन (1% डीएमएस के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थीहे) मान। त्रुटि सलाखों प्रत्येक rotenone एकाग्रता में तकनीकी प्रतिकृति के SEM दर्शाती (एन = 6)। सभी परीक्षण सांद्रता वाहन नियंत्रण (पी <0.001) के संबंध में एक उच्च सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर में हुई।

चित्र 2
ऑक्सीडेटिव तनाव paraquat 2. चित्रा सी की ऊर्जा स्थिति में कमी आई (bioluminescence द्वारा मापा जाता है) एक एकाग्रता निर्भर तरीके से एलिगेंस तनाव PE254। (एल 1 लार्वा को उपलब्ध कराई भोजन के बाद 41 घंटे में इस उदाहरण में सुविधा के लिए) सिंक्रनाइज़ L4 मंच कीड़े 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 या 8 से अवगत कराया गया 24 घंटे के लिए मिमी paraquat। GFP प्रतिदीप्ति (इकाई रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों, RFU) bioluminescence डेटा (इकाई RLU), 65 घंटा के विकास पर प्राप्त दोनों समापन के सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डेटा नियंत्रण का एक प्रतिशत (1% DMSO) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। त्रुटि सलाखों तकनीकी प्रतिकृति के SEM दर्शाती(एन = अलग सांद्रता के लिए 5, n = 18 नियंत्रण के लिए)। एक तरह से एनोवा: *** पी <वाहन पर नियंत्रण करने के लिए 0,001 रिश्तेदार।

चित्र तीन
चित्रा 3. साइट्रिक एसिड चक्र मध्यवर्ती oxaloacetate (8 मिमी) सी के bioluminescence बढ़ाया एलिगेंस तनाव PE254। सिंक्रनाइज़ L4 मंच कीड़े (एल 1 लार्वा को उपलब्ध कराई भोजन के बाद 45-46 घंटा) हौसले से 30 मिनट ± 18 घंटे के लिए 8 मिमी oxaloacetate तैयार करने के लिए अवगत कराया गया। Bioluminescence (इकाई RLU) 63.5 घंटा ± 1 घंटा की एक विकासात्मक समय में पढ़ा था और वाहन पर नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी (DDH 2 ओ)। विभिन्न स्तंभों में एक ही प्रयोग के भीतर अलग से 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए आवंटित 8 तकनीकी प्रतिकृति के विभिन्न डेटा सेट का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों तकनीकी प्रतिकृति के SEM दर्शाती (एन = 8)। 2 तरह-एनोवा 'सेट' और 'एकाग्रता' कारक के रूप में साथ: ̵6; सेट 'p> 0.05,' एकाग्रता 'पी <0.001 और बातचीत अवधि p> 0.05।


चित्रा 4
बी
चित्रा 4
जुगनू luciferase luminescence पर ज्ञात निरोधात्मक गतिविधि के साथ (DDD00023047: DDD00001434, सी 2: DDD0001477, सी 3: DDD00000635 और सी 4 सी 1) डंडी दवाओं की खोज परिसर पुस्तकालय में 13 से 4 यौगिकों के लिए प्रतिक्रियाओं की चित्रा 4. परीक्षण। शुद्ध जुगनू luciferase की गतिविधि पर यौगिकों के (ए) प्रभाव, (प्रकाश इकाइयों, RLU के रूप में मापा) वाहन पर नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। एटीपी bioluminescence CLSII किट (रॉश, Manheim, जर्मनी) कुओं (सफेद 96-W के लिए aliquoted luciferase एंजाइम का एक ही राशि के साथ निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया गया थापक्ष microtiter प्लेट)। एटीपी 10 माइक्रोन और परिसर के 1 μl के अंतिम एकाग्रता में प्रदान किया गया (अंतिम एकाग्रता संकेत) या DMSO (1%) जोड़ा गया है। Luminescence संकेत 10 सेकंड के लिए एकीकृत किया गया। त्रुटि सलाखों तकनीकी प्रतिकृति के SEM दर्शाती (एन = 4)। विश्लेषण: एक तरह से एनोवा; * पी <0.05 या *** पी <वाहन पर नियंत्रण करने के लिए 0,001 रिश्तेदार। , और सी 2 और सी 3 के लिए महत्वपूर्ण (क्रमशः DDD0001477 और DDD00000635; पी <0.05)। GFP प्रतिदीप्ति (बी) bioluminescence के vivo मापन, सामान्यीकृत bioluminescence और; सी 1 (पी <0.001 DDD00001434) के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण 25 और 100 माइक्रोन के बीच मतभेद सी के GFP प्रतिदीप्ति 22 घंटे के लिए परीक्षण यौगिकों को प्रदर्शन के बाद 67 घंटा विकास समय पर एलिगेंस तनाव PE254। त्रुटि सलाखों तकनीकी प्रतिकृति के SEM दर्शाती (एन = 8)। सांख्यिकीय विश्लेषण (एक तरह-एनोवा) 3 डेटा सेट (3 XN = 8) से जमा डेटा पर बाहर किया। * पी <0.05 या *** पी <संबंधित वाहन पर नियंत्रण करने के लिए 0,001 रिश्तेदार। एडवेंचर्ससी 4 (DDD00023047) के प्रदर्शन के बाद सामान्यीकृत bioluminescence के लिए 25 और 100 माइक्रोन केवल सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी <0.05) के बीच सीईएस।

अपना समय दिन 1 दूसरा दिन तीसरा दिन 4 दिन दिन 5 दिन 6 7 दिन दिवस 8
9-10 चरण 5
10-11 चरण 5
11-12 चरण 4 चरण 5
12-13 चरण 4
13-14
14-15
15-16
16-17 स्टेप 1 चरण 3
17-18
18-19 चरण 2

प्रोटोकॉल कदम की तालिका 1. अवलोकन निमेटोड प्रयोगों के प्रत्येक दिन पर (धारा 3) किया जाता है और समय का सुझाव दिया जा करने के लिए।

Discussion

मॉडल जीव सी एलिगेंस एक शक्तिशाली प्रायोगिक प्रणाली प्रदान करता है। यह संस्कृति के लिए आसान है और (L4 के माध्यम से किशोर लार्वा चरणों एल 1 के माध्यम से) वयस्क reproducing के लिए अंडे से 3.5 दिन के जीवन चक्र के साथ भरपूर मात्रा में आनुवंशिक रूप से समान संतान पैदा करता है। कारण अपने छोटे आकार के लिए, यह आसानी से यौगिक स्क्रीनिंग की सुविधा, 96 अच्छी तरह प्लेटें में उगाया जा सकता है। हम सी के तनाव के आधार पर एक प्ररूपी स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत एक 96 अच्छी तरह से थाली luminometer और एक बाँझ कैबिनेट की आवश्यकता है, हालांकि ऊर्जा के स्तर के vivo सेंसर के रूप में कार्य है कि एलिगेंस। 14 प्रोटोकॉल, किसी भी प्रयोगशाला के लिए लागू है। यह अच्छा प्रयोगशाला तकनीक का उपयोग करके assays में प्रदूषण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। मैन्युअल काम कर रहे हैं, तो प्राप्त निमेटोड प्लेटों की अधिकतम संख्या 2x 96 अच्छी तरह से दवा प्लेटों के परीक्षण की इजाजत दी और दो वाहन प्लेटों सहित प्रयोग के प्रति 13 है। प्रतिनिधि परिणाम मैं rotenon अवरोध करनेवाला माइटोकॉन्ड्रियल परिसर के लिए प्रस्तुत कर रहे हैंई, सुपरऑक्साइड जनरेटर paraquat, साइट्रिक एसिड चक्र मध्यवर्ती oxaloacetate और ज्ञात जुगनू luciferase निरोधात्मक गतिविधि के साथ चार यौगिकों। oxaloacetate, एक वृद्धि करने के लिए एटीपी के लिए अधिक से अधिक पीढ़ी से परिणाम की संभावना के नेतृत्व जबकि भविष्यवाणी के रूप में पहले दो यौगिकों bioluminescence में कमी करने के लिए नेतृत्व किया। oxaloacetate डेटा सेट में भी एक पत्रकार के रूप में जुगनू luciferase पर आधारित प्रयोगों में आंतरिक परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों की एक न्यूनतम अज्ञात यौगिकों के लिए प्रतिक्रियाओं की मजबूती का पता लगाने की सलाह दी जाती है।

जुगनू luciferase गतिविधि के निषेध इन विट्रो परख एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर के साथ पहचान योग्य था। 3 यौगिकों में से एक के स्तर को बढ़ाने के अवरोध करनेवाला के साथ संगत GFP प्रतिदीप्ति में पर्याप्त वृद्धि के परिणामस्वरूप GFP टैग luciferase एंजाइम सक्रिय करने के लिए बाध्य द्वारा जुगनू luciferase साइट है, और यह प्रतिपादन अधिक स्थिर है। 15 कुछ उदाहरणों मेंअवरोध करनेवाला अतिरिक्त सब्सट्रेट से विस्थापित किया जाता है जब (नहीं इस विशेष मामले में) इस bioluminescence के स्तर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। 15 अत: यह महत्वपूर्ण जुगनू एंजाइम के साथ बातचीत कि यौगिकों से ग़लती से परिणामों की व्याख्या करने के लिए नहीं है, एटीपी के स्तर में कमी आई है या वृद्धि के रूप में / माइटोकॉन्ड्रियल समारोह। Luminescence संकेत में परिवर्तन अक्सर इस तरह के आंदोलन, विकास और विकास के रूप में स्वास्थ्य के अतिरिक्त माप के साथ संबंध स्थापित। Bioluminescence संकेत में एक नाटकीय गिरावट का पता चला लेकिन कीड़े सूक्ष्म अवलोकन द्वारा नियंत्रण से पृथक कर रहे है, तो एक उदाहरण के रूप में, एक परिसर में एक संदिग्ध luciferase अवरोध करनेवाला है। नहीं विकास या यौगिक autofluorescence द्वारा समझाया GFP प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई है, यह भी एक अवरोध करने के लिए बात कर सकते हैं। Luciferase अवरोधकों 15 के एक नंबर से जाना जाता है और PubChem में दर्ज किया गया है। इसलिए पहले उदाहरण में, यह PubChem द्वारा आयोजित luciferase अवरोधकों के बारे में जानकारी से परामर्श करने के लिए अच्छा अभ्यास है; टी द्वारा पीछाअतिरिक्त साधन द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल समारोह पर प्रभाव का शुद्ध एंजाइम 3 और / या पुष्टि के साथ इन विट्रो assays में यौगिक प्रभाव का esting। 16,17

GFP प्रतिदीप्ति माप जहां संभव bioluminescence के साथ-साथ इस समापन बिंदु को मापने के लिए एक मजबूत मामला बनाने जुगनू luciferase स्तर का पता लगाने के लिए (और ऊपर चर्चा के रूप में कुछ luciferase एंजाइम अवरोधकों की क्षमता का पता लगाने) को सक्रिय करें। GFP के लिए bioluminescence रीडिंग के सामान्यीकरण भी है (यह भी कई तकनीकी प्रतिकृति का समावेश करके प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि) कुओं के बीच कीड़ा संख्या में बदलाव के लिए लेखांकन का एक साधन है। अधिक से अधिक संवेदनशीलता के लिए, यह रीडिंग से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल हालांकि निमेटोड autofluorescence वर्तमान परख की (एक सीमा है, किसी भी उम्र बढ़ने के छात्रों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण के लिए जिम्मेदार नहीं है पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति करने के लिए जीवाणु निलंबन के योगदान का आकलन) उम्र के साथ कि निमेटोड autofluorescence बढ़ जाती दिया मर जाता है। परीक्षण यौगिकों के autofluorescence भी समानांतर में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। शोधकर्ताओं bioluminescence transgene की अभिव्यक्ति के स्तर पर किसी भी तनाव मतभेद के लिए नियंत्रित करने के क्रम में, विभिन्न आनुवंशिक म्यूटेंट में या विभिन्न जीनों के मुंह बंद करने के बाद सेलुलर एटीपी पूल तुलना करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए चाहते हैं, जहां GFP के सामान्यीकरण अनिवार्य प्रतीत होता है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण पैरामीटर जोखिम शुरू की है, जिस पर विकास मंच, जोखिम की लंबाई, और विभिन्न कुओं में नेमाटोड के समान संख्या प्राप्त करने में शामिल हैं। एक्सपोजर हालांकि, नेमाटोड के विकास के किसी भी चरण में एल 3 चरण शुरू कर सकते हैं या पुराने के लिए बेहतर है। MtDNA सामग्री, ऑक्सीजन की खपत और एटीपी के स्तर में एक बहुत ही महत्वपूर्ण वृद्धि के सबूत के रूप में इस स्तर से, नेमाटोड, वयस्कता में विकास के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण पर निर्भर करते हैं। 18,19,20 वर्तमान प्रोटोकॉल एक्सपो शुरू कीL4 मंच पर Ure। (बल्कि वे पहले एल 1 चरण में भोजन के साथ प्रदान किया गया जब से) केवल इस चरण में 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए नेमाटोड aliquoting के लिए कारण, प्लेटें वाष्पीकरण कम करने के लिए नम कक्षों में रखा जाता है, हालांकि, वाष्पीकरण की एक डिग्री अभी भी में होता यह है कि पलकों पर बनाने बहुत छोटी बूंदों के रूप में देखा हमारे मिलाते इनक्यूबेटर, (इसमें दूसरे मिलाते इन्क्यूबेटरों के साथ एक मुद्दा नहीं हो सकता है)। सिर्फ दवा मानकों के अलावा पहले प्लेटों के लिए नेमाटोड aliquoting करके, वास्तविक दवा एकाग्रता वाष्पीकरण के कारण मात्रा में किसी भी छोटे बदलाव से प्रभावित नहीं है। वाहन के साथ एक निमेटोड प्लेट लोड हो रहा है केवल नेमाटोड समान रूप से कुओं के बीच वितरित किया गया है कि जांच करने के लिए उपयोगी है। वाहन ही थाली के लिए पाया किसी भी महत्वपूर्ण मतभेद वेल्स को नेमाटोड वितरण में गरीब तकनीक का संकेत होगा।

जोखिम की लंबाई पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। स्वतंत्र रूप से विकास के लिए ऊर्जा की स्थिति पर प्रभाव हित के समर्थक रहे हैंtocol (उदाहरण के लिए करने के लिए लगभग तत्काल प्रतिक्रिया से, 2 घंटा) कम जोखिम के समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। सी में यौगिकों के दूसरी ओर, प्रविष्टि एलिगेंस ऊतकों में कुछ समय लग सकता है। उदाहरण के लिए 12-24 घंटे resveratrol और 5-फ्लोरो 2'- डिऑक्सीयूरिडीन (FUDR) की अधिकतम आंतरिक सांद्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। 21 इसलिए, एक लंबे समय तक जोखिम (18 घंटा के लिए 24) जोखिम के स्तर को अधिकतम करने के लिए उचित हो सकता है। जोखिम समय प्रजनन के महत्वपूर्ण स्तर कुएं में जगह लेने के लिए अनुमति नहीं है कि समय के लिए सीमित होना चाहिए। हम नेमाटोड की कुल विकास के समय 66-67 घंटे के तहत रखा जाता है कि सलाह देते हैं। हालांकि सुविधाजनक, नेमाटोड तब तक गर्भवती हैं और egglaying शुरू कर दी है। फिर भी हम नगण्य होने के लिए अंडे की तैयारी से bioluminescence रीडिंग पाया () नहीं दिखाया। सुर-5 प्रमोटर संचालित transgene अभिव्यक्ति पहले ही 2-2 और एक आधे घंटे 100 सेल चरण 22 और सी में निषेचन के बाद पता चला हैhitinous खोल luciferin के प्रवेश को सीमित करने की संभावना है। दूसरों embryonated अंडे गर्भवती वयस्कों के चयापचय में महत्वपूर्ण योगदान नहीं किया है कि मिल गया है। 23 बहरहाल, महत्वपूर्ण संतानों के उत्पादन के लिए अनुमति की स्थिति को टाला जा सकता है। अगर पसंद है, प्रयोगात्मक समयमान वेतनमान वापस स्थानांतरित कर दिया जा सकता है: हम पहले से देर L3 लार्वा चरण (36 घंटे) में एक पर्यावरण विष के लिए जोखिम शुरू की और 55 घंटा में bioluminescence और GFP माप बाहर किया है सशर्त बाँझ कर रहे हैं कि 2 वैकल्पिक रूप से, आनुवंशिक पृष्ठभूमि। उदाहरण के फेर-15 (B16) द्वितीय के लिए के रूप में, संतान उत्पादन को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; 15 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है, जो (hc17) चतुर्थ डबल उत्परिवर्ती -1 FEM, लेकिन 25 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ है। 24 बाँझपन प्रेरित करने के लिए FUDR का उपयोग अपने आप में निमेटोड चयापचय को प्रभावित कर सकते हैं इस के रूप में की सिफारिश नहीं है। 25 परख कर सकता है भी इस तरह के आंशिक नुकसान के funct के रूप में अधिक पारगम्य cuticles के साथ उपभेदों में प्रदर्शन कियाबहुऔषध संवेदनशील दवाओं की पारगम्यता वृद्धि के कारण। 26 जो कर रहे हैं आयन बस-8 म्यूटेंट यह कम जोखिम और कम यौगिक सांद्रता की सुविधा होगी। इन नेमाटोड के लिए luciferin जोड़ने के लिए शर्तों में भी चमक बफर में 1% DMSO और 0.05% ट्राइटन X100 luciferin उपलब्धता बढ़ाने के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है, यानी एडजस्ट करने की जरूरत है।

प्रोटोकॉल परिसर में प्रसव के लिए वाहन के रूप में 1% DMSO के उपयोग करता है। हम पिछले एक प्रकाशन में चर्चा की है के रूप में घातक नहीं है, DMSO के इस एकाग्रता कुछ जैविक प्रभाव है। उपलब्ध दवा पुस्तकालयों में से कई 3 ​​वाहन के कमजोर पड़ने के बाद सेल आधारित assays के लिए उपयुक्त होगा कि सांद्रता में, DMSO के 100% में तैयार कर रहे हैं 0.1% करने के लिए। उच्चतर यौगिक सांद्रता सी में प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए आवश्यक हैं एलिगेंस यह कम से कम 1% DMSO पर assays के संचालन करने के लिए अक्सर संभव नहीं है कि इस तरह के मानव कोशिकाओं, के साथ तुलना में। फिर, उपभेदों के उपयोग के साथअधिक पारगम्य cuticles वाहन की कम सांद्रता के साथ परीक्षण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। DMSO के अधिक से अधिक 1% की सांद्रता की सिफारिश नहीं कर रहे हैं।

प्रायर रीडिंग के लिए luciferin के साथ एक सेट ऊष्मायन समय का पालन किया जाना चाहिए। पहले से दिखाया गया है, luminescence अगले 30 मिनट के एक से अधिक चमक में एक धीमी गति से धीरे-धीरे कमी के बाद, luciferin जोड़ने पहले 5 मिनट के लिए अपेक्षाकृत स्थिर रहने के बाद दूसरे मिनट के भीतर अपनी अधिकतम स्तर तक पहुँचता है। एक विशेष रासायनिक करने के लिए काइनेटिक प्रतिक्रियाओं luciferin के प्रारंभिक वितरण के बाद 30 मिनट के इस प्रारंभिक चरण के दौरान किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल निमेटोड आबादी के तुल्यकालन को प्राप्त करने के लिए अंडे के संग्रह के बाद एक भुखमरी कदम शामिल है। विकास के विभिन्न चरणों सेलुलर एटीपी के स्तर में मतभेद है और परीक्षण यौगिकों को अलग तरह से प्रतिक्रिया हो सकती है, क्योंकि हम निमेटोड परीक्षण आबादी के तुल्यकालन सलाह देते हैं। एस पूरा में भुखमरी से बाहर ले जाने सेM9 का विरोध करने के माध्यम के रूप में, अंडे सेने नेमाटोड कि लार्वा को विकसित नहीं है तो, एक कार्बन स्रोत (इथेनॉल) के साथ प्रदान की जाती हैं, लेकिन पूरी तरह से भूखे नहीं हैं। 27,28 यह भी एल 1 गिरफ्तार कर लिया के भोजन के लिए तेजी से प्रतिक्रिया के लिए primed रहे हैं और दिखाया गया है कि सामान्य एल 1 विकास दर को भोजन उपलब्ध हो जाता है के बाद 3 घंटा के भीतर हासिल की है। 29 बहरहाल, यह संभावना भुखमरी कदम सी के चयापचय को बदल सकता है कि एलिगेंस बाहर नहीं किया जा सकता है। भुखमरी की लंबाई 24 घंटा से अधिक नहीं होनी चाहिए इस कारण से 30 (18 घंटा तुल्यकालन के लिए पर्याप्त है)। कुछ प्रयोगशालाओं पूरी तरह भुखमरी कदम दरकिनार उम्र तुल्यकालन के लिए एक Copas Biosorter उपयोग करने की संभावना हो सकती है। अन्य प्रयोगशालाओं से पहले विरंजन के लिए (OP50 साथ एन जी एम प्लेट) ठोस मीडिया पर (कदम 3.1) निमेटोड आबादी के विस्तार के लिए एक प्राथमिकता हो सकती है और यह भी अच्छी तरह से काम करेगा। हम निमेटोड संवर्धन के लिए एक मानक माध्यम है, के रूप में यौगिक प्रदर्शन के दौरान एस माध्यम का उपयोग Howeveआर अन्य मीडिया उदाहरण कश्मीर मध्यम या ईपीए मामूली मेहनत पानी के लिए चुना जा सकता है अक्सर ecotoxicological अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। 31,32

प्रोटोकॉल एक साधन स्क्रीन करने के लिए और mitochondrial समारोह पर प्रभाव के मामले में आगे की जांच के लिए उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए प्रदान करता है। प्राथमिक जांच के स्तर पर यह कुछ यौगिकों इसलिए दवा स्क्रीन संपूर्ण नहीं माना जाना चाहिए, के कारण केवल एक ही एकाग्रता परीक्षण किया जा रहा करने के लिए याद किया गया हो जाएगा संभावना है। हिट्स उदाहरण ऑक्सीजन की खपत, सी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल समारोह के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए तकनीक के उपयोग द्वारा मान्य किया जा सकता एलिगेंस GFP व्यक्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ तनाव, mitochondrial झिल्ली क्षमता और / या आरओएस मापन के लिए दाग। 16,33,34 पद्धति का सबसे बड़ा महत्व बहुकोशिकीय जीवधारी स्तर पर यौगिकों और / या शर्तों के बड़ी संख्या में स्क्रीनिंग के लिए एक साधन के लिए है, और महत्वपूर्ण बात वीं का लाभ लेने के लिए सक्षम होने के लिएसी ई आनुवंशिक शिक्षणीयता कार्रवाई के तंत्र की जांच करने के लिए एलिगेंस। तकनीक में तेजी लाने और दिलचस्प यौगिकों और लक्ष्यों की खोज करने के लिए नए रास्ते खोजने के लिए मदद कर सकता है। यह एक बीमारी प्रासंगिक संदर्भ में यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए मानव रोग के साथ जुड़े आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सेंसर के संयोजन देने के लिए काफी होगा कि परिकल्पना की गई है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orion II Microplate Luminometer Berthold Detection Systems with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
FLx800 fluorimeter  Biotek with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
Ks 130 basic shaking platform Ika #0002980000
Innova 4349 New Brunswick Scientific Refrigerated incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804R Eppendorf with eppendorf rotor A-4-44  (for 50/15 ml tubes)
Stripette, Costar Corning #4489 Serological pipette
Cellstar 50 ml tubes Greiner bio-one #227661
Cellstar 15 ml tubes Greiner bio-one #188261
Cellstar 60 mm tissue culture plates  Greiner bio-one #628160
Superfrost Microscope slides VWR #631-0909
Sterile spatula Corning #3007; #3004 for weighing out chemicals
0.22 mM Millex GP filters Millipore #SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml Fisher Scientific #MCT-150-R
Corning 96 well assay plate VWR #3603 Black plate clear bottom with lid
Nunc 96 well assay plate Fisher Scientific #236105 White plate with lid
Reservoir reagent 60 ml Thermo Scientific Finnpipette #9510027 used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1
Storage box/damp chamber Roche Diagnostics #10 800 058 001 174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content Sigma Aldrich #239305 Store in aliquots at 4 °C,  seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil
D-Luciferin, potassium salt Biotium Inc # 10101-2 Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots
Name Company Catalog Number Comments
Tween 20 Sigma Aldrich # P9416
DMSO CalBiochem #317275 Purity 99.99%
Triton X100 Alfa Aesar #A16046 Diltute to 10% in ddH2O
Nystatin CalBiochem #475914
C. elegans bioluminescent strains Author's own laboratory PE254, PE255 contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.
E. coli OP50 CGC
General chemicals Sigma Aldrich/Fisher Scientific

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References

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